WO1992011356A1

WO1992011356A1 - Peptide thrombolytique, sa production et agent thrombolytique

Info

Publication number: WO1992011356A1
Application number: PCT/JP1991/001722
Authority: WO
Inventors: Osamu Matsuo; Masashi Sakai; Kisaku Shimura; Hiroshi Sansawa; Tsunekazu Watanabe; Tsumeo Matsumoto; Yoshiyuki Shishido; Shusuke Hashimoto; Teruo Yokokura; Masaharu Onoue; Tomoyuki Sako
Original assignee: Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
Priority date: 1990-12-17
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 1992-07-09
Also published as: KR930703437A; AU9083791A; DE69127757T2; EP0563385B1; JP2895626B2; DK0563385T3; EP0563385A1; CA2098588A1; EP0563385A4; AU665935B2; KR100221571B1; ES2107525T3; ATE158613T1; DE69127757D1; CA2098588C; US5475089A

Description

明細書

血栓溶解作用を有するベプチド，その製造方法及び血栓溶解剤

[ 技術分野 ]

本発明は、例えば心筋梗塞、脳梗塞、動脈硬化などの治療に有効であるスタフィ口キナーゼから、その活性に影響を与えない部分を削除した血栓溶解作用を有するペプチド，その製造方法及び血栓溶解剤に関するものである。

[ 背景技術 ]

スタフイロキナーゼ（以下、 S A Kと記す）はそれ自身にプロテアーゼ活性ほないが、ブラスミノゲン或いはブラスミンとの複合体がブラスミノゲンを活性化する点でストレブトキナーゼ（以下、 S Kと記す）に類似のブラスミノゲンァクチベータである。ところで、 S A Kは分子量が約 15 , 000で S Kの 1/3以下の大きさであり、また、遺伝子がクローニングされ D N A配列が明らかにされているため、作用機構を分子レベルで解析するのに好適な材料と考えられている。

本出願人と同一の出願人は、 S A K遺伝子を組み込んだ大腸菌を培養し、菌体に蓄積した S A Kを採取する方法を提案した（特開昭 5 8— 6 7 1 8 1号）。この方法で得られる S A Kの大部分は、後述する配列表の配列番号 1に記載のように 1 3 6個のアミノ酸からなるぺブチドであった（Sako , T . , Eur . J . Biochera . , 149 , 557-563 (1985) ) ₀

更に、 S A Kの作用機構は S Kと相違することが判明し、特に S Kにはない特徴として、フイブリン存在下での活性の増強（所謂、フィプリン特異性）を有していることが確認され、良好な血栓溶解剤として機能することが確認された（特願昭 6 3— 9 0 2 5 2号）。また、 S A Kの反応の遅延性を改良するため、予め S A Kとブラスミノ一ゲン（又は、フィブリン）と複合体を形成させた血栓溶解剤も提案されている（特願平 1 - 1 3 0 4 4号）。

前述の方法で得られた 1 3 6個のアミノ酸からなるペプチドである S A Kは、従来から用いられてきた他の血栓溶解剤に比べ分子量が小さく、血栓内への浸透性の点からも有利であり、容易に大量生産が可能となり、価格的にも他の血栓溶解剤と比べて有利である等の優れた特性を有している。

前述のように、 1 3 6個のアミノ酸からなるペプチドである S A Kは優れた特性を有しているが、分子量は小さいほど抗原性や投与量等の問題が生じ難い。

[ 発明の開示 ]

本発明ほ、 1 3 6個のアミノ酸からなるペプチドである S A Kを改良して、更に抗原性の問題がより少なく、投与量も更に少なくてすむ血栓溶解作用を有するぺブチド，その製造方法及び血栓溶解剤を得ることを目的とする。

前記目的を達成することに成功した本発明による血栓溶解作用を有するべプチド及び血栓溶解剤ほ、少なくとも後述する配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、該ペプチドを有成分としたものである。

詳細にほ、 S A Kの活性に影響しないァミノ酸又はべプチドを切除したベプチド及びこれを有効成分とするものであり、 S A Kを卜リブシン型プロテアーゼで処理して得られる S A Kの N末端の 1 0アミノ酸を切除したペプチド及びこれを有効成分とするものである。

また、ペプチドの製造方法としては、卜リブシン型プロテア一ゼによって、スタフィ口キナーゼの活性に影響しないアミノ酸又はべプチドを切除する方法であり、具体的には、前記トリブシン型プロテア一ゼとして、ブラスミン又はブラスミノゲンを用いて、スタフイロキナーゼの N末端の 1 0アミノ酸を切除する方法である。 .

