JPH1121252A - アルツハイマーアミロイドポリペプチドを使用した薬学的組成物および処置方法 - Google Patents

アルツハイマーアミロイドポリペプチドを使用した薬学的組成物および処置方法

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JPH1121252A
JPH1121252A JP9342118A JP34211897A JPH1121252A JP H1121252 A JPH1121252 A JP H1121252A JP 9342118 A JP9342118 A JP 9342118A JP 34211897 A JP34211897 A JP 34211897A JP H1121252 A JPH1121252 A JP H1121252A
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dna
amino acid
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コーデル バーバラ
James W Schilling
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 クニッツ（Kunitz）型塩基性プロテアーゼイ
ンヒビターに関連する疾患を治療するための、Ａ４ｉプ
ロテアーゼを含有する薬学的組成物およびそのプロテア
ーゼのアナログを提供すること。 【解決手段】 炎症を抑制するための薬学的に許容可能
な組成物であって、薬学的に許容可能な担体； 配列 【化１】 のタンパク質；および該配列中の１３位のアルギニンで
あるアミノ酸型のアミノ酸で置換されているタンパク質
アナログ；を含有する、組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、概して、薬学的組
成物の分野およびそのような組成物を種々の疾患を処置
するために使用する方法に関する。詳細には、本発明
は、クニッツ（Kunitz）型塩基性プロテアーゼインヒビ
ターに関連する疾患を治療するための、Ａ４ｉプロテア
ーゼを含有する薬学的組成物およびそのプロテアーゼの
アナログに関する。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病の人口統計学は次第に
よく理解されつつある。統計によると、65才以上のアメ
リカ人の5％を超える人々、および85才以上のアメリカ
人の15％を超える人々がこの疾患で苦しんでいる（Cros
s, A.J., Eur J Pharmacol (1982) 82:77-80; Terry,
R.D. ら、Ann Neurol (1983) 14:497-506）。老人の長
期看護施設での幽閉はこの疾患に起因し、専門の看護施
設で死亡する人々の約65％がこの疾患をわずらっている
と思われる。
【０００３】残念なことに、現在のところ、治療は実験
的なものであり、診断も信頼性がない。直接的な診断法
がなく、示されている徴候に対して別の説明がなされ
る、陰性の結果に基づく一連の評価によって診断がなさ
れている。死後の脳の生検によってこの疾患の存在が正
確に査定され得るとすると、最近の結果は、生存者にお
ける現在の診断法では約20％の割合の偽陽性があること
を示す。
【０００４】アルツハイマー病の存在を診断する直接的
なアッセイ法を有することは、患者の適切な看護を可能
にし、治療法を開発するのに非常に有用である。以下に
述べる本発明は、この診断法を開発することを提供す
る。
【０００５】アルツハイマー病の存在に伴う、生化学的
および代謝的現象に関するある種の事実が知られてい
る。アルツハイマー病の脳に見られる形態学的および病
理組織学的な２つの変化は、神経原線維変化（NFT）お
よびアミロイドの沈着である。神経細胞内の神経原線維
変化は他の退行性疾患にも存在するが、神経細胞問（軸
索斑、neuritic plaques) および毛細血管系周囲（血管
斑、vascular plaques)の両方でのアミロイド沈着物の
存在は、アルツハイマーの特徴と考えられる。これらの
うちで、軸索斑に最も多く羅患しているようである（Pr
ice, D.L. ら、DrugDevelopment Research (1985) 5:59
-68)。老人斑はまた、アルツハイマー病が進行する老齢
のダウン症患者の脳にも見られる。これらの老人斑の塊
を構成するタンパク質は、部分的に精製され、配列が決
定されている。死亡したアルツハイマー病患者の老人斑
の多い脳が、本明細書文に「β-アミロイドコアタンパ
ク質」として引用する、約4.2kdの「コア」ポリペプチ
ド、アミロイドプラークコアタンパク質（APCP）を抽出
するのに使用されて来た。このペプチドはGlenner, G.
