JPS61149094A - 組換えｄｎａによつて製造されたヒト子宮組織プラスミノ−ゲン活性化因子 - Google Patents

組換えｄｎａによつて製造されたヒト子宮組織プラスミノ−ゲン活性化因子

Info

Publication number
JPS61149094A
JPS61149094A JP60216313A JP21631385A JPS61149094A JP S61149094 A JPS61149094 A JP S61149094A JP 60216313 A JP60216313 A JP 60216313A JP 21631385 A JP21631385 A JP 21631385A JP S61149094 A JPS61149094 A JP S61149094A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tpa
human uterine
uterine tpa
human
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP60216313A
Other languages
English (en)
Inventor
チヤーメー　ウエイ
ナンシー　シオン
ブイ　ビー　レデイ
ネツド　コール
リチヤード　ダグラス
ジエフ　レモン
ウイリアム　ダコウスキー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKU
INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKUSU Inc
Original Assignee
INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKU
INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKUSU Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKU, INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKUSU Inc filed Critical INTEGUREITETSUDO JIENETEITSUKU
Publication of JPS61149094A publication Critical patent/JPS61149094A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Control Of Ac Motors In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇粟上ム■亙分互 本発明は治療用蛋白質を産生ずるための組換えＤＮＡ技
術の使用、特に蛋白質、ヒト子宮組織プラスミノーゲン
活性化因子（ヒト子宮ＴＰＡ又はｕＴＰＡと略する）を
産生ずるためのこのような技術の使用に関するものであ
る。
災釆叫扱４ ＴＰＡ　（Ｔｉｓｓｕｅ　　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇａｎ　
　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）はプラスミン、ウロキナーゼに
続く第三世代の血栓溶解剤として注目されているもので
、その作用機序は、血液中のプラスミノーゲンに働きか
けてプラスミンとなし、このプラスミンが血栓を溶解す
るものである。
プラスミノーゲン活性化因子は、その存在分野として、
１．血液性（白血球、血小板）、２０組織性（子宮、前
立腺、卵巣、ＪＪＩ、血管）、３、分泌性（尿、乳汁、
唾液）、４．癌細胞性（Ｍｐ、１ａｎｏｍａ　　ｃｅｌ
ｌｓｙＨｅｌｌａ　　ｃｅｌｌＳ）等が挙げられる。
Ｒｉｊｋｅｎら、　「バイオヒミカ・エト・バイオフィ
ジカ・アクタ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ）Ｊ　、５８０，１４０　　（１９７９）には、
血中のプラスミンによりフィブリン凝塊を溶解する能力
のある２本鎖型へ活性化される１本鎖のチモーゲン型酵
素であるｕＴＰＡの、ヒト子宮組織からの部分精製につ
いて記載されている。ｕＴＰＡは、このように１種々の
血管病、特に心臓の中やそのまわりの凝塊に帰因する心
筋梗塞を患っている患者の凝塊を溶解するための治療用
成分として確かに有用である。
一方、プラスミノーゲンの組換えＤＮＡ技術としては、
Ｇｏｅｄｄｅｌら、ヨーロッパ特許公開第００９３６１
９号に記載されているように、癌細胞（ポーズ黒色腫細
胞）の一系列からｍ　ＲＮ　Ａを得、そのｍ　ＲＮ　Ａ
からボーズＴＰＡをコードしているｃＤＮＡを産生する
ことに以前から使用されている。
明が解決しようとする問題点 しかしながら、前記Ｒｉ　ｊ　ｋ　ｅ　ｎらの方法では
ｕＴＰＡのアミノ酸配列、およびそれに対応するｃＤＮ
Ａ配列は全く知られておらず、また天然のヒト子宮から
得られるＴＰＡは僅かであり、治療用に大量生産技術の
開発が望まれていた。
またＧｏｅｄｄｅｌらの方法は癌細胞からのＴＰＡに関
するもので、これを組換えＤＮＡ技術に適用して得られ
た産生物に発癌性の不安が全くないわけではない。
司　弘を解゛するための 本発明は上記従来技術のような欠点のない、血栓溶解性
を有し治療薬として有用なＴＰＡを提供するもので、ヒ
ト子宮組織からのＴＰＡに対応するｃＤＮＡに関するも
のであり、また組換え操作において、宿主として微生物
ばかりでなく真核宿主細胞（動物細胞）をも採用し得る
ものである。
すなわち、本発明は活性のあるヒト子宮ＴＰＡをコード
するｃＤＮＡ配列に関する。
また本発明は活性のあるヒト子宮ＴＰＡをコードするＤ
ＮＡ配列を形質転換された宿主細胞中で発現させること
ができる複製可能な発現ベクターおよびこのベクターに
より形質転換された宿主細胞１例えば酵母又は哺乳類動
物細胞に関する。
宿主たる酵母細胞としては、サツカロミセス・セレビシ
ェ、サツカロミセス・フラジリス、キャンディダ・ユテ
ィリス、キャンディダ・トロピカリス、サツカロミセス
・カールスパージェネス等が挙げられる。
また宿主たる動物細胞としてはマウス線維芽細胞：Ｃ，
１２７，Ｌ９２９，３Ｔ３、ウシ線維芽細胞：ＢＴ＠胞
、ウシ上皮細胞：ＣＰＡ、ＣＰＡＥ。
ＭＤＢＫ細胞等が挙げられる。
上記培養された形質転換細胞は、他のヒト蛋白質を含ま
ず、かつ非ｕＴＰＡを含まず、少なくとも９９重量％ま
で精製され得るｕＴＰＡを産生す゛　るために使用され
る。
ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａは哺乳類動物細胞培養培地から、又は酵
母の場合には細胞物質の抽出液から、より高いｕＴＰＡ
の比活性を有する組成を得るように、培地から非ｕＴＰ
Ａ蛋白質の部分を除去するための第一の液／液相抽出段
階を含む工程により精製される。
液／液相抽出段階は、培養液や抽出液を２種の異なる水
溶性の重合体化合物と混合して、一方の相に少なくとも
４ｏ容量％の培地又は抽出物中の水が存在する２指温合
物を形成させることにより行なう。２種の異なる水溶性
の重合体化合物の組合せとしては、ポリエチレングリコ
ール／デキストラン、ポリエチレングリコール／ポリビ
ニールアルコール、ポリエチレングリコール／ポリビニ
ールピロリドン、ポリエチレングリコール／フィコール
、ポリビニールアルコール／メチルセルロース、ポリビ
ニールアルコール／デキストラン等が挙げられる。
精製と濃縮は限外濾過および／または疎水性アフィニテ
ィクロマトグラフィ一工程をも含むことができる。好ま
しくは、ｕＴＰＡが抗ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ抗体に結合させら
れるアフィニティクロマトグラフィーもさらに含むこと
ができる。
さらに好ましくはｕ　Ｔ　Ｐ　Ａを生産する培養された
細胞の培地に対して、第１工程として疎水性アフィニテ
ィークロマトグラフィー、第２工程として抗体アフィニ
ティークロマトグラフィー、および第３工程としてゲル
濾過を実施することも含む。
走凰 本発明のｕＴＰＡに対応するｃＤＮＡは新規なりＮＡ配
列であり、このものを動物細胞を宿主とした組換えＤＮ
Ａ操作に付すことにより、ＴＰＡ本来の形態である糖蛋
白質としてＴＰＡを得ることができ、また分泌能力もあ
るため産生物の回収が容易である。
本発明のｕＴＰＡはその遺伝子の起源（正常なヒト子宮
組織）故に、ヒトにおけるｕＴＰＡの正常な生合成（真
核宿主細胞が使用される場合には。
多分グルコシル化された型を含む）を真似る発現ベクタ
ーによりコードされているので、その結果、蛋白質産物
はヒトの患者の中で自然に働くと考えられる。
ここで本発明の好ましい実施態様について記載する。
ましい　　　　の記 まず図面を説明する。
韮 第１図はフランキング領域を含むヒト子宮ＴＰＡ遺伝子
の塩基配列の図解表示であり、さらに子宮ＴＰＡ遺伝子
とポーズ黒色腫ＴＰＡ遺伝子（Ｇｏｅｄｄｅｌら、ヨー
ロッパ特許公開第０，０９３．６１９号）との相違が示
されている。ポーズＤＮＡが子宮ｃＤＮＡ中に存在する
ヌクレオチドを欠いている位置は＃ｌ　Ｘ　Ｈで示され
ている。子宮ＣＤＮＡがポーズｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ中に存在
するヌクレオチドを欠いている位置は”／”で示されて
おり、続いて欠損ヌクレオチドが示されている。
第２図は全ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の構築
図解表示である。
第３図は本発明の酵母（サツカロミセス　セレビシェ、
Ｓａｃｃｂａｒｒｏｍｙｃｅｇ　　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）の発現ベクターの図解表示である。
第４図は本発明の他の酵母の発現ベクターの図解表示で
ある。
第５図は本発明の哺乳類動物の発現ベクターの構築図解
表示である。
第６図は本発明の他の哺乳類動物の発現ベクターの構築
の図解表示である。
第７図は本発明の他の哺乳類動物の発現ベクターの構築
の図解表示である。