また、担体にトリブシン型プロテア一ゼを固定し、該固定化トリブシン型プロテア一ゼを用いて、スタフィ口キナーゼの¾ ^性に影響しないアミノ酸又はべプチドを切除する方法を開示する。

更に、本発明でほ、上記のペプチドが、 S A Kと比較して更に優れた血栓溶解作用を有することを見出したものである。

本発明では、 1 3 6個のアミノ酸からなるペプチドである S A Kに様々のプロテァ一ゼを用いて S A Kの活性に影響しないァミノ酸又はべプチドを切除することを検討した。その結果、 S A Kの N末端の 1 0アミノ酸からなるペプチド（具体的には、 S er Ser Ser Phe Asp Lys G ly し ys Tyr Lys ) を削除したもの（以下、 S A K— 1 1 と記す）は、フイブリン溶解活性、ブラスミノゲン活性化能、フィブリン特異性等の諸性質は 1 3 6個のアミノ酸（ペプチド）からなる S A K の諸性質と同等であり、更に幾つかの点でより優れていることが判明した。すなわち、 S A Kの N末端の 1 0アミノ酸からなるペプチドを切除した S A K— 1 1 は、 S A Kと比べ、抗原性の問題が少なく、投与量も少なくてすむ血栓溶解剤である。

また、 S A K— l 1は S A Kにプロテア一ゼ、具体的には卜リブシン型ブロテァーゼを作用させることによって、生成することが判明し、特にブラスミノゲンを作用させることにより夾雑物を生成することなく S A K— 1 1が生じ、それ以外の分解は起きないことが判明した。尚、ブラスミノゲンの代わりにその活性体であるブラスミンを用いることも可能である。その他、使用可能な卜リブシン型プロテアーゼとしては、卜リブシン，リジルエンドべブチダーゼ，ェンテロキナーゼ，トロンビン，血液凝固第 Vi la因子，血液凝固第 IXa 因子，血液凝固第 Xa因子，血液凝固第 XI a 因子，血液凝固第 XI la因子. カブトガニ凝固酵素. ゥロキナーゼ，ブロウ口キナーゼ，組織ブラスミノーゲンァクチベータ，高分子キニノ一ゲン，低分子キニノ一ゲン，カテブシン B , 血漿カリクレイン，脾カリクレイン等が代表的なものであり、また、それらのチモーゲン（酵素前駆体）であって、本反応系で活性を発現するものも含まれる。

また、前述のように S A K— 1 1は、各種トリブシン型プロテア一ゼ（塩基性アミノ酸の C端側を切断する）によって S A K— 1 1の製造が可能であるが、場合によっては S A K— 1 1以外の夾雑物も生成するため、その後の分離精製処理が必要になる。

なお、固定化酵素を利用することにより、精製操作（酵素の除去など）の簡略化が及び酵素の繰り返し利用が可能となる。

以上のように、 S A Kの N末端 1 0アミノ酸からなるペプチドを除いた S A K 一 1 1は、抗原性の低下、安定性の向上、代謝試験の簡便化などの様々な特性がある。

以上のように、术発明においては、 1 3 6個のアミノ酸からなるペプチドである S A Kに様々のプロテア一ゼを用いて S A Kの活性に影響しないアミノ酸を切除することを検討し、抗原性の低下、安定性の向上、代謝試験の簡便化などの様々な特性を有する後述の配列番号 2に記載の血栓溶解作用を有するベプチド及び血栓溶解剤を得た。

具体的にほ、 S A Kの N末端の 1 0アミノ酸からなるペプチドを切除して寻られたフイブリン溶解反応、ブラスミノゲン活性ィ匕反応、フイブリン特異性等の活性は 1 3 6個のアミノ酸（ペプチド）からなる本来の S A Κに比べて活性面でも優れた血栓溶解作用を有するベプチド S A K— 1 1及び血栓溶解剤を得た。また、 S A K— l 1はプロテア一ゼによって、具体的にはトリブシン型ブロテァ一ゼによって、生成することが判明し、特にブラスミノゲン又はブラスミンを作用させることにより夾雑物を生成することなく S A K - 1 1が生じ、非常に有利な製造方法である。

以上のように、 5 の末端1 0アミノ酸からなるペプチドを除いた血栓溶解剤 S A K— 1 1は、抗原性の低下、安定性の向上、代謝試験の簡便化などの様々な特性がある。

[図面の簡単な説明]

図 1は S A K— 1 1の分取した全分画べプチドの配置を示すぺプチドマッブである。

図 2は S A K— 1 1の投与量と血栓湿重量の関係を示す線図である。

図 3は血柱溶解反応の経時変化を示す線図である。

図 4は血漿中に残存するフィブリノ一ゲンの経時変化を示す線図である。

図 5は血漿中に残存するブラスミノーゲンの経時変化を示す線図である。

図 6は血漿中に残存する α ₂ —ブラスミンインヒビターの経時変ィ匕を示す線図である。

図 7は S A Κ— 1 1での各種濃度におけるブラスミノ一ゲン活性化反応の強度を示す線図である。

図 8は S A Kでの各種濃度におけるブラスミノ一ゲン活性ィ匕反応の強度を示す線図である。 [発明を実施するための最良の形態]

