JPH07186A - ヒトウロキナーゼを発現する組換え発現ベクター及び形質転換細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 天然型とは異なる形態をも含む種々の形態の
組換えヒトウロキナーゼを高純度で提供する。 【構成】 デトロイト５６２細胞の全ｍＲＮＡを用いて
ヒトウロキナーゼ構造遺伝子をクローニングし、これを
利用して高分子型、低分子型、高分子型前駆体、および
それぞれの単一鎖体並びに二本鎖体など種々の形態のヒ
トウロキナーゼタンパク質を実質的に不純物を含まない
純度で生産すると共に、それらの一次構造を明らかにし
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヒトウロキナーゼをコードする
ＤＮＡ断片を含有する組換え発現ベクター及び該ベクタ
ーによる形質転換細胞に関する。

【０００２】本発明は、部分的には、天然ウロキナーゼ
のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列ならびに機能的生
物活性部(functional bioactive moieties)であること
が判明したウロキナーゼ分子の関連部分を知見したこと
に基づいている。この知見により、組換ＤＮＡ技術を適
用して種々の形態でウロキナーゼを生産することが可能
になり、さらに分子の生物学的に機能するしたがって有
用な部分を同定するための必須の生物学的試験を行なう
のに充分な質および量の物質を生産することが可能にな
った。従って、遺伝子操作およびin vitro処理により、
機能性種の(functional species)ウロキナーゼを製造
し、従来得られなかった産業上有効量の活性物質を効果
的に得ることができたのである。本発明は、全ての面で
これらの関連する具体例に向けられる。

【０００３】本発明の背景を説明し、かつ特にその実施
に関し附加的に詳細を示すために使用する文献およびそ
の他の資料を本明細書中に番号を附して引用し、さらに
便宜のため明細書末尾に列挙する。

【０００４】Ａ. ヒトウロキナーゼ 繊維素溶解系は凝集系との動的平衡状態にあり、完全か
つ独特な血管床を維持する。凝集系は繊維素をマトリッ
クスとして沈着させ、止血状態を回復するのに役立つ。
繊維素溶解系は、止血状態が達成された後、繊維素ネッ
トワークを除去する。この繊維素溶解過程は、血漿蛋白
質である先駆体プラスミノーゲンから生ずる蛋白質分解
酵素、プラスミンによってもたらされる。プラスミノー
ゲンは活性化剤による活性化を介してプラスミンに変換
される。

【０００５】ウロキナーゼは、この種の活性化剤の１種
である。この活性化剤およびその他の活性化剤、たとえ
ばストレプトキナーゼは現在市販されている。この両者
は、たとえば心筋梗塞、卒中、肺動脈塞栓症、深静脈血
栓症、末梢血管閉塞症およびその他の静脈血栓症のよう
な急性血管病の治療に必要とされている。総合して、こ
れらの病気は重大な健康上の危険をもたらす。

【０００６】これら病気に対する基本的原因は、血餅
(血栓または血栓塞栓)による血管の部分的または重度の
場合には全体的閉塞にある。たとえばヘパリンおよびク
マリンを用いるような従来の凝固防止治療は、血栓もし
くは塞栓物質の溶解を何ら直接には改善しない。ストレ
プトキナーゼおよびウロキナーゼは、血栓崩壊剤として
実用的かつ有効に使用されている。しかしながら今日ま
で、これらには厳しい制限があった。さらに、繊維素に
対する高度の親和性も示されていない。したがって、両
者は、循環している繊維素に結合したプラスミノーゲン
を比較的無差別に活性化させる。循環血液中で形成され
たプラスミンは、比較的急速に中和されて有効な血栓崩
壊能を失なう。残留するプラスミンは、数種の凝血因子
蛋白質、たとえばフィブリノーゲン、因子Ｖおよび因子
ＶIIIを減成して出血能力をもたらす。さらに、ストレ
プトキナーゼは強度に抗原性であり、高度の抗体力価を
有する患者は治療に対し効果を示さず、継続処置を続け
ることができない。ウロキナーゼ治療法は人間の尿また
は組織培養物から単離することを含むため高価であり、
したがって臨床的には一般に許容されない。ウロキナー
ゼは多くの研究の主題であった。たとえば文献１〜９参
照。上記したように、現在入手しうるウロキナーゼは人
間の尿または組織培養物、たとえば腎臓細胞(９Ａ,９
Ｂ)から単離される。

【０００７】ウロキナーゼ分子は幾つかの生物学上活性
な形態で存在し、高分子量(約５４０００ダルトン)およ
び低分子量(約３３０００ダルトン)のものがあり、それ
ぞれ単一鎖もしくは二本鎖物質(twochain material)で
構成されている。低分子量型は、酵素開裂によって高分
子量型から誘導される。生物学上活性な物質はいわゆる
セリンプロテアーゼ部分(serine protease portion)を
含有し、この部分は活性型においてジスルフィド結合を
介し第二鎖(second chain)に結合されている。高分子量
物質に起因する活性は、いずれもこれら２つの結合した
鎖が同じ様に存在していることによるものと思われ、配
列中の有効なジスルフィド結合および中断(interruptio
n)は疑いもなく全分子のセリンプロテアーゼ部分に存在
する(図１参照)。いずれにせよ、本発明までは、約２１
０００ダルトン残基の本質従ってその機能は未知であ
り、ウロキナーゼの公知部分のいずれかにその活性を結
びつけることは必らずしも可能でなかった。

【０００８】最近、低活性ではあるが特異的活性を有す
る他の型のウロキナーゼペプチドが報告された(１０,１
０Ａ)。この物質は天然ウロキナーゼに対応し、恐らく
単一鎖よりなる従来単離された上記の活性物質の先駆型
(preform)であると推定された。微生物宿主において発
現を達成するという希望をもってウロキナーゼに必須の
遺伝子をクローン化するという従来の試みは成功しなか
ったと信じられる(１１,１１Ａ)。(６)をも参照。

【０００９】結局、組換ＤＮＡ技術およびその関連技術
を使用することが、高品質かつ高生物活性のヒトウロキ
ナーゼを他のヒト蛋白質を実質的に含有せずに多量に提
供し、さらに機能的生物活性を保持するその誘導体を提
供し、かくしてこれら物質を種々の血管状態(vascular
conditions)もしくは病気(diseases)の治療に臨床的に
使用しうる最も有効な方法であると思われた。

【００１０】Ｂ. 組換ＤＮＡ／蛋白質生化学技術 組換ＤＮＡ技術は、複雑な段階に達している。分子生物
学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に組換え、著量
の外来蛋白質生産物をトランスフォームされた微生物も
しくはセルカルチャー(細胞培養物)中で産生しうる新た
なＤＮＡ物質を生成させることができる。一般的手段お
よび方法は、種々の平滑末端もしくは「付着性」末端のＤ
ＮＡ断片をin vitroで結合させ、特定生物をトランスフ
ォームするのに有用な強力な発現ベヒクルを生成させ、
かくして所望の外来生産物の効率的な合成を行なうこと
である。しかしながら、個々の生産物について見ると、
その経路は若干繁雑であり、科学は成功を常に予測しう
る段階にまで進歩していない。事実、基礎的実験を伴な
わずに成功結果を予告する者もいるが、このような者は
実施不能という著しい危険を伴なう。

【００１１】必須要素、すなわち複製のオリジン、１種
もしくはそれ以上の表現型選択特性、発現プロモータ、
異種遺伝子挿入物および残余のベクターのＤＮＡ組換
は、一般に宿主細胞の外部で行なわれる。得られた複製
しうる組換発現ベヒクルすなわちプラスミドをトランス
フォーメーションにより細胞中へ導入し、トランスフォ
ーマントを増殖させることにより多量の組換ベヒクルを
得る。コードＤＮＡメッセージの転写および翻訳を支配
する部分に関し遺伝子が適切に挿入されていると、得ら
れる発現ベヒクルを使用して挿入遺伝子がコードするポ
リペプチド配列を実際に産生することができる(この過
程を発現と呼ぶ)。得られる産生物は、必要に応じ、微
生物系で宿主細胞を溶菌し、かつ適当な精製により他の
蛋白質から産生物を回収することにより得られる。

【００１２】実際上、組換ＤＮＡ技術を用いれば全体が
異種のポリペプチドを発現することができ(いわゆる直
接発現)、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一
部に融合した異種ポリペプチドを発現することもでき
る。後者の場合、目的とする生物活性産生物は、しばし
ば、細胞外環境で開裂されるまで融合した同種／異種ポ
リペプチドとして生物不活性にされている。文献(１２)
および(１３)参照。

【００１３】同様に、遺伝学および細胞生理学を研究す
るための細胞培養(cell culture)または組織培養の技術
は充分に確立されている。単離された正常細胞から一連
の継続したトランスフアー処理により調製された永久セ
ルライン(細胞系)を維持する手段および方法は公知であ
る。研究に使用するため、これらのセルラインは液体培
地中の固体支持体上に維持され、或いは支持栄養源を含
有する懸濁物中で増殖させることにより維持される。大
量生産のための規模拡大は、機械的問題のみを提起する
と思われる。その他の背景については、文献(１４)およ
び(１５)を参照することができる。

【００１４】同様に、生物工学においては蛋白質生化学
が有用かつ実際上必要な手段である。所望の蛋白質を産
生する細胞は、さらに多数の他の蛋白質、すなわち細胞
固有の代謝産生物をも生成する。これらの夾雑蛋白質な
らびにその他の化合物は、所望蛋白質から除去されない
と、所望蛋白質による治療処置の過程で動物もしくはヒ
トに投与した場合、有毒となるであろう。蛋白質生化学
の技術は、目的とする特定のシステムに適する分離方法
の設計を可能にし、かつ目的用途に対し安全な均質生産
物を提供することができる。さらに、蛋白質生化学によ
り、所望生産物を特性化する本質が明らかにされ、細胞
が何らの交代もしくは突然変異を生ずることなく忠実に
所望生産物を生成したことを証明する。この科学分野
も、臨床的研究および市場開発を成功裡に行ないうるた
めに必要とされる生物分析(バイオアッセイ)、安定性の
検討およびその他の過程の設計に含まれる。

【００１５】本発明は、組換ＤＮＡ／蛋白質生化学的技
術を使用して、生物学的に機能する調製種の形態でヒト
ウロキナーゼを成功裡に生産しうるという知見に基づい
ている。本発明は、全ゆる形態において各種の血管状態
もしくは病気に対し人間の予防処置もしくは治療に使用
するのに適した活性ウロキナーゼ蛋白質を提供する。各
形態は、生物活性部分すなわちセリンプロテアーゼ部分
からなる２本鎖領域に存在すると思われる天然物質の酵
素部分(enzymatic portion)を包含する。本発明によれ
ば、一連のウロキナーゼ活性生産物を生物活性型におい
て直接に、或いは特に生物活性生産物を生成させるよう
にin vitroで処理しうる形態で製造することができる。
さらに、本発明は、特に生物活性型もしくは生物活性化
しうる型において全長(full length)の天然ウロキナー
ゼ分子を生産し、天然原料から単離されたいかなるウロ
キナーゼ生産物についても現在まで示されていないよう
な繊維素に対する特異的親和性という有力な附加的利点
を有するウロキナーゼ分子を生産する手段および方法を
提供する。かくして、触知しうる現存の血栓に対し特異
的活性を示すような有力な新しい性質を有するヒトウロ
キナーゼ生産物が提供される。この生産物は各生産物の
本質をコードする組換ＤＮＡを備えたセルカルチャーに
より生産されるが、従来可能であったよりもずっと効率
的な方法で、かつ生物学的に向上された顕著な性質を示
す形態でヒトウロキナーゼを生産する手段が現在可能で
ある。さらに、宿主細胞に応じて、そのウロキナーゼ活
性化剤は天然物質と比較して多かれ少なかれ関連グリコ
シレーション(associated glycosylation)を有すること
ができる。