ヒト子　ＴＰＡｃＤＮＡのＡ ヒト子宮ＴＰＡをコードするｃＤＮＡは次の主工程に従
って産生されクローン化された。
１）全てのｍ　ＲＮ　Ａはヒト子宮組織から単離された
。
２）ｕＴＰＡのｍＲＮＡは全てのｍ　ＲＮ　Ａから濃縮
された。
３）ｃＤＮＡは３″と５’ｃＤＮＡ配列を与えるように
、ＴＰＡのｍ　ＲＮ　Ａから合成された。
４）３′と５’ｃＤＮＡ配列は中間体プラスミドベクタ
ー中で完全なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を与えるように結合さ
れた。
ｕＴＰＡのｍＲＮＡの ヒト子宮組織からのｍ　ＲＮ　Ａは次のようにして単離
した。４Ｍグアニジンチオシアネート、１Ｍ２−メルカ
プトエタノール、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＰＨ５，０
）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むグアニジンチオシア
ネート溶液４０ｍ１中で。
約３０ｇのヒト子宮組織を組織ホモジナイザーにより粉
砕した０次いでホモジネート１ｍｌ当り１ｇの塩化セシ
ウムを添加し、ホモジネートは３０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離した。
５０ｍ１の遠心管中の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５
，０）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび溶媒１ｍｌ当り１．
５９２ｇの塩化セシウムを含む「クッション４１５ｍ１
の上に、上澄液は重層され、２０℃で４５．ＯＯＯｒｐ
ｍ、２４時間遠心分離を行なった。ＲＮＡを含む白いバ
ンドが集められ。
塩化セシウム溶液は水で３倍に希釈し、次いで一２０℃
で２倍容のエタノールを加えることにより、ＲＮＡを沈
澱させた。沈澱は遠心分離により集めた。溶解、沈澱操
作を繰り返すことにより、混入する塩化セシウムを除い
た。約１１ｍｇの精製ＲＮＡが回収された。精製された
ＲＮＡは高塩濃度緩衝液［１０ｍＭｈリス塩酸（ｐＨ８
，０）、０゜５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．２％ドデシ
ル硫酸ナトリウム〕中のオリゴ−ｄＴセルロース１ｍｌ
のアフィニティカラムの上に載置し、エタノール沈澱に
より濃縮して３００Ｐｇの濃縮ＲＮＡを得た。
ＲＮＡはＳＷ４１チユーブの中で０．１Ｍトリス塩酸（
ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１％ドデシル硫酸
ナトリウムおよび５０％ホルムアミドを含む２００．−
１の溶液中に溶解させた。チューブは３５０００ｒｐｍ
、１５℃で１６時間遠心分離した０両分が集められ、そ
れぞれの両分のＲＮＡの大きさは３Ｈで標識された４Ｓ
、１８Ｓ、２８Ｓ内部標準により決定された。
ＴＰＡのｍＲＮＡを含む両分は３Ｚｐで標識されたプロ
ーブを用いたノーザンブロッティング分析により同定さ
れ、集められた。等容の０．４Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ
５、で希釈し、希釈液の２゜５倍容のエタノールで沈澱
させることにより１ｍＲＮＡをグラディエンドから回収
した。回収されたＲＮＡになお混在するホルムアミドは
溶解、沈澱を繰り返すことにより除いた。
ｕＴＰＡのｃＤＮＡの３′配りの産生 ｕＴＰＡのｃＤＮＡの最初の１本鎖は下記に従って単離
されたｍＲＮＡから産生じた。５０ｍＭトリス塩酸、ｐ
Ｈ８，３，５０ｍＭ塩化カリウム。
８ｍＭ塩化マグネシウム、それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、２５．−ｇ／　ｍ　１
オリゴ−ｄ　Ｔ、２−、、、５０１．　ｇアクチノマイ
シンＤ、３０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０゜５　
　ｍＣ４／ｍｌ　　ｄＣＴＰ、５０単位ＲＮＡ５ｉｎお
よび４０単位のＡＭＶ逆転写酵素を含む全容５０、、Ｌ
中で、ＲＮＡは３７℃、１時間インキュベートし、２０
ｍＭ　　ＥＤＴＡの添加により反応停止した１次いで反
応混合物は１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡおよび０１１％ドデシル硫酸ナトリウムで
平衡化し、５０．−ｇのＥ、ｃｏｌｉｔＲＮＡでプレク
ロマトグラフされたセファデックスＧ−１００カラムに
載せた。
ｍ　ＲＮ　Ａ　−ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドを含む両
分を集め、エタノールの添加により沈澱させた。回収し
たハイブリッドは０．５Ｎ苛性ソーダで３７℃で数時間
処理し、氷酢酸で中和し、そしてエタノールで沈澱させ
た。
ヌクレオチド３リン酸は下記の方法で高塩濃度−エタノ
ール沈澱により除いた。２０〜５０．μｌの水にＤＮＡ
を先ず溶解し１等容量の４Ｍ酢酸アンモニウムを加えた
、それから２倍容のエタノールを加えた後、−７０℃に
保った。この溶液を室温に戻した後、遠心分離によりＤ
ＮＡをペレット化した。この操作をさらに２回繰り返し
た後、ベレットを７０％エタノールで１度洗浄したこと
により、ＴＰＡ遺伝子の３′末端側の大部分に対応する
ｃＤＮＡの精製された最初の１本鎖が得られた。
５０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳＩＩ衝液（ｐＨ６，９）、１０
ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ　　ＤＴＴ、７０ｍＭ塩
化カリウム、各々０．５ｍＭのｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含む全容１００７−１
中で、ｃＤＮＡの最初の１本鎖は第２の１重鎖ｃＤＮＡ
の合成に用いられた。この混合物に２０革位のＤＮＡポ
リメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片を１５℃で２０時間の間に
加えた。ＤＮＡはフェノールおよびクロロホルム１：１
（ｖ／ｖ）の混液で抽出し、エタノールで沈澱させた。
ヘアピン構造を除くために一３０ｍＭ酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，５）、０．３Ｍ塩化ナトリウム。
４．５ｍＭ塩化亜鉛およびＳ１ヌクレアーゼを含む全１
００．−１中で、２重鎖のｃＤＮＡは室温で３０分間Ｓ
１ヌクレアーゼで処理した０次いでＥＤＴＡと１Ｍトリ
ス塩酸、ｐ）Ｉａ、Ｏをそれぞれ１０ｍＭと０．１Ｍの
終濃度になるように加えて、反応を停止した。ＤＮＡは
前記したように、フェノール−クロロホルム抽出と高塩
存在下のエタノール沈澱を繰り返すことにより精製した
。
精製された２重鎖のｃＤＮＡ配列は次のようにしてクロ
ーン化したｍ　６０　ｍ　Ｍ力コジレート−０゜１Ｍｌ
−リス塩酸（ｐＨ７，６）、１ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　　ｄＣＴＰおよび０．２７、、Ｃｉ／、
−１（’Ｈ）ｄＣＴＰを含む全反応容量１００１．、、
ｌ中で、２重鎖ｃＤＮＡにまずオリゴ−ｄＣを付加した
。１０ｍＭの塩化コバルトは最終濃度１ｍＭになるよう
に最後に加え、１５℃で１０分間、５０単位の末端転移
酵素を加えた。ＥＤＴＡをｊＯｍ　Ｍに、ドデシル硫酸
ナトリウムを０゜１％になるように加えることにより、
反応を停止し、水で２倍に希釈した。次いでこの反応混
合物はアガロース電気泳動にかけ、５００ｂｐ又はそれ
以上のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをゲルから回収した。
オリゴ−ｄＣを付加されたｃＤＮＡは、ＰｓｔＩで直線
状にされたオリゴ−ｄＧを付加したｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と１５ｍＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ７。
５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む全容０．５ｍｌ中で、６５℃で１０分間、さらに
４２℃で２時間アニール処理をされた６アニールされた
ｃＤＮＡは塩化カルシウムで前処理し、凍結乾燥されて
いたコンピテント旦、！！±土（ＭＣ１０６１）細胞２
．５ｍｌを形質転換するのに使用された。細胞とＤＮＡ
の混合物は氷上に２０分間保持し、３７℃で７分間熱処
理し、３７℃で４５分間、２０容のし培地と共にインキ
ュベートした後、１５．−ｇ／ｍｌのテトラサイクリン
を含むし一プレートに播いた。
組換体クローン体はニトロセルロースフィルターに移さ
れ、そしてフィルターは生きたクローンを保存するため
に、テトラサイクリンプレート上に置いた０組換体クロ
ーンのレプリカを含む第２組のフィルターはプラスミド
の増殖のために３７℃で１晩クロラムフエニコールプレ
ートに置いた。
フィルターはＤＮＡを曝すために処理した。フィルター
のプレハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド
、３ＸＳＳＣ１５ＸＤｅｎｈａ　ｒ　ｔ’ｓ、０．１％
ドデシル硫酸ナトリウムおよび１００、　ＬＡｇ／ｍ　
ＩＥ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　ｔＲＮＡを含む溶液中で、４２
℃で２時間又はそれ以上行った。ＴＰＡのｃＤＮＡ配列
を含む　Ｐで標識されたプローブはプレハイブリダイゼ
ーション溶液に添加し、４２℃で１８時間又はそれ以上
、フィルター上のＤ上のＤＮＡとハイブリダイズさせた
。次いでフィルターは６５℃で３０分間、３ＸＳＳＣ１
０，１％ドデシル硫酸ナトリウム中で４回、そして室温
で３０分間、３ｘｓｓｃ中でもう１度洗浄した。
フィル−ターは風乾し１次いで一７０℃で１６時間。
増感スクリーンを有するコダックＭＡＲ−５Ｘ線フィル
ムに露出させた。
１０個の陽性と推定されるクローンを単離し。