1. 種々の酵素との反応

種々のプロテアーゼと SA Kを反応させて、反応生成物を調べた。次の表 1にその結果を示す。

表 1に示すように、ブラスミノゲン，ブラスミン，トリブシン. リジルエンドベプチダ一ゼのトリブシン型プロテアーゼは 1 3 6個のアミノ酸（ペプチド）からなる S A Kの N末端 1 0アミノ酸が削除された S A K— 1 1が生成した。特に、ブラスミノゲン，ブラスミンでは夾雑物がなく、良好に SAK— 1 1が生成することが示されている。表 1

2. ヒ卜—ブラスミノゲンとの反応による方法

1 0 mMリン酸ナトリゥム緩衝液（ P H 8.0) に溶解した S A K溶液（ 4.0m g/m 1 ) 1.0m lに対して、ヒトーブラスミノゲン溶液を 0.01m g (0.133 C U) 相当を添加し、 3 7でで 3時間インキュベートした。反応物を S D Sポリアクリルァミド電気泳動にて解析した結果、全てが S A K— 1 1に変換されていることがわかった。

更に、この反応生成物を S-セファロース（S-Sepharose ) カラムを用いた陽ィオン交換クロマトグラフィーにて精製して得られた S A K— 1 1は、後述するように、 N末端ァミノ酸配列から確かに S A K— 1 1であることが確認された。また、後述するように、モル換算で 1 3 6個のアミノ酸からなる S A Kと同等かそれ以上の活性を示した。

3. 固定化ブラスミノゲンの利用

市販の BrCN—ァクチべ一ティド♦セファロ一ス 4 B (BrCN- activated Sepharo se 4B ) に対して、ヒトーブラスミノゲンをカップリングさせ、固定化ブラスミノゲン（Plasminogen-Sepharose 4B)を作製した。 1 m 1のブラスチック注射筒に固定化ブラスミノゲンを 0.2m l充塡し、緩衝液 A 0.5m 1で 2回洗浄した後、 SAK(0.2mg/0.05ml) 0.05m lを添加し、緩衝液 A 0.5m lで 4回洗浄した後、緩衝液 B 0.5m 1で溶出した。

緩衝液 A ： 0.01Mリン酸緩衝液 (Phosphate buffer) (p H7.0)

緩衝液 B ： 0.1Mクェン酸緩衝液 (Citrate buffer (p H4.25)+0.4M NaCl) その結果、 S A Kはカラム吸着画分に回収され、かつ SAK— 1 1に変換されていることが電気泳動により確認された。

4. S ΑΚ— 1 1のアミノ酸配列の決定

ベプチドマツピングの手法を用いて、詳細に SAK— 1 1のァミノ酸配列の決定を行った。使用したプロテアーゼはリジルエンドべブチダーゼ（ァクロモバクタープロテアーゼ I ：和光純薬工業（株）社製）及び V 8プロテアーゼ（宝酒造 (株）社製）であり、リジルェンドべブチダーゼは 1 00 μ gZm 1、 V 8プロテアーゼは 200 s/m 1となるように水で希釈したものを用いた。

酵素反応はリジルェンドべプチダーゼ処理の場合、 20 m Mトリス一塩酸 ( p H 9.5) を含む 20 1の反応液に 5 gの SAK— 1 1と 0.1^ gの酵素を加え、 37 で 6時間インキュベートした。また、 V8プロテア一ゼの場合、 50 mM炭酸水素アンモニゥム（ p H 7.9)、 1 mM E D T Aを含む 20 ^ 1の反応液に 5 μ gの S AK— 1 1と 0.67 μ gの酵素を加え、 37tで 24時間ィンキュべ一卜した。

酵素反応終了後、それぞれの反応液中のベプチド♦フラグメントを H P L C法を用いて分離した。 H P L Cシステムは、島津製作所（株）製 L C— 6 Aシステム（LC一 6A 2台、 S PD— 6AV、 C— R3A、 S CL— 6A) にエルマネ土製 ERC— 3322デガッサーとバイオラッドネ土製 AS— 1 00Tオートサンブラーを組合わせたものを使用し、溶出液の 21 0 nmでの吸光度をフルスケ一ル 0.02 で測定した。分離に使用したカラムは日本ウォータースネ土製 BOND AS PHERE C 1 8カラム（粒径 5 、ポアサイズ 300 A、 3.9x150 m m) である。

