KR100194287B1 - 혈소판 응집 억제 펩타이드를 포함하는 전구체의 cdna - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 살모사(Korean salmosa snake:Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘 cDNA 라이브러리로 부터 분리한, 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)를 포함하는 전구체의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 전구체에 관한 것이다. 본 발명의 살모신 전구체 cDNA는 190개 아미노산으로 구성된 프로-프로테인 영역, 216개 아미노산으로 구성된 메탈로프로테이네이즈 영역 및 73개 아미노산으로 구성된 살모신 영역을 코딩하는 1440bp의 염기서열로 이루어져 있다. 살모신 전구체 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

혈소판 응집 억제 펩타이드를 포함하는 전구체의 cDNA

제1도는 한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리의 제조과정을 나타내는 모식도이다.

제2(a)도는 cDNA 라이브러리로 부터 유래한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸다.

제2(b)도는 PCR 산물로 부터 번역되는 살모신과 다른 뱀독 혈소판 응집 억제 펩타이드의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

제3(a)도는 살모신을 포함하는 전구체의 cDNA 염기서열을 나타낸다.

제3(b)도는 제3(a)도에 개시된 전구체 cDNA의 염기서열로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 살모신 또는 공지된 뱀독 혈소판 응집 억제 펩타이드를 포함하는 전구체들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

[발명의 목적]

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

본 발명은 혈소판 응집 억제 펩타이드를 포함하는 신규한 전구체의 cDNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한구산 살모사(Korean salmosa snake:Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로 부터 분리한 혈소판 응집 억제 펩타이드를 포함하는 전구체의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 전구체에 관한 것이다.

혈전증(thrombosis)과 지혈(hemostasis)에 영향을 미치는 여러가지 단백질들이 뱀독에 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 인체내에서 혈소판의 비정상적인 응집으로 인한 혈전을 형성하는 경우 치명적인 혈전증을 야기할 수 있으므로, 각종 뱀독으로 부터 이러한 혈소판 응집을 억제하거나 촉진시키는 단백질들이 분리되었고 그들의 특성이 규명되었다.

혈소판 응집기작을 살펴보면, 혈소판에 존재하는 당단백질인 GPⅡb-Ⅲa 수용체에 피브리노겐이 결합함으로써 혈소판 응집이 일어나는데, GPⅡb-Ⅲa 수용체에 대한 피브리노겐의 결합부위에는 Arg-Gly-Asp(RGD) 아미노산 서열이 매우 중요한 것으로 알려져 있다(참조:Rouslagti and Pierschbacher, Science, 238:491-497(1987)). 따라서, 전기 아미노산 서열을 가진 단백질들은 GPⅡb-Ⅲa 수용체에 피브리노겐이 결합하는 것을 경쟁적으로 방해함으로써, 혈소판 응집을 억제할 수 있는 것이다.

처음에 뱀독으로 부터 분리된 GPⅡb-Ⅲa 수용체에 대한 억제제는 주로 5 내지 9kDa의 작은 단백질들이었으나(참조:Huang et al., J. Biol. Chem., 262:16157-16163(1987)), 그 이후 분자량이 큰 억제제를 포함한 여러가지 혈소판 응집 억제제들이 뱀독으로 부터 분리되었다. 이들 억제제는 모두 시스테인(Cys) 잔기가 풍부하며, Arg-Gly-Asp 아미노산 서열에 의해 GPⅡb-Ⅲa 수용체에 결합하는 공통적인 특징을 가지고 있다. 또한, 현재 키스트린(Kistrin)(참조:Alder et al., Science, 253:445-448(1991); Alder et al., Biochemistry, 32:282-289(1993)), 플라보리딘(Flavoridin)(참조:Klaus et al., J. Mol. Biol., 232:897-906(1993); Senn and Klaus, J. Mol. Biol., 232:907-925(1993)), 알보라브린(Albolabrin)(참조:Jaseja et al., Eur. J. Biochem., 218:853-860(1993)) 및 에키스타틴(Echistatin)(참조:Chen et al., Biochemistry, 30:11625-11636(1991); Cooke et al., Eur. J. Biochemistry, 202:323-328(1991); Cooke et al., Protein Eng., 5:473-477(1992); Saudek et al., Biochemistry, 30:7369-7372(1991); Dalvit et al., Eur. J. Biochem., 202:315-321(1991)) 등의 혈소판 응집 억제제들의 구조는 NMR을 통하여 밝혀진 상태에 있으며, 이들 억제제들에 의한 GPⅡb-Ⅲa 수용체에의 피브리노겐 결합방해는 동물모델을 통하여 명백히 규명되었다(참조:Collen, J. Cln. Invest., 76:101-108(1985); Gold et al., Circulation, 77:670-677(1988); Yasuda et al., J. Cln. Invest., 81:1284-1291(1988); Collar et al., Blood, 68:783-786(1986); Hanson et al., J. Clin. Invest., 81:149-158(1988)).