【００１６】ここで「ヒトウロキナーゼ」という用語は、
微生物カルチャーもしくはセルカルチャーにより生産さ
れる或いは適宜in vitroでの処理により生産される生物
活性型のポリペプチドを意味し、天然物質に対応する酵
素部分を含む。したがって、本発明によるヒトウロキナ
ーゼは、(１)従来天然材料から単離された物質と対照し
て全長で、または(２)プラスミノーゲン活性化に必須と
思われる酵素部分の部位を有するその他の生物活性型に
おいて、または(３)酵素部分のＮ末端に、第１アミノ酸
であるメチオニン、または融合したシグナルポリペプチ
ドもしくはこのシグナルポリペプチドとは異なる共役ポ
リペプチドを有する形態で提供され、ここでメチオニ
ン、シグナルポリペプチドまたは共役ポリペプチドは細
胞内もしくは細胞外の環境で特異的に開裂することがで
きる(文献１２参照)。いずれにせよ、このように生産さ
れるヒトウロキナーゼポリペプチドを回収し、かつ種々
の心臓血管状態もしくは病気の治療に使用するのに適す
るレベルまで精製する。

【００１７】Ａ. 微生物／セルカルチャー １． 細菌菌株／プロモータ 本明細書中に記載した研究は、特に１９８２年４月９日
付でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)に寄託した微
生物Ｅ. coli Ｋ−１２菌株ＧＭ４８(thr^-,leu^-,Ｂ₁ ^-,l
acＹ１,galＫ１２,galＴ２２,ara１４,tonＡ３１,tsx７
８,ＳupＥ４４,dam３、dcm６)(ＡＴＣＣＮo．３９０９
９)および１９７８年１０月２８日付でＡmerican Ｔype
ＣultureＣollectionに寄託しかつ文献(１６)中に記載
したＥ. coli Ｋ−１２菌株２９４(endＡ、thi^-,hsr^-,k
hsm⁺)(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４４６)を用いて行なった。
しかしながら、たとえばＥ. coli Ｂ、Ｅ. coli Ｘ１７
７６(ＡＴＣＣ Ｎo.３１５３７,１９７９年７月３日付
で寄託)およびＥ. coli Ｗ３１１０(Ｆ^-,λ^-,プロトロ
フイック,protrophic)(ＡＴＣＣ Ｎo.２７３２５,１９
７２年２月１０日付で寄託)のような公知のＥ. coli 菌
株、或いはたとえばＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollec
tion(ＡＴＣＣ)のような承認された微生物寄託機関に寄
託されかつそこから入手しうる(ＡＴＣＣカタログ参照)
その他の微生物菌株を含め、種々のその他の微生物菌株
も使用できる。文献(１７)参照。これらのその他微生物
は、たとえば枯草菌(Ｂacillus subtilis)のようなＢac
illi属細菌類を包含し、さらにその他の腸内細菌科(ent
erobacteriaceae)の菌株を包含し、そのうちたとえばサ
ルモネラ・チフイムリウム(Ｓalmonella typhimuriu
m)、セラチア・マルセサンス(Ｓerratia marcesans)およ
びシュードモナス(Ｐseudomonas)を挙げることができ
る。さらに、異種遺伝子配列を複製し、かつ発現しうる
プラスミドを使用することができる。

【００１８】たとえば、異種ポリペプチドの微生物学的
生産を開始させかつ保持するには、β−ラクタマーゼお
よび乳糖プロモータ系が有利に使用されている。これら
プロモータ系の構成および作成に関する詳細は、文献
(１８)および(１９)を参照することができる。極く最
近、トリプトフアン経路に基づく系、いわゆるtrpプロ
モータ系が開発された。この系の構成および作成に関す
る詳細は文献(２０)および(２１)を参照することができ
る。その他の多くの微生物プロモータが見出されかつ使
用されており、当業者がプラスミドベクター中に機能的
に結合させうるそれらのヌクレオチド配列に関する詳細
は文献(２２)に公開されている。

【００１９】２. 酵母菌株／酵母プロモータ 本発明発現系には、さらにＥ. coliおよび／または酵
母、サッカロミセス・セレビシー(Ｓaccharomyces cere
visiae)のいずれかまたは両者において選択および複製
しうるプラスミドを使用することもできる。酵母中で選
択する場合、プラスミドはＴＲＰ１遺伝子を含有するこ
とができ(２３,２４,２５)、これは酵母の染色体ＩＶに
見られるこの遺伝子における突然変異を含む酵母を補完
する(トリプトファンの不存在において増殖を可能にす
る)(２６)。有用な菌株は１９８０年１２月８日付で制
約なしにＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionに寄託
された菌株ＲＨ２１８(ＡＴＣＣ Ｎo.４４０７６)であ
る(２７)。しかしながら、細胞をtrp１にする突然変異
を含む任意のＳaccharomyces cerevisiaeの菌株が、発
現系を含むプラスミドの発現に関し有効であり、たとえ
ば菌株pep４−１(２８)があることも理解されるであろ
う。このトリプトファン栄養要求性菌株も、ＴＲＰ１遺
伝子に点突然変異を有する。

【００２０】非酵母遺伝子の５'側に位置する場合、酵
母遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼ１)からの５'−
フランキングＤＮＡ配列(プロモータ)は、酵母をトラン
スフォームするために使用されるプラスミド中に入れた
場合酵母における外来遺伝子の発現をプロモートするこ
とができる。

【００２１】プロモータの他に、酵母における非酵母遺
伝子の適切な発現は、酵母における適切な転写終了とポ
リアデニル化とを可能にするように、プラスミドにおけ
る非酵母遺伝子の３'末端に位置した第２酵母配列を必
要とする。好適具体例において、酵母３−ホスホグリセ
レートキナーゼ遺伝子(２９)の５'−フランキング配列
は構造遺伝子の上流に位置し、この構造遺伝子には、次
いで終了信号−ポリアデニル化信号を含むＤＮＡたとえ
ばＴＲＰ１(２３−２５)遺伝子もしくはＰＧＫ(２９)遺
伝子が続く。

【００２２】酵母の５'−フランキング配列は(酵母の
３'−停止ＤＮＡと組合せて、下記参照)、酵母における
外来遺伝子の発現をプロモートするよう機能しうるの
で、任意の酵母遺伝子の５'−フランキング配列は、重
要な遺伝子生産物、たとえばグリコール分解遺伝子(gly
colytic genes)、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの発現に使
用しうると思われる。これら遺伝子の３'−フランキン
グ配列のいずれを使用しても、この種の発現系における
適切な終了とmＲＮＡポリアデニル化とを行なうことが
できる。

【００２３】最後に、多くの酵母プロモータはさらに転
写制御部を含むので、増殖条件における変化によってオ
ン・オフすることができる。この種の酵母プロモータの
幾つかの例は次の蛋白質を生産する遺伝子である:アル
コールデヒドロゲナーゼII、酸ホスファターゼ、窒素代
謝に関連する分解酵素(degradative enzymes)、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼなら
びにマルトースおよびガラクトースの利用に必要な酵素
(３０)。この種の制御領域は、蛋白質生産物の発現を制
御する際、特にその生産が酵母に対し有毒である場合、
極めて有用である。さらに、１個の５'−フランキング
配列の制御領域を、高度に発現された遺伝子からのプロ
モータを含む５'−フランキング配列と組合せることも
可能であろう。これはハイブリッドプロモータをもたら
しかつ可能であろう。何故なら、制御領域およびプロモ
ータは物理的に異なるＤＮＡ配列であると思われるから
である。

【００２４】３. セルカルチャー／セルカルチャーベ
クター 培養(組織培養)において脊椎動物細胞を増殖させること
が、近年慣用の方法となった(３１参照)。異種蛋白質を
生産するための有用な宿主は、猿の腎臓繊維芽細胞のＣ
ＯＳ−７ラインである(３２)。しかしながら、本発明は
適合性ベクターを複製かつ発現しうる任意のセルライ
ン、たとえばＷＩ３８、ＢＨＫ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＶＥ
ＲＯおよびＨeＬaセルラインにおいて実施することもで
きる。さらに、発現ベクターに必要とされるものは、発
現すべき遺伝子の前方に位置する複製のオリジンおよび
プロモータであって、これらとともに、任意の必要なリ
ボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位および転写終了配列を含む。本発明は、好適具
体例に関して記載するが、これら配列のみに限定されな
いと理解すべきである。たとえば、他のウイルス性(た
とえばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)ベク
ターの複製のオリジン、ならびに一体化されてない状態
で機能しうるＤＮＡ複製の細胞性オリジンも使用するこ
とができる。

【００２５】この種の脊椎動物細胞宿主において、ウロ
キナーゼ生産物ポリペプチドに対する遺伝的発現ベクタ
ーは、さらに同じプロモータの制御下で第２の遺伝子コ
ード化配列を含むこともできる。第２の配列は、一般の
トランスフォーマントおよび第１の配列に対する高度の
発現レベルを示すトランスフォーマントの両者に対し有
利なスクリーニングマーカーを附与し、かつ所望のウロ
キナーゼポリペプチドの発現を調節し、特にしばしば向
上させうる制御手段としても作用する。

【００２６】これは二種の蛋白質が成熟型で別々に生産
されるので特に重要である。両方のＤＮＡコード化配列
は、融合メッセージ(mＲＮＡ)が形成されるように同じ
転写プロモータによって制御され、これらは第一のもの
の翻訳停止信号と第二のものの開始信号によって分離さ
れているため、二種の独立した蛋白質が生ずる。

【００２７】或る種の増殖条件下で細胞により生産され
る特定酵素の量を制御するには、しばしば環境条件が有
効であると認められる。好適具体例においては、ジヒド
ロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)の阻害剤であるメ
ソトレキセート(ＭＴＸ)に対する或る種の細胞の感受性
を利用する。ＤＨＦＲは、１個の炭素単位のトランスフ
ァーを含む合成反応に間接的に必要とされる酵素であ
る。ＤＨＦＲ活性が欠如すると、これら化合物が存在し
ない限り、細胞の増殖が不可能となる。他の場合には、
これらの化合物の合成には１つの炭素単位のトランスフ
ァーが必要である。しかしながら、ＤＨＦＲを欠く細胞
は、グリシンとチミジンとヒポキサンチンとの組合せの
存在下で増殖するであろう。

【００２８】通常ＤＨＦＲを生産する細胞は、メソトレ
キセートにより阻害されることが知られている。大抵の
場合、正常細胞に対するメソトレキセートの適当量の添
加は、細胞の死滅をもたらす。しかしながら、或る種の
細胞はＤＨＦＲ量を増加させることによりメソトレキセ
ート処理に耐えると思われ、したがってメソトレキセー
トがこの酵素を阻害する能力を上まわる。この種の細胞
には、ＤＨＦＲ配列をコードするメッセンジャＲＮＡの
量が増加していることが従来示されている。このこと
は、このメッセンジャＲＮＡをコードする遺伝物質にお
けるＤＮＡ量の増加を考えることにより説明される。効
果上、明らかにメソトレキセートの添加はＤＨＦＲ遺伝
子の遺伝子増幅をもたらす。ＤＨＦＲ配列と物理的に結
合された遺伝子配列は、同じプロモータにより調節され
ないがやはり増幅される。したがって、メソトレキセー
ト処理の結果生ずるＤＨＦＲ遺伝子の増幅を使用して、
同時に他の蛋白質、すなわちこの場合は所望のウロキナ
ーゼポリペプチドに対する遺伝子を増幅することができ
る。