H P L Cによる分離は、酵素反応後の試料 20 1 (5 U g SAK— 1 1を含む）に 280 1の A溶媒（ 0.1%TFAを含む水）を加えて総量を 300 1とし、このうちの 280 1をアブライし、 A溶媒と B溶媒（ 0.1%TFAを含むァセトニトリル）との 2溶媒による直線濃度勾配で行い、流量を 1 m 1 /m i η·とした。濃度勾配条件は以下の表 2に示す条件のうち何れかを用いた。

表 2 グラディエント一 1 グラディェン卜一 2 グラディエント一 3

0 min 5%B 0 min 3%B 0 min 2%B

5 min 5%B 5 min 3%B 5 min 2%B

55 min 50%B 55 min 5%B 55 min 45%B

60 min 70%B 60 min 70%B 60 min 70%B

65 min 70%B 65 min 70%B 65 min 70%B

65.01 rain 5%B 65 01 min 3%B 65 01 min 2%B

80.01 rain 5%B 79 min 3¾B 79 min 2%B

80.02 min STOP 79 01 min STOP 79 01 min STOP リジルェンドべプチダーゼ処理による反応液からは、 H P L C分析により L一 1から L一 1 3のビークが分離された。また、 V 8プロテアーゼ処理による反応液からほ V— 1から V— 1 5のビークが分離された。得られた各分画べプチドについて、アブライドバイオシステムネ土 473 Aプロテインシークェンサ一を用いてァミノ酸配列の決定を行つた。

各分画中のベプチドのァミノ酸配列の結果を次の表 3に示す。更に、図 1は S A K- 1 1の分取した全分画ペプチドの配置を示すペプチドマップであり、図 1 に示す通り、 S AK- 1 1の C末端アミノ酸残基を除く全アミノ酸配列を決定した。表 3 番号位置アミノ酸配列

L-1 99-102 Glu Glu Thr Lys

L-2 97-102 Lys Lys Glu Glu Thr Lys

L-3 51-57 Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys

L-4

L-5 131-135 Val Val lie Glu Lys

L-6 103-109 Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys

I L _7 / o / ϋ¾ iu V3丄 inr l r ly sp Lys

L-8 122-130 Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie Thr Lys

L-9 75-86 Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys

L-10 110-121 Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His lie Lys

L-11 36-50 Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro lie Lys

L-12 11-35 Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu

Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys

L-13 60-74 lie Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys

V-1 94-99 Lys Asn Lys Lys Lys Glu

V-2 59-61 Lys lie Glu

V-3 70-75 Ala Thr Ala Tyr Lys Glu

V-4 89-99 Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu

V-5 62-65 Tyr Tyr Val Glu

V-6 81-88 Leu Asp Pro Ser Ala Lys lie Glu

V-7 76-80 Phe Arg Val Val Glu

V-8 101-108 Thr Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu

V-9 39- 4 & Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu

109-115 Lys Gly Phe Val Val Pro Asp

V - 10 66-69 Trp Ala Leu Asp

67-69 Ala Leu Asp

V-11 47-58 phe Pro lie Lys Pro Gty Thr Thr Leu Thr Lys Glu

V- 12 109-118 Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu

V-13 39-58 Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro He Lys Pro Gly Thr

Thr Leu Thr Lys Glu

V- 14 11-38 .ys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe lu Pro Thr Gly Pro Τ>τ Leu

Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu

V-15 119-134 iis lie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie Thr Lys Val Val lie

Glu 表 3及び図 1に示すように、 SAK— 1 1の Ly s— 1 1から、 Ly s— 1 3 5までの配列が、遺伝子配列から予想されたァミノ酸配列に完全に一致することを石萑 ISした。

更に、 SAK— l 1のカルボキシル末端（C末端）の構造を解明する目的で、以下の実験を行った。即ち、 S A K— 1 1溶液（ 2.4m gZm 1 ) 0.15m 1に対して同量の 0.1M クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 3.8) を加え、ここにカルボキシベプチダーゼ W (生化学工業社製）溶液（ 2.0mgZm 1 ) 0.01m 1を加え、 37 にて反応させた。反応開始後、 0, 5, 20時間後に 0.10m 1を採取して 0.1Mジイソプロビルフル才ロリン酸（D F P) 0.01m 1を加えて反応を停止し、ここに 20mM リン酸ナトリウム溶液 0.29m 1を加えることにより pHを整えた。

得られた反応液をセントリコン 1 0 (商品名；アミコンネ土製）にて限外濾過し高分子画分（>分子量 10,000) と低分子画分（<分子量 10, 000) に分画した。それぞれの反応時間において得られた高分子画分を陰イオン交換クロマトグラフィ一（Mo n o Q, P P LCシステム）にて分析した結果、反応開始前にはビ一ク I (未反応の SAK— 1 1 ) のみが認められるが、反応 5時間後にはビーク I は減少し代わりにそれより後のピーク IIと更に後のビーク III が検出された。更に、反応 20時間を経過するとビーク I， IIはほとんど認められず大部分がビ一ク III となった。

