JP2895626B2 - 血栓溶解剤 - Google Patents
血栓溶解剤Info
- Publication number
- JP2895626B2 JP2895626B2 JP4502176A JP50217691A JP2895626B2 JP 2895626 B2 JP2895626 B2 JP 2895626B2 JP 4502176 A JP4502176 A JP 4502176A JP 50217691 A JP50217691 A JP 50217691A JP 2895626 B2 JP2895626 B2 JP 2895626B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sak
- reaction
- plasminogen
- thrombus
- amino acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、例えば心筋梗塞、脳梗塞、動脈硬化などの
治療に有効であるスタフィロキナーゼから、その活性に
影響を与えない部分を削除した血栓溶解剤に関するもの
である。
治療に有効であるスタフィロキナーゼから、その活性に
影響を与えない部分を削除した血栓溶解剤に関するもの
である。
［背景技術］ スタフィロキナーゼ（以下、SAKと記す）はそれ自身
にプロテアーゼ活性はないが、プラスミノゲン或いはプ
ラスミンとの複合体がプラスミノゲンを活性化する点で
ストレプトキナーゼ（以下、SKと記す）に類似のプラス
ミノゲンアクチベータである。ところで、SAKは分子量
が約15,000でSKの1/3以下の大きさであり、また、遺伝
子がクローニングされDNA配列が明らかにされているた
め、作用機構を分子レベルで解析するのに好適な材料と
考えられている。
にプロテアーゼ活性はないが、プラスミノゲン或いはプ
ラスミンとの複合体がプラスミノゲンを活性化する点で
ストレプトキナーゼ（以下、SKと記す）に類似のプラス
ミノゲンアクチベータである。ところで、SAKは分子量
が約15,000でSKの1/3以下の大きさであり、また、遺伝
子がクローニングされDNA配列が明らかにされているた
め、作用機構を分子レベルで解析するのに好適な材料と
考えられている。
本出願人と同一の出願人は、SAK遺伝子を組み込んだ
大腸菌を培養し、菌体に蓄積したSAKを採取する方法を
提案した（特開昭58−67181号）。この方法で得られるS
AKの大部分は、後述する配列表の配列番号１に記載のよ
うに136個のアミノ酸からなるペプチドであった（Sako,
T.,Eur.J.Biochem.,149,557−563（1985））。
大腸菌を培養し、菌体に蓄積したSAKを採取する方法を
提案した（特開昭58−67181号）。この方法で得られるS
AKの大部分は、後述する配列表の配列番号１に記載のよ
うに136個のアミノ酸からなるペプチドであった（Sako,
T.,Eur.J.Biochem.,149,557−563（1985））。
更に、SAKの作用機構はSKと相違することが判明し、
特にSKにはない特徴として、フィブリン存在下での活性
の増強（所謂、フィブリン特異性）を有していることが
確認され、良好な血栓溶解剤として機能することが確認
された（特願昭63−90252号）。また、SAKの反応の遅延
性を改良するため、予めSAKとプラスミノーゲン（又
は、フィブリン）と複合体を形成させた血栓溶解剤も提
案されている（特願平１−13044号）。
特にSKにはない特徴として、フィブリン存在下での活性
の増強（所謂、フィブリン特異性）を有していることが
確認され、良好な血栓溶解剤として機能することが確認
された（特願昭63−90252号）。また、SAKの反応の遅延
性を改良するため、予めSAKとプラスミノーゲン（又
は、フィブリン）と複合体を形成させた血栓溶解剤も提
案されている（特願平１−13044号）。
前述の方法で得られた136個のアミノ酸からなるペプ
チドであるSAKは、従来から用いられてきた他の血栓溶
解剤に比べ分子量が小さく、血栓内への浸透性の点から
も有利であり、容易に大量生産が可能となり、価格的に
も他の血栓溶解剤と比べて有利である等の優れた特性を
有している。
チドであるSAKは、従来から用いられてきた他の血栓溶
解剤に比べ分子量が小さく、血栓内への浸透性の点から
も有利であり、容易に大量生産が可能となり、価格的に
も他の血栓溶解剤と比べて有利である等の優れた特性を
有している。
前述のように、136個のアミノ酸からなるペプチドで
あるSAKは優れた特性を有しているが、分子量は小さい
ほど抗原性や投与量等の問題が生じ難い。
あるSAKは優れた特性を有しているが、分子量は小さい
ほど抗原性や投与量等の問題が生じ難い。
［発明の開示］ 本発明は、136個のアミノ酸からなるペプチドであるS
AKを改良して、更に抗原性の問題が少なく、投与量も更
に少なくてすむ血栓溶解剤を得ることを目的とする。
AKを改良して、更に抗原性の問題が少なく、投与量も更
に少なくてすむ血栓溶解剤を得ることを目的とする。
前記目的を達成することに成功した本発明による血栓
溶解剤は、少なくとも後述する配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列からなるペプチドを有効成分としたものであ
る。
溶解剤は、少なくとも後述する配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列からなるペプチドを有効成分としたものであ
る。
詳細には、SAKの活性に影響しないアミノ酸又はペプ
チドを切除したペプチドを有効成分とするものであり、
SAKをトリプシン型プロテアーゼで処理して得られるSAK
のＮ末端の10アミノ酸を切除したペプチドを有効成分と
するものである。
チドを切除したペプチドを有効成分とするものであり、
SAKをトリプシン型プロテアーゼで処理して得られるSAK
のＮ末端の10アミノ酸を切除したペプチドを有効成分と
するものである。
即ち、本発明では、上記のペプチドが、SAKと比較し
て更に優れた血栓溶解作用を有することを見出したもの
である。
て更に優れた血栓溶解作用を有することを見出したもの
である。
本発明では、136個のアミノ酸からなるペプチドであ
るSAKの様々のプロテアーゼを用いてSAKの活性に影響し
ないアミノ酸又はペプチドを切除することを検討した。
その結果、SAKのＮ末端の10アミノ酸からなるペプチド
（具体的には、Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr
Lys）から削除したもの（以下、SAK−11と記す）は、フ
ィブリン溶解活性、プラスミノゲン活性化能、フィブリ
ン特異性等の諸特性は136個のアミノ酸（ペプチド）か
らなるSAKの諸性質と同等であり、更に幾つかの点でよ
り優れていることが判明した。すなわち、SAKのＮ末端
の10アミノ酸からなるペプチドを切除したSAK−11は、S
AKと比べ、抗原性の問題が少なく、投与量も少なくてす
む血栓溶解剤である。
るSAKの様々のプロテアーゼを用いてSAKの活性に影響し
ないアミノ酸又はペプチドを切除することを検討した。
その結果、SAKのＮ末端の10アミノ酸からなるペプチド
（具体的には、Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr
Lys）から削除したもの（以下、SAK−11と記す）は、フ
ィブリン溶解活性、プラスミノゲン活性化能、フィブリ
ン特異性等の諸特性は136個のアミノ酸（ペプチド）か
らなるSAKの諸性質と同等であり、更に幾つかの点でよ
り優れていることが判明した。すなわち、SAKのＮ末端
の10アミノ酸からなるペプチドを切除したSAK−11は、S
AKと比べ、抗原性の問題が少なく、投与量も少なくてす
む血栓溶解剤である。
また、SAK−11はSAKにプロテアーゼ、具体的にはトリ