【００２９】さらに、ＤＨＦＲ用の第二の配列が導入さ
れる宿主細胞自身がＤＨＦＲを欠如している場合、ＤＨ
ＦＲは成功裡にトランスフェクトされる細胞の選択のた
めの便利なマーカーとしても作用する。ＤＨＦＲ配列が
所望ペプチドのための配列に効果的に結合されると、こ
の能力は所望の配列による有効なトランスフェクション
に対するマーカーとしても作用する。

【００３０】Ｂ. ベクター系 １. 細菌系における発現 細菌使用の場合、たとえばＥ. coliに対する発現プラス
ミドは、一般にベクターとしてpＢＲ３２２(３７)を使
用しかつ異種遺伝子配列、翻訳開始および停止信号を機
能的プロモータと共に有効に解読されるように挿入し、
これは一般的なまたは合成的に生成しうる制限部位を利
用することにより達成される。このベクターは１個もし
くはそれ以上の表現型選択特性遺伝子を有し、さらに宿
主内での増幅を確保する複製のオリジンをも有する。さ
らに、異種挿入物を整列させて、たとえばtrp系遺伝子
から誘導しうる融合予備配列(プレシーケンス)と共に発
現させることもできる。

【００３１】２. 酵母における発現 たとえばヒトウロキナーゼに対するcＤＮＡのような異
種遺伝子を酵母中で発現するには、４つの成分を含有す
るプラスミドベクターを作成する必要がある。１つの成
分は、Ｅ. coliおよび酵母の両者をトランスフォームさ
せうる部分であり、したがって各微生物からの選択しう
る遺伝子を含まねばならない。これはＥ. coli由来のア
ンピシリン耐性に関する遺伝子および酵母由来の遺伝子
ＴＲＰ１とすることができる。この成分は、さらに両微
生物においてプラスミドＤＮＡとして維持すべき両微生
物由来の複製のオリジンをも必要とする。これはpＢＲ
３２２由来のＥ. coliオリジンおよび酵母の染色体III
からのars１オリジンとすることができる。

【００３２】プラスミドの第二の成分は酵母遺伝子由来
の５'−フランキング配列であって、下流に位置する構
造遺伝子の転写をプロモートする。この５'−フランキ
ング配列は酵母３−ホスホ−グリセレートキナーゼ(Ｐ
ＧＫ)遺伝子由来のものとすることができる。この断片
はＰＧＫ構造配列のＡＴＧを除去するような方法で作成
され、このＡＴＧは、５'−フランキング配列を構造遺
伝子へ有利に結合させるため、たとえばＸbaIおよびＥc
oＲI制限部位のような代替制限部位を含む配列で置換す
ることもできる。

【００３３】この系の第三の成分は、ＡＴＧ翻訳開始信
号と翻訳停止信号との両者を含有するように作成された
構造遺伝子である。第四の成分は酵母遺伝子の３'−フ
ランキング配列を含む酵母ＤＮＡ配列であって、転写終
了とポリアデニル化とに対する適切な信号を含む。

【００３４】３. 哺乳動物セルカルチャーにおける発
現 哺乳動物セルカルチャーにおける異種ペプチドの合成方
法は、異種転写単位の制御下で外来遺伝子の自律複製と
発現との両者を行ないうるベクターの開発に依存する。
組織培養におけるこのベクターの複製は、ＤＮＡ複製オ
リジン(たとえばＳＶ４０ウイルス由来のもの)を与え、
かつ抗原(Ｔ抗原)を外生的に発現するセルライン中へベ
クターを導入することによりヘルパー機能(Ｔ抗原)を与
えることによって達成される(３３,３４)。ＳＶ４０ウ
イルスの後期プロモータ(late promoter)は、構造遺伝
子の前に位置し、遺伝子の転写を確保する。

【００３５】発現を得るのに有用なベクターはpＢＲ３
２２配列より成っており、Ｅ. coliにおける選択のため
の選択可能なマーカー(アンピシリン耐性)ならびにＤＮ
Ａ複製のＥ. coliオリジンを附与する。これらの配列は
プラスミドpＭＬ−１から誘導することができる。ＳＶ
４０オリジンは、この領域を包含する３４２塩基対Ｐvu
II−ＨindIII断片から誘導することができる(３５,３
６)(両末端はＥcoＲＩ末端に変換することができる)。
これらの配列は、ＤＮＡ複製のウイルス性オリジンから
なる他、早期および後期転写単位の両者に対するプロモ
ータをコードする。ＳＶ４０オリジン領域の配向は、後
期転写単位に対するプロモータがウロキナーゼをコード
する遺伝子の近くに位置するようなものである。

【００３６】Ａ. ウロキナーゼmＲＮＡの起源 デトロイト５６２(Ｄetroit５６２,ヒト咽頭癌)細胞(３
８)(ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ１３８)を、３％の重炭酸ナ
トリウム(pＨ７.５)と１％のＬ−グルタミン(アービン,
Ｉrvine)と１０％の牛胎児血清と１％のピルビン酸ナト
リウム(アービン)と１％の非必須アミノ酸(アービン)と
２.４％のＨＥＰＥＳ(pＨ７.５)、５０μg／mlのガラマ
イシン(Ｇaramycin)とを含有するように補充したイーグ
ルの最小基本培地(３９)で合一するまで培養し、そして
５％ＣＯ₂雰囲気中で３７℃にてインキュベートした。
０.２５％のトリプシンにより３７℃で１５分間処理し
た後、合一細胞(confluentcells)を遠心分離により採取
した。

【００３７】Ｂ. メッセンジャＲＮＡの単離 Ｌynch et al.(４０)により実質的に記載されたように
全ＲＮＡをデトロイト５６２細胞から抽出した。これら
細胞を遠心分離によりペレットにし、次いで約１gの細
胞を１０mＭのＮaＣlと１０mＭのトリスＨＣl(pＨ７.
４)と１.５mＭのＭgＣl₂との１０ml中に再懸濁させた。
非イオン系洗剤ＮＰ−４０を１％の最終濃液となるまで
添加して、細胞を溶解させた。遠心分離により核を除去
し、さらにＲＮＡをフェノール(再蒸留)／クロロホルム
とイソアミルアルコールとの２回の４℃における順次の
抽出によって精製した。水相を０.２ＭのＮaＣlとな
し、２倍容量の１００％エタノールを添加しかつ−２０
℃にて１晩貯蔵することにより全ＲＮＡを沈澱させた。
遠心分離の後、ポリＡ mＲＮＡをオリゴ−dＴセルロー
スクロマトグラフィー(４１)により全ＲＮＡから精製し
た。細胞１gからの収量は典型的には１０〜１５mgの全
ＲＮＡであり、その約２％がポリＡ mＲＮＡであった。

【００３８】Ｃ. ポリＡ mＲＮＡのサイズ分画 ２００μgのポリＡ mＲＮＡのサイズ分画は、１.７５％
のアガロースと２５mＭのクエン酸ナトリウム(pＨ３.
８)と６Ｍの尿素とより構成された酸−尿素ゲルを通す
電気泳動により行なった(４０,４２)。電気泳動は２５m
Ａかつ４℃にて７時間行なった。次いで、ゲルを剃刀の
刃により手で分割した。このゲルの個々の切片を７０℃
で溶融させ、１０mＭのＮaＣlと１０mＭのトリスＨＣl
(pＨ７.４)と１.５mＭのＭgＣl₂と０.１％のＳＤＳとの
１２ml中へ希釈し、水飽和された再蒸留フェノールで２
回およびクロロホルムで１回抽出した。次いで、これら
フラクションをエタノールで沈澱させ、次いでin vitro
で翻訳して(４３)、ポリＡmＲＮＡの得られたサイズ分
画と完全性とを決定した。

【００３９】Ｄ. ウロキナーゼＤＮＡ配列を含有する
オリゴ−dＴでプライム処理したコロニーライブラリの
調製 ポリＡ mＲＮＡを酸−尿素ゲル上でサイズ分画した。１
２Ｓより大きいmＲＮＡフラクションをプールし、そし
てこれらを標準法による二重鎖cＤＮＡのオリゴ−dＴプ
ライム処理調製の雛型として使用した(４４,４５)。cＤ
ＮＡを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサイズ分
画し、長さが３５０塩基対より大きいds cＤＮＡ１３
２ngを電気溶出によって得た。３０ngのds cＤＮＡ
を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
(４６)を用いてデオキシＣ残基によって延長させ、Ｐst
Ｉ部位(４６)においてデオキシＧ残基により同様に末端
処理されたプラスミドpＢＲ３２２(３７)２００ngとと
もにアニールした。次いで、各アニールされた混合物を
Ｅ. coli Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４４
６)にトランスフォームした。アンピシリン感受性かつ
テトラサイクリン耐性の約１００００個のトランスフォ
ーマントが得られた。

【００４０】Ｅ. ウロキナーゼスクリーニングプロー
ブとして使用するための合成ＤＮＡオリゴマーの調製 長さ１４塩基の８種の合成ＤＮＡオリゴマーを、ＣＢ６
と呼ばれるウロキナーゼシアノゲンブロマイドポリペプ
チド断片のＭet−Ｔyr−Ａsn−Ａsp−Ｐroアミノ酸配列
に基づきmＲＮＡに対し相補的となるよう設計した。こ
れら８種のデオキシオリゴヌクレオチドを次の２種のオ
リゴマーからなるプールすなわち(ＣＢ６Ａ)５'ＧＧＧ
ＴＣＧＴＴＡ／ＧＴＡＣＡＴ３'、(ＣＢ６Ｂ)５'ＧＧＡ
ＴＣＧＴＴＡ／ＧＴＡＣＡＴ３'、(ＣＢ６Ｃ)５'ＧＧＧ
ＴＣＡＴＴＡ／ＧＴＡＣＡＴ３'、(ＣＢ６Ｄ)５'ＧＧＡ
ＴＣＡＴＴＡ／ＧＴＡＣＡＴ３'においてホスホトリエ
ステル法(１７)によって合成した。次いで、２種のオリ
ゴマーのそれぞれのプールを次のようにして放射活性と
なるように燐酸化した:２５０ngのデオキシオリゴヌク
レオチドを６０mＭのトリスＨＣl(pＨ８)と１０mＭのＭ
gＣl₂と１５mＭのβ−メルカプトエタノールと１００μ
Ｃi(γ−³²Ｐ)ＡＴＰ(アメルシャム社Ａmersham、５０
００Ｃi／mＭ)との２５μl中で混合した。５単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを加え、反応を３７℃で３０
分間進行させ、そして２０mＭまでのＥＤＴＡの添加に
よって停止させた。