一般に陰ィォン交換ク口マトグラフィ一では等電点の高い蛋白質から順に溶出される傾向にあること、及び S D S—ポリァクリルアミド電気泳動の結果、ビーク I , II， III の分子量はほとんど変わらなかったことから、ピーク II, III はそれぞれビーク Iから塩基性ァミノ酸を 1個或いは 2個失つた蛋白質と推定される。また、低分子画分中の遊離アミノ酸を分析した結果、反応 5時間でリジン（L ys) のみが出現し 20時間ではそれよりも更に増加していた。

以上の結果から SA K - 1 1の C末端 2ァミノ酸の配列は Lys-Lys と結論され、 S AKの DNA配列から予想される通り、 N末端の 1 0アミノ酸からなるぺプチドを切除したアミノ酸配列であり、他のアミノ酸修飾がないこと及び他のァミノ酸が欠失していないことが確認された。尚、後述の配列表の配列番号 2に S AK- 1 1の全ァミノ酸配列を示す。

5. S AK- 1 1の血辁溶解試験（ゥサギ血栓モデル）

S AK- 1 1の血栓溶解作用の薬効を評価する目的で、ゥサギ頸静脈血铨モデルを用いて検討を行った。

使用した実験動物は、ニュージーランド（New Zealand) 白色ゥサギ（Kbl:NZW ) の雄性で、体重が 2.8kg以上になったものを用いて、各群 6羽（但し、対象群のみ 1 1羽）で実験を行った。また、各動物に投与したサンブルは、最終濃度で、ツイーン（tween) 80を 0.003%濃度、リン酸緩衝液を 3 m M濃度舍む生理食塩水溶液として、 SAK— l 1を投与量として 0.15〜2.1 mg/kg含むように調製した。

血栓の形成ほ、次のようにして行つた。先ず、トロンビン溶液（ 3 UZm 1の 25mM C a C 12 溶液) を満たした 1 m 1シリンジを留置針に接続して血栓作製用血管内を 2回洗淨した。続いて大腿静脈に設置したカテーテルから 1 m 1 シリンジに新鮮血液を採取し、速やかに留置針より約 0.25 m 1の新鮮血液を血栓作製用血管内に注入し、シリンジを留置針に装着したまま 30分間静置する。 3 0分経過後、顔面静脈よりシリンジ及び留置針を抜き取って結紮し、血栓作製用血管の両端に設置したクレンメを取り除き、血流を再開させゥサギ頸静脈血栓モデルの作製を終了した。術後は、乾燥防止のため生理食塩水を含ませたカツト綿を切開部に当てた。

サンブルの投与は、血栓作製流量直後より血栓作製部に対して対側の耳介静脈よりシリンジポンプにて、各濃度に調製した S A K- 1 1及び対象としてのツイーン 80とリン酸緩衝液のみを含む生理食塩水を静注した。投与速度は先に 2 m 1の溶液を流速 120m 1 Zhで 1分間かけてボーラス（bolus) 投与、続いて残り 1 8m lを流速 4.5 m 1 / hで 4時間かける点滴静注とした。また作製した実験的血栓の成長を阻止するため、へパリン溶液（1 0 Uノ m l , ノボ社製）を血栓作製部両側に 0.5m 1ずつ及び血栓作製終了直後より 30分毎に 0. 5 m 1大腿静脈に設置したカテーテルより静注した。

血栓湿重量の測定として、血栓作製終了直後或いは 6時間後に、血栓作製部を中心に大きく頸静脈血管の両端を結紮しこの区間の頸静脈を摘出した。摘出した頸静脈血管に切開を加え、生理食塩水を張つたシャーレ中にて血管内に存在する未凝固血液を洗い流して付着した余分な水分を濾紙にて吸い取り、天种にてこの時の重量 A (血栓、血管及び毛糸の合計重量）を測定した。次に血管をシャーレに戻し、内有する血栓を洗い流し水分を濾紙にて吸い取った後の重量 B (血管及び毛糸の合計重量）を測定した。血栓湿重量は、重量 Aより重量 Bを差し引いた値より求めた。図 2ほ S A K - 1 1の投与量と血栓湿重量の関係を示す線図であり、縦軸は血栓湿重量（mg) 、横軸は S A K投与量 (mg/k g) を示している。使用したゥサギの頭数ほ SA K O mg投与が 1 1羽、他の全ての群が各々 6羽である。各値は血栓湿重量の平均土標準偏差である。