らによって、β-タンパク質と命名された（Biochem Bio
phys Res Commun (1984) 120:885-890)。アミノ末端の
アミノ酸配列は決定されており（Glenner, G. ら、Bioc
hem Biophys Res Commun (1984) 122:1131-1135); Mast
ers, C. L. ら、Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:42
45-4259)、２つのグループにより報告されているアミノ
酸配列は、Glennerらが、アルツハイマー病大脳血管の
アミロイドの11位をグルタミンであるとしているのに対
し、Mastersらは11位をグルタミン酸としていること以
外は、同一である。さらに、前者は、大脳血管のアミロ
イドは独特のアミノ末端を有すると報告しているが、後
者は、アミロイドコアブラークに見い出される形態は
「不ぞろいの」アミノ末端を有する、すなわち、この原
料から単離されたペプチドは、3、7、あるいは8位のア
ミノ酸がアミノ末端から欠失していると報告している。
両方のグルーブは、同じペプチドがアミロイドプラーク
コアおよび成人ダウン症をわずらっている人々の血管ア
ミロイドに見い出されることを示し、11位がグルタミン
酸であると報告している。β-アミロイドコアタンパク
質に関するさらなる研究もまた、Roher，A.ら、Proc Na
tl Acad Sci USA (1986)83:2662-2666 によってなさ
れ、それは、タンパク質の完全なアミノ酸組成を示し、
既知のタンパク質のそれのいずれとも相同しないことを
証明した。しかし、得られた構成成分は明かにAllsop,
D.ら、Brian Res (1983) 259:348352 のそれとも、Glen
nerあるいはMasters（上述）により公表されたものとも
一致しない。
【０００６】Wong, C.W.ら、Proc Natl Acad Sci USA
(1985) 82:8729-8732 は、Masters（上述）によって記
載されたβ-アミロイドコアタンパク質の最初の10個の
アミノ酸に相同する合成ペプチドがマウスで抗体を引き
起こし得、これらの抗体がアミロイドが沈着している大
脳血管の染色のみでなく、軸索斑の染色にも使用され得
ることを示した。これらの結果は、Allsop, D.ら、Neur
oscience Letters (1986) 68:252-256 により、8-17位
のアミノ酸に相当する合成ペプチドに対するモクローレ
ナル抗体用いて確認された。従って、アルツハイマー病
患者の脳の様々な位置に見られる斑タンパク質は概し
て、免疫反応性において類似するようである。洗浄剤お
よびカオトロピックエージェントのような一般に使用さ
れる多くの変性剤によって可溶化が達成され得ないこと
に示されるように、それは非常に不溶性である（Master
s, 上述、Allsop, D.ら,上述）。
【０００７】ある種の他のアミロイドタンパク質からの
類推によって、β-アミロイドコアタンパク質は、末梢
循環系あるいはリンパ系で前駆体から形成され得ると考
えられている。アミロイドタンパク質の前駆体タンパク
質の性質が知られている、既知の疾患関連アミロイド沈
着物が6例ある：原発性アミロイドーシスでは、原料は
免疫グロブリンのＬ鎖であり；続発性アミロイドーシス
では、前駆体はアミロイドAタンパク質であり；家族性
アミロイド多発性神経障害および老人性心性アミロイド
ーシスでは、プレアルブミンあるいはその変異体であ
り；甲状腺の髄質癌では、プロカルシトニンフラグメン
トであり；そして、遺伝性脳出血ではγ-トレースフラ
グメント（gamma-trace fragmen)tである（例えぱ、Gle
nner, G. New England Jourmal of Medicine (1980) 30
2:1283; Sletton, K.ら、Biochem J(1981) 195:561; Be
ndittら、FEBS Lett (1971) 19:169; Sletton, K.ら、E