プシン型プロテアーゼを作用させることによって、生成
することが判明し、特にプラスミノゲンを作用させるこ
とにより夾雑物を生成することなくSAK−11が生じ、そ
れ以外の分解は起きないことが判明した。尚、プラスミ
ノゲンの代わりにその活性体であるプラスミンを用いる
ことも可能である。その他、使用可能なトリプシン型プ
ロテアーゼとしては、トリプシン，リジルエンドペプチ
ダーゼ，エンテロキナーゼ，トロンビン，血液凝固第VI
II a因子，血液凝固第IX a因子，血液凝固第X a因子，
血液凝固第XI a因子，血液凝固第XII a因子，カブトガ
ニ凝固酵素，ウロキナーゼ，ブロウロキナーゼ，組織プ
ラスミノーゲンアクチベータ，高分子キニノーゲン，低
分子キニノーゲン，カテプシンB,血漿カリクレイン，膵
カルクレイン等が代表的なものであり、また、それらの
チモーゲン（酵素前駆体）であって、本反応系で活性を
発現するものも含まれる。
プシン型プロテアーゼを作用させることによって、生成
することが判明し、特にプラスミノゲンを作用させるこ
とにより夾雑物を生成することなくSAK−11が生じ、そ
れ以外の分解は起きないことが判明した。尚、プラスミ
ノゲンの代わりにその活性体であるプラスミンを用いる
ことも可能である。その他、使用可能なトリプシン型プ
ロテアーゼとしては、トリプシン，リジルエンドペプチ
ダーゼ，エンテロキナーゼ，トロンビン，血液凝固第VI
II a因子，血液凝固第IX a因子，血液凝固第X a因子，
血液凝固第XI a因子，血液凝固第XII a因子，カブトガ
ニ凝固酵素，ウロキナーゼ，ブロウロキナーゼ，組織プ
ラスミノーゲンアクチベータ，高分子キニノーゲン，低
分子キニノーゲン，カテプシンB,血漿カリクレイン，膵
カルクレイン等が代表的なものであり、また、それらの
チモーゲン（酵素前駆体）であって、本反応系で活性を
発現するものも含まれる。
また、前述のようにSAK−11は、各種トリプシン型プ
ロテアーゼ（塩基性アミノ酸のＣ端側を切断する）によ
ってSAK−11の製造が可能であるが、場合によってはSAK
−11以外の夾雑物も生成するため、その後の分離精製処
理が必要になる。
ロテアーゼ（塩基性アミノ酸のＣ端側を切断する）によ
ってSAK−11の製造が可能であるが、場合によってはSAK
−11以外の夾雑物も生成するため、その後の分離精製処
理が必要になる。
なお、固定化酵素を利用することにより、精製走査
（酵素の除去など）の簡略化が及び酵素の繰り返し利用
が可能となる。
（酵素の除去など）の簡略化が及び酵素の繰り返し利用
が可能となる。
以上のように、SAKのＮ末端10アミノ酸からなるペプ
チドを除いたSAK−11は、抗原性の低下、安定性の向
上、代謝試験の簡便化などの様々な特性がある。
チドを除いたSAK−11は、抗原性の低下、安定性の向
上、代謝試験の簡便化などの様々な特性がある。
以上のように、本発明においては、136個のアミノ酸
からなるペプチドであるSAKに様々のプロテアーゼを用
いてSAKの活性に影響しないアミノ酸を切除することを
検討し、抗原性の低下、安定性の向上、代謝試験の簡便
化などの様々な特性を有する後述の配列番号２に記載の
ペプチドを有効成分とする血栓溶解剤を得た。
からなるペプチドであるSAKに様々のプロテアーゼを用
いてSAKの活性に影響しないアミノ酸を切除することを
検討し、抗原性の低下、安定性の向上、代謝試験の簡便
化などの様々な特性を有する後述の配列番号２に記載の
ペプチドを有効成分とする血栓溶解剤を得た。
具体的には、SAKのＮ末端の10アミノ酸からなるペプ
チドを切除して得られた126個のアミノ酸からなるペプ
チド（SAK−11）を有効成分とする血栓溶解剤のフィブ
リン溶解反応、プラスミノゲン活性化反応、フィブリン
特異性等の活性は、136個のアミノ酸（ペプチド）から
なる本来のSAKに比べて活性面でも優れている。
チドを切除して得られた126個のアミノ酸からなるペプ
チド（SAK−11）を有効成分とする血栓溶解剤のフィブ
リン溶解反応、プラスミノゲン活性化反応、フィブリン
特異性等の活性は、136個のアミノ酸（ペプチド）から
なる本来のSAKに比べて活性面でも優れている。
以上のように、SAKのＮ末端10アミノ酸からなるペプ
チドを除いた血栓溶解剤SAK−11は、抗原性の低下、安
定性の向上、代謝試験の簡便化などの様々な特性があ
る。
チドを除いた血栓溶解剤SAK−11は、抗原性の低下、安
定性の向上、代謝試験の簡便化などの様々な特性があ
る。
［図面の簡単な説明］ 図１はSAK−11の分取した全分画ペプチドの配置を示
すペプチドマップである。
すペプチドマップである。
図２はSAK−11の投与量と血栓湿重量の関係を示す線
図である。
図である。
図３は血栓溶解反応の経時変化を示す線図である。
図４は血漿中に残存するフィブリノーゲンの経時変化
を示す線図である。
を示す線図である。
図５は血漿中に残存するプラスミノーゲンの経時変化
を示す線図である。
を示す線図である。
図６は血漿中に残存するα２−プラスミンインヒビタ
ーの経時変化を示す線図である。
ーの経時変化を示す線図である。
図７はSAK−11での各種濃度におけるプラスミノーゲ
ン活性化反応の強度を示す線図である。
ン活性化反応の強度を示す線図である。
図８はSAKでの各種濃度におけるプラスミノーゲン活
性化反応の強度を示す線図である。
性化反応の強度を示す線図である。
［発明を実施するための最良の形態］ 1.種々の酵素との反応 種々のプロテアーゼとSAKを反応させて、反応生成物
を調べた。次の表１にその結果を示す。
を調べた。次の表１にその結果を示す。
表１に示すように、プラスミノゲン，プラスミン，ト
リプシン，リジルエンドペプチダーゼのトリプシン型プ
ロテアーゼは136個のアミノ酸（ペプチド）からなるSAK
のＮ末端10アミノ酸が削除されたSAK−11が生成した。
特に、プラスミノゲン，プラスミンでは夾雑物がなく、
良好にSAK−11が生成することが示されている。
リプシン，リジルエンドペプチダーゼのトリプシン型プ
ロテアーゼは136個のアミノ酸（ペプチド）からなるSAK
のＮ末端10アミノ酸が削除されたSAK−11が生成した。
特に、プラスミノゲン，プラスミンでは夾雑物がなく、
良好にSAK−11が生成することが示されている。
2.ヒト−プラスミノゲンとの反応による方法 10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に溶解したSAK
溶液（4.0mg/ml）1.0mlに対して、ヒト−プラスミノゲ
ン溶液を0.01mg（0.133CU）相当を添加し、37℃で３時
間インキュベートした。反応物をSDSポリアクリルアミ
ド電気泳動にて解析した結果、全てがSAK−11に変換さ
れていることがわかった。
溶液（4.0mg/ml）1.0mlに対して、ヒト−プラスミノゲ
ン溶液を0.01mg（0.133CU）相当を添加し、37℃で３時
間インキュベートした。反応物をSDSポリアクリルアミ
ド電気泳動にて解析した結果、全てがSAK−11に変換さ
れていることがわかった。
更に、この反応生成物をＳ−セファロース（Ｓ−Seph
arose）カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ
ーにて精製して得られたSAK−11は、後述するように、
Ｎ末端アミノ酸配列から確かにSAK−11であることが確
認された。
arose）カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ
ーにて精製して得られたSAK−11は、後述するように、
Ｎ末端アミノ酸配列から確かにSAK−11であることが確
認された。
また、後述するように、モル換算で136個のアミノ酸
からなるSAKと同等かそれ以上の活性を示した。
からなるSAKと同等かそれ以上の活性を示した。
3.固定化プラスミノゲンの利用 市販のBrCN−アクチベーティド・セファロース4B（Br