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

한편, 본 발명자들은 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로 부터, 혈소판 응집 억제능이 매우 우수하면서 하기의 아미노산 서열로 이루어진 약 7,500Da의 신규한 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신(Salmosin))를 분리 및 정제한 바 있다(참조:대한민국 특허출원 제95-19685혈소판):EAGEE CDCGS PGNPC CDAAT CKLRQ GAQCA EGLCC DQCRF MKEGT ICRRA RGDDL DDYCN GISAG CPRNP FHA.

지금까지 발견된 몇가지 혈소판 응집 억제 단백질의 유전자들은 프로-프로테인(pro-protein) 영역, 메탈로프로테이네이즈(haemorrhagin) 영역 및 혈소판 응집 억제 펩타이드(disintegrin) 영역을 공통적으로 갖고 있었으므로, 본 발명자들도 살모신을 포함하는 전구체의 유전자를 알아내고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 뱀독 cDNA 라이브러리로 부터 살모신을 포함하는 전구체의 cDNA를 클로닝하였고, 그 cDNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열이 신규하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘으로 부터 분리한 살모신 전구체의 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 살모신 전구체의 cDNA로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 살모신 전구체를 제공하는 것이다.

[발명의 구성 및 작용]

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 다른 뱀독에서 분리한 혈소판 응집 억제 펩타이드들에 잘 보존되어 있는 아미노산 부위에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스 독샘의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)시켜 제조한 PCR 산물을 프로브로 사용하여, 살모신 전구체를 코딩하는 1.4kb cDNA를 클로닝하였다. 클로닝된 cDNA는 479개의 아미노산을 코딩하는 1440개 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 그로 부터 번역되는 단백질은 190개 아미노산으로 구성된 프로-프로테인 영역, 216개 아미노산으로 구성된 메탈로프로테이네이즈 영역 및 73개 아미노산으로 구성된 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신) 영역으로 분류됨이 확인되었다. 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)는 12개의 Cys 잔기를 포함하며, 혈소판 응집 억제 활성부위인 RGD 아미노산 서열을 가지고 있다.

한편, 단백질의 정보검색 결과로 부터, 살모신 전구체는 공지된 뱀독의 혈소판 응집억제 펩타이드들의 전구체와 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다. 아울러, 본 발명의 살모신 전구체는 메탈로프로테이네이즈의 아연(Zn) 결합부위를 구성하는 HEXGHNLGXHD(X는 IUPAC-IUB에 의해 명명된 자연계에 존재하는 20개 아미노산 중의 하나이다) 아미노산 서열, 혈소판 응집 억제 펩타이드의 활성부위를 구성하는 RGD 서열, 그 주변의 아미노산 서열 및 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다.

본 발명의 살모신 전구체 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 베큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 위해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리 제조]

한국산 살모사 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘 조직을 분리하였다. 독샘은 콩알 크기의 작은 조직으로, 최소한 5개 정도를 사용하여 충분한 양의 RNA를 분리하였다. 전체 RNA의 분리는 공지된 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)를 사용하여 CsCl 쿠션(cushion) 하에서의 고속 원심분리하는 방법을 이용하였다. 전체 RNA로 부터 올리고(dT)-셀룰로스 컬럼을 2회 사용하여 poly(A)+RNA를 분리한 다음, 역전사효소, RNase H 및 E.coli DNA 중합효소 I을 이용하여, 첫번째 및 두번째 가닥 cDNA를 제조하였다(참조:Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)). 제조된 cDNA에서 적절한 어댑터(adaptor)를 부착한 다음, 람다 ZAPII(Stratagene, USA)에 삽입하고 실험실적 패키징(in vitro packaging)을 거쳐 라이브러리를 완성하였다. cDNA 라이브러리는 106개의 독립된 플라크를 포함하는 것으로 검정되었다. 한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리를 제조하는 과정은 제1도에 모식적으로 나타내었다.

[실시예 2]

[프로브의 제조]

실시예 1에서 제조한 cDNA 라이브러리로 부터 살모신 전구체의 cDNA를 스크리닝하기 위한 프로브를 선정하기 위하여, 다른 뱀독의 혈소판 응집 억제 펩타이드들에서 잘 보존된 아미노산 부위에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 합성하였다:즉,

5'-프라이머로는 다른 뱀독의 혈소판 응집 억제 펩타이드들의 N-말단 영역의 공통된 아미노산 서열인 GEECDCG에 근거하여, 5'-GGIGA(A/G)GA(A/G)TG(T/C)GA(T/C)TG(T/C)GG-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하였고; 3'-프라이머로는 poly A tail 및 λ 파아지(phase)의 DNA 서열에 상보적인 5'-GACTCGAGTCGACATCGA[T]17-3' 서열을 보유하는 dT/Ad(어댑터) 프라이머를 사용하였다.

실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 상기 프라이머들과 Taq DNA 중합효소를 이용하여 변성(denaturation, 95℃에서 3분), 결합(annealing, 48℃에서 1분), 연장(extension, 72℃에서 2분)을 30회 진행시키는 PCR을 수행한 결과, 750bp PCR 산물을 수득하였다. 얻어진 PCR 산물(PCR 750)을 플라스미드 pCRII(Invitrogen, USA)에 서브클로닝하고 염기서열을 결정하였는데, 그 중 5'부터 시작하여 약 216bp까지의 염기서열을 제2(a)도에 나타내었다. 제2(a)도에서, 밑줄친 부분 Ⅰ은 상기 PCR의 '5 프라이머에 해당하는 염기서열이고, 밑줄친 Ⅱ는 하기 실시예 3에서의 cDNA 라이브러리 스크리닝시 사용한 프로브의 염기서열이다.

전기 염기서열로 부터 번역되는 아미노산 서열은 공지된 혈소판 응집 억제 펩타이드, 즉 Agkistrodon piscivorous로 부터 분리한 아플라긴(Applagin) 및 Trimeresurus flavoviridis로 부터 분리한 트리그라민(Trigramin)과 83 내지 91%의 상동성을 보유함이 확인되었다(참조:제2(b)도).

따라서, 하기 실시예 3에서의 cDNA라이브러리 스크리닝에는 750bp PCR 산물의 중간부분에 해당하는 RGD 아미노산 서열의 코딩부분을 포함하는 안티센스(antisense) 5'-CCAGATCATCACCCCTTGCTCTCCGGCATA-3'를 프로브로 사용하였다.

[실시예 3]

[cDNA 라이브러리의 스크리닝]

실시예 1에서 제조한 cDNA 라이브러리를 대장균(E.coli) XL-1 Blue 위에 플레이팅하여 전체 1.2×105개의 플라크를 얻었다. 플라크를 2회에 걸쳐 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 다음, 막을 변성용액(0.5N NaOH, 1.5M NaCl)에 2분, 중화용액(0.5M Tris-HCl(pH 7.4), 1.5M NaCl)에 5분간 처리하고, -2X SSC에서 30초간 세척하였다. 막을 80℃ 진공하에서 2시간 처리한 다음, 5X SSC, 20mM 인산화 나트륨(pH 6.5), 3% SDS, 100ug/ml 연어 정액(salmon sperm) DNA를 포함하는 용액에서 68℃, 3시간 전혼성화(prehybridization)하였다. 실시예 2에서 선정한 프로브를 [γ-32P]ATP로 말단 표지(end-label)하여 1×106cpm/ml의 농도로 상기의 전혼성화 용액에 첨가한 후, 53℃에서 16시간 동안 혼성화하였다. 그런 다음, 막을 3X SSC, 3% SDS, 10mM 인산화 나트륨(pH 6.5)을 포함하는 용액에서 53℃, 1시간 동안 세척한 후, 제차 1X SSC, 1% SDS 포함 용액에서 53℃, 1시간 동안 세척하였다. 막은 증강 스크린(intensifying screen)하에서 X-ray 필름(Agfacurix)에 -70℃, 24시간 노출시켰다. 그 결과 X-ray 필름상의 복사물(duplicate)에서, 동일 위치에 스폿(spot)이 형성된 10개의 양성 클론(positive clone)을 찾아내었다. 낮은 희석 배수로 플레이팅하여 2차 스크리닝을 위와 동일한 방법으로 반복한 결과, 13개의 독립된 플라크를 얻었다.

각 클론은 pBluescript 벡터(Stratagene, USA)에 서브클로닝하였으며, 그 중 840bp의 클론이 PCR 클론(PCR 750)과 일치하는 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나, 840bp의 클론은 지금까지 발견된 몇가지 혈소판 응집 억제 단백질의 유전자들이 공통적으로 갖는 프로-프로테인 영역과 메탈로프로테이네이즈 영역이 결실된 부분 클론이므로, 이들 영역을 포함하는 전체 클론을 찾기 위해 다음의 과정을 수행하였다.

[실시예 4]

[살모신 전구체 cDNA의 클로닝]

살모신 전구체의 cDNA를 제조하기 위하여, 5'-프라이머로는 전장(full length)의 서열이 밝혀진 다른 뱀독의 혈소판 응집 억제 펩타이드 전구체들의 N-말단 영역에 위치하는 공통된 아미노산 서열인 MIQVLL에 근거하여, 5'-AAATGAT(A/C)CA(A/G)GTTCTNTTG-3'(N은 A, G, T 또는 C를 나타낸다) 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하였고; 3'-프라이머로는 제2(a)도에서 확인된 C-말단 서열의 안티센스 DNA에 BamHI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 포함하는 5'-CTGGATCCCTCGAGTTAGGCATGGAAGGGAAT-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 1.4kb PCR 산물을 수득하였으며, 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 PCRII(Invitrogen, USA)에 서브클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 1.4kb PCR 산물의 3'부위는 실시예 3에서 확인된 PCR 750의 염기서열과 동일하며, 5'부위는 그로 부터 번역되는 아미노산 서열이 다른 뱀독이 프로-프로테인 부분과 상동성을 가지는 것으로 확인되어, 전기 1.4kb PCR 산물은 살모신 전구체의 cDNA임이 확인되었다.

[실시예 5]

[DNA 염기서열의 결정]

1.4kb의 클론은 시쿼나제(Sequenase, USB, USA)를 사용한 디데옥시 종결(dideoxy termination)법(참조:Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed.,(1989))으로 벡터상의 프라이머와 cDNA 서열에서 유래한 프라이머를 사용하여 양쪽상에서 서열이 결정되었다. 서열의 결정은 전체 삽입체 1.4kb중, 전체 개방 해독틀(ORF:open reading frame)을 포함하는 부위에 대하여 중점적으로 수행하였으며, 그 결과 479개 아미노산을 코딩하는 1440bp의 염기서열을 결정하였다(참조:제3(a)도). 제3(a)도에서, 밑줄친 부분은 번역개시코돈 및 번역종결코돈을 각각 나타낸다.

[실시예 6]

[DNA 염기서열의 분석]

상기에서 결정된 1440bp의 염기서열은 190개 아미노산으로 구성된 프로-프로테인 영역, 216개 아미노산으로 구성된 메탈로프로테이네이즈 영역 및 73개 아미노산으로 구성된 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신) 영역에 해당하는 총 479개의 아미노산을 코딩하는 것으로 확인되었다(참조:제3(b)도). 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)는 12개의 보존된 Cys기를 포함하며, 혈소판 응집 억제 활성부위인 RGD 아미노산 서열을 가지고 있었다. 제3(b)도에서, 밑줄친 부분은 순서대로 시그날 펩타이드, 아연 결합부위, 메탈로프로테이네이즈에서의 보존된 영역인 메티오닌 턴(methionine turn) 및 GPⅡb-Ⅲa 수용체에의 결합부위를 각각 나타낸다.

한편, Swiss-Prot을 이용한 단백질의 정보검색 결과로 부터, 본 발명의 살모신 전구체는 공지된 뱀독의 혈소판 응집 억제 단백질들의 전구체와 64 내지 71%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다(참조:제4도). 제4도에서, ($) 표시는 활성부위, (#) 표시는 보존된 시스테인 잔기를 각각 나타낸다.

아울러, 본 발명의 살모신 전구체는 메탈로프로테이네이즈의 아연(Zn) 결합부위를 구성하는 HEXGHNLGXHD(X는 IUPAC-IUB에 의해 명명된 자연계에 존재하는 20개 아미노산 중의 하나이다) 아미노산 서열, 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)의 활성부위를 구성하는 RGD(제4도에서 $로 표시됨) 및 그 주변의 아미노산 서열, 그리고 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 또한, 혈소판 응집 억제 펩타이드(disintegrin)들의 아미노산 서열 전체에 보존되어 있는 12개의 시스테인(제4도에서 #로 표시됨)이 모두 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 한국산 살모사의 독샘으로 부터 분리한 살모신 전구체의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 살모신 전구체를 제공한다. 본 발명의 살모신 전구체 cDNA는 190개 아미노산으로 구성된 프로-프로테인 영역, 216개 아미노산으로 구성된 메탈프로테이네이즈 영역 및 73개 아미노산으로 구성된 살모신 영역을 코딩하는 1440bp의 염기서열로 이루어져 있다. 살모신 전구체 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 혈소판 응집 억제 펩타이드(살모신)는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘 cDNA 라이브러리로 부터 분리한 하기와 같은 염기서열을 가지는 살모신 전구체.
2. 제1항의 살모신 전구체 cDNA로 부터 번역되는 하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 살모신 전구체.
3. 제2항에 있어서, 살모신은 407번째 아미노산 글루탐산(Glu)에서 479번째 아미노산 알라닌(Ala)까지의 73개 아미노산으로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 혈소판는 살모신 전구체.
4. 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로 부터 분리된 제2항의 아미노산 서열을 가지는 살모신 전구체.