サブクローン化し、そして前述の方法により再スクリー
ンした。繰返し陽性シグナルを示すクローンのみが制限
酵素切断により解析された。ｐＵＰＡ３７２と呼ばれる
クローンは最も大きいｃＤＮＡインサート、２．１５ｋ
ｂを含んでいた。
ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａの５′　Ｊの産生 最も大きいｃＤＮＡクローンでさえｕＴＰＡをコードし
ている全配列を含んでいなかったので、欠けている５′
配列を単離するために次の戦略が用いられた。ｍ　ＲＮ
　Ａは大きさによる選別をしないということを除いて、
上述の如く単離した。次いで最初の１木調ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａは下記の如くプライマー伸長法により合成した。ＴＰ
ＡｃＤＮＡの７２ｂｐのＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド５
５２−６２４）が８０％ホルムアミド、１０ｍＭ　　Ｐ
ＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６，４）、０．４Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．２５．−ｇの７２ｂｐ断片、そして７０Ｐｇの
ｍＲＮＡを含む１００．−１の反応混合物中で、ｍＲＮ
Ａにアニールさせられた。この混合物は８５℃に５分間
加熱し、そしてハイブリダイゼーションのために５０℃
で２０時間インキュベートした。
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは水による３倍希釈と一２
０℃１晩のエタノール沈澱により緩衝液から回収した。
ｍＲＮＡの溶解、沈澱操作を不純物を除くためにもう１
度繰り返した。最初の１本鎖のｃＤＮＡ合成条件はオリ
ゴ−ｄＴが省かれたことを除いて、３′配列に用いられ
た条件と同じである。
第２の１本領ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼ■−Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片のブライマー（ヌクレオチド１−１５）とし
て合成ペンタデカマーＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＴ
を用いて合成した。５００ｎｇのペンタデカマーが５０
ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６，９）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、そして７０ｍＭ塩化カリウムを含む１
００，１中の最初の１本領ｃＤＮＡと５分間、６５℃で
、１５分間、６５℃から４３℃で、１５分間、４３°Ｃ
でアニールさせられ、次いで混合物は使用するまで氷上
に保持した。２重鎖のｃＤＮＡは３′配列に対して上述
したと全く同様に合成しクローン化した。
ブレーティング、スクリーニング、サブクローニング後
、１個のクローン、ｐＵＰＡ４３２と呼ばれる。が同定
されたが、そのクローンは欠けている５′コ一デイング
配列を含み、そしてクローンｐＵＰＡ３７２に６０ｂｐ
重複していた。
全長ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの構ヒト子宮ＴＰ
Ａ遺伝子をコードする全ｃ　ＤＮＡクローンを構築する
前に、５′と３′部分の遺伝子の塩基配列を決定した。
これはＭ　ａ　ｘ　ａ　ｍ　−Ｇ　１ｌｂｅｒｔの化学
分解法とＳａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーション法の組み合せを用いて、クローンＰ
ＵＰＡ４３２　（５’コ一デイング配列）とｐＵＰＡ３
７２（３’コ一デイング配列）を解析することにより行
なわれた。
得られた塩基配列は第１図に示されている。
遺伝子の配列が決定された後、第２図に図解された如く
、完全なｃＤＮＡ遺伝子を構築した。
プラスミドｐＵＰＡ４３２　（５’配列）は先ず、Ｂｇ
ｌ　　ＩとＢｇｌＩＩの組み合せで消化した。４００ｂ
ｐのＢｇｌ　　Ｉ−Ｂｇｌ　　ＩＩ断片がポリアクリル
アミドゲルから単離され、そしてさらにＨａｅ　ＩＩＩ
にて部分的に消化した。得られたＢｇｌＩＩ　−Ｈａ　
ｅ　ＩＩＩ断片（ヌクレオチド１１７−３８７）はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
断片Ｐｓｔ　　Ｉ−Ｎａｒ　　Ｉ　　（ヌクレオチド３
２１−４４８）はｐＵＰＡ３７２のＰｓｔＩとＮａｒ　
　Ｉの組合せでの消化とそれに続くゲル電気泳動とによ
り単離した。この断片は６１ｂｐのＨａ　ｅ　ｌｌｌ−
Ｎａ　ｒ　　Ｉ断片を生じさせるためにＨａｅＩＩＩに
よってさらに消化した。
上記ｐＵＰＡ４３２からのＢｇｌＩＩ−ＨａｅＩＩＩ断
片とｐＵＰＡ３７２からのＨａｅＩＩＩ−Ｎａｒ　　Ｉ
断片はＢａｍＨＩとＮａｒＩの組合せによる消化で直線
状にされたｐＢＲ３２２にクローン化した。得られたク
ローン、ｐＵＰＡ−ＢｇｌＩＩ／ＮａｒＩと呼ばれる、
からＢｇｌ　　ＩＩ−Ｎａｒ　　Ｉ断片（ヌクレオチド
１１７−４４８）を単離した。
プラスミドｐ　Ｕ　Ｐ　Ａ　３７２中のヌクレオチド２
０９１位のＢｇｌＩＩ部位は、ＢｇｌＩＩによりプラス
ミドを消化し、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端を形
成し、５ａｌＩリンカ−、ｄ　（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）を
加え１次いでＥ、ｃｏｌｉにクローン化することにより
ｐ　Ｕ　Ｐ　Ａ　３７２−　Ｓ　ａ　ＩＩを生じさせて
、Ｓａｌ　　Ｉ部位に変換させた。
ＮａｒＩとＳａｌ　　Ｉとによる二重消化によって。
ｐＵＰＡ３７２−５ａｌ　　Ｉの次の断片はＮａｒＩ−
３ａｌＩ断片（ヌクレオチド４４８−２０９１）を産生
じた。
次に子宮ＴＰＡｃＤＮＡのリーダー配列がＧ−Ｃテイル
を除き、５ａｌＩ部位を導入することによりｐＵＰＡ４
３２から工作された。この５ａｌＩ部位はＰｓｔ　　Ｉ
消化物からのｃＤＮＡの単離、５ｆａＮＩによる５′非
翻訳部位の切断、ＤＮＡポリメラーゼＩによる平滑末端
形成、５ａｌＩリンカ−付加、Ｓａｌ　　ＩとＢｇｌＩ
Ｉの組合せによる消化、そしてＢａｍ　ＨＩとＳａｌ　
　Ｉとによる二重消化により直線化されたｐ　Ｂ　Ｒ３
２２ベクターへのクローン化により導入した。操作され
た子宮ＴＰＡリーダーはＸｈｏＩＩとＳａｌ　　Ｉ消化
の組合せによりベクターから切り取られた。
このＳａｌ　　Ｉ−Ｂｇｌ　　ＩＩ断片（ヌクレオチド
７−１１７）は上述のＢｇｌ　　ＩＩ　　Ｎａｒ　　１
．Ｎａｒｌ−８ａｌＩ、そして直線状にされたｐＢＲ３
２２を結合することにより形成されたＳａｌＩ−ＢｇＩ
ＩＩ断片（ヌクレオチド１１７−２０９１）に継ぎ合せ
られた。
結合と形質転換の後、Ｓａｌ　　Ｉ部位を両端につけた
全子宮ＴＰＡ遺伝子はｐ　Ｕ　Ｃ９ベクターにクローン
化した。このＰ　Ｕ　Ｃ９−ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａプラスミド
は引き続き行なわれた発現ベクター構築のための中間体
として使用された。
酵　の　　ベクター 酵母の発現ベクターは酵母のプロモーターとシグナル配
列が成熟蛋白質（すなわちｕ　Ｔ　Ｐ　Ａシグナルを除
く）をコードするｕ　Ｔ　Ｐ　ＡのｃＤＮＡ部分に先立
つように作られ得るか、又は代りにベクターは酵母のプ
ロモーターを含むが酵母のシグナルを含まないようにで
きる。
この際、ｕＴＰＡｃＤＮＡはＴＰＡシグナルを含む未成
熟蛋白質をコードする。換言すれば、シグナル配列は酵
母又はｕＴＰＡ起源のどちらでもあり得る。下記の個々
のベクターが他の蛋白質よりもむしろ活性のあるｕＴＰ
Ａを発現するという事実を除いて、Ｌａｍｍｏｎｔｔ等
の米国特許出願番号第６３６３６５号および第６２９２
０２号に記載された方法と似た方法に従ってベクターは
作られた。これにより、これらの米国特許出願を本明細
書中に引用して包含する。従って構築の詳細ではなく、
ベクターの構造だけが示される。
のシグナルを　むベクター 第３図に示されるように、酵母のＲ現ベクターｐＹＢＤ
Ｔ−６（Ｅ、ｃ　ｏ　ｌｉに保持されたものがアグリカ
ルチュラル　リサーチ　カルチャーコレクション（ＮＲ
ＲＬ）に受託番号Ｎｏ、Ｂ−１５８８３として寄託され
ている〕は（特異的にＢａｍＨＩ部位から始まって反時
計回りで）次のようなりＮＡ断片から成り立っている。
Ｂ　ａ　ｍ　　ＨＩ　−Ｂ　ｇ　Ｉ　　ＩＩは酵母のＰ
Ｈ○５プロモーターとシグナル配列、さらに第１図に示
されるようなＧｌ　ｙ　（６）　、　Ａｌ　ａ　（−５
）　、　Ａｒｇ（−４）をフードする合成りＮＡ配列を
内包する。この断片は約０．６ｋｂの長さである。
Ｂｇｌ　　ｌｌ−５ａｌ　　Ｉは上記の子宮由来のＴＰ
ＡｃＤＮＡを含む、この断片は成熟蛋白質と約０゜４ｋ
ｂの３′非翻訳領域を含む。この断片は約１゜９７５ｋ
ｂの長さである。
Ｓａｌ　　Ｉ　　（Ｓａｌ　　ＩＩＸｈｏ　　Ｉ）は元
来ＴＲＰ　１遺伝子のＨ４ｎｄ　ＩＩＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ
断片であったところのＴＲＰＩ”ターミネイター″領域
を含む。この断片は約０．２４０ｋｂの長さである。
（Ｓａ　Ｉ　　ＩＩＸｈｏ　　Ｉ）−Ｘｈｏ　　ＩはＴ
ＲＰｉ遺伝子のＥｃｏ　　ＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ断片を含
む。
Ｘｈ−ｏ　　Ｉ−Ｘｈｏ　　１．これはＡＭＰ’　とＯ
ＲＩを内包するｐ　ＢＨ３２２の断片である。この約２
．１ｋｂの断片はｐＢＲ３２２地図上の部位２２４６か
ら部位４３６０のｐ　ＢＨ３２２の部分にほぼ相当する
。
Ｘｈｏ　　Ｉ−Ｂａｍ　ＨＩ　；この断片は２−ミクロ
ン環、Ｉｔ　Ｂ　ＨＩ型の約２．２ｋｂのＥｃｏＲｒ断
片である。
ＴＰＡシグナルを　　するベクター 第４図に示されるように、２断片を除いて酵母の発現ベ