【００４１】Ｆ. ウロキナーゼ配列に対するオリゴ−d
Ｔプライム処理されたコロニーライブラリのスクリーニ
ング 約１００００個のコロニーを、ＬＢ(４８)＋５μg／ml
のテトラサイクリンを含有するマイクロタイター培養皿
のウエルに個々に接種し、そして７％までＤＭＳＯを添
加した後−２０℃で貯蔵した。このライブラリからの個
々のコロニーをシュライヒャー(Ｓchleicher)およびシ
ュエル(Ｓchuell)のＢＡ８５／２０ニトロセルロースフ
ィルタにトランスファーし、そしてＬＢ＋５μg／mlの
テトラサイクリンを含有する寒天板上で増殖させた。３
７℃にて約１０時間の増殖の後、これらコロニーフィル
タをＬＢ＋５μg／mlのテトラサイクリンと１２.５μg
／mlのクロラムフェニコールとを含有する寒天プレート
にトランスファーし、そして３７℃にて１晩再インキュ
ベートした。次いで、各コロニーからのＤＮＡを変性さ
せ、グルンシュタイン−ホグネス(Ｇrunstein−Ｈognes
s)法(４９)の変法によってフィルタへ固定した。各フィ
ルタを０.５ＮのＮaＯＨと１.５ＭのＮaＣlとの上に３
分間浮遊させてコロニーを溶菌させかつＤＮＡを変性さ
せ、次いで３ＭのＮaＣlと０.５ＭのトリスＨＣl(pＨ
７.５)との上に１５分間浮遊させて中和した。次いで、
これらフィルタを２ＸＳＳＣ上でさらに１５分間浮遊さ
せ、次いで８０℃の真空オーブン内で２時間焼成した。
これらフィルタを０.９ＭのＮaＣlと１Ｘのデンハルツ
(Ｄenhardts)と１００mＭのトリスＨＣl(pＨ７.５)と５
mＭのＮa−ＥＤＴＡと１mＭのＡＴＰと１Ｍの燐酸ナト
リウム(二塩基)と１mＭのピロ燐酸ナトリウムと０.５％
のＮＰ−４０と２００μg／mlのＥ. coli t−ＲＮＡ
中、室温で約２時間にわたり予備ハイブリダイズさせ、
次いで同じ溶液中でＷallace et al.(５０)により実質
的に記載された方法により１晩ハイブリダイズさせた。
この場合約４０×１０⁶cpmの各キナーゼ処理された２の
ＣＢ６デオキシオリゴヌクレオチドプールを用いた。６
ＸＳＳＣと０.１％のＳＤＳ中で３７℃で激く洗浄した
後、これらフィルタをコダック(Ｋodak)ＸＲ−５のＸ線
フィルムにデュポン露光強化スクリーン(Ｄupont Ｌigh
tning−Ｐlus intensityiing screens)を用いて−８０
℃にて１６〜２４時間露出させた。２種のコロニーすな
わち:ＵＫ５１３dＴ６９Ｄ２(pＤ２)およびＵＫ５１３d
Ｔ７３Ｄ１２(pＤ１２)は、８種のプローブの混合物と
のハイブリダイゼーションを示した。

【００４２】Ｇ. pＤ２およびpＤ１２プラスミドＤＮ
Ａの特性 迅速ミニスクリーン法(５１)によってＥ. coliコロニー
ＵＫ５１３dＴ６９Ｄ２およびＵＫ５１３dＴ７３Ｄ１２
から単離したプラスミドＤＮＡを、ＰstＩ制限エンドヌ
クレアーゼ分析にかけた。この分析は、pＤ２とpＤ１２
とが同一であることを強く示唆した。各プラスミドＤＮ
Ａは、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動させると、
一緒に移動する３個のＰstＩ制限断片を有する。このプ
ラスミドpＤ２ cＤＮＡ挿入物の完全なヌクレオチド配
列を、ＰstＩ制限断片をＭ１３ベクターmp７(５３)中へ
サブクローン化した後、ジデオキシヌクレオチド連鎖停
止法(５２)によって決定した。図２、３および４はヌク
レオチド配列を示し、図５および６はpＤ２のcＤＮＡ挿
入断片の翻訳されたヌクレオチド配列(すなわちアミノ
酸配列)を示している。低分子量(３３Ｋ)のウロキナー
ゼの完全コード化領域をこの大きい方のpＤ２断片から
単離した。ＣＢ６Ｂ(５'−ＧＧＡＴＣＧＴＴＡ／ＧＴＡ
ＣＡＴ)デオキシオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配
列は、この地図によればヌクレオチド４６６〜４７９を
包含する。典型的なセリンプロテアーゼ活性部位(gly a
sp ser gly gly pro)は、アミノ酸２２２と２２７との
間に存在する。コード化領域は、８３８個の塩基対もし
くは高分子量(５４Ｋ)ウロキナーゼのカルボキシ末端部
分の２７９個のアミノ酸よりなっている。

【００４３】アミノ酸位置２８０における停止コドンＵ
ＧＡは、ポリＡ配列に至るまでの３'−未翻訳配列の約
９３５個のヌクレオチドの始まりとなる。全長(full le
ngth)ウロキナーゼのうち１４１３ダルトンのみがpＤ２
のcＤＮＡ挿入物によってコードされていたので、高分
子量ウロキナーゼを同定するにはウロキナーゼ配列を有
する附加的なコロニーバンクを作成する必要があった。

【００４４】Ｈ. 現存するウロキナーゼクローンのア
ミノ末端延長のための２種の異なる特異的にプライム処
理したコロニーバンクの作成 第一の特異的にプライム処理したcＤＮＡバンクは、位
置２２５におけるＨaeIIで始まりかつ位置２７０におけ
るＡccＩで終る(図２、３および４)４５塩基対のウロキ
ナーゼＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ断片をオリゴdＴ
₁₂−₁₈の代わりにプライマーとして使用した。この断片
を２０μgの未分画デトロイト５６２ポリＡ mＲＮＡの
存在下で加熱変性させ、そしてcＤＮＡを上記Ｄに記載
した方法にしたがって調製した。２００bpより大きい二
本鎖cＤＮＡ１１.５ngを６％ポリアクリルアミドゲルか
ら電気溶出させ、そしてこれを使用してＥ. coli２９４
における約６０００種のクローンを生成させた。

【００４５】ＵＫ８９ＣＢ６と呼ばれる約４０００個の
コロニーよりなる第二の特異的にプライム処理したcＤ
ＮＡバンクを作成し、この場合４μgのポリＡ mＲＮＡ
酸−尿素アガロースゲルフラクション８と、フラクショ
ン９からの４μgのポリＡ mＲＮＡとのプールを使用し
た(上記Ｃ)。各ＣＢ６デオキシオリゴ−ヌクレオチドプ
ール(上記Ｅ)２５０ngをオリゴdＴ_12-18の代わりにプラ
イマーとして使用した。

【００４６】Ｉ. 全長コロニーバンクのスクリーニン
グ 全長cＤＮＡを含有するコロニーを、ニトロセルロース
フィルタへ直接トランスファーし、次いで３７℃で増殖
させた。これらコロニーを溶菌させ、そしてＤＮＡを変
性させかつ上記Ｆに記載したようにフィルタへ固定した
(４９)。³²Ｐ−標識したＤＮＡプローブをpＤ２のcＤＮ
Ａ挿入物からの１４３塩基対ＨinfＩ〜Ｈae II制限エン
ドヌクレアーゼ断片から調製し(５４)、そしてフィルタ
に固定された全長cＤＮＡとハイブリダイズさせた(５
５)。８×１０⁶ＣＰＭのプローブを１６時間ハイブリダ
イズさせ、次いで上記したように洗浄し(５５)、そして
Ｘ線フィルムに露出させた。２つのコロニーは強いハイ
ブリダイゼーションを示した:Ａ３およびＥ９。

【００４７】Ｊ. 全長ウロキナーゼcＤＮＡ pＡ３お
よびpＥ９の特性 Ａ３プラスミドＤＮＡのＰstＩ制限分析は約３６０bpお
よび約５０bpのcＤＮＡ挿入断片を示し、かつＥ９プラ
スミドＤＮＡのそれは約３４０bpの１つの断片を示し
た。各プラスミドＤＮＡのＰstＩ ＥcoＲＩ二重制限は
予想したように約１９０bpの共通のcＤＮＡ挿入断片を
示し、この場合各プラスミドＤＮＡはＨaeIIＡccＩプラ
イマー断片に対するウロキナーゼ配列情報５'をコード
していた。プラスミドpＡ３は１８５bpのＰstＩＥcoＲ
ＩcＤＮＡ挿入断片をさらに有し、そしてＥ９のそれは
１６０bpの追加断片を有した。pＡ３のより大きい約３
６０bpのＰstＩcＤＮＡ挿入断片をＭ１３ベクターmp７
(５３)中へサブクローン化させ、ジデオキシヌクレオチ
ド連鎖停止法(５２)によって配列決定した。pＡ３のウ
ロキナーゼコード配列は、図７、８および９に示したよ
うに全長ウロキナーゼ蛋白質に対するcＤＮＡ配列にお
けるほぼ位置４０５から位置７８５までに存在する。

【００４８】Ｋ. ウロキナーゼコロニーバンクＵＫ８
９ＣＢ６のスクリーニング 〜１９００ＵＫ８９ＣＢ６cＤＮＡ挿入物を含有するコ
ロニーからのＤＮＡを変性させ、そして上記Ｆに記載し
たと同様にニトロセルローズフィルタへ固定した。³²Ｐ
−標識したＤＮＡプローブを、pＡ３のcＤＮＡ挿入断片
の１４６bp ＰstＩ ＨinfＩ断片から調製した(５４)。
このプローブ４０×１０⁶ＣＰmを次いでＵＫ８９ＣＢ６
コロニーのフィルタに結合したＤＮＡへ１６時間ハイブ
リダイズさせ、次いで上記(５５)したように洗浄し、そ
してＸ線フィルムに露出させた。陽性のハイブリダイゼ
ーションを示す２つのコロニーは、ＵＫ８９ＣＢ６Ｆ１
(pＦ１)およびＵＫ８９ＣＢ６Ｈ１０(pＨ１０)であっ
た。

【００４９】Ｌ. pＦ１およびpＨ１０ウロキナーゼcＤ
ＮＡの特性 pＦ１のＰstＩ制限は〜４５０bpおよび−１２５bpのcＤ
ＮＡ挿入断片を示し、pＨ１０は〜５００bpの１個のＰs
tＩcＤＮＡ挿入断片を示す。pＦ１のＰstＩ ＥcoＲＩ二
重制限はＥcoＲＩ制限部位を示さず、ＰstＩ制限のみの
断片と同一のcＤＮＡ挿入断片を有する。pＨ１０はＥco
ＲＩ制限部位を示し、〜３７５bpおよび〜１１０bpのc
ＤＮＡ挿入断片を生産する。pＨ１０のこのＥcoＲＩ部
位は、恐らく位置６２７に示したと同じＥcoＲＩ部位で
あろう(図７、８および９)。pＦ１cＤＮＡ挿入物は、こ
のＥcoＲＩ制限部位を含有しない。

【００５０】pＨ１０よりも長いcＤＮＡ挿入断片を有す
るpＦ１を配列決定(sequencing)用に選択した。pＦ１c
ＤＮＡ挿入物の両ＰstＩ制限断片をＭ１３サブクローン
化およびジデオキシ配列決定により配列決定した。高分
子量全長ウロキナーゼの全アミノ酸配列をコードするp
Ｆ１,pＡ３およびpＤ２からのＵＫcＤＮＡ挿入物の複合
ヌクレオチド配列を図７、８および９に示す。pＦ１の
ウロキナーゼコード配列は位置１からほぼ位置５７０ま
で示されている。pＤ２のウロキナーゼコード化配列
は、図７、８および９において位置５３２から位置２３
０４まで位置する。