urJ Biochem (1974) 41:117; Sletton, K.ら、J Exp Me
d (1976) 143:993）。前述はリストの一部であり、甲状
腺癌のアミロイドの前駆体としてのプロカルシトニンフ
ラグメントに関する参考文献がさらに、少なくともいく
つかある。一方で、あるいはさらに、そのようなβ-ア
ミロイドコアタンパク質の前駆体は脳で産生され得る。
大きなタンパク質の構造内にβ-アミロイドコアタンパ
ク質配列を有するタンパク質が存在することが報告され
ている（Kang, J.ら、Nature (1987)325:733-736)。β-
アミロイドコアタンパク質のインビボの潜在的前駆体で
あるこのタンパク質は、ヒト胎児脳組織cDNAライブラリ
ーから単離されたcDNAクローンの配列から予想され、そ
れは、β-アミロイドコアタンパク質のアミノ末端は597
位から始まる、695個のアミノ酸配列からなる。上述し
た一連のことから類推すると、そのような前駆物質ある
いはそのフラグメントは、アルツハイマー病患者の血清
中に、羅患していない人と比較して区別し得るレベルで
循環している。一方で、あるいはさらに、そのような差
が脳脊髄液中に検出し得る。本発明に記載の新規な前駆
体タンパク質の発見以来、類似の了ミロイト前駆体タン
パク質（Kitaguchi et al., Nature 331:530-532 (198
8)）、またはやや大きい、７７０個のアミノ酸のアミロ
イド前駆体（Tanzi et al., Nature 331:528-530 (198
8)）の特性が他者によって記述されている。これらは全
て、約５７個のアミノ酸挿入を含む。この特定の挿入配
列は、多数のセリンプロテアーゼに特異的な多数のクニ
ッツ型インヒビターとの相同性が高い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】５７個のアミノ酸のプ
ロテアーゼインヒビターを含有する薬学的組成物および
これらの組成物の使用が教示されている。このプロテア
ーゼインヒビターは、Ａ４ｉと記載され、これはアルツ
ハイマー病に関連するものである。Ａ４ｉプロテアーゼ
に加えて、他のアナログも教示されており、同様に、そ
のようなアナログを含有する薬学的組成物、およびクニ
ッツ型塩基性プロテアーゼインヒビターに関連する種々
の異常の処置におけるこれらの薬学的組成物の使用が教
示されている。例えば、Ａ４ｉプロテアーゼおよびその
アナログを含有する薬学的組成物は、プラスミンおよび
トリプターゼを阻害し、さらに膵臓トリプシン、α一キ
モトリプシン、組織カリクレイン、および血清カリクレ
インを阻害する。ある疾患は、トリプシン、キモトリプ
シンおよびエラスターゼなどのプロテアーゼが循環系中
へ全体的に放出することに関連する。したがって、Ａ４
ｉおよびアナログを含有する薬学的組成物は、これらの
プロテアーゼの活動を阻害し、そのような疾患の処置に
使用され得る。
【０００９】
【課題を解決するため位の手段】本発明の重要な目的
は、プロテアーゼの放出に関連する疾患を処置するため
の認可された方法を提供することである。この方法に
は、そのような疾患に苦しむ患者に、アミノ酸配列が：
【００１０】
【化２】
【００１１】であるタンパク質（またはそのアナログ）
の薬学的に有効な量を投与することが含まれる。
【００１２】本発明のさらに他の重要な目杓は、上記の
タンパク質と組み合わせて、薬学的に許容可能な担体お
よび賦形剤材料を含有する薬学的組成物を提供すること
である。本発明のさらに他の重要な目的は、繊維素溶解
阻害活性を有している薬学的に許容可能な組成物を開
示、および記載することである。これらの組成物は、繊
維素溶解阻害に有効な量の上記のタンパク質と共に、薬
学的に許容可能な担体および賦形剤材料を含有する。
【００１３】本発明の他の重要な目的は、薬学的組成物
を提供すること、および被験体の創傷部位におけるフィ
ブリン溶解を不活性化して創傷修復を促進するために有
用であるこれらの組成物を使用する方法を提供すること
である。
