JPH0480010B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

(イ) 利用分野 本発明は、ウロキナーゼ前駆体（以下、単に前
駆体という）乾燥製剤に関する。 (ロ) 従来技術 前駆体は生体内に存在する線維素溶解酵素の一
種であり、その詳細は特開昭60−62981号明細書
に記載されている。前駆体はそのままでは不活性
であるが、プラスミン処理することにより酵素活
性を発現する、いわゆるチモゲンであり、ヒト腎
細胞の無血清培地中にて生成できる。 前駆体は、アミノ酸411個からなる１本の鎖状
構造を有する分子量約50000の蛋白である。前駆
体は上記の如く酵素活性を示さないが、プラスミ
ン処理により発現するプラスミノーゲンアクチベ
ータ活性は、抗ウロキナーゼ抗体によい完全に阻
害される。前駆体はフイブリンに対して特異的な
親和性を有し、また血栓を構成する線維であるフ
イブリンを選択的に分解するなど、従来のウロキ
ナーゼとは異なる血栓溶解特性を有する。ウロキ
ナーゼとは異なる優れた特性を有する前駆体は線
維素溶解酵素として臨床上の幅広い利用が期待さ
れる。 (ハ) 本発明が解決しようとする問題点 前駆体は通常注射用として単位投与量あたりの
アンプルあるいは分注容器に封入し、凍結乾燥製
剤として提供されるが、前駆体を主成分とする医
薬組成物が凍結乾燥に対して不安定な傾向にあ
り、凍結乾燥を行うと力価が低下しあるいは経時
的にも力価の減少が認められる。 本発明者らな前駆体を主成分とする医薬組成物
の長期保存の安定性を確保するための種々の研究
を行い、その結果前駆体に少くとも(1)ゼラチンお
よび(2)塩基性アミノ酸あるいは有機酸またはその
塩を添加すろことにより、凍結乾燥時ならびに保
存期間中の経時的な前駆体の変性、分解、力価の
低下が抑制され、しかも前駆体製剤の溶解性を高
めることを見いだし、本発明を完成した。 本発明は、ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、
安定化剤として少なくとも(1)ゼラチンおよび(2)塩
基性アミノ酸あるいは有機酸またはその塩を配合
してなるウロキナーゼ前駆体乾燥製剤である。 (ニ) 問題点を解決するための手段 本発明で用いられる前駆体はその由来を限定さ
れるものではなく、たとえばヒト腎細胞を無血清
培地中で培養する方法にて得られたもの、遺伝子
工学に基づくものなどが挙げられる。このうち、
腎細胞培養法および前駆体の回収・精製法は、特
開昭60−62981、遺伝子工学による製法は特開昭
61−177987に開示されている。 また、前駆体は高度に精製されたものにおいて
特に効果が著しい。例えば、比活性100〜500U／
mg程度が例示される。 〔なお、1Uはプラスミンにより前駆体を活性化
し、この時、合成基質S2444（Pyro−Glu−Gly−
Arg−pNA）から標準状態で１秒間に1nMの
PNAを遊離させる力価を意味する。以下同様。
また、本測定法での300Uはウロキナーゼ国際単
位力価表示の１×10⁵IUに相当する。〕 本発明において安定化剤として用いるゼラチン
は、医療用に用いるものであれば特に限定されな
い。例えば、日本薬局方収載の「ゼラチン」、「精
製ゼラチン」などが例示される。 ゼラチンの添加量としては前駆体100〜2000U
に対して１〜100mg程度が例示される。 本発明の前駆体乾燥製剤は好ましくは凍結乾燥
品であり、ゼラチンは凍結乾燥前または直後に添
加すればよいが、好適にはゼラチンを前駆体溶液
（100〜500U／ml程度）に添加した後、凍結乾燥
する。 安定化剤として、本発明は、前記ゼラチンと塩
基性アミノ酸あるいは有機酸またはその塩を少な
くとも含む。該塩基性アミノ酸としては、アルギ
ニン、リジン、ヒスチジンが挙げられ、有機酸と
しては、クエン酸、マンデル酸、シユウ酸等が挙
げられ、有機酸塩としては、前記酸のナトリウム
塩等が挙げられる。また、本発明は所望により更
に、アルブミン、アスパラギン酸、グルタミン酸
等のアミノ酸、無機塩（塩化ナトリウム、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム）等を添加すること
もできる。 (ホ) 効果 本発明により、凍結乾燥時および保存時の前駆
体の安定性の向上（すなわち、変性、分解、力価
の低下等の抑制）、溶解性の向上が図られる。 (ヘ) 実施例・実験例 本発明を詳細に説明するたえにさらに実施例・
実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるも
のではない。 実験例 精製前駆体（比活性400U／mg）300Uを0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）１mlに溶解した後、表１に
示すような組成の添加剤を加え、７種の試料とし
た後、各々を凍結乾燥し60℃で２週間保存した。 各々の試料について前駆体の残存力価（Ｕ）を
凍結乾燥前、凍結乾燥直後、１週間保存後、２週
間保存後に測定した。 前駆体の活性は、プラスミンにより前駆体を活
性化した後、合成基質（S2444）を用いて測定し
た。結果を表２に示す。

【表】

【表】

【表】 比較例 精製前駆体（比活性400U／mg蛋白）300U、精
製ゼラチン（局方品）10mgをPH6.0、0.1Mリン酸
緩衝液１mlに溶解し、無菌濾過後、バイアル瓶に
充填し、凍結乾燥し、注射用乾燥製剤を得た。 実施例 １ 安定化剤とて、ゼラチンの他にクエン酸ナトエ
ウム16mgを用いる以外は全て前記比較例に準じて
操作し、同様に注射用乾燥製剤を得た。 実施例 ２ 安定化剤とてゼラチンの他にアルギニン16mgを
用いる以外は全て前記比較例に準じて操作し、同
様に注射用乾燥製剤を得た。 ＜参考例：製造例＞ 培養人腎細胞を0.1％ヒト血清アルブミン添加
無血清培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離
し、その上清を凍結し保存した。プールした培養
上清をPH5.5に調整した後、CM−Sephadex Ｃ−
50に接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH5.5）で
カラムを洗浄した後、0.16Mリン酸緩衝液（PH
8.5）で吸着していた前駆体を溶出させた。 一方、前駆体で予め免疫しておいたマウス
BALB／Ｃの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
をポリエチレングリコールにより融合させたハイ
ブリドーマのうち、前駆体に対する抗体生産の高
いクローンを選択した。この融合細胞の培養液か
ら、抗前駆体モノクローナル抗体を回収した。こ
のモロクロール抗体をBrCN活性化Sepharose
4B（Pharmacia社）に固定した。 このモロクローナル抗体カラムを0.4M NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、こ
れに前記の前駆体を含有する溶出液を接触した。
0.4M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）でカ
ラムを洗浄した後、吸着していた前駆体を0.5M
NaCl含有0.2Mグリシン−HCl水溶液（PH2.5）で
溶出させた。溶出液を中和後抗マウスIgGウサギ
IgGを固定化した担体を通過し漏出してくる極く
微量のマウスIgGを除去した。通過液を除菌濾過
した後、凍結乾燥し比活性が少なくとも240U／
mg（80000IU／mgに相当）の高度精製前駆体を得
た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量５万の１本の帯を示
した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、安定化剤
   として少なくとも(1)ゼラチンおよび(2)塩基性アミ
   ノ酸あるいは有機酸またはその塩を配合してなる
   ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤。