KR100221571B1

KR100221571B1 - 혈전용해제

Info

Publication number: KR100221571B1
Application number: KR1019930701826A
Authority: KR
Inventors: 오사무 마쯔오; 마사시 사카이; 키사쿠 시무라; 히로시 산사와; 쯔네카즈 와타나베; 쯔네오 마쯔모토; 요시유키 시시도; 슈우수케 하시모토; 테루오 요코쿠라; 마사하루 오노우에; 토모유키 사코
Original assignee: 구와하라 쥰; 가부시키가이샤 야쿠루트 혼샤
Priority date: 1990-12-17
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 1999-10-01
Also published as: ATE158613T1; DK0563385T3; DE69127757D1; US5475089A; EP0563385B1; CA2098588C; EP0563385A1; AU665935B2; CA2098588A1; EP0563385A4; WO1992011356A1; DE69127757T2; KR930703437A; ES2107525T3; JP2895626B2; AU9083791A

Abstract

스타필로키나제(SAK)와 비교하여 항원성의 문제가 적고, 투여량도 적어도되는 136개의 아미노산으로 이루어지는 혈전용해작용을 보유하는 펩티드. 그 제조방법 및 혈전용해제를 얻는 것을 목적으로 한다.

트립신형 프로테아제에 의하여 SAK의 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산 또는 펩티드를 절제한 펩티드를 얻는다. 특히 SAK의 N말단의 10아미노산으로 이루어지는 펩티드를 절제하여 얻어진 SAK-11은, SAK의 피브린 용해반응, 플라스미노겐 활성화반응, 피브린특이성 등의 활성에 있어서 SAK를 상회하는 우수한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

혈전용해제

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 예를 들면 심근경색, 뇌경색, 동맥경화 등의 치료에 유효한 스타킬로키나제로부터 그 활성에 영향을 미치지 않는 부분을 삭제한 혈전용해제에 관한 것이다.

[배경기술]

스타필로키나체(이하 SAK라고 칭함)는 그 자체에 프로테아아제활성은 없지만 플라스미노겐을 점에서 스트레프트키나제(이하 SK라고 칭함)에 유사한 플라스미노겐 액티베이터이다. 그런데 SAK는 분자량이 약 15,000이고 SK의 1/3이하의 크기이며, 또 유전자가 클로닝되어서 DNA배열이 명확하게 되어 있으므로 작용기구를 분자레벨로 해석하기에 적당한 재료라고 생각되고 있다.

본 출원인과 동일한 출원인은, SAK유전자를 조합한 대장균을 배양하여 균체에 축적된 SAK를 채취하는 방법을 제안하였다(특개소 58-67181호). 이 방법으로 얻어지는 SAK의 대부분은 후술하는 배열표의 배열번호 1에 기재되어 있듯이 136개의 아미노산으로 된 펩티드였다(Sako, T., Eur, J, Biochem., 149, 557-563(1985)).

또, SAK의 작용기수는 SK와는 다르다는 것이 판명되고 특히 SK에는 없는 특징으로서 피브린존재하에서의 활성의 증강(소외, 피브린특이성)을 갖고 있는 것이 확인되어서 좋은 혈전용해제로서 기능하는 것이 확인되었다(특원소 63-90252호). 또, SAK의 반응의 지연성을 개량하기 위하여 미리 SAK와 플라스미노겐(또는 피브린)과 복합체를 형성시킨 혈전용해제도 제안되어 있다(특원평 1-13044호).

상기한 방법으로 얻어진 136개의 아미노산으로 된 펩디드인 SAK는 종래로부터 사용되어온 다른 혈전용해제에 비하여 분자량이 작고 혈전내로의 침투성이 유리하며, 용이하게 대량생산이 가능하게 되어서 가격의 면에서도 다른 혈전용해제와 비교하여 유리하다고 하는 등의 우수한 특성을 보유하고 있다.

상기한 바와같이 136개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드인 SAK는 우수한 특성을 갖고 있는데, 분자량은 작을수록 항원성이나 투여량 등의 문제가 잘 발생하지 않는다.

[발명의 개시]

본 발명은 136개의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 SAK를 개량하여서 항원성의 문제가 적고, 투여량도 더욱 적어도 되는 혈전용해제를 얻는 것을 얻는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하는데에 성공한 본 발명에 의한 혈전용해제는 적어도 후술하는 배열번호2에 기재된 아미노산배열 된 펩티드를 유효성분으로 한 것이다.

상세하게는 SAK의 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산 또는 펩티드를 절제한 펩티드를 유효성분으로 하는 것으로서 SAK를 트립신형 프로테아제로 처리하여 얻어지는 SAK의 N말단의 10아미노산을 절제한 펩티드를 유효성분으로 하는 것이다.

즉 본 발명에서는 상기한 펩티드가 SAK와 비교하여 더욱 우수한 혈전용해작용을 보유하고 있는 것을 발견한 것이다.

본 발명에서는 136개의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 SAK에 여러가지 프로테아제를 사용하여서 SAK의 활성에 영향을 미치지 않고 아미노산 또는 펩티드를 절제하는 것을 검토하였다. 그 결과 SAK의 N말단의 10아미노산으로되는 펩티드(구체적으로는 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Tyr Lys)를 삭제한 것(이하 절제하는 것을 검토하여서 항원성의 저하, 안정성의 향상, 대사시험의 간편화 등의 여러가지 특성을 보유하는 후술하는 배열번호 2에 기재된 펩티드를 유효성분으로 하는 혈전용해제를 얻었다.

구체적으로는 SAK는 N말단의 10아미노산으로 이루어진 펩티드를 절제하여 얻어젠 126개의 아미노산(펩티드, SAK-11)을 유효성분으로 하는 혈전용해제의 피브린용해반응, 플라스미노겐활성화반응, 피브린특이성 등의 활성은 136개의 아미노산(펩티드)으로 이루어지는 본래의 SAK에 비교하여 활성면에서도 뛰어나다.

이상과 같이 SAK의 N말단 10아미노산으로 이루어지는 펩티드를 제외한 혈전용해제 SAK-11은 항원성의 저하, 안정성의 향상, 대사시험의 간편화 등의 여러가지 특성이 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 SAK-11의 분취(分取)한 전체분획(分劃)펩티드의 배치를 표시하는 펩티드 설명도이다.

제2도는 SAK-11의 투여량과 혈전습중량의 관계를 표시하는 선도(線圖)이다.

제3도는 혈전용해반응의 경시변화를 표시하는 선도이다.

제4도는 혈장속에 잔존하는 피브리노겐의 경시변화를 표시하는 선도이다.

제5도는 혈장속에 잔족하는 플라스미노겐의 경시변화를 표시하는 선도이다.

제6도는 혈정속에 잔존하는 a₂-플라스민억제제의 경시변화를 표시하는 선도이다.

제7도는 SAK-11에서의 각종 농도에 있어서의 플라스미노겐활성이 반응의 강도를 표시하는 선도이다.

제8도는 SAK에서의 각종 농도에 있어서의 플라스미노겐활성화반응의 강도를 표시하는 선도이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

1. 여러효소와의 반응

여러 프로테아제와 SAK를 반응시켜서 반응생성물을 조사하였다. 다음 표 1에 그 결과를 표시한다.

표 1에 표시하듯이 플라스미노겐, 플라스민, 트립신, 리질엔도펩티다제의 트립신형 프로테아제는 136개의 아미노산(펩티드)으로 이루어지는 SAK의 N말단 10아미노산이 삭제된 SAK-11이 생성되었다. 특히 플라스미노센, 플라스민에서는 협잡물이 없고 양호하게 SAK-11이 생성되는 것이 표시되고 있다.

2. 플라스미노겐과의 반응에 의한 방법

10mM 인산나트륨완충액(pH 8.0)에 용해한 SAK용액(4.0/) 1.0에 대하여, 플라스미노겐용액을 0.01(0.133CU)상당을 첨가하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 반응물을 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석한 결과 모두 SAK-11로 변환되고 있는 것을 알 수 있었다.

또, 이 반응생성물을 S-세파로스(S-Sephrose) 컬럼을 사용한 양이온교환 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 SAK-11은, 후술하는 바와같이 N말단 아미노산배열에서 확실하게 SAK-11인 것이 확인되었다.

또, 후술하는 바와같이 몰환산으로 136개의 아미노산으로 이루어지는 SAK와 동등하거나 그 이상의 활성을 나타내었다.

3. 고정화플라스미노겐의 이용

시판하고 있는 BrCN-액티베이티드·세파로스4B(BrCN-activated sepharose 4B)에 대하여 플라스미노겐을 커플링시켜서 고정화플라스미노겐(plasminogen-sepharose)을 제작하였다. 1의 플라스틱주사통에 고정화플라스미노겐을 0.2충전하고 완충액A 0.5로 2회 세정한 후에 SAK(0.2/0.05) 0.05을 첨가하고 완충액 A 0.5로 4회 세정한 후에 완충액 B 0.5로 용출하였다.

완충액 A: 0.01M 인산완충액(phosphate buffer)(pH 7.0)

완충액 B: 0.1M 구연산완충액(citrate buffer)((pH4.25)+0.4M NaCl)

그 결과 SAK는 컬럼흡착획분에 회수되고 또 SAK-11로 변환되고 있는 것이 전기영동에 의하여 확인되었다.

4. SAK-11의 아미노산배열의 결정

펩티드 머핑의 방법을 사용하여 상세하게 SAK-11의 아미노산배열의 결정을 실시하였다. 사용한 프로테아제는 리실엔도펩티다제(아크로모바크타 프로테아제 Ⅰ: 와코오 쥰야쿠 (주)사제품) 및 V8프로테아제(타카라슈죠오 (주)사제품)이며, 리실엔도펩티다제는 100/, V8프로테아제는 200/가 되도록 물로 희석한 것을 사용하였다.

효소반응은 리실엔도 펩티다제 처리의 경우, 20mM 트리스-염산(pH9.5)을 포함하는 20㎕의 반응액에 5㎕의 SAK-11가 0.1㎕의 효소를 첨가하고 37℃로 6시간 배양하였다. 또, V8프로테아제의 경우 50mM 탄산수소암모늄(pH 7.9), 1mM EDTA로 포함하는 20㎕의 반응액에 5㎕의 SAK-11r과 0.67의 효소를 첨가하고 37℃ 24시간 배양하였다.

효소반응종료후에 각각의 반응속에 펩티드·프라그멘트를 HPLC방식을 사용하여 분리하였다. HPLC시스템은 시마즈제작소(주)제 LC-6A시스템(LC-6A 2대, SPD-6AV, C-R3A, SCL-6A)에 엘마(사)제 ERC-3322 데갓사와와 바이오랫드(사)제 AS-100T오오토산브라아를 조합한 것을 사용하여서 용출액의 210㎚에서의 흡광도를 풀스케일 0.02로 측정하였다. 분리에 사용된 컬럼은 일본 워터스(사)제 μBOND ASPHERE C18컬럼(입경 5μ, 포아사이즈 300Å, 3.9×150㎜)이다.

HPLC에 의한 분리는 효소반응후의 시료 20㎕(5SAK-11을 포함)에 280㎕의 A용매(0.1TFA를 포함하는 물)를 첨가하여 총량을 300㎕로 하고, 그 중의 280㎕을 공급하여 A용매와 B용매(0.1TFA를 포함하는 아세토니트릴)와의 2용매에 의한 직선농도구배로 실싱하여 유량을 1/분으로 하였다. 농도구배조건을 다음 표2에 표시하는 조건중에서 어느 한가지를 사용하였다.

리젤엔도 펩테다제 처리에 의한 반응액으로부터는 HPLC분석에 의하여 L-1로부터 L-13의 피이크가 분리되었다. 또, V8프로테아제 처리에 의한 반응액으로부터는 V-1에서 V-15의 피이크가 분리되었다. 얻어진 각 분획 펩티드에 대하여 어플라이드바이오시스템(사) 473A프로테인 시이크엔서를 사용하여 아미노산배열의 결정을 실시하였다.

각 분획중 펩티드의 아미노산배열의 결과를 다음 표3의 표시한다. 또, 제1도에 SAK-11의 분취(分取)한 전체분획 펩티드의 배치를 표시하는 펩티드설명도이며, 제1도에 표시한 바와같이 SAK-11의 C말단 아미노산 잔기(殘期)를 제외한 전체 아미노산배열을 결정하였다.

표3 및 제1도에 표시하듯이 SAK-11의 Lys-11에서 Lys-13까지의 배열이 유전자배열에서 예상된 아미노산배열에 완전하게 일치되는 것을 확인하였다.

또 SAK-11의 카르복실말단(C말단)의 구조를 해명할 목적으로 다음의 실험을 하였다. 즉 SAK-용액(2.4/) 0.15에 대하여 등일량의 0.1M 구연산나트륨완충액(pH 3.8)을 가하고, 여기에 카르복시 펩타다제 W(생화학공업(사)제)용액(2.0/) 0.01을 가하여 37℃로 반응시켰다. 반응개시후 0, 5, 20 시간후에 0.10을 채취하여 0.1M 디이소프로필 플루오로인산(DFP) 0.01을 가하여 반응을 정지하고, 여기에 20mM 인산나트륨용액 0.29을 가하므로서 pH를 조정하였다.

얻어진 반응액을 센트리콘10(상품명:아미콘(사)제)으로 한외(限外)여과하여 고분자분획(>분자량 10,000)과 저분자분획(<분자량 10,000)으로 분획하였다. 각각의 반응시간에 있어서 얻어진 고분자분획을 음이온교환 크로마토크래피-(Mono Q, PPLC시스템)로 분석한 결과, 반응개시전에는 피이크 Ⅰ(미반응 SAK-11)만 확인되었지만 반응 5시간 후에는 피이크Ⅰ은 감소하고 대신에 그것보다 후의 피이크Ⅱ와 다시 그 후의 피이크Ⅲ이 검출되었다. 다시 반응 20시간을 경과하면, 피이크Ⅰ, Ⅱ는 거의 찾아볼수 없고, 대부분이 피이크Ⅲ이 되었다.

일반적으로 음이온교환 크로마토그래피에서는 등전점(等電點)이 높은 단백질로부터 차례로 용출되는 경향이 있는 것과 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동과 결과, 피이크Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ의 분자량은 거의 변하지 않는 점으로 미루어서 피이크 Ⅱ,Ⅲ은 각각 피이크Ⅰ로부터 염기성 아미노산을 1개 또는 2개 상실한 단백질이라고 추정된다. 또, 저분자분획중의 유리아미노산을 분석한 결과, 반응 5시간에서 리진(Lys)만이 출현하고, 20시간에서는 그것보다는 더욱 증가하였다.

이상의 결과에서는 SAK-11의 C말단 2 아미노산의 배열은 Lys-Lys라고 결론짓고, SAK의 DNA배열로부터 예상한대로 N말단의 10아미노산으로 이루어지는 펩티드를 절제한 아미노산 배열이며, 다른 아미노산수식이없다는 것과 다른아미노산이 결실되어있지않다는 것이 확인되었다. 또, 후술하는 배열표의 배열번호 2에, SAK-11의 전체 아미노산배열을 표시한다.

5. SAK-11의 혈전용해시험(토리혈전모델)

SAK-11의 혈전용해작용의 약효를 평가할 목적으로 토끼경정맥혈전모델을 사용하여 검토하였다.

사용한 실험동물은, 뉴질랜드백색토끼(kbl: NZW)의 수컷으로서 체중이 2.8이상된 것을 사용하여, 각군 6마리(단, 대상군만 11마리)로 실험하였다. 또 각 동물에 투여한 샘풀은, 최종농도로 트윈(tween)80을 0.003농도, 인산완충액을 3mM농도를 함유하는 생리식염수용액으로서 SAK-11을 투여량으로 하여서 0.15내지 2.1/을 포함하도록 조제하였다.

혈전의 형성은 다음과 같이하여 실시하였다. 먼저 트롬빈용액(3U/의 25mM CaCl₂용액)을 채운 1실린지를 유치침에 접속하고, 혈전제작용 혈관내에 2회세정하였다. 계속하여 대퇴정맥에 설치한 카테테르에서 1실린지에 신선혈액을 채취하고 즉시 유치침으로 약 0.25의 신선혈액을 혈전제작용 혈관내에 주입하여서 실린지를 유치침에 장착한 그대로 30분간 정치(靜置)한다. 30분경과후에 안면정맥으로부터 실린지 및 유지침을 뽑아서 결찰(結紮)하고 혈정제작용 혈관의 양끝에 설치한 크렌메를 제거하여 혈류(血流)를 재개시켜서, 토기경정맥혈전모델의 제작을 종료하였다. 시술후에는 건조방지를 위하여 생리식염수를 함유시킨 컷면(綿)을 절개부분에 대었다.

샘플의 투여는 혈전제작유량직후부터 혈전제작부에 대하여 대측(待側)의 이개(耳介)정맥으로부터 실린지 펌프로 각 농도로 조제한 SAK-11 및 대항으로서 트윈 80과 인산완충액 만을 포함한 생리식염수를 정주(靜住)하였다. 투여속도는 먼저 2의 용액을 유속 120/시간 로 4시간에 걸쳐서 보루스(bolus)투여하고, 계속해서 남은 18을 유속 4.5/시간으로 4시간에 걸쳐서 점적정주(点適精住)로 하였다. 또, 제작한 실험적 혈정의 성장을 저지하기위하여, 헤파린용액(10U/,노보(사)제)을 혈전제작부의 야윽에 0.5씩 혈전제작종료직후로부터 30분마다 0.5대퇴정맥에 설치한 카테테르에서 정주하였다.

혈전습중량의 측정으로서 혈전제작종료직후, 또는 6시간후에 혈전제작부를 중심으로 크게 경정맥혈관의 양끝을 결찰하여서 이 구간의 경정맥을 추출하였다. 추출한 경정맥혈간에 절개을 가하여 생리식염수를 채운 배양접시(culture)속에서 혈관내에 존재하는 미응고혈액을 씻어내고 부착한 여분의 수분을 여과지로 흡취하여 천평칭에 의해 이때의 중량 A(혈정, 혈관 및 모사의 합계중량)를 측정하였다. 다음에 혈관을 배양접시에 되돌려 보내고, 내부에 있는 혈전을 씻어내고 수분을 여과지로 흡취한 후의 중량 B(혈관 및 모사의 합계중량)를 측정하였다. 혈전습중량은 중량A에서 중량B를 공제한 값으로 구하였다. 제2도는 SAK-11의 투여량과 혈전습중량의 관계를 표시하는 선도이며, 세로축은 혈전습중량(), 가로측은 SAK투여량(/)을 표시하고 있다. 사용한 토끼의 마리수는 SAK 0투여가 11마리, 다른 모든 군(群)이 각각 6마리이다. 각 값은 혈전습중량의 평균±표준편차이다.

상기한 실험예에 있어서 SAK-11투여전 및 투여후 2, 4, 6시간 경화한 시점에서 각 군의 토끼로부터 채혈을 하여서 혈장속의 피브리노겐의 측정을 하였다.