クターｐＹＢＤＴ　−１０（Ｅ、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉに保
持されたものがＮＲＲＬに受託番号Ｎｏ、Ｂ−１５８８
４として寄託されている）はＰＹＢＤＴ−６と同一であ
る。それらの２断片は１）Ｂａｍ　　ＨＩ−Ｂｇｌ　　
ＩＩ断片ではなく、ｐ’ｙＢＤＴ−１０では３′挿入部
位がＳａｌ　　Ｉリンカ−を結合されたＰＨ０５プロモ
ーター領域を含むＢａｍＨＩ−５ａｌＩである。この断
片は約０゜５２ｋｂの長さである。
２）Ｂｇｌ　　ｌｌ−８ａｌ　　Ｉ断片ではなく、ｐＹ
ＢＤＴ−１０はシグナルを内包する未成熟蛋白質をコー
ドする子宮ＴＰＡｃＤＮＡを含むＳａｌ　　ｌ−５ａｌ
Ｔである。
の　　ベクター 酵母の発現ベクターに加えて、哺乳類動物発現ベクター
もヒトの子宮のＴＰＡの産生用に作ることができる。酵
母の場合のように、各種の補助ＤＮＡ断片が子宮のＴＰ
ＡＤＮＡの転写と翻訳を遂行すると共に細胞の形質転換
を遂行するために使用されうる。
ここに培養哺乳類動物細胞内でヒト子宮のＴＰＡの産生
のための個々の発現ベクターについて記述する。ここに
記述されるベクターは宿主の哺乳類動物細胞の形質転換
に使用される前はＥ、ｃ。
土工ＲＦ　　３２２株に維持される。
第５図に示されるように、哺乳類動物発現ベクターＣＬ
２８−ｕＴＰＡ−ＢＰＶを下記のようにして構築した。
このベクターにおいてｕＴＰＡ遺伝子はマウスのメタロ
チオネイン（Ｍ　Ｔ）プロモーターの制御下にあり、宿
主細胞の形質転換はウシのバピロマウィルス（ＢＰＶ）
により遂行される。
２個の出発プラスミドはｐ　Ｕ　Ｃ９−ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ
（ＴＰＡ遺伝子を含む、上述）と、５Ｖ４０ＤＮＡが除
かれ、そしてＭＴプロモーターの近くにＢｇｌＩＩ部位
ではなく、Ｘｈｏ制限部位を置いたｐＣＬ２８　（Ｈａ
ｍｅｒら、「ジャーナル　オブモレキュラー　アプライ
ド　ジェネティクス（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌｉｅｄ　　
Ｇｅｎ、）Ｊ＋上、２７３　（１９８３）にｐＪＹＭＭ
Ｔ　（Ｅ）として記述〕の誘導体であるｐ　ＣＬ　２８
−　Ｘ　ｈ　ｏである。
プラスミドｐＵＣ９−ｕＴＰＡはＳａｌ　　ｒで消化し
、モしてｕＴＰＡ遺伝子を含む２０９８ｂＰ断片をｐＣ
Ｌ２８−ＸｈｏのＸｈｏ　　Ｉ部位に挿入し、ｐ　ＣＬ
　２８−　ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａを形成した。ＰＣＬ　２８−
　ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ中においてｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ遺伝子はＭ
丁プロモーターとＭＴの構造遺伝子の間にある。
次の段階において、全ＢＰＶゲノムを含むプラスミドｐ
Ｂ２−２がＢａｍＨＩとＳａｌ　　Ｉとにより消化され
ることによって、全ＢＰＶゲノムとｐＢＲ３２２ＤＮＡ
の一部を含む断片を得た。この断片は１３’ａｍＨＩと
Ｓａｌ　　Ｉによる消化により直線状にされたｐ　ＣＬ
　２８−　ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａに挿入することによって、プ
ラスミドｐ　ＣＬ　２８−　ｕ　Ｔ　ＰＡ−ＢＰＶを得
た。
プラスミドＢＭＴＨ−ｕＴＰＡ 第６図に示されるように、哺乳類動物の発現ベクターＢ
ＭＴＨは上述のｐＣＬ２８−ｕＴＰＡとメリーランド州
、ベセスダ市のアメリカ国立衛生研究所のＤｅａｎ　　
Ｈａｍｅｒから入手したＰＢＭＴＨｌを用いて構築した
。プラスミドＰＢＭＴＨ１はＭＴの構造遺伝子、そして
一端にＢＰＶの６９％の形質転換領域および他端にＢＰ
Ｖの残り３１％の形質転換領域が継かったＭＴプロモー
ターを含む。
ＭＴ遺伝子を含むｐＢＭＴｌ（ｌのＨｉｎｄＩＩＩ断片
は除かれ、そしてＭＴ遺伝子に挿入されたＵＴＰＡ遺伝
子を含むｐ　ＣＬ　２８−　ｕ　Ｔ　Ｐ　ＡのＨｉｎｄ
ＥＩＩ断片と入れ替えた結果、プラスミドＢＭＴ　Ｈ−
ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａが得られた。
プラスミド　ＣＡＴ 第７図に示されるように、プラスミドｐＵＰＡ３７２（
第１図に示されたように３７２ｂｐから始まるｕ　Ｔ　
Ｐ　Ａ配列および配列の残りを含む子宮ＴＰＡのｃＤＮ
Ａプラスミド）はＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、Ｂ
ｃｌＩとＥｃｏＲＩで切断されたウィルス５Ｖ４０ＤＮ
Ａに結合させた。
ライゲーション反応混液はｐＢＲ３２２のＥｃ。
Ｒ１部位にクローンされ、プラスミドｐＴＰＡ−Ａを得
た５ ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａの転写の方向を変えるため、プラスミド
ｐ　ＣＬ　２８−　ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ　（第５図）をＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断し、そして高ＤＮＡ濃度で再結合させ
たｅ　Ｅ　ｃ　ｏ　　ＲＩとＢａｍ　　ＨＴとにより切
断することによるスクリーニングの結果、組換えプラス
ミドｐＣＬ２８ＸＴＨ３が選ばれた。
ｐＴＰＡ−ＡとｐＣＬ２８ＸＴＨ３は共にＳｍａＩとＢ
ａｍ　ＨＩとで消化、結合してｐＣＬ２８ＸＴＨ３Ａを
得た。ｐＣＬ２８ＸＴＨ３ＡはｐＣＬ２８ＸＴＨ３中の
１．５ｋｂのメタロチオネイン断片に入れ替って２３７
ｂｐの５Ｖ４０ＤＶＡ断片を含んでいるにの構築におい
てｕＴＰＡの発現はＭＴプロモーターと、そして−ｕ　
Ｔ　Ｐ　Ａ遺伝子（ＭＴ構造遺伝子は欠損しているので
）の下流にあるＳＶ４０の初期ポリＡシグナル配列のみ
の使用に依存している。
プラスミドｐＣＬ２８ＸＴＨ３ＡとｐＢ２−２（上述）
はＢａｍＨＩとＳａｌ　　Ｉで切断し、そしてｐＢ２−
２からのＢＰＶＤＮＡはＢａｍＨＩ−５ａｌＩ断片とし
て挿入した。得られた構築物はＰＣＡＴである。
ＩＩＭ乳　動物細胞の形質転 ｐＣＬ２８−ｕＴＰＡ−ＢＰＶまたはＰＢＭＴＨ−ｕ　
Ｔ　Ｐ　ＡプラスミドＤＮＡはＷ　ｉ　ｇ　ｌ　ｅｒら
「セル（Ｃｅｌｌ）Ｊ、１上、２２３　　（１９７７）
のトランスフェクション技術の変法を用いて、下記の如
くマウスＣ１２７細胞へ導入した。
５　、、　ｇのＤＮＡを１０．−ｇのキャリヤー、サケ
精子ＤＮＡを含む２４０ｍＭ塩化カルシウム溶液に加え
た。この溶液は等容のｐＨが７，１の２×ＨＢＳ　（２
８０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、および
１．５ｍＭリン酸ナトリウム）中に泡立てながら混入さ
せた。リン酸カルシウムは室温で３０分間形成させ、そ
して５ＸＩＯ’Ｃ１２７細胞はトランスフェクションの
２４時間前にプレートされた。リン酸カルシウム沈澱物
形成中に細胞増殖培地を交換した。リン酸カルシウムの
沈澱は細胞に加えられ、３７℃で６−８時間インキュベ
ートした。ＤＮＡは除かれ、そして細胞は室温で１〜２
分間リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の２０％グリ
セリンにさらした。細胞はＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ
胎児血清（ＭＡ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ペニシ
リン／ストレプトマイシンと１０ｍＭグルタミン（ＧＴ
ＢＣＯ）を含む１０ｍ１のＤｕｌｂｅｃｃｏの変法培地
を加えた。フォーサイは１４−２１日後に認められ、そ
して２１日後にりａ−ニング環法により単離した。
形質転換細胞は常法により培養され、そしてＴＰＡは常
法により培養液から継続的に採取した。
ｐＣＬ２８−ｕＴＰＡ−ＢＰＶ又はｐＢＭＴＨ−ｕＴＰ
Ａを含む形質転換されたマウスＣ１２７細胞は２４−２
８時間毎に培地交換さえすれば、コンフェルト細胞培養
として６０日まで生存する。
細胞は形質転換細胞の増殖特徴をもって、フラスコやロ
ーラーボトル中で継続的に２分割する。ＰＣＡＴを含む
形質転換されたＣＩ　２７細胞はより短時間、細胞培養
状態で生存するが、より高率でｕＴＰＡを産生ずる。
ＢＰＶベクター（これが増幅されたＤＮＡコピー数を与
える）中にｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ産生を制御する強力なメタロ
チオネインのプロモーターとＢＰＶ形質転換細胞の継続
的増殖特性の組合せはｕ　Ｔ　Ｐ　Ａの多量生産にとっ
て最適のシステムを供給する。
酵母細胞の形　−換 宿主酵母細胞〔サツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）は通常
、Ｂｅｇｇｓ、ｒネイチャー（Ｎａｔｕ−ｒｅ）Ｊ　、
２７５，１０４−１０９　（１９７８）に記載されてい
るように、常法に従って酵母の発現ベクターを使用して
形質転換した。宿主細胞はトリプトファン要求性を引き
起こすＴＲＰ１変異を有し、一方プラスミドは機能し得
るＴＲＰ遺伝子をもつ６形質転換株はこのようにトリプ
トフアンプロトトローフとして選ばれた。形質転換され
た宿主酵母細胞は、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　　ａｎｄ　　Ｄ
ａｖｉｓ、ｒプリンシプルズ　アンドプラクチイス　オ
プ　リコンビナント　ＤＮＡリサーチ　ウィズ　イース
ト　イン　ザ　モレキュラー　バイオロジー　オブ　ザ
　イースト　サン力ロミセス：メタボリズム　アンド　
ジーン　エクスプレッション（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　
　ａｎｄ　　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ｏｆ　　Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ｗｉ
ｔｈＹｅａｓｔ）　　ｉｎ　　　Ｔｈｅ　　　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　　　ｏｆ　　　ｔｈｅ　　
　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｍｅｔｈａ
ｂｏｌｉｓｍ　　　ａｎｄ　　　Ｇｅｎｅ　　　Ｅｘｐ
ｒ　　ｅ　ｓｓ　　ｉ　。
ｎＪ　　、　　ｐｐ６０７−６３６．Ｃｏ１ｄ　　　Ｓ
ｐｒ　　ｉｎｇ　　　Ｈａｒｂｏｒ　　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　Ｈａｒｂ
ｏｒ、ＮＹ　　（１９８２）に記載された方法を通常用
いる標準酵母培養培地中で増殖させた。
宿主酵母細胞を形質転換するために環状のプラスミドＰ
ＹＢＤＴ−６とｐＹＢＤＴ−１０を使用するよりもむし
ろ、これらのベクターはｐ　ＢＲ３２２配列を除去する
ＸｈｏＩを用いて形質転換に先んじて直線状にし、直線
状にされたベクターを形質転換に用いることができる。
再環状化は宿主細胞内で起る。この処置はベクターのコ
ピー数を減じるか、さもなければｕＴＰＡＲ現を干渉す
る可能性をもつ全ての細菌の配列を除去するという潜在
的利益を有する。
培地からのｕＴＰＡの抽出と　製 酵母によって生産される活性型子宮ＴＰＡはガラスピー
ズを用いて細胞を破砕することにより作られた抽出物か
ら回収される。組換え哺乳類動物細胞によって生産され
る活性型子宮ＴＰＡは宿主細胞培地から回収される。細
胞抽出物又は培地からの活性型ｕＴＰＡの精製は通常、
１）液体／液体相抽出、２）疎水性アフィニティ・クロ
マトグラフィー、及び／又は３）抗体アフィニティ・ク
ロマトグラフィーの工程を含む。さらに詳細には。
これらの工程は次の如〈実施される。
韮婆Ｚ辰狭皿迫蛋 第１工程の液体／液体相抽出は急速な容量減少と培地中
の多くの非ＴＰＡ蛋白質の除去を達成するが、他方にｕ
ＴＰＡ活性の多くを保持するので。
大スケールでのｕＴＰＡ生産にとってはきわめて重要で
ある。一般に液体／液体相抽出工程は２つの水可溶性の
重合体化合物、例えばデキストランおよびポリエチレン
グリコールと培地を組合わすことにより行なわれ、これ
は２層の形成を引き起し、これらの内の１つは捨てられ
る（液体／液体相抽出はよく知られた蛋白抽出技術であ
り、Ｊ。
ｈａｎｓｓｏｎら「ヨーロピアン・ジャーナルわオブ・
バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ　ｉ　。
ｃｈｅｍ、　３３．　’３７９　３８６　（１９７３）
に記載されている。）。
好ましい液体／液体抽出工程はｕＴＰＡを含む血清不在
培地又は血清含有培地をＴｗｅｅｎ８０で０゜１％（ｖ
／ｖ）まで希釈し１次いで最終濃度が４％（４０ｇ／ｌ
）になるように粉末デキストランを添加することを含む
。
デキストランは溶けるまで混合し、そしてポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）６０００が最終濃度が１２％（１
２０ｇ／ｌ）になるように加える。
該溶液は十分混合し、相分離を達成するために１０分間
Ｉｎｔｅｒｎａｔ　１ｏｎａｌ冷却型遠心分離機を用い
て１２０Ｏｒｐｍで２００　ｍ　ｌボトル中で遠心分離
する。上部相は傾瀉し、下部のデキストラン相をプール
する。初期蛋白の約４０％と共に、初期ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ
活性の７５％の回収が達成される。５０％以上の容量減
少を伴なって、６倍の濃縮が達成される。液体／液体抽
出操作は細胞破片や血清含有培地中に通常見出される複
合成長因子、例えば上皮細胞成長因子、トランスフェリ
ン及びインスリンの存在にもかかわらず有効であること
が見出されている。
疎水性アフィニティ・クロマトグラフィー次の工程は前
の工程からの濃縮材料中に存在するｕＴＰＡを、ｕＴＰ
Ａは結合できるが培地中の他の蛋白の成るものは結合で
きない成る種の色素。
例えばトリスアクリルブルー（ＬＫＢ）又はＣＭアフィ
ーゲルブルー（Ｂｉｏ　　Ｒａｄ）に結合させることを
含む（アフィーゲルブルーは硫酸アンモニウム沈澱およ
びＰ−アミノベンズアミニシン−セファロースクロマト
グラフィーと連結してヒト神経芽細胞腫株から単離され
るプラスミノーゲン活性化因子に対する異なった精製ス
キームにおいて用いられている〔バイオヒミカ・エト・
バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。
Ａｃｔａ）、７０４，４５０　４６０（１９８０））。
この工程は好ましくは次の如〈実施される。前の工程か
らのデキストラン相の容量を粘度を減少させるために水
を加えて２倍にする。リン酸塩で緩衝化された食塩水、
０．１％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７，２で平衡化した５０ｍ１
のトリスアクリルブルー（Ｌ　Ｋ　Ｂ）マトリックスを
１リットル当り加える。この溶液は２時間４℃でゆるや
かに混合し、それからリン酸塩で緩衝化した食塩水、０
．１％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ、ｐＨ７，２と０．５Ｍ塩化ナト
リウム、０．０２Ｍリン酸塩、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、
ｐＨ７，２を用いて回分方式で洗浄する。該物質はゲル
フィルトレイジョンカラムに注ぎ１次いで３．０Ｍチオ
シアン化カリウム、０．０２Ｍリン酸塩、０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ、ｐＨ７，２を用いてトリスアクリルブルーマ
トリックスから溶出する。　前工程から４倍濃縮がこの
工程において達成される。デキストラン相からの直接的
なｕＴＰＡの結合は塩濃度の急速な変化を許し、ｕＴＰ
Ａの純度を増加する。
上述の溶出工程に対して、３Ｍチオシアン化カリウムを
用いるよりむしろ他の塩、例えば食塩が用いられ得る。
その−例はＣＭアフイーゲルブルー（Ｂｉｏ　　Ｒａｄ
）で、これはｕ　Ｔ　Ｐ　Ａと同じ程度に十分結合し、
そしてトリスアクリルブルーと同じパターンでｕ　Ｔ　
Ｐ　Ａを溶出する。
試薬類の濃度は上記２つの精製工程の各段階において変
えられ得る。例えば液体／液体抽出工程において用いら
れるデキストランとＰＥＧの濃度はデキストラン（下部
）相よりもむしろＰＥＧ（上部）相にｕ　Ｔ　Ｐ　Ａ活
性を移動するように変えられることができる。この場合
、傾瀉された物質は蓄えられ、上部相は捨てられる。
アフィニティ　クロマトグラフィー 次の工程は、ここでは精製の大部分が達成されるが、固
体支持カラム上に固定化された抗ＴＰＡ抗体を用いるア
フィニティクロマトグラフィーを含む。通常の技術に従
って作られるポリクロナールまたはモノクローナル抗体
の何れかが用いら、ｈ得る。
好ましいアフィニティクロマトグラフィ一工程は次の如
く行われる。トリスアクリルマトリックスから溶出され
る物質はチオシアン化カリウムを除去するために、１．
０Ｍ塩化ナトリウム、０１０１％Ｔｗｅｅｎ、０．０２
Ｍリン酸塩、ｐＨ７゜４に対して透析される。溶出液は
溶出された液中に含まれるｕＴＰＡ活性の全てを結合す
ることができるモノクローナル抗ＴＰＡ抗体−セファロ
ースマトリックス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｃａｐｅ
ｎｈａｇｅｎ　　Ｉｎ５ｔ、ＰａｔｈｉＡｎａｔｏ　ｍ
　ｙのＫｅｌｄ　　Ｄａｎｏ博士から得た）上、４°Ｃ
で非常にゆっくりと通過させる。抗体マトリックスは０
．１Ｍｌ−リス塩酸、０．１％Ｔｒｉｔ。
ｎＸ−１００，ｐＨ８，０中で予め平衡化し、１゜０Ｍ
塩化ナトリウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０
，０５Ｍトリス塩酸、ｐ）（ｓ、Ｏで洗浄し、３．０Ｍ
チオシアン化アンモニウム、０゜１％トリトンＸ−１０
０，０，０５Ｍトリス塩酸、ｐＨ８，０で溶出する（最
終工程に対するＴｒｉｔ　ｏ　ｎ　Ｘ　−１００はＴｗ
ｅｅｎ８０によって置き換えても同様の結果を得ること
ができる）。
１ｍｌフラクシミンが集められ、ｕＴＰＡ活性の大部分
は最初の３〜４カラムボリユームで溶出される。抗体−
セファロースカラムによって結合された活性の６０％以
上が回収される。
ｕ　Ｔ　Ｐ’　Ａを含む材料は結合効率に影響を及ぼす
ことなく、１．５Ｍ塩化ナトリウムと同程度の塩中で抗
体／セファロースマトリックスに供給することができる
ｅ　ｕ　Ｔ　Ｐ　Ａは３Ｍチオシアン化アンモニウムを
用いるよりもむしろ、例えばＯ，１ＭグリシンでｐＨを
２．５に低下させることにより溶出され得るが、チオシ
アン化アンモニウムは歩容量でのｕ　Ｔ　Ｐ　Ａの回収
を許すので好ましく、また中和は不必要である。チオシ
アン化アンモニウムはまた蛋白質をより安定化した環境
下に保持する。
上述のスキームにおいて、最初の液体／液体抽出工程は
、水を除去し従ってｕ　Ｔ　Ｐ　Ａを濃縮する通常の限
外濾過工程によって置き換えられるし。
或いはまた、この後で実施することもできる。培地中に
存在するプロテアーゼによる抗体の損傷を防ぐために、
液体／液体相抽出に代えて、抗体アフイニテイクロマト
グラフイ一工程の前に疎水性クロマトグラフィ一工程を
実施することもできる。
また抗体アフィニティ工程に続いて純度を９９％以上に
増加するために疎水性又は分子篩ＨＰＬＣ工程を用いる
ことができる。
ｍ監 精製は上述の操作を通して次の如く監視される。
各段階におけるフラクシゴンのサンプルは０゜５Ｍ塩化
ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、０゜０２Ｍリン酸
塩、ｐＨ７，４で希釈し、アミドリティック活性はフィ
ブリノーゲンの存在下でヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターと連結した８２２５１発色物質を用いて分析する
（Ｃａｍｐｅｌｌら、「クリニカル　ケミストリー（Ｃ
１ｉｎ。
Ｃｈｅｍ、）Ｊ、２８，１１２５〜１１２８　（１９８
２）に記載されている。〕。ｄＨ，ｏで希釈された試料
の２８０ｎｍにおける吸収を記録する。