CN−activated Sepharose 4B）に対して、ヒト−プラス
ミノゲンをカップリングさせ、固定化プラスミノゲン
（Plasminogen−Sepharose 4B）を作製した。1mlのプラ
スチック注射筒に固定化プラスミノゲンを0.2ml充填
し、緩衝液A 0.5mlで２回洗浄した後、SAK（0.2mg/0.05
ml）0.05mlを添加し、緩衝液A 0.5mlで４回洗浄した
後、緩衝液B 0.5mlで溶出した。
CN−activated Sepharose 4B）に対して、ヒト−プラス
ミノゲンをカップリングさせ、固定化プラスミノゲン
（Plasminogen−Sepharose 4B）を作製した。1mlのプラ
スチック注射筒に固定化プラスミノゲンを0.2ml充填
し、緩衝液A 0.5mlで２回洗浄した後、SAK（0.2mg/0.05
ml）0.05mlを添加し、緩衝液A 0.5mlで４回洗浄した
後、緩衝液B 0.5mlで溶出した。
緩衝液A:0.01Mリン酸緩衝液（Phosphate buffer）（p
H7.0） 緩衝液B:0.1Mクエン酸緩衝液（Citrate buffer（pH4.
25）＋0.4M NaCl） その結果、SAKはカラム吸着画分に回収され、かつSAK
−11に変換されていることが電気泳動により確認され
た。
H7.0） 緩衝液B:0.1Mクエン酸緩衝液（Citrate buffer（pH4.
25）＋0.4M NaCl） その結果、SAKはカラム吸着画分に回収され、かつSAK
−11に変換されていることが電気泳動により確認され
た。
4.SAK−11のアミノ酸配列の決定 ペプチドマッピングの手法を用いて、詳細にSAK−11
のアミノ酸配列の決定を行った。使用したプロテアーゼ
はリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテ
アーゼI:和光純薬工業（株）社製）及びV8プロテアーゼ
（宝酒造（株）社製）であり、リジルエンドペプチダー
ゼは100μg/ml、V8プロテアーゼは200μg/mlとなるよう
に水で希釈したものを用いた。
のアミノ酸配列の決定を行った。使用したプロテアーゼ
はリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテ
アーゼI:和光純薬工業（株）社製）及びV8プロテアーゼ
（宝酒造（株）社製）であり、リジルエンドペプチダー
ゼは100μg/ml、V8プロテアーゼは200μg/mlとなるよう
に水で希釈したものを用いた。
酵素反応はリジルエンドペプチダーゼ処理の場合、20
mMトリス−塩酸（pH9.5）を含む20μｌの反応液に５μ
ｇのSAK−11と0.1μｇの酵素を加え、37℃で６時間イン
キュベートした。また、V8プロテアーゼの場合、50mM炭
酸水素アンモニウム（pH7.9）、1mM EDTAを含む20μｌ
の反応液に５μｇのSAK−11と0.67μｇの酵素を加え、3
7度で24時間インキュベートした。
mMトリス−塩酸（pH9.5）を含む20μｌの反応液に５μ
ｇのSAK−11と0.1μｇの酵素を加え、37℃で６時間イン
キュベートした。また、V8プロテアーゼの場合、50mM炭
酸水素アンモニウム（pH7.9）、1mM EDTAを含む20μｌ
の反応液に５μｇのSAK−11と0.67μｇの酵素を加え、3
7度で24時間インキュベートした。
酵素反応終了後、それぞれの反応液中のペプチド・フ
ラグメントをHPLC法を用いて分離した。HPLCシステム
は、島津製作所（株）製LC−6Aシステム（LC−6A ２
台、SPD−6AV、Ｃ−R3A、SCL−6A）にエルマ社製ERC−3
322デガッサーとバイオラッド社製AS−100Tオートサン
プラーを組合わせたものを使用し、溶出液の210nmでの
吸光度をフルスケール0.02で測定した。分離に使用した
カラムは日本ウォータース社製μBONDASPHERE C18カラ
ム（粒径５μ、ポアサイズ300Å、3.9×150mm）であ
る。
ラグメントをHPLC法を用いて分離した。HPLCシステム
は、島津製作所（株）製LC−6Aシステム（LC−6A ２
台、SPD−6AV、Ｃ−R3A、SCL−6A）にエルマ社製ERC−3
322デガッサーとバイオラッド社製AS−100Tオートサン
プラーを組合わせたものを使用し、溶出液の210nmでの
吸光度をフルスケール0.02で測定した。分離に使用した
カラムは日本ウォータース社製μBONDASPHERE C18カラ
ム（粒径５μ、ポアサイズ300Å、3.9×150mm）であ
る。
HPLCによる分離は、酵素反応後の試料20μｌ（５μｇ
SAK−11を含む）に280μｌのＡ溶媒（0.1％TEAを含む
水）を加えて総量を300μｌとし、このうちの280μｌを
アプライし、Ａ溶媒とＢ溶媒（0.1％TFAを含むアセトニ
トリル）との２溶媒による直線濃度勾配で行い、流量を
1ml/minとした。濃度勾配条件は以下の表２に示す条件
のうち何れかを用いた。
SAK−11を含む）に280μｌのＡ溶媒（0.1％TEAを含む
水）を加えて総量を300μｌとし、このうちの280μｌを
アプライし、Ａ溶媒とＢ溶媒（0.1％TFAを含むアセトニ
トリル）との２溶媒による直線濃度勾配で行い、流量を
1ml/minとした。濃度勾配条件は以下の表２に示す条件
のうち何れかを用いた。
リジルエンドペプチダーゼ処理による反応液からは、
HPLC分析によりＬ−１からＬ−13のピークが分離され
た。また、V8プロテアーゼ処理による反応液からはＶ−
１からＶ−15が分離された。得られた各分画ペプチドに
ついて、アプライドバイオシステム社473Aプロテインシ
ークエンサーを用いてアミノ酸配列の決定を行った。
HPLC分析によりＬ−１からＬ−13のピークが分離され
た。また、V8プロテアーゼ処理による反応液からはＶ−
１からＶ−15が分離された。得られた各分画ペプチドに
ついて、アプライドバイオシステム社473Aプロテインシ
ークエンサーを用いてアミノ酸配列の決定を行った。
各分画中のペプチドのアミノ酸配列の結果を次の表３
に示す。更に、図１はSAK−11の分取した全分画ペプチ
ドの配置を示すペプチドマップであり、図１に示す通
り、SAK−11のＣ末端アミノ酸残基を除く全アミノ酸配
列を決定した。
に示す。更に、図１はSAK−11の分取した全分画ペプチ
ドの配置を示すペプチドマップであり、図１に示す通
り、SAK−11のＣ末端アミノ酸残基を除く全アミノ酸配
列を決定した。
表３及び図１に示すように、SAK−11のLys−11から、
Lys−135までの配列が、遺伝子配列から予想されたアミ
ノ酸配列に完全に一致することを確認した。
Lys−135までの配列が、遺伝子配列から予想されたアミ
ノ酸配列に完全に一致することを確認した。
更に、SAK−11のカルボキシル末端（Ｃ末端）の構造
を解明する目的で、以下の実験を行った。即ち、SAK−1
1溶液（2.4mg/ml）0.15mlに対して同量の0.1M クエン
酸ナトリウム緩衝液（pH3.8）を加え、ここにカルボキ
シペプチダーゼＷ（生化学工業社製）溶液（2.0mg/ml）
0.01mlを加え、37度にて反応させた。反応開始後、0,5,
20時間後に0.10mlを採取して0.1Mジイソプロピルフルオ
ロリン酸（DFP）0.01mlを加えて反応を停止し、ここに2
0mM リン酸ナトリウム溶液0.29mlを加えることによりp
Hを整えた。
を解明する目的で、以下の実験を行った。即ち、SAK−1
1溶液（2.4mg/ml）0.15mlに対して同量の0.1M クエン
酸ナトリウム緩衝液（pH3.8）を加え、ここにカルボキ
シペプチダーゼＷ（生化学工業社製）溶液（2.0mg/ml）
0.01mlを加え、37度にて反応させた。反応開始後、0,5,
20時間後に0.10mlを採取して0.1Mジイソプロピルフルオ
ロリン酸（DFP）0.01mlを加えて反応を停止し、ここに2