【００５１】アミノ酸配列分析により決定したアミノ酸
位置１におけるアミノ末端セリンを図１並びに図１０お
よび１１に示す。メチオニンで始まりかつグリシンで終
るアミノ末端における先行の２０個のアミノ酸は、恐ら
く高分子量ウロキナーゼの残余の４１１個のアミノ酸を
分泌するためのシグナル配列として作用すると思われ
る。この推定シグナル配列は、他の特性化シグナル配列
と共通して、たとえばサイズおよび疎水性のような特徴
を有する(５６,５７)。

【００５２】高分子量ウロキナーゼから３３Ｋの二本鎖
低分子量ウロキナーゼにするトリプシン開裂部位は次の
通りである:位置１３６におけるlysは短鎖のアミノ末端
アミノ酸であり、位置１５９におけるileは長鎖のアミ
ノ末端である(図１並びに図１０および１１)。

【００５３】Ｍ. Ｅ. coliにおけるウロキナーゼの低
分子量誘導体の発現 １. 長trp ＬＥ融合(図１２) 次の性質を有するプラスミド(pＮＣＶ、５８)を作成し
た:(１)このプラスミドはpＢＲ３２２の誘導体であっ
て、細胞１個当り約２０個のコピーで存在する。(２)こ
のプラスミドは、そのＥ. coli宿主をテトラサイクリン
耐性にする。(３)このプラスミドは、trpリーダーヘプ
チドとtrp Ｅ構造遺伝子(ＬＥ融合遺伝子)との間に融合
部を有する蛋白質の合成を指示する誘発性トリプトファ
ンプロモータを含有する。(４)独特のＰstＩ制限部位が
trpＥ遺伝子に作成され、これを使用してプラスミドpＳ
ＯＭ７Δ１Δ４におけるＬＥ遺伝子の遠位末端における
ＥcoＲＩ部位を、合成配列: を使用する２つのＥcoＲＩ部位によりフランクされたＰ
stＩ部位へ変換することによって、ＰstＩＤＮＡ断片を
クローン化することができる。次いで、trpプロモータ
とＬＥ遺伝子とを含有するＤＮＡ断片を、プラスミドp
ＢＲ３２２中へ導入してプラスミドpＮＣＶを与えた(４
７Ａ)。

【００５４】ヌクレオチド位置５(ＰstＩ５'−開裂部
位)からヌクレオチド位置１１３０(図２、３および４)
までのウロキナーゼＰstＩ断片を、融合蛋白質がtrpプ
ロモータの誘発の際に作成されるように、pＮＣＶのＰs
tＩ部位へクローン化させた。Ｎ末端部はtrpＬＥであ
り、Ｃ末端部は低分子量ウロキナーゼである。

【００５５】図１２を参照して、５μgのプラスミドpＵ
Ｋ５１３dＴ６９Ｄ２(pＤ２)を２０単位のＰstＩによっ
て消化し、低分子量ウロキナーゼをコードする１１２５
bpのcＤＮＡ挿入断片を６％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により単離した。この挿入物〜１μgをゲルから
電気溶出させ、フェノール／クロロホルム抽出し、そし
てエタノールで沈澱させた。１μgのベクタープラスミ
ドpＮＣＶ(５８)を１０単位のＰstＩで消化し、そして
フェノール／クロロホルム抽出の後にエタノール沈澱さ
せた。この１１２５bp断片〜１００ngを２０mＭのトリ
スＨＣl(pＨ７.５)と１０mＭのＭgＣl₂と１０mＭのＤＴ
Ｔと２.５mＭのＡＴＰと３０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
との２０μl中で、ＰstＩ消化したpＮＣＶの〜１００ng
と混合した。１４℃にて一晩結合させた後、混合物の半
分をＥ. coli Ｋ１２菌株２９４にトランスフォームし
た。１２種のトランスフォーマントからのＤＮＡのＢam
ＨＩ消化は適切な配向を有する３種を示した。Ｅ. coli
におけるこのプラスミド(pＵＫ３３trpＬＥ_L)(図１２)
の発現は、３３０００ウロキナーゼを含む長いtrpＬＥ
融合蛋白質を生成した。３３０００ウロキナーゼは、ト
リプシン様活性酵素により位置３および４と位置２６お
よび２７との間で開裂させて活性化した(図５および６
参照)。

【００５６】２. 短trpＬＥ融合(図１３) プラスミドpＩＮＣＶを作成した。これは、trpＥ遺伝子
の大部分が欠失している以外は全ゆる点でpＮＣＶと類
似している(上記参照)。このプラスミドにおいて、Ｂgl
II部位をＰstＩ部位に変換し、そしてこの新しいＰst
Ｉ部位と元のＰstＩ部位との間の領域を欠失させた。p
ＩＮＣＶ〜１００ngをＰstＩおよびＨindIIIによって消
化し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出しそして
エタノール沈澱させた。pＵＫ３３trpＬＥ_L(図１３)〜
３μgをＨind IIIにより完全にかつＰstＩにより部分的
に消化して１１５０bpのＰst I・Ｈind IIIＤＮＡ断片
を生成させ、これを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動後の電気溶出によって精製した。構造ＵＫ遺伝子のＰ
stＩ部位は消化から免れた。ＰstＩ・Ｈind III消化pＩ
ＮＣＶの全部をpＵＫ３３trpＬＥ_Lの１１５０bpＨind I
II・部分ＰstＩ断片〜５０ngと混合し、１４℃にて一晩
結合させた。次いで、この混合物でＥ. coli Ｋ１２菌
株２９４をトランスフォームした。ＢamＨＩ消化によ
り、このプラスミド(pＵＫ３３trpＬＥ_S)の適性な作成
を確認した(図１３)。Ｅ. coliにおけるこのプラスミド
の発現により融合蛋白質が得られ、これから３３０００
ウロキナーゼが活性化された(上記)。

【００５７】３. ３３Ｋウロキナーゼの直接的発現(図
１４および図１５） ヌクレオチド１６で始まるウロキナーゼＤＮＡ断片（図
２、３および４)をpＢＲ３２２誘導体へクローン化さ
せ、trpプロモータが、低分子量ウロキナーゼをコード
しているこのウロキナーゼ断片の直前に位置する構造を
生成させた。プラスミドpＬeＩＦＡtrp１０３(図１４)
はプラスミドpＬeＩＦＡ２５(５８)の誘導体であり、こ
こでＬeＩＦＡ遺伝子末端のＥcoＲＩ部位は除去されて
いる(５９)。pＬeＩＦＡtrp１０３(図１４)の１０μgを
２０単位のＥcoＲＩで消化し、フェノール／クロロホル
ムで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。プラスミド
ＤＮＡ分子のＥcoＲＩ付着末端を延長させて末端を平滑
化し、この場合６０mＭのＮaＣlと７mＭのＭgＣl₂と７m
ＭのトリスＨＣl(pＨ７.４)と１mＭの各リボヌクレオチ
ドトリホスフェートとを含有する５０μlの反応物中で
１２単位のＤＮＡポリメラーゼＩを用いた。反応物を３
７℃にて１時間インキュベートし、フェノール／クロロ
ホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。次い
で、ＤＮＡを１０mＭのトリスＨＣl(pＨ８)と１mＭのＥ
ＤＴＡとの５０μl中に再懸濁させ、５００単位の細菌
性アルカリホスフアターゼ(Ｂacterial Ａlkaline Ｐho
sphatase)により６５℃にて３０分間処理し、２回抽出
し、そしてエタノール沈澱させた。ＰstＩによって消化
した後、混合物を６％ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動にかけ、〜３９００bpベクター断片を電気溶出させ
た。

【００５８】プラスミドpＵＫ３３trpＬＥ_LをＥ. coli
Ｋ１２菌株ＧＭ４８(デオキシアデノシンメチラーゼ^-)
にトランスフォームさせて、このＥ. coli菌株から精製
されたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢclＩによって
消化することができた(６０)。このＤＮＡ４μgを６単
位のＢclＩ(７５mＭのＫＣl、６mＭのトリスＨＣl(pＨ
７.４)、１０mＭのＭgＣl₂、１mＭのＤＴＴ中において)
により５０℃にて１時間処理し、次いで５０mＭのＮaＣ
lとなし、そして１０単位のＰstＩによって消化した。
６％のゲル電気泳動を行ない、９１４bp断片を電気溶出
させた。

【００５９】met lys lys proのアミノ酸配列をコー
ドする１４ヌクレオチドＤＮＡプライマーをホスホトリ
エステル法(４７)によって合成し、これは次の配列を有
した: このプライマー５００ngを、０.５mＭのＡＴＰを含有す
る２０μlの反応物中で１０単位のＴ４ＤＮＡキナーゼ
により５'未満で燐酸化させた。pＵＫ３３trpＬＥ_L(Ｅ.
coli ＧＭ４８における増殖)の２６４bpＰstＩＡccＩ
cＤＮＡ挿入断片を単離した。脱イオン水１０μl中に再
懸濁したこの断片〜５００ngを、燐酸化プライマー２０
μlと混合し、９５℃にて３分間加熱し、ドライアイス
エタノール浴中で急速に凍結させた。この変性したＤＮ
Ａ溶液を６０mＭのＮaＣl、７mＭのＭgＣl₂、７mＭのト
リスＨＣl(pＨ７.４)、１mＭの各デオキシリボヌクレオ
チドトリホスフェートとなし、そして１２単位のＤＮＡ
ポリメラーゼＩ大断片を加えた。３７℃にて２時間のイ
ンキュベーション後、このプライマー修復反応物をフェ
ノール／クロロホルム抽出しそしてエタノール沈澱さ
せ、ＢclＩによって５０℃で完全に消化させた。次い
で、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、
そしてＢclＩに対する２００bpのアミノ末端平滑末端断
片〜５０ngを電気溶出させた。次いで、平滑末端−Ｂcl
Ｉプライマー修復断片〜５０ngとＢclＩＰstＩカルボキ
シ−末端断片〜１００ngと〜３９００bpベクター断片〜
１００ngとを１４℃にて一晩結合させ、Ｅ. coli２９４
中へトランスフォームさせた。多数のトランスフォーマ
ントのＥcoＲＩ消化は適切な作成を示し、ＤＮＡ配列分
析はこの新たなプラスミドpＵＫ３３trp１０３(図１４)
の開始コドンを介している所望の配列を証明した。この
作成において、Ｎ末端メチオニンに続いて２つのリジン
が存在し、それに続いて図５に示すようにアミノ酸配列
５〜２７９が存在する。Ｅ. coliにおけるこのプラスミ
ドの発現は、低分子量ウロキナーゼの合成をもたらし
た。この蛋白質を上記したようにトリプシン様活性酵素
で活性化させ、この酵素はＮ−末端リジン対を開裂させ
かつ位置２６におけるリジンと位置２７におけるイソロ
イシンとの間で開裂するよう作用する(図５)。

【００６０】テトラサイクリン耐性(アンピシリン耐性)
を宿主細胞に付与するようなpＵＫ３３trp１０３の誘導
体プラスミドを作成するのが望ましいと判明した。図１
５はpＵＫ３３trp１０３Ａp^R−Ｔc^Rの以下に述べる作成
を示している。５μgのpＨＧＨ２０７−１(下記参照)を
ＨpaＩおよびＰvu IIで消化した。ベクター断片を単離
しそして精製した。５μgのpＵＫ３３trp１０３をＨpa
ＩおよびＢamＨＩによって消化し、６％ポリアクリルア
ミドで電気泳動させ、そして８３６bpＤＮＡ断片を精製
した。別にpＵＫ３３trp１０３ ５μgをＢamＨＩおよび
Ｐvu IIで消化し、１１９bpＤＮＡ断片を単離かつ精製
した。これら３種の各ＤＮＡ断片の等モル量を１４℃に
て一晩結合させ、これを使用してＥ. coli２９４をトラ
ンスフォームさせた。数種のアンピシリン耐性トランス
フォーマントから得られるプラスミドＤＮＡの制限エン
ドヌクレアーゼ分析はpＵＫ３３trp１０３Ａp^Rの適切な
作成を証明し、かつtrpプロモータ／ＵＫ３３コード化
ＤＮＡの配向における逆転を示した。