精製はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
も又、監視される。抗体／セファロースカラムから回収
された精製ｕＴＰＡは５ＤＳＰＡＧ電気泳動において３
％よりも少ない夾雑物を示す。還元条件下において、若
干の２本領ＴＰＡ（活性物；１本鎖が好ましい型）がＷ
４察される。
２本鎖型は精製工程において用いられる緩衝液中にアプ
ロチニンを加えることにより防ぐことができる。
子宮ＴＰＡおよび子宮Ｔ　Ｐ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの特
　化上に述べられた如く、第１図にはｃＤＮＡによって
コードされた子宮ＴＰＡの推論されるアミノ酸′配列と
共に、子宮ＴＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド配列が示され
ている。暫定的プレプロ配列は−３８から−Ｉのアミノ
酸に相当する。
第１図においてアミノ酸＋１．−３および−６の前の垂
直線は開裂部位を示す。可能なグルコシル化部位はＡ　
ｓ　ｎ残基の”ＣＨＯ”によって示されている。プラス
ミン開裂部位（ここにおいて１本領ｕＴＰＡは２本領ｕ
　Ｔ　Ｐ　Ａに変換される）は矢印によって示されてい
る。活性中心におけるセリンプロテアーゼの保護配列は
下線で示されている。
第１図は子宮Ｔ　Ｐ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと前述のＧｏ
ｅｄｄｅｌら、ヨーロッパ特許公開第０．０９３，６１
９号に述べられているポーズ黒色腫細胞ｃＤＮＡとのヌ
クレオチド配列の差を示す。ポーズＤＮＡが子宮ＴＰＡ
ｃＤＮＡ中に存在するヌクレオチドを欠いている位置は
”Ｘ　ＩＦで示されている。子宮ｃ　ＤＮＡがポーズｃ
ＤＮＡ中に存在するヌクレオチドを欠いている位置はＰ
Ｔ／ＩＩで示されており、続いて欠損ヌクレオチドが示
されている。
朋盗 本発明のｕＴＰＡは製剤学的に認容されるキャリヤー物
質１例えば食塩水と混合され、経口的にあるいは静脈内
へ、又は罹患動脈又は心臓内へ注射によって投与される
。投与は現在用いられる２つの血栓溶解酵素、ストレプ
トキナーゼおよびウロキナーゼに対して行なわれている
のと一般的に同様である。
その他の実施態様は特許請求の範囲内に記載されたもの
を含む。
大息■ 動物細胞組換え体（宿主細胞Ｃｌ２７）を２０ＫＩＵ／
ｍｌアブロニチンを含む培地で培養して。
得られた培養液３５１　　（ｔＰＡ１０４０ｍｇ）をあ
らかじめ４〜６℃に冷却し、フィルター濾過（０，２２
，−ｍ）により培養濾液を得た。該培養濾液ｉ；Ｌ０．
１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／　ｖ）Ｔｗ　
ｅ　ｅ　ｎ　８０及び２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍ　ｌアブロ
ニチンを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で
平衡化された疎水性アフィニティクロマトグラフイーの
ブルー・トリスアクリルＭカラム（ＬＫＢ製、１１．３
Ｘ１０ｃｍ）に吸着せしめる。吸着後、平衡化に使用し
た緩衝液５１で該カラムを洗滌し、その後０．０１％（
ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０及び２０ＫＩＵ／ｍｌアプロニ
チンを含む０．５Ｍアルギニン溶液（ｐＨ７，５）２１
でｔＰＡを溶出せしめた。６５０ｍ１　　（ｔＰＡ９４
０ｍｇ）の粗ｔＰＡ画分を得た。
該粗ｔＰＡ画分は０．１５Ｍ塩化ナトリウム。
０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　８０及び２０Ｋ
ＩＵ／ｍｌアブロニチンを含むＯ，，０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）で平衡化された抗ＴＰＡモノクロナル
抗体をアフィゲル１０（バイオラッド社製）に結合せし
めた抗体カラム（９Ｘ１０ｃｍ）に吸着せしめた。
吸着後、１．０Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ
）Ｔｗｅｅｎ８０及び２０ＫＩＵ／ｍｌアブロニチンを
含むＯ，１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９）４１及び０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ
／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０及び２０ＫＩＵ／ｍｌアプロニチ
ンを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）４１で該カラム
を順次洗滌し、その後、０．０１％（ｖ／　ｖ）Ｔｗ　
ｅ　ｅ　ｎ　８０及び２０ＫＩＵ／ｍｌアブロニチンを
含む０．　１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３）２１でｔ
ＰＡを溶出せしめた。７７０ｍ１　（ｔＰＡ８５０ｍｇ
）の粗ｔＰＡ画分を得た。
該粗ｔＰＡ画分は０６３Ｍ塩化ナトリウム、０゜０１％
（ｖ／　ｖ）Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ　８０及び２０　Ｋ　Ｉ
　Ｕ／ｍｌアブロニチンを含む０．０１Ｍトリス・塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化されたトーヨーパールＨ
Ｗ５５ＦＦ（東洋曹達製、１１．３Ｘ１２０Ｃｍ）でゲ
ル濾過せしめた。ｔＰＡ画分として１４１０ｍｌ　　（
ｔ　ＰＡ６９０ｍｇ）を分離した。
該処理液の純度、１本鎖及び２本領ｔＰＡの割合は５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｗｅｂｅｒ、
に、ら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）Ｊ　ｖｏｌ、２４
４．ｐｐ４４０６〜４４１２　（１９６９））に準じて
実施した。ゲル濃度は１０％、泳動装置としてはスラブ
式泳動装置（マリツル産業社製）を用いて１０ｍＡの定
電流にて４時間室温で泳動した。泳動後、０．２５％ク
マジー・ブリリアント・ブルーＲ２５０を用いて蛋白を
染色後、１０％酢酸と１０％メタノール混合液を用いて
脱色した。脱色後ウルトロスキャンレーザー・デンシト
メーター（ＬＫＢ製）にて定量した。
その結果、該処理液の純度は９９％、１本領ｔＰＡの割
合は９８％であった。第１表に該精製法におけるＦＣＬ
Ｔ活性及び蛋白の収率を記載する。
第１表　物質収支 ＦＣＬＴ：Ｆｉｂｒｉｎ　　（、ｌｏｔ　　Ｌｙｓｉｓ
　　Ｔｉｍｅ法（Ｒｉ　ｊ　ｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，ら、バイ
オヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）。
ｖｏ　ｌ　２５６．ｐｐ７０３５〜７０４　ｔ。
蛋白　　ｊＬｏｗｒＹ法
【図面の簡単な説明】
第１図はフランキング領域を含むヒト子宮ＴＰＡ遺伝子
の塩基配列の図解表示である。 第２図は全ヒト子宮ＴＰＡｃＤＮＡの構築図解表示であ
る。 第３図は本発明の酵母（サツカロミセス　セレビシェ、
Ｓａｃｃｈａｒｒｏｍｙｃｅｓ　　Ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉ
ａｅ）の発現ベクターの図解表示である６ 第４図は本発明の他の酵母の発現ベクターの図解表示で
ある。 第５図は本発明の哺乳類動物の発現ベクターの構築の図
解表示である。 第６図は本発明の他の哺乳類動物の発現ベクターの構築
の図解表示である。 第７図は本発明の他の哺乳類動物の発現ベクターの構築
の図解表示である。 特許出願人　　インテグレイテッドジェネティックスイ
ンコーポレイテッド

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）活性のあるヒト子宮組織プラスミノーゲン活性化
    因子（ヒト子宮ＴＰＡ）をコードしているｃＤＮＡ配列
    。
  2. （２）形質転換された宿主細胞内において、活性型ヒト
    子宮ＴＰＡをコードしているＤＮＡ配列を発現すること
    ができる複製可能な発現ベクター。
  3. （３）形質転換された宿主細胞内において、活性型ヒト
    子宮ＴＰＡをコードしているＤＮＡ配列を発現すること
    ができる複製可能な発現ベクターで形質転換された細胞
    。
  4. （４）細胞が酵母細胞である特許請求の範囲第３項記載
    の細胞。
  5. （５）細胞が哺乳類動物細胞である特許請求の範囲第３
    項記載の細胞。
  6. （６）酵母細胞がサッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃ
    ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞で
    ある特許請求の範囲第４項記載の細胞。
  7. （７）少なくとも９９％が非ＴＰＡ蛋白質を含まないヒ
    ト子宮ＴＰＡ。
  8. （８）ヒト起源の他の蛋白質を含まないヒト子宮ＴＰＡ
    。
  9. （９）形質転換された宿主細胞内において活性型ヒト子
    宮ＴＰＡをコードしているＤＮＡ配列を発現することが
    できる複製可能な発現ベクターで形質転換された細胞に
    よって生産されるヒト子宮ＴＰＡ。
  10. （１０）製剤学的に許容されるキャリヤー物質と混合さ
    れた血栓を溶解する量の特許請求の範囲７〜９のいずれ
    かのヒト子宮ＴＰＡからなる血栓溶解治療用組成物。
  11. （１１）形質転換された宿主細胞内において活性型ヒト
    子宮ＴＰＡをコードしているＤＮＡ配列を発現すること
    ができる複製可能な発現ベクターで形質転換された細胞
    を培養し、その細胞抽出液および／又はその培養液から
    ヒト子宮ＴＰＡを回収することを特徴とするヒト子宮Ｔ