0mM リン酸ナトリウム溶液0.29mlを加えることによりp
Hを整えた。
得られた反応液をセントリコン10（商品名；アミコン
社製）にて限外濾過し高分子画分（＞分子量10,000）と
低分子画分（＜分子量10.000）に分画した。それぞれの
反応時間において得られた高分子画分を陰イオン交換ク
ロマトグラフィー（Mono Q,PPLCシステム）にて分析し
た結果、反応開始前にはピークＩ（未反応のSAK−11）
のみが認められるが、反応５時間後にはピークＩは減少
し代わりにそれより後のピークIIと更に後のピークIII
が検出された。更に、反応20時間を経過するとピークI,
IIはほとんど認められず大部分がピークIIIとなった。
社製）にて限外濾過し高分子画分（＞分子量10,000）と
低分子画分（＜分子量10.000）に分画した。それぞれの
反応時間において得られた高分子画分を陰イオン交換ク
ロマトグラフィー（Mono Q,PPLCシステム）にて分析し
た結果、反応開始前にはピークＩ（未反応のSAK−11）
のみが認められるが、反応５時間後にはピークＩは減少
し代わりにそれより後のピークIIと更に後のピークIII
が検出された。更に、反応20時間を経過するとピークI,
IIはほとんど認められず大部分がピークIIIとなった。
一般に陰イオン交換クロマトグラフィーでは等電点の
高い蛋白質から順に溶出される傾向にあること、及びSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、ピークI,II,II
Iの分子量はほとんど変わらなかったことから、ピークI
I,IIIはそれぞれピークＩから塩基性アミノ酸を１個或
いは２個失った蛋白質と推定される。また、低分子画分
中の遊離アミノ酸を分析した結果、反応５時間でリジン
（Lys）のみが出現し20時間ではそれよりも更に増加し
ていた。
高い蛋白質から順に溶出される傾向にあること、及びSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、ピークI,II,II
Iの分子量はほとんど変わらなかったことから、ピークI
I,IIIはそれぞれピークＩから塩基性アミノ酸を１個或
いは２個失った蛋白質と推定される。また、低分子画分
中の遊離アミノ酸を分析した結果、反応５時間でリジン
（Lys）のみが出現し20時間ではそれよりも更に増加し
ていた。
以上の結果からSAK−11のＣ末端２アミノ酸の配列はL
ys−Lysと結論され、SAKのDNA配列から予想される通
り、Ｎ末端の10アミノ酸からなるペプチドを切除したア
ミノ酸配列であり、他のアミノ酸修飾がないこと及び他
のアミノ酸が欠失していないことが確認された。尚、後
述の配列表の配列番号２にSAK−11の全アミノ酸配列を
示す。
ys−Lysと結論され、SAKのDNA配列から予想される通
り、Ｎ末端の10アミノ酸からなるペプチドを切除したア
ミノ酸配列であり、他のアミノ酸修飾がないこと及び他
のアミノ酸が欠失していないことが確認された。尚、後
述の配列表の配列番号２にSAK−11の全アミノ酸配列を
示す。
5.SAK−11の血栓溶解試験（ウサギ血栓モデル） SAK−11の血栓溶解作用の薬効を評価する目的で、ウ
サギ頚静脈血栓モデルを用いて検討を行った。
サギ頚静脈血栓モデルを用いて検討を行った。
使用した実験動物は、ニュージーランド（New Zealan
d）白色ウサギ（Kbl:NZW）の雄性で、体重が2.8Kg以上
になったものを用いて、各群６羽（但し、対象群のみ11
羽）で実験を行った。また、各動物に投与したサンプル
は、最終濃度で、ツイーン（tween）80を0.003％濃度、
リン酸緩衝液を3mM濃度含む生理食塩水溶液として、SAK
−11を投与量として0.15〜2.1mg/kg含むように調製し
た。
d）白色ウサギ（Kbl:NZW）の雄性で、体重が2.8Kg以上
になったものを用いて、各群６羽（但し、対象群のみ11
羽）で実験を行った。また、各動物に投与したサンプル
は、最終濃度で、ツイーン（tween）80を0.003％濃度、
リン酸緩衝液を3mM濃度含む生理食塩水溶液として、SAK
−11を投与量として0.15〜2.1mg/kg含むように調製し
た。
血栓の形成は、次のようにして行った。先ず、トロン
ビン溶液（3U/mlの25mM CaCl2溶液）を満たした1mlシ
リンジを留置針に接続して血栓作製用管内を２回洗浄し
た。続いて大腿静脈に設置したカテーテルから1mlシリ
ンジに新鮮血液を採取し、速やかに留置針より約0.25ml
の新鮮血液を血栓作製用血管内に注入し、シリンジを留
置針に装着したまま30分間静置する。30分経過後、顔面
静脈よりシリンジ及び留置針を抜き取って結紮し、血栓
作製用血管の両端に設置したクレンメを取り除き、血流
を再開させウサギ頚静脈血栓モデルの作製を終了した。
術後は、乾燥防止のため生理食塩水を含ませたカット綿
を切開部に当てた。
ビン溶液（3U/mlの25mM CaCl2溶液）を満たした1mlシ
リンジを留置針に接続して血栓作製用管内を２回洗浄し
た。続いて大腿静脈に設置したカテーテルから1mlシリ
ンジに新鮮血液を採取し、速やかに留置針より約0.25ml
の新鮮血液を血栓作製用血管内に注入し、シリンジを留
置針に装着したまま30分間静置する。30分経過後、顔面
静脈よりシリンジ及び留置針を抜き取って結紮し、血栓
作製用血管の両端に設置したクレンメを取り除き、血流
を再開させウサギ頚静脈血栓モデルの作製を終了した。
術後は、乾燥防止のため生理食塩水を含ませたカット綿
を切開部に当てた。
サンプルの投与は、血栓作製流量直後より血栓作製部
に対して対側の耳介静脈よりシリンジポンプにて、各濃
度に調製したSAK−11及び対象としてのツイーン80とリ
ン酸緩衝液のみを含む生理食塩水を静注した。投与速度
は先に2mlの溶液を流速120ml/hで１分間かけてボーラス
（bolus）投与、続いて残り18mlを流速4.5ml/hで４時間
かける点滴静注とした。また作製した実験的血栓の成長
を阻止するため、ヘパリン溶液（10U/ml,ノボ社製）を
血栓作製部両側に0.5mlずつ及び血栓作製終了直後より3
0分毎に0.5ml大腿静脈に設置したカテーテルより静注し
た。
に対して対側の耳介静脈よりシリンジポンプにて、各濃
度に調製したSAK−11及び対象としてのツイーン80とリ
ン酸緩衝液のみを含む生理食塩水を静注した。投与速度
は先に2mlの溶液を流速120ml/hで１分間かけてボーラス
（bolus）投与、続いて残り18mlを流速4.5ml/hで４時間
かける点滴静注とした。また作製した実験的血栓の成長
を阻止するため、ヘパリン溶液（10U/ml,ノボ社製）を
血栓作製部両側に0.5mlずつ及び血栓作製終了直後より3
0分毎に0.5ml大腿静脈に設置したカテーテルより静注し
た。
血栓湿重量の測定として、血栓作製終了直後或いは６
時間後に、血栓作製部を中心に大きく頚静脈血管の両端
を結紮しこの区間の頚静脈を摘出した。摘出した頚静脈
血管に切開を加え、生理食塩水を張ったシャーレ中にて
血管内に存在する未凝固血液を洗い流して付着した余分
な水分を濾紙にて吸い取り、天秤にてこの時の重量Ａ
（血栓、血管及び毛糸の合計重量）を測定した。次に血
管をシャーレに戻し、内有する血栓を洗い流し水分を濾
紙にて吸い取った後の重量Ｂ（血管及び毛糸の合計重
量）を測定した。血栓湿重量は、重量Ａより重量Ｂを差
し引いた値より求めた。図２はSAK−11の投与量と血栓
湿重量の関係を示す線図であり、縦軸は血栓湿重量（m
g）、横軸はSAK投与量（mg/kg）を示している。使用し
たウサギの頭数はSAK 0mg投与が11羽、他の全ての群が
各々６羽である。各値は血栓湿重量の平均±標準偏差で
ある。
時間後に、血栓作製部を中心に大きく頚静脈血管の両端
を結紮しこの区間の頚静脈を摘出した。摘出した頚静脈
血管に切開を加え、生理食塩水を張ったシャーレ中にて
血管内に存在する未凝固血液を洗い流して付着した余分