【００１４】本発明の他の目的は、血栓溶解性を有する
薬学的組成物を提供することである。これらの組成物
は、薬学的に許容可能な賦形剤材料と組み合わせて、血
栓溶解に有効な量の上記タンパク質を含有する。
【００１５】本発明の重要な特徴は、本発明の薬学的組
成物が疾患に関連する広範囲の生化学的反応の阻害に有
用であることである。本発明の利点は、本発明の組成物
に使用されるタンパク質が毒性が無く、そして望ましく
ない副作用をもたらさないことである。
【００１６】本発明のこれらの目的および他の目的、利
点および特徴は、本明細書の一部を構成する添付の図
面、並びにDNAおよびアミノ酸配列を参照しつつ、以下
にさらに詳述される構造、合成、処方、および便用法の
詳細を読むに従って当業者に明らかとなるであろう。
【００１７】
【発明の実施の形態】プロテアーゼインヒビターおよび
そのアナログを含有する本発明の薬学的組成物並びにそ
の組成物を使用する方法を記載する前に、本発明が、記
載する特定の処方または使用に限定されるものではない
ことを理解されたい。そのような処方および使用は、当
然変更され得るからである。さらに、本明細書で使用さ
れる用語が特定の実施態様のみを記載するためのもので
あり、限定を意図するものではないことも理解された
い。本発明の範囲は添付の請求の範囲にのみ限定される
からである。
【００１８】本明細書および添付の請求の範囲に使用さ
れているように、単数の形態である”ａ”、”ａｎ”、
および”ｔｈｅ”は、文脈において明らかに他の指示が
ない限り、複数の意味も含むことに留意しなければなら
ない。したがって、例えば、”a protease inhibitor”
（プロテアーゼインヒビター）という表現は、複数のそ
のようなプロテアーゼインヒビターの混合物を包含す
る。”an anaog of an inhibitor”（インヒビターのア
ナログ）という表現は、複数のそのようなアナログの混
合物を包含し、”the method of use”（使用方法）と
いう表現は、当業者に既知であるような複数の方法また
は本開示を読むに従って当業者に明らかとなるであろう
複数の方法を包含する。
【００１９】A.定義 本明細書文に使用されるように、「β-アミロイドコア
タンパク質」は、Masters, C.L.ら、Proc Natl Acad Sc
i USA (1985) 82:4245-4249によって記載されたタンパ
ク質を意味し、本明細書文で「Masteresら」として引用
される。この約4kDのタンパク質は、わずかに異なるア
ミノ末端を有する4つのペプチドの混合物として、配列
分析によりアミノ末端において定義きれ、3つの小さい
ペプチドのアミノ末端は最も大きいペプチドのアミノ末
端に完全にコードされている。最も長い形態の最初の28
個のアミノ酸は；
【００２０】
【化３】
【００２１】である。
【００２２】「β-アミロイド関連タンパク質あるいは
β-アミロイド関連ペプチド」を、それらの配列内に、
上述で定義されたβ-アミロイドコアタンパク質の配
列、あるいは上述で定義されたβ-アミロイドコアタン
パク質の配列を必ずしも含まないようなタンパク質を有
するタンパク質と定義する。１例として、この用語はKa
ng, J.ら、Nature (1987) 325:733-736によって記載さ
れ、ここに「Kangら」として定義するタンパク質に言及
するのに使用され、それはその構造内の695個のアミノ
酸のタンパク質の597位にβ-アミロイドコアタンパク質
を有する。
【００２３】別の例として、この用語は、図１に示すλ
APCP168i4によってコードされるタンパク質を言い、そ
の構造内の751個のアミノ酸のタンパク質の653位にβ-
アミロイドコアタンパクー質を有する。
【００２４】「免疫原性β-アミロイドコアペプチド」
あるいは「免疫原性β-アミロイド関連ペプチド」と
は、そのアミノ酸配列が、β-アミロイドコアタンパク
質あるいはβ-アミロイド関連タンパク質のある領域に
相同し、免疫した動物で抗体反応を引き起こし得るペプ
チドを言う。