【００６１】〜５μgのpＢＲ３２２ＤＮＡをＥcoＲＩに
て消化し、付着性末端をクレノー(Ｋlenow)ＰolＩで満
たして平滑化した。ＰstＩ消化の後、テトラサイクリン
耐性をコードするＤＮＡと複製のオリジンとアンピシリ
ン耐性遺伝子の一部とを有する大型ベクター断片を単離
しかつ精製した。〜５μgのpＵＫ３３trp１０３Ａp^Rを
ＢamＨＩおよびＰstＩによって消化した。アンピシリン
耐性遺伝子の残部とtrpプロモータと殆どの低分子量ウ
ロキナーゼとをコードするＤＮＡ断片を精製した。ほぼ
等モル量のこれら２種のＤＮＡ断片およびpＵＫ３３trp
１０３Ａp^Rからの１１９bpＢamＨＩ−ＰvuＩＩＤＮＡ断
片を１４℃で一晩結合させてpＵＫ３３trp１０３Ａp^RＴ
c^Rの作成を完結させた。このプラスミドを、高分子量全
長ウロキナーゼを発現するよう設計したプラスミドの作
成に使用した(下記Ｎおよび図１６参照)。

【００６２】Ｎ. ウロキナーゼの高分子量誘導体の発
現 １. ５４Ｋウロキナーゼの直接的発現 図１６は全長ウロキナーゼの作成を示している。単一tr
pプロモータを有するプラスミドpＨＧＨ２０７−１を、
二重lacプロモータとそれに続く単一のtrpプロモータと
を有するpＨＧＨ２０７から二重lacプロモータを除去す
ることによって得た。これは次のように行なった:trpプ
ロモータ３１０bpＤＮＡ断片をＥcoＲＩ消化によりpＦ
ＩＦtrp６９(２０)から得た。この断片を、予めＥcoＲ
Ｉで開裂させたpＨＧＨ１０７(４４)中へ挿入した。か
くして、プラスミド(pＨＧＨ２０７)を得、これはＥco
ＲＩ部位がフランクにされた二重lacプロモータとそれ
に続くtrpプロモータとを有する。このように得られたp
ＨＧＨ２０７をＢamＨＩによって消化し、これをＥcoＲ
Ｉによって部分的に消化し、そして最も大きい断片を単
離した。この断片はしたがって完全なtrpプロモータを
有する。pＢＲ３２２から最も大きいＥcoＲＩ−ＢamＨ
Ｉ断片を単離した。両断片を結合させ、そして混合物を
用いてＥ. coli２９４をトランスフォームした。Ｔe
t^r、Ａmp^rコロニーを単離し、それらの殆んどはpＨＧＨ
２０７−１につき示したような構造のプラスミドを有し
た。したがって、プラスミドpＨＧＨ２０７−１はプラ
スミドpＨＧＨ１０７(４４)の誘導体であり、次の性質
を有する:(１)ヒト成長ホルモン遺伝子がpＨＧＨ１０７
によるようにlacプロモータの代わりにトリプトファン
プロモータによってフランクされ、(２)このプラスミド
はＥ. coliで発現させた場合アンピシリン耐性およびテ
トラサイクリン耐性を付与する(４７Ａ参照)。

【００６３】２０μgのpＨＧＨ２０７−１をＥcoＲＩに
より部分的にかつＢglＩＩによって完全に消化した。大
ベクター断片の精製は、５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動と電気溶出とフェノール／クロロホルム抽出とエ
タノール沈澱とによって達成した。１４μgのpＦ１をＢ
gl IIおよびＴaqＩによって消化し、２３６bpのＤＮＡ
断片を単離し、そして６％ポリアクリルアミドゲルによ
って精製した。

【００６４】次の相補的ＤＮＡ断片がホスホトリエステ
ル法(４７)によって合成された: Ｍet Ｓer Ａsn Ｇlu Ｌeu Ｈis ５' ＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴ ＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡ Ｇln Ｖal Ｐro ＣＡＡＧＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＣＡＡＧＧＴＡＧＣ ５’

【００６５】上記したように、アミノ酸配列 Ｍet Ｓe
r Ａsn Ｇlu Ｌeu Ｈis Ｇln ＶalＰroは開始コドンす
なわちＡＴＧと高分子量ウロキナーゼの８個のアミノ末
端アミノ酸とをコードする。５０ngの各合成ＤＮＡ断片
を燐酸化させ、そしてこれら断片を混合し、６５℃にて
１分間加熱し、そして室温にて５分間放冷却した。燐酸
化しかつ混合した合成ＤＮＡ断片の１０ngをＥcoＲＩ
(部分)、Ｂgl IIpＨＧＨ２０７−１ベクター断片の〜２
００ngおよび２３６bpのＢgl IIＴaqＩのＤＮＡ断片〜
５０ngと混合し、１４℃にて一晩結合させ、そしてＥ.
coli２９４にトランスフォームした。２４個のアンピシ
リン耐性コロニーからの個々のプラスミドＤＮＡをＥco
ＲＩおよびＢgl IIによって消化し、適切な構造を示す
１個のプラスミド(pＩnt １)をＤＮＡ配列分析用に選択
した。この分析は、ＡＴＧ開始コドンを介する正確なＤ
ＮＡ配列と高分子量ウロキナーゼのアミノ末端部分とを
証明した。

【００６６】４μgのpＮＣＶ(上記Ｍ)をＢgl IIおよび
ＣlaＩによって消化し、大ベクター断片を単離し、そし
て５％ポリアクリルアミドゲルにより精製した。３０μ
gのpＦ１をＰstＩおよびＢgl IIによって消化し、そし
て６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動させた。４４bp
のＤＮＡ断片を電気溶出させ、フェノール／クロロホル
ム抽出し、そしてエタノール沈澱させた。４μgのpＡ３
ＤＮＡをＰstＩおよびＴaqＩによって消化し、１９２bp
のＤＮＡ断片を６％ポリアクリルアミドゲルから精製し
た。〜１００ngのＢgl II ＣlaＩベクターＤＮＡ断片と
〜５０ngの１９２bp断片と〜５０ngの４４bp断片とを混
合し、１４℃にて一晩結合させ、次いでＥ. coli２９４
にトランスフォームさせた。数種のテトラサイクリン耐
性トランスフォーマントからのプラスミドＤＮＡのＢgl
II ＣlaＩ二重消化物は、pＩnt２と名付けるこの新し
いプラスミドの正確な作成を示した。

【００６７】Ｅ. coli ＧＭ４８(ＡＴＣＣ Ｎo.３９０
９９、１９８２年４月９日寄託)において増殖させたpＵ
Ｋ３３trp１０３Ａp^RＴc^Rの５μgをＢclＩおよびＳalＩ
によって消化し、１３６６bpのＤＮＡ断片を単離かつ精
製した。１０８bpのＥcoＲＩ−ＢclＩＤＮＡ断片を同じ
プラスミドから単離した。pＵＫ３３trp１０３Ａp^RＴc^R
からのＥcoＲＩ−ＳalＩ ＤＮＡ断片と、同じくpＵＫ３
３trp１０３Ａp^RＴc^RからのＥcoＲＩ−ＢclＩ ＤＮＡ断
片とのほぼ等モル量を１４℃にて一晩結合させてpＩnt
を得た。

【００６８】５μgのpＩnt３ ＤＮＡをＢgl IIおよびＳ
alＩで消化し、６％ポリアクリルアミドによって電気泳
動させ、全長ウロキナーゼのカルボキシ末端部分とテト
ラサイクリン耐性遺伝子のアミノ末端部分とを有する１
７０１bpの断片を精製した。

【００６９】〜５μgのpＩnt１ ＤＮＡをＢgl IIおよび
ＳalＩによって消化し、６％ポリアクリルアミドゲルに
よって電気泳動させ、そしてテトラサイクリン耐性遺伝
子のカルボキシ末端部分と複製のオリジンとアンピシリ
ン耐性遺伝子とtrpプロモータと開始コドンＡＴＧと全
長ウロキナーゼのアミノ末端部分とを有する大ベクター
断片を精製した。〜１００ngのベクター断片と〜１００
ngの１７０１bp断片とを混合し、１４℃にて一晩結合さ
せ、そしてＥ. coli２９４にトランスフォームさせた。
正確なＰvu II制限エンドヌクレアーゼパターンを示す
テトラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性コロニー
からのプラスミドが同定され、これはtrpプロモータの
下流の全長ウロキナーゼの作成を確認した。これはプラ
スミドpＵＫ５４trp２０７−１である。全長ウロキナー
ゼはＥ. coli２９４におけるこのプラスミドの発現によ
って生成される。

【００７０】２. Ｅ. coliにおけるpre−ＵＫ５４Ｋの
直接的発現(図１７) 次の方法を用いてpreＵＫ５４の直接発現のためのプラ
スミドを作成した。ホスホトリエステル法(４７)によ
り、アミノ酸配列開始コドンＡＴＧとそれに続くウロキ
ナーゼ予備配列(プレシーケンス)Ａrg Ａla Ｌeuの最
初の３個のＮ−末端アミノ酸とをコードする２つの相補
的ＤＮＡ断片を合成し、これを次に示す:

【００７１】ＥｃｏＲＩおよびＢglＩ制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位は、予備配列のこの部分でフランクして
いる。５０ngの各合成ＤＮＡ断片を燐酸化した。燐酸化
されたこれら断片を混合し、６５℃にて１分間加熱し、
そして室温まで冷却させた。５μgのpＦ１ ＤＮＡをＢg
lＩおよびＢgl IIによって消化し、３１０bpＵＫ ＤＮ
Ａ断片を単離しかつ精製した。〜５０ngの３１０bpＵＫ
ＤＮＡ断片とpＨＧＨ２０７−１(上記Ｎ)からの〜１５
０ngの部分ＥcoＲＩ、Ｂgl IIベクターＤＮＡ断片と１
０ngの燐酸化されかつ混合された合成ＤＮＡ断片とを１
４℃にて一晩結合し、そしてＥ. coli２９４にトランス
フォームさせた。数種のアンピシリン耐性トランスフォ
ーマントから単離された個々のプラスミドＤＮＡを分析
して、高分子量ウロキナーゼの予備配列に関する適性な
作成とヌクレオチド配列とを確認した。

【００７２】１種の正確なプラスミドをpＩnt４と名付
けた。５μgのpＩnt４ ＤＮＡをＢglIIおよびＥcoＲＶ
によって消化し、pre−ＵＫ５４のＮ−末端ヌクレオチ
ドとtrpプロモータとアンピシリン耐性遺伝子と複製の
オリジンとテトラサイクリン耐性をコードするＤＮＡの
部分とを有するベクターＤＮＡ断片を単離かつ精製し
た。５μgのpＵＫ５４trp２０７−１ＤＮＡをＢgl IIお
よびＥcoＲＶによって消化した。ＵＫ５４の残部とテト
ラサイクリン耐性コード化ＤＮＡとをコードするＢglII
ＥcoＲＶ ＤＮＡ断片を単離し、精製しかつＢgl IIＥco
ＲＶベクターＤＮＡ断片と結合させてプラスミドp−pre
ＵＫ５４trp２０７−１の作成を完結した。