上記の実験において、 S AK— 1 1投与前及び投与後 2, 4, 6時間経過した時点で、各群のゥサギから採血を行い、血漿中のフィブリノ一ゲンの測定を行つた。

先す、採血した血獎を分離し、 5M e-amino-n-capronic acidを血獎 l m l に 20 μ 1づっをィムノブレ一卜の 4つのゥエルに分注、うち 2つには 50 μ 1 のべロナール緩衝液を加えこれをリフアレンスとした。残りの 2つのゥエルには 0. 5 UZm 1のトロンビンと 12.5mMの C a C 1₂ とを舍む 12.5m Mのべロナール緩衝液 50 ^ 1を加えた。これらのゥエルを 3 7 :で 1 0分間保温した後、それぞれのゥエルの 40 5 n mの吸光度を測定し、トロンビンと C a C l ₂ を加えたゥエルからリファレンスのゥエルの 0 Dを引いた値を厶 0 Dとした。

血漿中フイブリノ一ゲンの変動の指標は、 1：投与後0, 2, 4, 6時間目に採取した血漿について厶 0 Dを求め、 0時間の血漿の O Dを 1 0 0%としたときの各時間の厶0 Dをパーセントで表した。得られた結果を次の表 2に示す。表 4に示すように、得られた結果は平均値土標準偏差で示し、 SAK— 1 1の作用容量の検定は Duncan's multiple range testを用いて行い、それぞれ危険率 5% 以下をもって有意差ありとした。

以上のように、血铨溶解作用に関しては S A K— 1 1の 0.15msと 0.3m k gの投与量で血栓の湿重量は対象群に対して用量依存的に有意な減少を示した。特に、 1.8mgZk g投与群では血栓の湿重量が 60.8±15.5m gとなり、血栓溶解率は 6 ε .2 %に逢し血栓作製部位にわずかに血栓塊が認められる程であつた。また、 S A K— 1 1の投与によるゥサギ血漿中のフイブリノ一ゲンに与える影響ほ、 S A Κ— 1 1の投与量が 0.6m g/k gまでは血漿中フィブリノ一ゲン量の減少はほとんど認められなかったが、 0.9m g k g以上の投与量でフィブリノーゲン量の減少が明らかに認められた。

表 4 投与量 S A K投与後の時間 (h) mg/kg 2 4 6

0.15 107 は10 • 6 107.2±11.6 118 .5±14.6

0.3 88. 8土 S .4 89.8土 7.0 93 .5土 9.7

0.6 86. 7土 3 .4 87.7± 2.5 103 .5± 7.1

0.9 78. 8土 4 .3 ' 77.9土 7.9 88 .9土 6.8

1.2 64. 6±19 .4 68.9土 7.4 70 .8±11.0

1.5 60. 0±28 .0 69.1土 5.0 82 .0±22.8

1.8 73. 2土 1 .9 66.4土 1.9 82 • 0土 9.9

2.1 72. 1土 8 .3 67.1±12.5 85 ,5±26.3

6. SA - 1 1の血栓溶解試験（閉鎖循環モデル）

閉鎖循環モデル (Matsuo.O. et al, Thronib. Res. ,24, 347-358 (1985)) を用いて、 S A K— 1 1にっき、ヒト血漿血栓溶解実験を行つた。 S A Κ— 1 1の最終濃度は、循環する全血漿量に対して 2 sZm 1となるように最初 1/10量を一度に注入し、残りの 9 / 10をポンプを用いて 4時間かけて注入していった。

循環モデルの下部チャンバ一より 1時間毎に一定量づっ血漿を採取して、血栓より遊離した放射活性から血栓溶解状態を評価し、同じ試料を用いてフィプリノ一ゲン、ブラスミノーゲン及び cc₂ —ブラスミノーゲンインヒビターを定量した。尚、実験は N- 3で実施し、平均値及び標準偏差を算出した。図 3ほ血栓溶解反応の経時変化を示す線図であり、縦軸は血漿中の放射活性、横軸ほ時間を示している。図 4は血漿中に残存するフイブリノ一ゲンの経時変化を示す線図であり、図 5は血漿中に残存するブラスミノ一ゲンの経時変化を示す線図であり、図 6は血漿中に残存する α₂ —ブラスミンインヒビターの経時変ィ匕を示す線図であり、縦軸ほ残存するフイブリノ一ゲン，ブラスミノーゲン， α₂ —ブラスミンィンヒビターの 1 0 0分率を示している _c 図 3〜6に示す通り、血栓が経時的に効率よく溶解し、血栓溶解剤の基本的性質が示された。同時に循環血漿中のフィブリノ一ゲンの分解は軽度であり、血栓溶解特性（血栓分解パ一セント Zフィプリノーゲン分解パーセン卜 1 6時間値）ほ 6. 3 2と 1より大きく、組織型ブラスミノーゲンァクチベータ（ t P A) 的性質が示された。