な水分を濾紙にて吸い取り、天秤にてこの時の重量Ａ
（血栓、血管及び毛糸の合計重量）を測定した。次に血
管をシャーレに戻し、内有する血栓を洗い流し水分を濾
紙にて吸い取った後の重量Ｂ（血管及び毛糸の合計重
量）を測定した。血栓湿重量は、重量Ａより重量Ｂを差
し引いた値より求めた。図２はSAK−11の投与量と血栓
湿重量の関係を示す線図であり、縦軸は血栓湿重量（m
g）、横軸はSAK投与量（mg/kg）を示している。使用し
たウサギの頭数はSAK 0mg投与が11羽、他の全ての群が
各々６羽である。各値は血栓湿重量の平均±標準偏差で
ある。
上記の実験において、SAK−11投与前及び投与後2,4,6
時間経過した時点で、各群のウサギの採血を行い、血漿
中のフィブリノーゲンの測定を行った。
時間経過した時点で、各群のウサギの採血を行い、血漿
中のフィブリノーゲンの測定を行った。
先ず、採血した血漿を分離し、5M ε−amino−ｎ−c
apronic acidを血漿1mlに20μｌづつをイムノプレート
の４つのウエルに分注、うち２つには50μｌのベロナー
ル緩衝液を加えこれをリファレンスとした。残りの２つ
のウエルには0.5U/mlのトロンビンと12.5mMのCaCl2とを
含む12.5mMのベロナール緩衝液50μｌを加えた。これら
のウエルを37℃で10分間保温した後、それぞれのウエル
の405nmの吸光度を測定し、トロンビンとCaCl2を加えた
ウエルからリファレンスのウエルのODを引いた値をΔOD
とした。
apronic acidを血漿1mlに20μｌづつをイムノプレート
の４つのウエルに分注、うち２つには50μｌのベロナー
ル緩衝液を加えこれをリファレンスとした。残りの２つ
のウエルには0.5U/mlのトロンビンと12.5mMのCaCl2とを
含む12.5mMのベロナール緩衝液50μｌを加えた。これら
のウエルを37℃で10分間保温した後、それぞれのウエル
の405nmの吸光度を測定し、トロンビンとCaCl2を加えた
ウエルからリファレンスのウエルのODを引いた値をΔOD
とした。
血漿中フィブリノーゲンの変動の指標は、SAK投与後
0,2,4,6時間目に採取した血漿についてΔODを求め、０
時間の血漿のODを100％としたときの各時間のΔODをパ
ーセントで表した。得られた結果を次の表２に示す。表
４に示すように、得られた結果は平均値±標準偏差で示
し、SAK−11の作用容量の検定はDuncan's multiple ran
ge testを用いて行い、それぞれ危険率５％以下をもっ
て有意差ありとした。
0,2,4,6時間目に採取した血漿についてΔODを求め、０
時間の血漿のODを100％としたときの各時間のΔODをパ
ーセントで表した。得られた結果を次の表２に示す。表
４に示すように、得られた結果は平均値±標準偏差で示
し、SAK−11の作用容量の検定はDuncan's multiple ran
ge testを用いて行い、それぞれ危険率５％以下をもっ
て有意差ありとした。
以上のように、血栓溶解作用に関してはSAK−11の0.1
5mgと0.3mg/kgの投与量で血栓の湿重量は対象群に対し
て用量依存的に有意な減少を示した。特に、1.8mg/kg投
与群では血栓の湿重量が60.8±15.5mgとなり、血栓溶解
率は66.2％に達し血栓作製部位にわずかに血栓塊が認め
られる程であった。また、SAK−11の投与によるウサギ
血漿中のフィブリノーゲンに与える影響は、SAK−11の
投与量が0.6mg/kgまでは血漿中フィブリノーゲン量の減
少はほとんど認められなかったが、0.9mg/kg以上の投与
量でフィブリノーゲン量の減少が明らかに認められた。
5mgと0.3mg/kgの投与量で血栓の湿重量は対象群に対し
て用量依存的に有意な減少を示した。特に、1.8mg/kg投
与群では血栓の湿重量が60.8±15.5mgとなり、血栓溶解
率は66.2％に達し血栓作製部位にわずかに血栓塊が認め
られる程であった。また、SAK−11の投与によるウサギ
血漿中のフィブリノーゲンに与える影響は、SAK−11の
投与量が0.6mg/kgまでは血漿中フィブリノーゲン量の減
少はほとんど認められなかったが、0.9mg/kg以上の投与
量でフィブリノーゲン量の減少が明らかに認められた。
6.SAK−11の血栓溶解試験（閉鎖循環モデル） 閉鎖循環モデル（Matsuo,O.et al,Thromb.Res.,24,34
7−358（1985））を用いて、SAK−11につき、ヒト血漿
血栓溶解実験を行った。SAK−11の最終濃度は、循環す
る全血漿量に対して２μg/mlとなるように最初1/10量を
一度に注入し、残りの9/10をポンプを用いて４時間かけ
て注入していった。
7−358（1985））を用いて、SAK−11につき、ヒト血漿
血栓溶解実験を行った。SAK−11の最終濃度は、循環す
る全血漿量に対して２μg/mlとなるように最初1/10量を
一度に注入し、残りの9/10をポンプを用いて４時間かけ
て注入していった。
循環モデルの下部チャンバーより１時間毎に一定量づ
つ血漿を採取して、血栓より遊離した放射活性から血栓
溶解状態を評価し、同じ試料を用いてフィブリノーゲ
ン、プラスミノーゲン及びα２−プラスミノーゲンイン
ヒビターを定量した。尚、実験はＮ＝３で実施し、平均
値及び標準偏差を算出した。図３は血栓溶解反応の経時
変化を示す線図であり、縦軸は血漿中の放射活性、横軸
は時間を示している。図４は血漿中に残存するフィブリ
ノーゲンの経時変化を示す線図であり、図５は血漿中に
残存するプラスミノーゲンの経時変化を示す線図であ
り、図６は血漿中に残存するα２−プラスミンインヒビ
ターの経時変化を示す線図であり、縦軸は残存するフィ
ブリノーゲン，プラスミノーゲン，α２−プラスミンイ
ンヒビターの100分率を示している。
つ血漿を採取して、血栓より遊離した放射活性から血栓
溶解状態を評価し、同じ試料を用いてフィブリノーゲ
ン、プラスミノーゲン及びα２−プラスミノーゲンイン
ヒビターを定量した。尚、実験はＮ＝３で実施し、平均
値及び標準偏差を算出した。図３は血栓溶解反応の経時
変化を示す線図であり、縦軸は血漿中の放射活性、横軸
は時間を示している。図４は血漿中に残存するフィブリ
ノーゲンの経時変化を示す線図であり、図５は血漿中に
残存するプラスミノーゲンの経時変化を示す線図であ
り、図６は血漿中に残存するα２−プラスミンインヒビ
ターの経時変化を示す線図であり、縦軸は残存するフィ
ブリノーゲン，プラスミノーゲン，α２−プラスミンイ
ンヒビターの100分率を示している。
図３〜６に示す通り、血栓が経時的に効率よく溶解
し、血栓溶解剤の基本的性質が示された。同時に循環血
漿中のフィブリノーゲンの分解は経度であり、血栓溶解
特性（血栓分解パーセント／フィブリノーゲン分解パー
セント16時間値）は6.32と１より大きく、組織型プラス
ミノーゲンアクチベータ（tPA）的性質が示された。
し、血栓溶解剤の基本的性質が示された。同時に循環血
漿中のフィブリノーゲンの分解は経度であり、血栓溶解
特性（血栓分解パーセント／フィブリノーゲン分解パー
セント16時間値）は6.32と１より大きく、組織型プラス
ミノーゲンアクチベータ（tPA）的性質が示された。
7.合成基質法によるSAK−11とSAKとのフィブリン特異性
の比較 スタフィロキナーゼ（SAK）及びSAK−11はプラスミノ
ーゲンと複合体を形成して作用を発現するプラスミノー
ゲン・アクチベータで、高いフィブリン特異性を有する
ことからウロキナーゼやストレプトキナーゼとは異なる
作用機序を持つ優れた血栓溶解剤である。そこで、合成
発色基質を用いて、SAK−11のプラスミノーゲン・アク
チベータ活性がSAKの場合と同様にトロンビン添加即ち
フィブリン形成によって増強されることを確認すると共
に、その作用の強さについて比較検討した。
の比較 スタフィロキナーゼ（SAK）及びSAK−11はプラスミノ
ーゲンと複合体を形成して作用を発現するプラスミノー