먼저 채혈한 혈장을 분리하여 5M ε-아미노-n-카프론산을 혈장 1에 20㎕씩을 임무노플레이트의 4개의 웰에 분주하고, 그중 2개에는 50㎕의 베로날완충액을 가하여 이것을 레퍼런스(reference)으로 하였다. 남은 2개의 웰에는 0.5u/의 트롬빈과 12.5mM의 CaCl₂를 포함하는 12.5mM의 베로날완충액 50㎕을 가했다. 이들 웰을 37℃로 10분간 보온한후에 각각 웰의 405㎚의 흡광도를 측정하고 트롬빈과 CaCl₂를 첨가한 웰로부터 레퍼런스인 웰의 OD를 뺀 값을 △OD로 하였다.

혈장중 피브리노겐의 변동지표는 SAK투여후 0, 2, 4, 6시간째 채취한 혈장에 대하여 △OD를 구하고 0시간혈장의 OD를 100로 했을때의 각 시간의 △OD를 퍼센트로 표시하였다. 얻어진 결과를 다음의 표 2에 표시한다. 표 4에 표시하듯이 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하고, SAK-11의 작용용량의 검정은, 던컨멀티플레인지테스트(Duncan's multiple range test)를 사용하여 실시하여서 각각 위험율 5이하로써 유의차(有意差)있다고 하였다.

이상과 같이 혈전용해작용에 관해서는 SAK-11의 0.15과 0.3/의 투여량으로 혈전의 습중량은 대상군(群)에 대하여 용량의존적으로 유의한 감소를 표시하였다. 특히 1.8/투여군에서는 혈전 습중량이 60.8±15.5으로되고, 혈전용해율은 66.2에 달하여 혈전제작부위에 근소하게 혈전괴(塊)를 볼 수 있을 정도였다. 또 SAK-11의 투여에 의한 토끼혈장중의 피브리노겐에 주는 경향은 SAK-11의 투여량이 0.6/까지는 혈장중의 피브리노겐양의 감소는 거의 볼 수 없었지만 0.9/이상의 투여량으로 피브리노겐량의 감소가 분명히 나타났다.

6. SAK-11의 혈전용해시험(폐쇄순환모델)

폐쇄순환모델(Matsuo, O, et al, Thromb, Res., 24, 347-358(1985))을 사용하여 SAK-11에 대하여 혈장 혈전용해실험을 하였다. SAK-11의 최종농도를 순환하는 전체혈장량에 대하여 2/이 되도록 최초에 1/10량을 한꺼번에 주입하고 나머지 9/10를 펌프를 사용하여 4시간걸쳐서 주입해갔다.

순환모델의 하부체인버에서 1시간마다 일정량식 혈장을 채취하여 혈전에서 유리한 방사활성으로 혈전용해상태를 평가하고, 같은 시료를 사용하여 피브리노겐, 플라스미노겐 및 a₂-플라스미노겐 억제제를 정량하였다.

또, 실험은 N=3으로 실시하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다. 제3도는 혈전용해반응의 경시변화를 표시하는 선도이고, 세로축은 혈장속의 방사활성이고 가로축은 시간은 표기하고 있다.

제4도는 혈장속에 잔존하는 피브리노겐의 경시변화를 표시하는 선도이고, 제5도는 혈장속에 잔존하는 플라스미노겐의 경시변화를 표시하는 선도이며, 제6도는 혈장속에 잔존하는 α₂-플라스민 억제제의 경시변화를 표시하는 선도이고, 세로축은 잔존하는 피브리노겐, 플라스미노겐, α₂-플라스민인히비터의 백분율을 표시하고 있다.