7. 合成基質法による SA K— 1 1 と SA Kとのフイブリン特異性の比較

スタフイロキナーゼ（S A K) 及び S A K— 1 1 はブラスミノーゲンと複合体を形成して作用を発現するブラスミノーゲン · ァクチベータで、高いフイブリン特異性を有することからゥロキナーゼゃストレブトキナーゼとは異なる作用機序を持つ優れた血栓溶解剤である。そこで、合成発色基質を用いて、 SA K— 1 1 のブラスミノ一ゲン ' ァクチベータ活' ¾が S A Kの場合と同様にトロンビン添加即ちフイブリン形成によつて増強されることを確認すると共に、その作用の強さについて比較検討した。

1 mgZmlの SAK— 1 1 (或いは S A K) 溶液（0.01%ツイ一ン 80を含む 20 m Mリン酸緩衝液（ p H 6.5) ) を同緩衝液で希釈して各種濃度の S A K - 1 1のサンブル溶液を調製する 9 6—ゥエル ' ィムノブレートを用意し、この溶液を各サンブル濃度毎に 8 1ずつ 4つのゥエルに分注した。 8 1の S A K — 1 1溶液が入った 4つのゥエルのうち、 2つのゥエルにはコントロールとしてイオン交換水を 8 1、残りの 2つのゥエルには 20 υ/ 1のヒ卜 · トロンビン（シグマ社製）溶液を 8 1添加した（トロンビンの終濃度は 2. 5 U m 1 ) 。ミキサーで混和した後、全てのゥエルにヒト血漿 8 1、 1 0 mM S - 2 25 1 (KA B I社製） 8 μ 1及び 0.01%ツイーン 80を含む 50 mM卜リス塩酸緩衝液 (p H 7. 4) 1 28 ^ 1の混液（合計 1 44 ^ 1 ) を添加して 3 7 °C で 3 0分間加温した。加温終了後、全ゥエルに 8%クェン酸を 40 μ 1づっ添カロし、反応を停止して波長 40 5 n mにおける吸光度を測定した。

図 7は S A K— 1 1での各種濃度におけるブラスミノーゲン活性ィ匕反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸は吸光度変化（ΔΑ₄₀₅ ) 、横軸は S A K - 1 1 の濃度、〇はコントロール、參は 20 U m 1のトロンビンを添加した場合を示している。図 8は S A Kでの各種濃度におけるプラスミノ一ゲン活性化反応の強度を示す線図であり、図中、縦軸は吸光度変ィ匕（ΔΑ₄₀₅ ) 、横軸は S A Κの濃度、口はコントロール、驪は 20 U/m 1の卜ロンビンを添加した場合を示している。図 7及び図 8に示す通り、 SAK— 1 1のブラスミノーゲン活性化活性も S A Kと同様トロンビンによって増強されることが確認された。更に、 SAK— 1 1は S A Kと比べ、活性が最大となる濃度が低く、また、 S A Kの数分の 1の瀵度で同程度の活性を示すことなど比活性でも優れていることが確認された。 8. S AK- 1 1の安全性に関する試験（マウスでの抗原性試験）

SA - 1 1の I gE抗体産生能を指標とした抗原性について、ストレブトキナーゼ（S K) 及び卵白アルブミン（OA) を対照として B A L B/c系マウスを用いて調べた。マウスの感作は、水酸化アルミニウム ·ゲルをアジュバン卜として 1 0 ^g/マウスの用量で腹腔内に 3週間隔で 2回感作するアジュバント感作群と静脈内投与により 2 m sZk sの用量を週 1回計 3回感作する臨床適用経路感作群の 2系を設けた。 I gE抗体産生能は、最終感作の 1週後に採血して得た感作血清のラット P C A反応により調べた。

S A K感作マゥス血清の S A K誘発 P C A反応は、アジュバント感作群及び臨床適用経路感作群共に陰性であつたが、 S K感作マウス血清では臨床適用経路感作群の 1例がおよそ 5倍の P C A価の陽性反応を示した。また、陽性対照である 0 Aのアジュバン卜感作群ブール血清の平均 P C A化は 254倍を示し、良好な反応を示した。 0 Aの静脈内投与による感作群でも 1例が P C A価 ί 0倍の陽性反応を示した。

以上の結果から、特異的 I S Ε抗体産生能を指標とした S A Κの抗原性は S K に比較して弱いこと力示された。また、ラットに対する 5mg/b o dy (約 1 0 mg/k g) およびマウスに対する 2mg/kgの SA K静脈内投与後の一般毒性学的観察において投薬に起因すると考えられる特記すべき変化は認められなかった。この結果から、 S A Kには臨床使用時の障害が予想されるような重大な毒性はないことが示唆された。