【００２５】「アルツハイマー病の遺伝的素質」とは、
アルツハイマー病患者、あるいはアルツハイマー病にな
る運命にある人のゲノムには見い出されるが、正常な
（無病の）人にはない、同定可能な遺伝子の変異あるい
は変化を言う。
【００２６】本明細書において使用される「Ａ４ｉ」
は、バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ｉ４由来のポ
リヌクレオチドによりコードされる、新規なセリンプロ
テアーゼインヒビターに対応するポリペプチドを言う。
Ａ４ｉポリペプチドは必ずしも物理的にこのバクテリオ
ファージの発現生成物由来のものであるとは限らず、ペ
プチド合成、組み換えDNA技術またはこれらを組み合わ
せたものなど、他の方法で生成され得る。「対応する
（Corresponding）」とは、指定の配列に相同であるか
または実質的に同等であることを意味する。
【００２７】 B. DNA配列β-アミロイドコアタンパク質あるいはβ-ア
ミロイド関連タンパク質に相当するDNAは、診断におけ
るプローブとして有用である。β-アミロイド関連タン
パク質配列の一部をコードする配列、および隣接する非
コード領域を含むβ-アミロイドコアタンパク質配列を
有する、いくつかのDNAをここに開示する。これらのDNA
配列の全部あるいは部分は、無処置のプローブか、ある
いはフラグメントのいずれかとして、診断に有用であ
る。
【００２８】特に、本発明は、図１に記載のヌクレオチ
ド配列およびそれに相当する推定アミノ酸配列を含有す
る、β-アミロイド関連タンパク質をコードするDNA配列
を包含する。このDNA配列は、β-アミロイドコアタンパ
ク質を含有する、約82,610ダルトンのタンパク質をコー
ドする。
【００２９】図１に記載の、このβ-アミロイドタンパ
ク質cDNA配列は、バクテリオファージλAPCP168i4から
単離し得る。このヒト線維芽細胞cDNAクローンは、SV40
で形質転換された線維芽細胞（SV80）から標準法を用い
てλgt10中に調製された、cDNAライブラリーから得られ
た（Todaro, G.J.ら、Science（1966）153:1252-125
4)。λgt10-SV80ライブラリーは、標識オリゴヌクレオ
チドの混合物でスクリーニングされた。β-アミロイド
関連配列を含有する２つの独特のファージが得られた；
これらのβ-アミロイド関連配列をプラスミドベクター
にサブクローニングし、その配列分析は、168bpの挿入
物が存在すること以外は、Kangらのβ-アミロイド関連
タンパク質をコードする配列と共直線性（co-linear）
であることを示した。168bpの挿入物はKangらの配列のV
al289のコドンを妨害し、その結果λAPCP168i4タンパク
質からこのアミノ酸が欠失する。168bp挿入物は、妨害
されたVal289コドンで増えた3bpとともに、図１に下線
で示される、新しい57個のアミノ酸をコードする。この
挿入物の下流の図１の653位のコドンに、Mastersらによ
って記載されたβ-アミロイドコアタンパク質のアミノ
末端のアスパラギン酸が位置する。λAPCP168i4クロー
ンは、1987年7月1日にATCCに受託番号40347として寄託
された。
【００３０】特に有用なのは、λAPCP168i4中の57個の
アミノ酸をコードする配列、およびKangらのβ-アミロ
イド関連タンパク質配列の「連結部位」の相当部位をコ
ードする配列である。
【００３１】例えば、１つの好ましい実施態様は、上述
で同定されたタンパク質の289位から345位の配列に相当
するアミノ酸配列を有する、β-アミロイド関連タンパ
ク質をコードするDNA配列を包含する。従って、この実
施態様は、アミノ酸配列が；
【００３２】
【化４】
【００３３】であるβ-アミロイド関連タンパク質を包
含する。
【００３４】任意のフラグメントを含むこの特定のペプ
チドは、報告されている他の形態から本明細書文のβ-
アミロイド関連タンパク質を区別する。
【００３５】別の好ましい実施態様において、本発明
は、DNA配列、および図１に記載のβ-アミロイド関連配