제3도 내지 제6도에 표시하듯이 혈전이 경시적으로 효율성있게 용해하여 혈전용해제의 기본적성질이 표시되었다. 동시에 순환혈장속의 피브리노겐 분해는 경도이고, 혈전용해특성(혈전분해 퍼센트/피브리노겐분해퍼센트 16시간치)은 6.32로서 보다크고, 조직형 플라스미노겐액티베이터(tPA)적 성질이 표시되었다.

7. 합성기질법에 의한 SAK-11과 SAK와의 피브린특이성의 비교

스타필록키나제(SAK) 및 SAK-11은 플라스미노겐과 복합체를 형성하여 작용을 발현하는 플라스미노겐 액트베이터로서 높은 피브린특이성을 보유하므로 우로키나제나 스트레프토키나제와는 다르는 작용기서(作用耭序)를 갖는 우수한 혈전용해제이다. 그래서 합성발색기질을 사용하여 SAK-11의 플라스미노겐 액티베이터활성이 SAK의 경우와 같이 트로빈첨가 즉 피브린 형성에 의하여 증강되는 것을 확인하는 동시에 그 작용의 강도에 대하여 비교검토하였다.

1/의 SAK-11(또는 SAK) 용액(0.01트윈 80을 포함하는 20m인산완충액(pH 6.5)을 동일 완충액으로 희석하여 각종 농도의 SAK-11의 샘플링용액에 조제하는 96-웰·임무노플레이트를 준비하고, 그 용액을 각 샘플농도마다 8㎕씩 4개의 웰에 분주하였다. 8㎕의 SAK-11 용액이 들어간 4개의 웰종에서 2개의 웰에는 콘트롤으로서 이온교환수를 8㎕, 나머지 2개의 웰에는 20U/의 트롬빈(시그마(사)제) 용액을 8㎕첨가하였다(트롬빈의 농도는 2.5u/). 믹서로 혼화한후에 모든 웰에 혈장 8㎕. 10mM S-2251(KABI(사)제) 8㎕ 및 0.01트윈 80을 포함하는 50mM트리스염산완충액(pH 7.4)128㎕의 혼액(합계 144㎕)을 첨가하여서 37℃로 30분간 가온하였다. 가온종료후, 전체 웰에 8구연산을 40㎕씩 첨가하여 반응을 정지하여 파장 405㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

제7도는 SAK-11에서의 각종농도에 있어서의 플라미노겐 활성화 반응의 강도를 표시하는 선도로서, 도면중, 세로측은 흡강도변화(△A₄₀₅), 가로축은 SAK-11의 농도, ○은 콘트롤, ●은 20u/의 트롬빈을 첨가한 경우를 표시하고 있다.

제8도는 SAK에서 각종 농도에 있어서의 플라스미노겐 활성화 반응의 강도를 표시하는 선도이고, 도면중 세로축은 흡광도변화(△A₄₀₅), 가로축은 SAK의 농도, □는 콘트롤, ■는 20u/의 트롬빈을 첨가한 경우를 표시하고 있다. 제7도 및 제8도에 표시하는대로 SAK-11의 플라스미노겐 활성화 활성도 SAK와 마찬가지로 트롬빈에 의하여 증강되는 것이 확인되었다. 또, SAK-11은 SAK와 비교하여 활성이 최대로 되는 농도가 낮고, 또, SAK의 수분(水分)의 1의 농도로 동일한 정도의 활성을 표시한다고하는 것 등으로 비활성(比活性)에서도 우수하다는 것이 확인되었다.

8. SAK-11의 안정성에 관한 시험(마우스에서의 항원성시험)

SAK-11 1gE항체산생능을 지표로한 항원성에 대하여 스트레프토키나제(SK) 및 난백(卵白)알부민(OA)을 대조로 하여 BALB/c계 마우스를 사용하여 조사하였다. 마우스의 감작(減作)은 수산화 알루미늄 겔은 애주번트로 하여 10㎕/마우스의 용량으로 복강내에 3주간격으로 2회감작하는 애주번트 감작군과 정맥내투여에 의하여 2/의 용량을 주 1회, 계3회 감작하는 임상적용 경로 감작군의 2계(系)를 설치하였다. 1gE항체생산능은 최종감작의 1주후의 채혈하여 얻어진 감작혈청의 래트 PCA반등에 의하여 조사하였다.