ゲン・アクチベータで、高いフィブリン特異性を有する
ことからウロキナーゼやストレプトキナーゼとは異なる
作用機序を持つ優れた血栓溶解剤である。そこで、合成
発色基質を用いて、SAK−11のプラスミノーゲン・アク
チベータ活性がSAKの場合と同様にトロンビン添加即ち
フィブリン形成によって増強されることを確認すると共
に、その作用の強さについて比較検討した。
1mg/mlのSAK−11（或いはSAK）溶液（0.01％ツイーン
80を含む20mMリン酸緩衝液（pH6.5））を同緩衝液で希
釈して各種濃度のSAK−11のサンプル溶液を調製する96
−ウエル・イムノプレートを用意し、この溶液を各サン
プル濃度毎に８μｌずつ４つのウエルに分注した。８μ
ｌのSAK−11溶液が入った４つのウエルのうち、２つの
ウエルにはコントロールとしてイオン交換水を８μｌ、
残りの２つのウエルには20U/mlのヒト・トロンビン（シ
グマ社製）溶液を８μｌ添加した（トロンビンの終濃度
は2.5U/ml）。ミキサーで混和した後、全てのウエルに
ヒト血漿８μｌ、10mM Ｓ−2251（KABI社製）８μｌ及
び0.01％ツイーン80を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）128μｌの混液（合計144μｌ）添加して37℃で30分
間加温した。加温終了後、全ウエルに８％クエン酸を40
μｌづつ添加し、反応を停止して波長405nmにおける吸
光度を測定した。
80を含む20mMリン酸緩衝液（pH6.5））を同緩衝液で希
釈して各種濃度のSAK−11のサンプル溶液を調製する96
−ウエル・イムノプレートを用意し、この溶液を各サン
プル濃度毎に８μｌずつ４つのウエルに分注した。８μ
ｌのSAK−11溶液が入った４つのウエルのうち、２つの
ウエルにはコントロールとしてイオン交換水を８μｌ、
残りの２つのウエルには20U/mlのヒト・トロンビン（シ
グマ社製）溶液を８μｌ添加した（トロンビンの終濃度
は2.5U/ml）。ミキサーで混和した後、全てのウエルに
ヒト血漿８μｌ、10mM Ｓ−2251（KABI社製）８μｌ及
び0.01％ツイーン80を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）128μｌの混液（合計144μｌ）添加して37℃で30分
間加温した。加温終了後、全ウエルに８％クエン酸を40
μｌづつ添加し、反応を停止して波長405nmにおける吸
光度を測定した。
図７はSAK−11での各種濃度におけるプラスミノーゲ
ン活性化反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸は吸
光度変化（ΔA405）、横軸はSAK−11の濃度、○はコン
トロール、●は20U/mlのトロンビンを添加した場合を示
している。図８はSAKでの各種濃度におけるプラスミノ
ーゲン活性化反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸
は吸光度変化（ΔA405）、横軸はSAKの濃度、□はコン
トロール、■は20U/mlのトロンビンを添加した場合を示
している。図７及び図８に示す通り、SAK−11のプラス
ミノーゲン活性化活性もSAKと同様トロンビンによって
増強されることが確認された。更に、SAK−11はSAKと比
べ、活性が最大となる濃度が低く、また、SAKの数分の
１の濃度で同程度の活性を示すことなど比活性でも優れ
ていることが確認された。
ン活性化反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸は吸
光度変化（ΔA405）、横軸はSAK−11の濃度、○はコン
トロール、●は20U/mlのトロンビンを添加した場合を示
している。図８はSAKでの各種濃度におけるプラスミノ
ーゲン活性化反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸
は吸光度変化（ΔA405）、横軸はSAKの濃度、□はコン
トロール、■は20U/mlのトロンビンを添加した場合を示
している。図７及び図８に示す通り、SAK−11のプラス
ミノーゲン活性化活性もSAKと同様トロンビンによって
増強されることが確認された。更に、SAK−11はSAKと比
べ、活性が最大となる濃度が低く、また、SAKの数分の
１の濃度で同程度の活性を示すことなど比活性でも優れ
ていることが確認された。
8.SAK−11の安全性に関する試験（マウスでの抗原性試
験） SAK−11のIgE抗体産生能を指標とした抗原性につい
て、ストレプトキナーゼ（SK）及び卵白アルブミン（O
A）を対照としてBALB/c系マウスを用いて調べた。マウ
スの感作は、水酸化アルミニウム・ゲルをアジュバント
として10μg/マウスの用量で腹腔内に３週間隔で２回感
作するアジュバント感作群と静脈内投与により2mg/kgの
用量を週１回計３回感作する臨床適用経路感作群の２系
を設けた。IgE抗体産生能は、最終感作の１週後に採血
して得た感作血清のラットPCA反応により調べた。
験） SAK−11のIgE抗体産生能を指標とした抗原性につい
て、ストレプトキナーゼ（SK）及び卵白アルブミン（O
A）を対照としてBALB/c系マウスを用いて調べた。マウ
スの感作は、水酸化アルミニウム・ゲルをアジュバント
として10μg/マウスの用量で腹腔内に３週間隔で２回感
作するアジュバント感作群と静脈内投与により2mg/kgの
用量を週１回計３回感作する臨床適用経路感作群の２系
を設けた。IgE抗体産生能は、最終感作の１週後に採血
して得た感作血清のラットPCA反応により調べた。
SAK感作マウス血清のSAK誘発PCA反応は、アジュバン
ト感作群及び臨床適用経路感作群共に陰性であったが、
SK感作マウス血清では臨床適用経路感作群の１例がおよ
そ５倍のPCA価の陽性反応を示した。また、陽性対照で
あるOAのアジュバント感作群プール血清の平均PCA化は2
54倍を示し、良好な反応を示した。OAの静脈内投与によ
る感作群でも１例がPCA価10倍の陽性反応を示した。
ト感作群及び臨床適用経路感作群共に陰性であったが、
SK感作マウス血清では臨床適用経路感作群の１例がおよ
そ５倍のPCA価の陽性反応を示した。また、陽性対照で
あるOAのアジュバント感作群プール血清の平均PCA化は2
54倍を示し、良好な反応を示した。OAの静脈内投与によ
る感作群でも１例がPCA価10倍の陽性反応を示した。
以上の結果から、特異的IgE抗体産生能を指標としたS
AKの抗原性はSKに比較して弱いことが示された。また、
ラットに対する5mg/body（約10mg/kg）およびマウスに
対する2mg/kgのSAK静脈内投与後の一般毒性学的観察に
おいて投薬に起因すると考えられる特記すべき変化は認
められなかった。この結果から、SAKには臨床使用時の
障害が予想されるような重大な毒性はないことが示唆さ
れた。
AKの抗原性はSKに比較して弱いことが示された。また、
ラットに対する5mg/body（約10mg/kg）およびマウスに
対する2mg/kgのSAK静脈内投与後の一般毒性学的観察に
おいて投薬に起因すると考えられる特記すべき変化は認
められなかった。この結果から、SAKには臨床使用時の
障害が予想されるような重大な毒性はないことが示唆さ
れた。
9.血栓溶解剤（用法・用量） 本発明の血栓溶解剤は、水溶性のペプチドであり、注
射薬等の製剤として、各種血栓症、血管内凝固症、心筋
梗塞症、脳梗塞症、等の予防、治療剤として、使用され
る。
射薬等の製剤として、各種血栓症、血管内凝固症、心筋
梗塞症、脳梗塞症、等の予防、治療剤として、使用され
る。
本発明の血栓溶解剤の製剤化に当たっては、本薬剤の
ほかに、賦形剤、溶解補助剤、安定化剤、pH調製剤、浸
透圧調製剤、抗酸化剤等の各種添加剤は、本薬剤の効果
を損なわない範囲で添加することができる。
ほかに、賦形剤、溶解補助剤、安定化剤、pH調製剤、浸