9. 血栓溶解剤（用法♦用量）

本発明の血栓溶解剤は、水溶性のペプチドであり、注射薬等の製剤として、各種血栓症、血管内凝固症、心筋梗塞症、脳梗塞症、等の予防、 '治療剤として、使用される。

本発明の血栓溶解剤の製剤化に当たっては、本薬剤のほかに、 S武形剤、溶解補助剤、安定化剤、 P H調製剤、浸透圧調製剤、抗酸化剤等の各種添加剤は、本薬剤の効果を損なわない範囲で添加することができる。

また、本製剤は生理食塩水等溶液としてか、又は、用時、注射用蒸留水や生理食塩水を加えて溶解して使用する凍結乾燥品の形態として供給される。

本剤は、通常 0 . 1 m _S〜5 0 O m g程度を 1単位として、年令、性別、体重、症状等に応じ、 1回又は複数回にわたり適宜、投与される。勿論、より緩やかな、もしくはより強い効果を得る目的で、この適用範囲を越える量の投与も可能である。また、投与方法は、製剤の形態に応じて、静脈内投与，動脈内投与，また患部への直接投与等が行われる。 '

製剤の具体的な例を以下の表 5及び表 6に記載する。

表 5 表 6

表 5は凍結乾燥製剤の例であり、表中の各成分を 5 m 1の注射用蒸留水に溶解し、無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥することにより、注射用バイアルを製造した。また、表 6は注射アンブルの製剤例であり、成分を 2 m 1の注射用蒸留水に溶解し、無菌アンブルに充塡し、注射用アンブルを製造した。 {：配列表: 3

配列番号： 1

配列の長さ： 1 6 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Met Leu Lys Arg Ser Leu Leu Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe

-25 -20 -15

Ser Phe Ser Ser lie Thr Asn Glu Val Ser Ala Ser Ser Ser Phe Asp -10 -5 1 5

Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr

10 15 20

Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn

25 30 35

Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro l ie Lys Pro Gly Thr

40 45 50

Thr Leu Thr Lys Glu Lys l ie Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp

55 60 65

Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85

Lys lie Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr

90 95 100

Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser

105 110 115

Glu His l ie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu He Thr Lys Val Val l ie

120 125 130

Glu Lys Lys 【配列表】

配列番号： 2

配列の長さ： 1 2 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met

5 10 15

Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro

20 25 30

His Tyr Val Glu Phe Pro He Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu

35 40 45

Lys l ie Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys

50 55 60

Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys l ie Glu Val Thr 65 70 75 80

Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro l ie

85 90 95

Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His H e Lys Asn

100 105 110

Pro Gly Phe Asn Leu l ie Thr Lys Val Val He Glu Lys Lys

115 120 126

Claims

[ 請求の範囲 ]

1 . 次のアミノ酸配列からなる血栓溶解作用を有するペプチド。

Lys-Gly-Asp-Asp-Ala-Ser-Tyr-Phe-Glu-Pro-Thr-Gly-Pro-Tyr-Leu-Met-Val-

Asn-Val-Thr-Gly-Val-Asp-Gly-Lys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Ser-Pro-His-Tyr-Val- Glu-Phe-Pro-Ile-Lys-Pro-Gly-Thr-Thr-Leu-T r-Lys-Glu-Lys-I l e-Glu-Tyr-Tyr- Val-Glu-Trp-Ala-Leu-Asp-Ala-Thr-Al a-Tyr-Lys-Glu-Phe-Arg-Val-Val-Glu-Leu- Asp-Pro-Ser-Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Thr-Tyr-Tyr-Asp-Lys-Asn-Lys-Lys-Lys-Glu- Glu-Thr-Lys-Ser-Phe-Pro-Ile-Thr-Glu-Lys-Gly-Phe-Val-Val-Pro-Asp-Leu-Ser- Glu-His-I le-Lys-Asn-Pro-Gly-Phe-Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Val-Val-I le-Glu-Lys- Lys

2 . スタフィ口キナーゼの活性に影響しないアミノ酸又はべプチドを切除した血栓溶解作用を有するベプチド。

3 . スタフィ口キナーゼの N末端の 1 0ァミノ酸を切除したアミノ酸配列からなる血栓溶解作用を有するぺプチド。

4 . 卜リブシン型プロテアーゼによって、スタフイロキナーゼの活性に影響しないァミ酸又はべプチドを切除することを特徴とする請求項 2記載の血栓溶解作用を有するペプチドの製造方法。

5 . 前記請求項 4に記載の方法において、

前記卜リブシン型プロテア一ゼとして、ブラスミン又はブラスミノゲンを用いて、スタフイロキナーゼの N末端の 1 0アミノ酸を切除することを特徴とする血栓溶解作用を有するベプチドの製造方法。

6 . 担体に卜リブシン型プロテア一ゼを固定し、該固定化卜リブシン型プロテア一ゼを用いて、スタフイロキナーゼの活性に影響しないアミノ酸又はべプチ