【００７３】Ｏ. 組織培養における(プレー)ウロキナ
ーゼの直接的発現 図１８はプレウロキナーゼをコードする遺伝子を、許容
し得る猿細胞中で、プレウロキナーゼを複製および発現
しうる真核発現ベクターp３４２Ｅ(６２)中へ導入する
ことを示している。１０μgのp３４２Ｅ ＤＮＡをＸba
Ｉによって消化し、〜１００塩基対をＢal３１ヌクレア
ーゼによって各方向に除去した(断片１)。ホスホトリエ
ステル法(４７)によって合成されたＨind IIIリンカー
５'ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧの１００ngを燐酸化さ
せ、６５℃まで１分間加熱し、そして室温まで冷却させ
た。燐酸化されたリンカーと断片１とを１４℃にて一晩
結合させ、そしてＥ. coli２９４にトランスフォームさ
せた。pＥＨ３−Ｂal１４と名付けた１種のトランスフ
ォーマントの制限エンドヌクレアーゼ分析は、Ｈind II
I制限エンドヌクレアーゼ部位の導入とＸbaＩ部位の喪
失とを示した。５μgのpＥＨ３−Ｂal１４ ＤＮＡをＨi
nd IIIおよびＨpaＩによって消化した。クレノーＰolＩ
を用いて付着性末端を平滑末端部まで延長させた。ＤＮ
ＡをＢＡＰによって処理し、ＳＶ−４０早期プロモータ
とアンピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンとを含有す
るベクター断片を単離しかつ精製した(断片２)。５μg
のpreＵＫ５４trp２０７−１をＣlaＩおよびＸbaＩによ
って消化した。付着性末端をクレノーＰolＩによって延
長させ、preＵＫ５４をコードするＤＮＡ断片を単離し
かつ精製した(断片３)。〜１００ngの断片２と〜１００
ngの断片３とを１４℃にて一晩結合させ、そしてＥ. co
li２９４にトランスフォームさせた。１種のトランスフ
ォーマントからのpＥＨ３−Ｂal１４preＵＫ５４と名付
けたプラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は
正確な作成を証明した。次いで、pＥＨ３−Ｂal１４pre
ＵＫ５４ＤＮＡを使用して、許容され得る猿細胞(６２)
にトランスフェクトしpreＵＫ５４を発現させると共に
全長高分子量ウロキナーゼを分泌させた。

【００７４】Ｐ. 単離および特性化 ウロキナーゼ含有残部をＥ. coliから単離した。この残
部を、５０mＭのトリス(pＨ８.０)を含有する５Ｍのグ
アニジン塩酸塩中に溶解させた。この溶液を１Ｍのグア
ニジンＨＣlと５０mＭのトリスＨＣl(pＨ９)まで１ng／
mlの蛋白質濃度になるように希釈した。次いで、この溶
液を２mＭの還元型グルタチオン(ＧＳＨ)と０.２mＭの
酸化型グルタチオン(ＧＳＳＧ)とに入れ、そして室温に
て一晩インキュベートした。次いで、再折重ね蛋白質(r
efolded protein)を含有する得られた溶液を水性媒体中
で透析した。得られた溶液は１００ＰＵ／mgの活性を示
すウロキナーゼを含有した。

【００７５】慣用技術にしたがって精製した際、蛋白質
は低分子量の生物活性物質の両連鎖に関する予想された
Ｎ−末端配列を示すことが特性化された。さらに、Ｃ−
末端分析は両連鎖につき適性な配列を示した。蛋白質は
〜３００００ダルトンの分子量にて移動する。これは〜
１７００００ＰＵ／mg(９２２５,０００ＩＵ／mg)の比
活性を有し、１mg／mlが１.３のＯＤ₂₈₀を有すると仮定
する。

【００７６】Ｑ. ウロキナーゼの発現の検出分析 １.発色基質 a 理 論 この分析は、発色団からのトリペプチドの蛋白質分解開
裂に基づいている。開裂の割合は、特異性および試験さ
れるプロテアーゼの濃度に直接関係する。ウロキナーゼ
はクロモゲン基質(発色基質、chromogenic substrate)
Ｓ２４４４(Ｋabi Ｇroup Ｉnc.Ｇreenwich ＣＴから購
入)を開裂する。発色団の生成をモニターすることによ
り、試料中に存在する機能的ウロキナーゼの量を決定す
ることができる。ウロキナーゼは不活性前駆体型として
合成され、活性化は残基２６(リジン)と残基２７(イソ
ロイシン)(プロテアーゼクローンに基づいて番号を付す
る、図５)との間の開裂によって生ずる。幾分かのウロ
キナーゼの生成が自己活性化されたことが判明しおよび
／またはＥ. coliプロテアーゼによって活性化された。
ウロキナーゼの活性化を確保してこのクロモゲン技術に
より検出を可能にするためには、少量のトリプシンによ
るこの試料の処理が必要である。トリプシンは、ウロキ
ナーゼ活性化に必要とされるリジン−イソロイシン結合
を開裂させうるプロテアーゼである。しかしながら、ま
たトリプシンはクロモゲン基質をも開裂させ、したがっ
て分析から除去せねばならない。大豆トリプシンインヒ
ビター(ＳＴＩ)は、ウロキナーゼに作用を示さずにトリ
プシンを不活性化する蛋白質である。したがって、この
分析はウロキナーゼのトリプシン活性化とトリプシンの
ＳＴＩ阻害と最後にクロモゲン基質の添加とからなっ
て、存在する機能的ウロキナーゼを測定する。

【００７７】b 手 順 この分析は次のように行なわれる:０.２mＬの０.１Ｍト
リス(pＨ８.０)と５０μＬの分析すべき試料と５μＬの
トリプシン(０.１Ｍのトリス(pＨ８.０)と０.２５Ｍの
ＣaＣl₂における０.１mg／mＬ)とを試験管に加え、この
試料を３７℃で１０分間インキュベート(培養)した。ト
リプシンを２μＬの１０mg／mＬ ＳＴＩ(０.１Ｍのトリ
スpＨ８.０中)の添加によって失活させた。５０μＬの
Ｓ２４４４の１mＭ溶液(水中)を加えかつ反応物を３７
℃にて１０分間インキュベートすることにより、ウロキ
ナーゼ活性を測定した。酢酸(５０μＬ)を加えて反応を
停止させ、溶液を遠心分離して沈澱物を除去し、そして
４０５nmにおける吸光度を測定した。ウロキナーゼの実
際量は、既知量のウロキナーゼ(Ｃalbiochem、ＳanＤie
go ＣＡから得られる)の標準溶液の希釈物につき分析を
行なって得られる測定値を試料の測定値と比較して計算
することができる。

【００７８】２.プラスミン形成の直接的分析 a 理 論 ウロキナーゼに対するさらに一層鋭敏な分析は、プラス
ミノーゲンからプラスミンへのウロキナーゼが触媒変換
をモニターすることにより得られる。プラスミンは、上
記１と同じ原理に基づいてクロモゲン基質分析を行なう
酵素である。この分析の基礎はウロキナーゼ含有溶液を
プラスミノーゲンの溶液と共にインキュベートした後に
形成されるプラスミンの量を測定することに基づいてい
る。ウロキナーゼの量が多い程、生成されるプラスミン
の量が多くなる。

【００７９】b 手 順 試料の１部を０.７mg／mlのプラスミノーゲン(０.０１
２ＭのＮaＣlを含有する０.５ＭのトリスＨＣl、pＨ７.
４)０.１０mlと混合し、そして容量を０.１５mlに調整
する。この混合物を３７℃にて(上記したような)種々の
時間にわたってインキュベートし、０.３５mlのＳ２２
５１(上記緩衝液中の１.０mＭ溶液)を加え、そして反応
を３７℃にて５分間続ける。酢酸(２５μＬ)を加えて反
応を停止させ、４０５nmにおける吸光度を測定する。活
性の定量は、標準ウロキナーゼ溶液の希釈物と比較して
得られる。

【００８０】３.プラスミン生成の間接的分析 a 理 論 ウロキナーゼ活性に関する鋭敏な分析が開発されている
(６１)。この分析は、繊維素とプラスミノーゲンとを含
有する寒天プレートにおいて繊維素のプラスミン消化の
程度を測定することによるプラスミン生成の定量に基づ
いている。プラスミンは、繊維素プレートにおいて透明
な溶菌領域を生成する。この溶菌領域の面積を、試料に
おけるウロキナーゼの量と相関させることができる。

【００８１】b 手 順 Ｇranelli−ＰipernoおよびＲeich(６１)の方法にした
がい、プレートを３７℃にて１〜３時間インキュベート
しそして溶菌領域を測定した。定量は、標準ウロキナー
ゼ溶液の希釈物につき分析を行なって得られた。

【００８２】Ｒ. ウロキナーゼ活性の検出 １. 細菌増殖とウロキナーゼ試料の調製 Ｅ . coli(Ｗ３１１０)の菌株を、ウロキナーゼ融合蛋白
質含有のプラスミド(pＵＫ３３trpＬＥs)を用いてトラ
ンスフォームさせた。この発現ベヒクル(短trpＬＥ融合
体)は上記した通りである。菌体を最小培地で５５０nm
にて１.２のＯ.Ｄとなるまで一晩増殖させた。２００ml
の培地を追加した。インドールアクリル酸、すなわちト
リプトファンオペロン制御遺伝子の発現を促進すると思
われる化合物を１０μg／mＬの濃度まで加えた。菌体を
２時間インキュベートし、そして採取した。４００mＬ
の培地から得られた菌体を水中に懸濁させ、グアニジン
を７Ｍ(最終容量４０mＬ)の濃度まで加えた。この溶液
を室温で９０分間インキュベートした。不溶物質を遠心
分離により除去した。上澄液を、０.１ＭのＮaＣlを含
有する０.０１ＭのトリスＨＣl(pＨ７.５)に対し４時間
透析した。不溶物質を遠心分離により除去し、試料を
０.０１ＭのトリスＨＣl(pＨ７.５)に対して２.５時間
透析した。

【００８３】この試料を０.０１ＭのトリスＨＣl(pＨ
７.５)で予め平衡化させた３.９×９cmのＤＥ−５２カ
ラムに施こし、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、かつ
０.１５ＭのＮaＣlを含有する０.０１ＭのトリスＨＣl
(pＨ７.５)によって溶出させた。活性のピークをプール
し、そしてこれを後の全ての試験に使用した。

【００８４】２. 活性の検出 図１９は、上記Ｑ・２・に記載したと同様な条件下で分
析した場合の分画Ｅ.coli抽出物によるプラスミノーゲ
ンの直接的活性化の結果を示している。プラスミノーゲ
ンの存在に依存する活性が生成される。したがって、モ
ニターされる活性はプラスミノーゲン依存性の活性であ
る。また測定される活性は時間と共に増加し、これはプ
ラスミンの時間依存性の触媒生成を示している。これら
の性質はウロキナーゼの性質、すなわちプラスミノーゲ
ンの触媒活性化と一致する。ウロキナーゼプラスミドを
含有しないＥ. coliについて行なった同様の抽出条件
は、これらの条件下でプラスミノーゲンを活性化しな
い。