    ＰＡの製造法。
  12. （１２）増大されたヒト子宮ＴＰＡ比活性を有する組成
    物を得るために、抽出液又は培地から非ヒト子宮ＴＰＡ
    蛋白質の一部を除去する最初の液体／液体相抽出工程を
    実施することを包含する、ヒト子宮ＴＰＡを生産する培
    養された細胞の培地からヒト子宮ＴＰＡを精製する方法
    。
  13. （１３）増大されたヒト子宮ＴＰＡ比活性を有する組成
    物を得るために、抽出液又は培地から非ヒト子宮ＴＰＡ
    蛋白質の一部を除去する液体／液体相抽出工程を実施す
    る工程、およびヒト子宮ＴＰＡを抗ＴＰＡ抗体に結合す
    るために、該組成物に対してアフィニティークロマトグ
    ラフィーを実施する工程を包含する、ヒト子宮ＴＰＡを
    生産する培養された細胞の培地からヒト子宮ＴＰＡを精
    製する方法。
  14. （１４）ヒト子宮ＴＰＡの少なくとも６５重量％が２相
    の１つに存在し、培地又は抽出物の水の少なくとも４０
    容量％が他の相に存在する２相混合物を形成すべく、培
    地又は抽出物と２つの異なった水可溶性重合体化合物を
    混合することによって、液体／液体相抽出工程が実施さ
    れる、特許請求の範囲第１２項または第１３項記載のヒ
    ト子宮ＴＰＡを生産する培養された細胞の培地からヒト
    子宮ＴＰＡを精製する方法。
  15. （１５）増大されたヒト子宮ＴＰＡ比活性を有する組成
    物を得るために、抽出液又は培地から非ヒト子宮ＴＰＡ
    蛋白質の一部を除去する液体／液体相抽出工程を実施す
    る工程、およびヒト子宮ＴＰＡを抗ＴＰＡ抗体に結合す
    るために、該組成物に対してアフィニティークロマトグ
    ラフィーを実施する工程、さらに前記２工程の間にヒト
    子宮ＴＰＡを多く含む相に対して疎水性アフィニティー
    クロマトグラフィーを実施する工程を包含する、ヒト子
    宮ＴＰＡを生産する培養された細胞の培地からヒト子宮
    ＴＰＡを精製する方法。
  16. （１６）第１工程として疎水性アフィニティークロマト
    グラフィー、第２工程として抗体アフィニティークロマ
    トグラフィーおよび第３工程としてゲル濾過を実施する
    ことを包含する、ヒト子宮ＴＰＡを生産する培養された
    細胞の培地からヒト子宮ＴＰＡを精製する方法。
JP60216313A 1984-10-01 1985-10-01 組換えｄｎａによつて製造されたヒト子宮組織プラスミノ−ゲン活性化因子 Pending JPS61149094A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US65677084A 1984-10-01 1984-10-01
US656770 2000-09-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS61149094A true JPS61149094A (ja) 1986-07-07

Family

ID=24634490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60216313A Pending JPS61149094A (ja) 1984-10-01 1985-10-01 組換えｄｎａによつて製造されたヒト子宮組織プラスミノ−ゲン活性化因子

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5344773A (ja)
EP (1) EP0178105B1 (ja)
JP (1) JPS61149094A (ja)
AT (1) ATE151111T1 (ja)
AU (1) AU599576B2 (ja)
DE (1) DE3588149T2 (ja)
DK (1) DK175327B1 (ja)
ES (3) ES8702945A1 (ja)
FI (1) FI89723C (ja)
IE (1) IE81135B1 (ja)
NO (1) NO175158C (ja)
NZ (1) NZ213647A (ja)
PT (1) PT81231B (ja)
ZA (1) ZA857574B (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH22337A (en) * 1983-11-21 1988-08-12 Ciba Geigy Ag Synthesis of fibrinolytic agents by yeast
US5073494A (en) * 1985-04-22 1991-12-17 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator substituted at position 275 or at positions 275 and 277
GB8528321D0 (en) * 1985-11-18 1985-12-24 Ciba Geigy Ag Modified fibrinolytic agents
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
ZA869626B (en) * 1985-12-23 1987-10-28 Chiron Corp Peptide plasminogen activators
US5258298A (en) * 1986-01-31 1993-11-02 Genetics Institute, Inc. Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator
EP0293394B2 (en) * 1986-01-31 2003-10-29 Genetics Institute, LLC Novel thrombolytic proteins
US5837518A (en) * 1986-01-31 1998-11-17 Genetics Institute, Inc. Thrombolytic proteins
IE81073B1 (en) * 1986-03-18 2000-01-12 Genentech Inc Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation
US5589361A (en) * 1986-03-18 1996-12-31 Genentech, Inc. Human tissue-type plasminogen activator variant
EP0264166B1 (en) 1986-04-09 1996-08-21 Genzyme Corporation Transgenic animals secreting desired proteins into milk
US5047241A (en) * 1986-07-11 1991-09-10 American Home Products Corporation Tris-Kringle plasminogen activator with novel K2 insert
JPH01500563A (ja) * 1986-07-16 1989-03-01 セルテック　リミテッド 精製方法
US5242819A (en) * 1986-12-05 1993-09-07 Ciba-Geigy Corporation DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase
US5580559A (en) * 1986-12-05 1996-12-03 Ciba-Geigy Corporation Hybrid plasminogen activator
EP0276846A3 (en) * 1987-01-29 1989-07-26 Zymogenetics, Inc. Colony-stimulating factor derivatives
JP2983997B2 (ja) * 1987-01-30 1999-11-29 アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレイション 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター
JPH084501B2 (ja) * 1987-03-20 1996-01-24 エーザイ株式会社 糖鎖に関する変異ｔＰＡ
NO882226L (no) * 1987-05-22 1988-11-23 Zymogenetics Inc Fibrinolytiske proteiner.
AU1668988A (en) * 1987-06-03 1988-12-08 Smithkline Beckman Corporation Purification of tpa
US6682733B1 (en) * 1987-06-18 2004-01-27 Roche Diagnostics, Gmbh Fibrinolytic enzymes
DE3726019A1 (de) * 1987-08-05 1989-02-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur abtrennung und reinigung von t-pa
US4963357A (en) * 1987-10-09 1990-10-16 Monsanto Company Tissue plasminogen activator modified by the substitution of Arg for Cys at position 73, methods and pharmaceutical compositions therefor
US5100666A (en) * 1987-10-09 1992-03-31 Monsanto Company Modified tissue plasminogen activator K2K2SP
US5244676A (en) * 1987-10-09 1993-09-14 Monsanto Company Modified tissue plasminogen activator with modified glycosylation site