列の284-Val289-(▽289-345）-349のアミノ酸配列に相
当する推定アミノ酸配列を有する、β-アミロイド関連
タンパク質を開示する（ここで▽は289位から345位の配
列の欠失を意味する）。この特異的な領域に広がるオリ
ゴヌクレオチドは、Kangらによって記載されているβ-
アミロイド関連タンパク質の遺伝子変異体と、本発明の
β-アミロイド関連タンパク質とを区別する、タンパク
質特異的診断試薬の生成に有用であろう。従って、この
実施態様は、アミノ酸配列が；
【００３６】
【化５】
【００３７】であるβ-アミロイド関連タンパク質を包
含する。このペプチドの配列内に含まれる小さいペプチ
ドもまた、有用であるかもしれない。
【００３８】168bpの挿入物および、kangらが記載した
β-アミロイド関連タンパク質のこの領域の連結部位に
特異的なオリゴヌクレオチドは合成され得、これらの２
つの異なるタンパク質のmRNAの発現レベルの比較に使用
し得る。例としては、オリゴ#2734と命名された、168bp
の挿入物に特異的なオリゴヌクレオチド；
【００３９】
【化６】
【００４０】および、連結部位に特異的なオリゴ#2733
と命名されたオリゴヌクレオチド；
【００４１】
【化７】
【００４２】をApplied Biosystems DNA合成機でのホス
ホアミデート（phosphoramidite）法を用いて合成し
た。
【００４３】「連結部位」オリゴは、挿入物のいずれか
の側の末端の15bpに相補的であり、公表されているβ-
アミロイド関連タンパク質配列とλAPCP168i4配列と
を、15bpの完全な相補は不安定であるが、30bpの完全な
相補は安定である、当業者の知るところの特異的ハイブ
リダイゼーションの条件で、区別するのに使用される。
これらのオリゴヌクレオチドを、cDNAライブラリーのス
クリーニング、あるいは特異的配列の発現レベルを測定
するアッセイとして種々の原料からのmRNAのスクリーニ
ングに使用される。
【００４４】以下に述べる別の例は、アルツハイマー病
の軸索斑における特徴である、β-アミロイドタンパク
質配列の最初の18個のアミノ酸（Metを含めると19個）
をコードするゲノム配列である。クローンは、λCharon
4AにLawn，R.M.ら、Cell (1978) 15:1157-1174に記載の
ゲノムライブラリーから得、図２に示すように、部分的
に配列決定された。示されているように、ゲノムクロー
ンの配列決定された部分は、以前に報告されているβ-
アミロイドコアタンパク質の1-18位のアミノ酸、および
その直前のメチオニンをコードする57bpのセグメントを
含む。18位のアミノ酸のコドンの下流では、ゲノム配列
は、報告されているβ-アミロイドコアタンパク質のア
ミノ酸配列から予想される配列と、コドン配列において
異なっている。図４の配列にコードされるタンパク質を
参照し、当分野で公知の知識を用いてこの領域に隣接す
る配列を調査することによると、この違いはイントロン
配列にあるようである。λSM2と命名されたこのクロー
ンを、1986年11月13日にATCCに寄託した。
【００４５】ゲノムクローン（図２を参照）由来のHind
III/RsaIプローブを、標準法に従って、正常なヒト（心
筋梗塞で死亡した55才の男性）の脳の側頭葉および頭頂
葉皮質から、λgt10中に構築したcDNAライブラリーのcD
NAフラグメントを単離するのに使用した。単離した3つ
のcDNAクローンを一般的方法で配列決定し、β-アミロ
イド関連タンバク質をコードする領域を同定するため
に、3つの可能なリーディングフレームの各々にコード
される各々のアミノ酸配列に相対させた。λSM2W4と命
名された、そのうちの1つのクローンは、図３にあるよ
うに、β-アミロイドコアタンパク質の5'末端のAsp Ala
Glu Pheのアミノ酸をコードする3'末端配列を含有し、
それはこのクローンの完全な塩基配列を示す。Asp1コド
ンの直前にメチオニンコドンがある。λSM2W3と命名さ
れた2番目のクローンは、β-アミロイドコアタンパク質