SAK감작 마우스혈청의 SAK 유발 PCE반응은, 애주번트감작군 및 임상적용경로 감작군 모두에 음성이었는데, SK감작마우스혈청에서는 임상적용경로 감작군의 1예가 거의 5배의 PCA가 양상반응을 표시하였다. 또, 양성대상인 OA의 애주번트감작군 풀 혈정의 평균 PCA화는 254배를 표시하여 양호한 반응을 표시하였다. OA의 정맥내투여에 의한 감작군에서도 1예가 PCA가(價)10배의 양성반응을 표시하였다.

이상의 결과에서 특이적 1gE항체생산능을 지표로한 SAK의 항원성은 SK에 비교하여 약하다는 것이 나타났다. 또 래트에 대한 5/body(약10/) 및 마우스에 대한 2/의 SAK정맥내 투여후의 일반독성학적 관찰에 있어서 투약에 기인된다고 생각되는 특기할만한 변화를 볼 수 없었다. 이 결과로서 SAK에는 임상사용시의 장해가 예상될 것 같은 중대한 독성은 없다는 것이 시사되었다.

9. 혈전용해제(용법·용량)

본 발명의 혈전용해제는 수용성 펩티트이며, 주사약 등의 제제로서 각종혈전증혈관내응고증, 심근경색증, 뇌경색증 등의 예방, 치료제로서 사용된다.

본 발명의 혈전용해제의 제제화에 있어서는 본 약제외에 부형제, 용해보조제, 안정화제, pH조제제, 항산화제 등의 각종 첨가제는 본 약제의 효과를 손상시키지 않는 범위에서 첨가할 수가 있다.

또 본 제제는 생리식염수등을 용액으로 하거나 또는 사용시에 주사용 증류수나 생리식염수를 첨가하여 사용하는 동결건조품의 형태로서 공급된다.

본 제제는, 통상제 0.1내지 500정도를 1단위로서 연령, 성별, 체중, 증상 등에 따라 1회 또는 복수회에 걸쳐서 적당히 투여할 수 있다. 물론 보다 완만한 또는 강한 효과를 얻는 목적으로 이 적용범위를 초과하는 양의 투여도 가능하다. 또, 투여방법은 제제의 형태에 따라서 정맥내투여, 동맥내투여, 또 환부에의 직접투여 등을 할 수 있다.

정재의 구체적인 예를 이하의 표 5 및 표 6이 기재한다.

표 5는 동결건조제제의 예이며, 표중의 각 성분을 5의 주사용 증류수에 용해하고 무균바이알에 충전하여 동결건조하므로서 주사용 바이알을 제조하였다. 또, 표 6는 주사앰플의 제제예이고, 성분을 2의 주사용 증류수에 용해하여 무균앰플에 충전하여 주사용 앰플을 제조하였다.

[배열표]

배열번호 : 1

배열의 길이 : 1 6 3

배열의 형 : 아미노산

위상 : 직쇄형상

배열의 종류 : 펩트드

배열

배열표

배열번호 : 2

배열의 길이 : 1 2 6

배열의 형 : 아미노산

위상 : 직쇄형상

배열의 종류 : 펩트드

배열

Claims

다음의 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 하는 혈전용해제.
스타필로키나제의 활성에 영향으르 미치지 않는 아미노산 또는 펩티드를 절제하여 얻어진, 제1항에 의거한 펩티드의 유효성분을 포함하는 혈전용해제.
상기한 스타필로키나제의 N말단의 10개 아미노산을 절제하여 얻어진, 제1항에 의거한 펩티드(SAK-11)의 유효성분을 포함하는 혈전용해제.