US5037752A (en) * 1987-10-09 1991-08-06 Monsanto Company Modified tissue plasminogen activator substituted at cysteine-73 and lysine-277
US5270198A (en) * 1988-05-20 1993-12-14 Genentech, Inc. DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells
US5665583A (en) 1988-08-12 1997-09-09 Arch Dev Corp Methods and materials relating to IMPDH and GMP production
US5714145A (en) * 1988-09-02 1998-02-03 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
US5070021A (en) * 1989-01-10 1991-12-03 Monsanto Company Method of modifying oligosaccharide structure of tissue plasminogen activator
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
ATE155816T1 (de) * 1992-06-03 1997-08-15 Genentech Inc Varianten des gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer wirkung
US7299805B2 (en) * 2002-06-07 2007-11-27 Marctec, Llc Scaffold and method for implanting cells
US10160813B2 (en) 2013-01-22 2018-12-25 University Of Tennessee Research Foundation Tissue plasminogen activator antibodies and methods of use

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5942321A (ja) * 1982-05-05 1984-03-08 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子
JPS59118717A (ja) * 1982-12-14 1984-07-09 サウスアフリカン・インヴエンシヨンズ・デイヴエロツプメント・コ−ポレ−シヨン プラスミノーゲン活性化剤

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
AR241654A1 (es) * 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
EP0125254A1 (en) * 1982-10-28 1984-11-21 Beecham Group Plc Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
PH22337A (en) * 1983-11-21 1988-08-12 Ciba Geigy Ag Synthesis of fibrinolytic agents by yeast
US4753879A (en) * 1984-08-27 1988-06-28 Biogen N.V. Modified tissue plasminogen activators
GB8528321D0 (en) * 1985-11-18 1985-12-24 Ciba Geigy Ag Modified fibrinolytic agents
ZA869626B (en) * 1985-12-23 1987-10-28 Chiron Corp Peptide plasminogen activators
IE81073B1 (en) * 1986-03-18 2000-01-12 Genentech Inc Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5942321A (ja) * 1982-05-05 1984-03-08 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子
JPS59118717A (ja) * 1982-12-14 1984-07-09 サウスアフリカン・インヴエンシヨンズ・デイヴエロツプメント・コ−ポレ−シヨン プラスミノーゲン活性化剤

Also Published As

Publication number Publication date
ES554450A0 (es) 1988-01-01
DK441585D0 (da) 1985-09-30
ES8702945A1 (es) 1987-01-16
ES554449A0 (es) 1987-07-01
DK441585A (da) 1986-04-02
ES8801306A1 (es) 1988-01-01
ATE151111T1 (de) 1997-04-15
DE3588149D1 (de) 1997-05-07
ES547416A0 (es) 1987-01-16
US5344773A (en) 1994-09-06
NO853851L (no) 1986-04-02
NO175158B (no) 1994-05-30
AU4814885A (en) 1986-04-10
NO175158C (no) 1994-09-07
EP0178105A2 (en) 1986-04-16
ZA857574B (en) 1986-06-25
IE81135B1 (en) 2000-03-22
EP0178105B1 (en) 1997-04-02
AU599576B2 (en) 1990-07-26
DK175327B1 (da) 2004-08-23
NZ213647A (en) 1989-05-29
FI89723B (fi) 1993-07-30
FI853761L (fi) 1986-04-02
DE3588149T2 (de) 1997-10-09
EP0178105A3 (en) 1988-11-17
FI89723C (fi) 1993-11-10
IE852394L (en) 1986-04-01
ES8706726A1 (es) 1987-07-01
PT81231B (pt) 1987-10-20
PT81231A (en) 1985-11-01
FI853761A0 (fi) 1985-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS61149094A (ja) 組換えｄｎａによつて製造されたヒト子宮組織プラスミノ−ゲン活性化因子
KR950000303B1 (ko) 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tpa) 상사체를 제조하는 방법
US5225537A (en) Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins
FI107939B (fi) Kluyveromyces isäntäkantana
US4943529A (en) Kluyveromyces as a host strain
EP0266190A2 (en) Expression of protein C
US4879224A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides
JPS62253380A (ja) 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ−
WO1986006408A1 (en) HIGH YIElD PRODUCTION OF ACTIVE FACTOR IX
JPS62272976A (ja) 変異組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−及びその製造
JPS62111690A (ja) ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
EP0249350A1 (en) Filamentous fungal expression systems
JPS62278986A (ja) ハイブリツドポリペプチド
EP0198645B1 (en) Human pancreatic elastase
WO2023274091A1 (zh) 一种以基因工程水稻表达和制备重组瑞替普酶的方法
JP2739892B2 (ja) 活性なヒトｔｐａをコードする組換えｄｎａ分子
US5212068A (en) Human pancreatic elastase
JP3045307B2 (ja) 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法
JPS62158487A (ja) 突然変異体コ−デイング配列
JP2518832B2 (ja) 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−
EP0247843B1 (en) Human protein s, a plasma protein regulator of hemostasis
JPH02500947A (ja) 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化
JPH022338A (ja) 真核細肪中での同時発現
EP0523296A1 (en) An improved method for folding tissue plasminogen activators and derivatives thereof