の3位および4位のアミノ酸をコードする、λSM2W4クロ
ーンの3'末端（EcoRI制限酵素部位）と6bpのオーバーラ
ッブを有する5'領域セグメント、およびβ-アミロイド
関連タンパク質の残りをコードする95個のコドンをさら
に含有する。λSM2W4およびλSM2W3中の100個のアミノ
酸のタンパク質（Metを含む）のDNA配列を図５に示す。
メチオニンは、たぶん、インビボで処理されること、お
よび、従って、この図に示すβ-アミロイド関連タンパ
ク質が、99個のアミノ酸配列であり得ることは、もちろ
ん、理解される。
【００４６】3番目のcDNAクローンは、図５の3-44位の
アミノ酸領域中の15個のヌクレオチドおよび4個のアミ
ノ酸の違いによって示される、λSM2W3と異なるβ-アミ
ロイド関連タンパク質の一部をコードする。λSM2W9と
命名されたこのクローンのDNA配列および推定アミノ酸
配列を図６に示す。λSM2W3との比較を図７に示す。
【００４７】C.タンパク質の生産 本明細書に記載するcDNAクローンは、報告されているβ
-アミロイドコアタンパク質のアミノ末端配列を有する1
00個のアミノ酸のβ-アミロイド関連タンパク質であ
る、完全なβ-アミロイド関連タンパク質、および他の
所望のタンパク質を得るために発現し得るコード配列の
構築を可能にする。これらの配列を、タンパク質の生産
のために適当な発現ベクターに挿入し得る。図１のDNA
配列のサブ配列を構築する方法の詳細、およびこの配列
の細菌発現ベクターへの挿入を実施例2に示す。
【００４８】簡単に説明すると、pAPCP118-3と命名され
た、E.coli発現ベクターを、図１に記載の655位から751
位のアミノ酸配列からなる融合タンパク質の発現のため
に構築した。pAPCP118-3の構築は、以下の3つのフラグ
メントをつなぐことによりなされた：（１）骨格プラス
ミド（pBR322の複製機能部、アンピシリン耐性遺伝子、
トリプトファンプロモーターおよびオペレーター、リボ
ゾーム結合部位、β-ガラクトシダーゼの構造遺伝子の7
個のアミノ末端コドンとそれに続く6個のスレオニン残
基をコードするDNA、および転写終止シグナルからな
る）；（２）図１の配列の655位から728位のアミノ酸配
列をコードする、EcoRI-HaeIIフラグメント；および
（３）図１の配列の729-751位のアミノ酸配列とそれに
続く終止コドンをコードする合成フラグメント。
【００４９】得られたベクターでE. coli W3110を形質
転換し、トリプトファン濃度を下げた後、3-β-インド
ールアクリル酸を加えて融合タンパク質の発現を誘導し
た。得られたタンパク質は、一般的な精製法で精製し
得、得られた精製物質は診断アッセイ用の抗体産生に使
用可能である。
【００５０】図１に記載のβ-アミロイド関連タンパク
質の完全なコード配列の2つのサブフラグメントを、寄
託されたλAPCP168i4クロー一ンから、ワクシニアウイ
ルス発現ベクターである、pSC11に挿入してサブクロー
ニングした。得られたベクター、pFL4T4BVの構築を図１
0に図説する。簡単に説明すると、図１に記載のタンパ
ク質の655-751位のアミノ酸配列に広がる約1.06キロベ
ース（kb）のEcoRIフラグメントを、EcoRIで消化したプ
ラスミト゛pGEM-3TM(Promega Biotecより市販)中にクロ
ーン化して、p4BIと命名された中問体ベクターを作製し
た。次に、β-アミロイド関連配列の3'側非コード配列
の多くを除くためにP4BIをHindIIIで消化した。得られ
たベクター、p4B△RlをEcoRIで消化し、λAPCP168i4由
来の2088bp EcoRIフラグメントにライゲートする前に、
仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼで処置してp4T4B
を作製した。図１に記載の全タンパク質コード配列に広
がる2678bpのフラグメントを作製するために、このプラ
スミドをSmaIおよびXmnIで消化した。 Cochran, M.A.