透圧調製剤、抗酸化剤等の各種添加剤は、本薬剤の効果
を損なわない範囲で添加することができる。
また、本製剤は生理食塩水等溶液としてか、又は、用
時、注射用蒸留水や生理食塩水を加えて溶解して使用す
る凍結乾燥品の形態として供給される。
時、注射用蒸留水や生理食塩水を加えて溶解して使用す
る凍結乾燥品の形態として供給される。
本剤は、通常0.1mg〜500mg程度を１単位として、年
令、性別、体重、症状等に応じ、１回又は複数回にわた
り適宜、投与される。勿論、より緩やかな、もしくはよ
り強い効果を得る目的で、この適用範囲を越える量の投
与も可能である。また、投与方法は、製剤の形態に応じ
て、静脈内投与，動脈内投与，また患部への直接投与等
が行われる。
令、性別、体重、症状等に応じ、１回又は複数回にわた
り適宜、投与される。勿論、より緩やかな、もしくはよ
り強い効果を得る目的で、この適用範囲を越える量の投
与も可能である。また、投与方法は、製剤の形態に応じ
て、静脈内投与，動脈内投与，また患部への直接投与等
が行われる。
製剤の具体的な例を以下の表５及び表６に記載する。
表５は凍結乾燥製剤の例であり、表中の各成分を5ml
の注射用蒸留水に溶解し、無菌バイアルに充填し、凍結
乾燥することにより、注射用バイアルを製造した。ま
た、表６は注射アンプルの製剤例であり、成分を2mlの
注射用蒸留水に溶解し、無菌アンプルに充填し、注射用
アンプルを製造した。
の注射用蒸留水に溶解し、無菌バイアルに充填し、凍結
乾燥することにより、注射用バイアルを製造した。ま
た、表６は注射アンプルの製剤例であり、成分を2mlの
注射用蒸留水に溶解し、無菌アンプルに充填し、注射用
アンプルを製造した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 常一 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 松本 常男 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 宍戸 祐之 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 橋本 秀介 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 横倉 輝男 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 尾上 正治 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (72)発明者 左古 知行 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式 会社ヤクルト本社内 (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ，11（22）ｐ．7679−7693（1983) Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，149 ｐ．557−563（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/52 A61K 37/54 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列から構成されたペプチド
を有効成分とする血栓溶解剤。 - 【請求項２】スタフィロキナーゼのＮ末端の10アミノ酸
を切除したアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分と
する血栓溶解剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4502176A JP2895626B2 (ja) | 1990-12-17 | 1991-12-17 | 血栓溶解剤 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41106390 | 1990-12-17 | ||
| JP2-411063 | 1990-12-17 | ||
| JP4502176A JP2895626B2 (ja) | 1990-12-17 | 1991-12-17 | 血栓溶解剤 |
| PCT/JP1991/001722 WO1992011356A1 (fr) | 1990-12-17 | 1991-12-17 | Peptide thrombolytique, sa production et agent thrombolytique |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2895626B2 true JP2895626B2 (ja) | 1999-05-24 |
Family
ID=18520124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4502176A Expired - Lifetime JP2895626B2 (ja) | 1990-12-17 | 1991-12-17 | 血栓溶解剤 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5475089A (ja) |
| EP (1) | EP0563385B1 (ja) |
| JP (1) | JP2895626B2 (ja) |
| KR (1) | KR100221571B1 (ja) |
| AT (1) | ATE158613T1 (ja) |
| AU (1) | AU665935B2 (ja) |
| CA (1) | CA2098588C (ja) |
| DE (1) | DE69127757T2 (ja) |
| DK (1) | DK0563385T3 (ja) |
| ES (1) | ES2107525T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992011356A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE139570T1 (de) * | 1991-12-30 | 1996-07-15 | Medac Klinische Spezialpraep | Expression signalpeptid-freier staphylokinasen |
| US5951980A (en) * | 1995-01-06 | 1999-09-14 | Leuven Research & Development Vzw | Identification, production and use of new staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity |
| US6383483B1 (en) * | 1995-01-06 | 2002-05-07 | Désiré José Collen | Staphylokinase derivatives with cysteine substitutions |
| CN100342007C (zh) * | 2000-01-28 | 2007-10-10 | 复旦大学 | 一种新型重组葡激酶及其制备方法 |
| CN112794879B (zh) * | 2015-06-23 | 2022-09-02 | 首都医科大学 | Glu-Leu-Phe-Tyr-Val五肽的合成及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2707273B2 (ja) * | 1988-04-14 | 1998-01-28 | 株式会社ヤクルト本社 | 血栓溶解剤 |