【００８５】さらに、抽出物を上記したような分析で試
験してウロキナーゼ活性を検出すると共に定量した。図
２０は、上記Ｑ・２・に記載した分析において１０分間
の活性化で得られる細菌性のフラクションの種々な量の
効果を示している。得られた数値を、標準ウロキナーゼ
溶液(プラフ・ユニテージ測定、Ｐlough Ｕnitage det
ermination)を用いて得られる数値と比較する。プラス
ミノーゲン活性化の程度は、加えたクローン化ウロキナ
ーゼの量に正比例する。精製した天然ウロキナーゼに対
して生じた抗体は、天然ウロキナーゼの活性を低下させ
ることが知られている。時刻０の時点でこの分析に加え
たこれら抗体の効果をも図２０に示す。Ｅ. coli由来の
物質の顕著な阻害が観察される。これは、Ｅ. coli由来
の物質において観察された活性が天然ウロキナーゼと同
じ抗原部位を有し、したがって実際にウロキナーゼ微生
物的に合成されることを証明している。

【００８６】活性の検出および抗体の阻害に対する同様
な結果が、繊維素プレート分析を用いて観察される(上
記Ｑ・３・に記載)。これらの結果を下記表１に要約す
る。

【表１】 ウロキナーゼ蛋白質の繊維素プレート分析 ウロキナーゼ抗体の 試 料 活 性 存在下における活性 阻害率％ (プラウ・単位／mＬ)¹ (プラウ・単位／mＬ)¹ ウロキナーゼ 標 準 １１２ ２.５ ９８ １１ ０.４５ ９６ １.１ ０ １００ 本発明で生成 された ウロキナーゼ ４８０ １.１２ ９９ ２２４ ０ １００ 注１.既知量のウロキナーゼ標準をウエルへ加えて得ら
れた標準曲線。Ｅ.coliフラクションにつき得られた数
値およびこの標準曲線から外挿することにより得られた
抗体阻害率。

【００８７】標準ウロキナーゼ活性は、この蛋白質に対
して生ずるウロキナーゼ抗体の添加により９６％もしく
はそれ以上阻害された。Ｅ. coli由来の抽出物の分析
は、顕著なウロキナーゼ活性を示した。この活性は、天
然ウロキナーゼに対する抗体を分析へ加えた際、殆んど
完全に阻害された。

【００８８】さらに、第三の分析(クロモゲン基質分析)
も、Ｅ. coli抽出物においてウロキナーゼ様活性を検出
した。これは分析の最も低い感度であるため、抗体阻害
試験は阻害を観察するのに必要とされる多量の抗体のた
め行うことができなかった。

【００８９】Ｃalbiochemから購入した標準ウロキナー
ゼを用いて、上記３種の分析値を定量化した。得られた
数値(プラウ・単位／mＬ)は、全て同じ程度の大きさで
あった:繊維素プレートにつき５００;プラスミノーゲン
活性化につき１００;およびクロモゲン基質(Ｓ２４４
４)につき３５０。生じた変化は、疑いもなく試験時に
おける物質の比較的不純な性質によるものである。

【００９０】薬剤組成物 本発明の化合物は公知方法にしたがって配合して薬剤上
有用な組成物を調製することができ、このヒトウロキナ
ーゼ生産物を薬剤上許容しうるキャリヤベヒクルと混合
する。適するベヒクルおよびその配合はたとえばＥ.Ｗ.
ＭartinによるＲemington's Ｐharmaceutical Ｓcience
sに記載されており、これを参考のためここに引用す
る。この種の組成物は有効量の本発明の蛋白質を、宿主
に有効投与するのに適する薬剤上許容される組成物を調
製するための適する量のベヒクルと一緒に含有する。

【００９１】Ａ 非経口投与 本発明のヒトウロキナーゼは血栓閉塞症またはその状態
にかかっている患者に非経口投与することができる。投
与量および投与割合は、他の心臓血管の血栓崩壊剤の臨
床的投与に現在使用されているものと同等であり、たと
えば肺動脈塞栓症にかかっている患者の場合体重１kg当
り約４４００ＩＵを静脈初期投与し、次いで１２時間に
わたり約４４００ＩＵ／kg／hr.の割合で連続的に静脈
潅流する。

【００９２】ここで使用しうる非経口型のほぼ均質なヒ
トウロキナーゼに対する適当な投与形態の１例として、
２５００００ＩＵウロキナーゼ活性を有する試料と２５
mgのマンニトールと４５mgの塩化ナトリウムとを注射用
の５mlの無菌水で再編成し、適量の０.９％塩化ナトリ
ウム注射液もしくは静脈投与用の５％デキストロース注
射液と混合することができる。

【００９３】本発明のヒトウロキナーゼ蛋白質は、決定
されたＤＮＡ遺伝子と推定アミノ酸配列とにより定義さ
れている。対応する天然の相同変異(allelicvariation
s)物も存在し、かつ個々に生ずることが理解されよう。
これらの変異は全体的配列におけるアミノ酸の相違によ
って、或いは前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、
挿入、逆転もしくは付加によって示すことができる。さ
らに、たとえば基礎的ＤＮＡの部位に関連する世代交代
による単一もしくは多重のアミノ酸置換、欠失、付加も
しくは置換によって種々改変される各種のヒトウロキナ
ーゼ誘導体を調製するため、組換ＤＮＡ技術を使用する
可能性が存在する。ヒトウロキナーゼの誘導体をもたら
す、これら全ての改変および対応する変異は、本質的か
つ特徴的なヒトウロキナーゼ活性が種類において影響を
受けない限り、本発明の範囲内に包含される。

【００９４】特定の好適具体例につき説明したが、本発
明はこれらのみに限定されないことが了解されるであろ
う。文 献 １. 米国特許Ｎo.３３５５３６１ ２. 米国特許Ｎo.３９２６７２７ ３. 米国特許Ｎo.４０２９７６７ ４. 米国特許Ｎo.４２５８０３０ ５. 米国特許Ｎo.４２７１１５０ ６. 欧州特許出願公開Ｎo.００３７６８７ ７. 米国特許Ｎo.３５５５０００ ８. Ｗallen,Ｐ.,Ｐroc.Ｓerono Ｓymp. ９,９１(１９
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４４(１９８３)

【図面の簡単な説明】

【図１】 ウロキナーゼポリペプチドの略図である。低
分子量ウロキナーゼはアミノ酸１３６から開始し、アミ
ノ酸４１１で終る。高分子量ウロキナーゼはアミノ酸１
から開始し、アミノ酸４１１で終る。高分子量および低
分子量ウロキナーゼの両者の単一鎖型から生物活性の２
本鎖型への変換は、アミノ酸１５８と１５９との間の蛋
白質分解開裂によって生ずる。プレウロキナーゼはアミ
ノ酸−２０で始まる。図示したジスルフィド結合の立体
配座位置決定は、他のセリンプロテアーゼに対する類似
性に基づいている。

【図２】 図３および図４と共に、低分子量３３０００
ダルトンのウロキナーゼ生物活性蛋白質に対するプラス
ミドpＤ２ cＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す図である。合成デオキ
シオリゴヌクレオチドＣＢ６Ｂプローブのヌクレオチド
部分に下線を施こす。

【図３】 図２および図４と共に、低分子量３３０００
ダルトンのウロキナーゼ生物活性蛋白質に対するプラス
ミドpＤ２ cＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す図である。合成デオキ
シオリゴヌクレオチドＣＢ６Ｂプローブのヌクレオチド
部分に下線を施こす。

【図４】 図２および図３と共に、低分子量３３０００
ダルトンのウロキナーゼ生物活性蛋白質に対するプラス
ミドpＤ２ cＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す図である。合成デオキ
シオリゴヌクレオチドＣＢ６Ｂプローブのヌクレオチド
部分に下線を施こす。

【図５】 図６と共に、図２、３および４のcＤＮＡ配
列の推定アミノ酸配列を示す図であり、cＤＮＡ挿入部
分のアミノ酸は１〜２７９の番号を符する。

【図６】 図５と共に、図２、３および４のcＤＮＡ配
列の推定アミノ酸配列を示す図であり、cＤＮＡ挿入部
分のアミノ酸は１〜２７９の番号を符する。

【図７】 図８および図９と共に、全長ヒトウロキナー
ゼ蛋白質に対するcＤＮＡのヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示している。ＣＢ６Ｂプロ
ーブには同様に下線を施こす。

【図８】 図７および図９と共に、全長ヒトウロキナー
ゼ蛋白質に対するcＤＮＡのヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示している。ＣＢ６Ｂプロ
ーブには同様に下線を施こす。

【図９】 図７および図８と共に、全長ヒトウロキナー
ゼ蛋白質に対するcＤＮＡのヌクレオチド配列および制
限エンドヌクレアーゼ地図を示している。ＣＢ６Ｂプロ
ーブには同様に下線を施こす。

【図１０】 図１１と共に、図７、８および９のcＤＮ
Ａ配列からの全長ウロキナーゼに対する推定アミノ酸配
列を示す図である。

【図１１】 図１０と共に、図７、８および９のcＤＮ
Ａ配列からの全長ウロキナーゼに対する推定アミノ酸配
列を示す図である。

【図１２】 長い融合−３３０００ダルトン蛋白質の発
現のためのプラスミドpＵＫ３３trpＬＥ_Rの作成を示す
図である。

【図１３】 短かい融合３３０００ダルトン蛋白質の発
現のためのプラスミドpＵＫ３３trpＬＥ_Sの作成を示す
図である。

【図１４】 ３３０００ダルトンの蛋白質の直接的発現
のためのプラスミドの作成を示す図である。

【図１５】 ３３Ｋダルトンの蛋白質の直接的発現のた
めのプラスミドの他の作成を示す図である。

【図１６】 ５４Ｋのウロキナーゼおよび５４Ｋのウロ
キナーゼの前駆体型を直接的に発現するためのプラスミ
ドの作成を示す図である。

【図１７】 ５４Ｋのウロキナーゼおよび５４Ｋのウロ
キナーゼの前駆体型を直接的に発現するためのプラスミ
ドの作成を示す図である。

【図１８】 ５４Ｋのウロキナーゼを真核生物細胞中で
発現するためのプラスミド(p−pＥＨ３−Ｂal１４preＵ
Ｋ５４)の作成を示す図である。

【図１９】 本明細書中に記載したように生産されるウ
ロキナーゼによるプラスミン分析におけるプラスミノー
ゲンの経時的活性化およびその要件を示す図である。

【図２０】 ウロキナーゼ抽出物のプラスミノーゲン賦
活活性および天然ウロキナーゼに対して生じた抗体によ
るこの活性の阻害を示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゴードン・アラン・ヴィハー アメリカ合衆国、カリフォルニア・94070、 サン・カーロス、メイプル・ウェイ・14

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナ
   ーゼをコードするＤＮＡ断片を含有し、宿主細胞中で該
   ＤＮＡ断片を発現させる能力を有する組換え発現ベクタ
   ー。 【化１】 【化２】
2. 【請求項２】 該ＤＮＡ断片の５'末端に融合した下記
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をも含むことを特
   徴とする請求項１の組換え発現ベクター。 【化３】
3. 【請求項３】 下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナ
   ーゼをコードするＤＮＡ断片を含有し、宿主細胞中で該
   ＤＮＡ断片を発現させる能力を有する組換え発現ベクタ
   ーで形質転換された細胞。 【化４】 【化５】
4. 【請求項４】 該組換え発現ベクターが該ＤＮＡ断片の
   ５'-末端に融合した下記アミノ酸配列をコードするＤＮ
   Ａ配列をも含むことを特徴とする請求項３の細胞。 【化６】
5. 【請求項５】 大腸菌である請求項３または請求項４に
   記載の細胞。