| KR0135980B1 (ko) * | 1988-04-14 | 1998-04-25 | 구와하라 쥰 | 플라스미노겐 액티베이터 및 혈전용해제 |
-
1991
- 1991-12-17 ES ES92900924T patent/ES2107525T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 AT AT92900924T patent/ATE158613T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-17 US US08/075,545 patent/US5475089A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 AU AU90837/91A patent/AU665935B2/en not_active Expired
- 1991-12-17 DE DE69127757T patent/DE69127757T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 JP JP4502176A patent/JP2895626B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 EP EP92900924A patent/EP0563385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 DK DK92900924.9T patent/DK0563385T3/da active
- 1991-12-17 WO PCT/JP1991/001722 patent/WO1992011356A1/ja active IP Right Grant
- 1991-12-17 CA CA002098588A patent/CA2098588C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 KR KR1019930701826A patent/KR100221571B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４９ ｐ．５５７−５６３（１９８５） |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１（２２）ｐ．７６７９−７６９３（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0563385A4 (en) | 1994-07-06 |
| ATE158613T1 (de) | 1997-10-15 |
| WO1992011356A1 (fr) | 1992-07-09 |
| ES2107525T3 (es) | 1997-12-01 |
| DK0563385T3 (da) | 1998-05-04 |
| KR930703437A (ko) | 1993-11-30 |
| AU9083791A (en) | 1992-07-22 |
| DE69127757T2 (de) | 1998-03-12 |
| KR100221571B1 (ko) | 1999-10-01 |
| EP0563385B1 (en) | 1997-09-24 |
| CA2098588C (en) | 2003-08-19 |
| AU665935B2 (en) | 1996-01-25 |
| CA2098588A1 (en) | 1992-06-18 |
| EP0563385A1 (en) | 1993-10-06 |
| DE69127757D1 (de) | 1997-10-30 |
| US5475089A (en) | 1995-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Collen | Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent | |
| JP5025868B2 (ja) | 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法 | |
| Nagai et al. | Recombinant human microplasmin: production and potential therapeutic properties | |
| EP0875252B1 (en) | Activated protein C formulations | |
| JPH07503454A (ja) | プラズミンによる線維素溶解および線維素原溶解治療 | |
| JPH06503950A (ja) | 血栓症に作用する組換え薬剤 | |
| JPH0378375B2 (ja) | ||
| WO1996004004A1 (en) | Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular diseases | |
| JP2010184930A (ja) | 血栓溶解および抗凝固両方の機能を有する融合タンパク質、ならびにその使用 | |
| JPH0759517B2 (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子含有医薬組成物 | |
| TW201822783A (zh) | 一種預防和治療組織器官纖維化的方法 | |
| US4996050A (en) | Fibrinolytic activity enhancer | |
| JPH04505753A (ja) | 血小板活性化阻害ポリペプチドを製造する方法ならびにそれを用いた方法，組合せおよび組成物 | |
| JP7214245B2 (ja) | 骨関節炎を予防または治療するための方法および薬剤 | |
| Ueshima et al. | Development of new fibrinolytic agents | |
| JP2895626B2 (ja) | 血栓溶解剤 | |
| RU2143490C1 (ru) | Бифункциональный вариант урокиназы, плазмида, содержащая синтетический структурный ген, кодирующий бифункциональную урокиназу, плазмида (варианты), способ получения плазмиды, способ получения бифункционального варианта урокиназы, тромболитическое средство | |
| EP0304311A1 (en) | Complex of polyethylene glycol and tissue plasminogen activator | |
| JPH06217773A (ja) | フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体とその製法 | |
| EP0942996B1 (en) | Thrombolytic agents with antithrombotic activity | |
| JP2001518933A (ja) | 血管障害の治療方法 | |
| EP0712934A2 (de) | Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften | |
| KR20220143913A (ko) | 혈압 이상 병증의 예방 및 치료 방법과 약물 | |
| JPH0369332B2 (ja) | ||
| JPH0327286A (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体 |