ら、 Proc Nat1 Acad Sci USA (1985) 82:19-23に記載の
真核細胞中問発現系（eucaryotic transient expressio
n system）を用いる、CV-1サル腎臓細胞でのβ-アミロ
イド関連タンパク質を引き続き発現させるために、この
SmaI-XmnIフラグメントにコードされる遺伝子を、周知
のワクシニアウイルスベクター、pSC11に挿入した。よ
り一般的には、このベクターは、その配列をワクシニア
ウイルスゲノムに挿入した後、インビボでのタンパク質
および抗体産生のために使用される（以下の「抗体作
成」の項を参照のこと）。
【００５１】同様に、哺乳類細胞ベクターを、本明細書
文に記載のβ-アミロイドコアタンパク質あるいはβ-ア
ミロイド関連タンパク質の発現に使用し得る。例えば、
プラスミドphGH-SV(10)（EPA 217,822、1987年4月15日
公開、ここに参考文献として引用する）は、pUC8プラス
ミドの骨格、hMT-IIa遺伝子プロモーターおよび制御配
列、SV-40 DNAプロモーターおよびエンハンサーエレメ
ント、および、hgH遺伝子のコーディング部分および3'
制御配列を有する。このプラスミドは、ヒト成長ホルモ
ンタンパク質のコード配列を除き、3'-非コード配列お
よび制御配列をプラスミドに結合したまま残すために、
BamHIおよびSmaIで消化し、BamHIリンカーで処理され得
る。この約5100塩基対のDNAフラグメントをゲルで精製
し、BamHIリンカーにライゲートする。BamHIによる消
化、DNAフラグメントの再精製、および、それに続くラ
イゲーションの結果、哺乳類細胞発現ベクターを含有
し、構造配列および制御配列を有する、pMTSV40 Po1yA
Bamと命名されたプラスミドを得る。pMTSV40 Po1yA Bam
をBamHIで消化し、DNAポリメラーゼ１および４つの全て
のdNTpで修復した後、このベクターは、プラスミドp4T4
Bの約2678bpのSmaI-XmnI制限フラグメントを挿入するの
に使用し得る。実施例4に記載のように、得られたベク
ターは次に、CHO細胞での効果的なタンパク質発現に使
用し得る。
【００５２】さらに、図３に記載の、λSM2W4クローン
の配列情報は、λSM2W3クローンに存在する配列と併せ
て、図５に記載のタンパク質をコードする哺乳類細胞発
現ベクターを構築するのに使用される。
【００５３】分泌されたプロテアーゼインヒビターは、
例えぱインヒビター活性に対して高いアフィニティーを
有するセリンプロテアーゼが結合したセファロースビー
ズのような、固体に支持されたアフィニティーマトリッ
クスを用いて、細菌培養上清から、生物学的に活性で、
再び折り畳まれた、実質上純粋な形態で回収し得る。こ
の使用のための入手可能な酵素には、例えば、セリンプ
ロテアーゼであるトリプシンおよびキモトリプシンがあ
る。プロテアーゼインヒビターがビーズ上に捕捉される
と、約1.0から約5.0の範囲のpH、好ましくはpH1.25の低
pH環境のような酸性条件を用いて、タンパク質を溶出し
得る。溶出されたタンパク質は実質的に純粋である。す
なわち、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（例え
ぱ、60％アセトニトリル/0.1％トリフルオル酢酸溶出用
勾配を用いるC4カラム）により、少なくとも70％、好ま
しくは80％、より好ましくは90％、最も好ましくは、少
なくとも95％が回収される。
【００５４】D. 抗体の調製 β-アミロイドコアタンパク質およびβ-アミロイド関連
タンパク質に対する抗体は、既知の方法で調製される。
合成ペプチドを用いる例として、好適な免疫原性の領域
を同定するために、極性および/あるいは荷電アミノ酸
残基を有する、少なくとも約10個のアミノ酸の長さの領
域についてタンパク質配列が典型的に分析される。
【００５５】他の例として、図１に示すDNA配列を、λA
PCP168i4中の挿入配列、および、Kangらが記載のβ-ア
ミロイド関連タンパク質とこの挿入物との連結部分に相
当する配列に特異的なオリゴペプチドを設計するのに使
用し得る。例えぱ、G1u-G1u-Va1-Va1-Arg-Va1-Pro-Thr-
Thr-A1aのような挿入された連結部分に広がるオリゴペ
プチドは、Kangらが記載のタンパク質の、この部分に対
して特異的抗血清を生産するために、動物を免疫するの
に使用され得る。λAPCP168i4の配列に関する知識を持
たずにKangらの配列を調査することは、当分野で公知の
いかなる方法によっても、有用な試薬としてこのペプチ
ドを同定するのに必要な情報を提供しないであろう。他
の例として、168bpの挿入部分に存在する配列を表すた
めに設計きれたオリゴペプチドは、同様の方法で、APCP
168i4のタンパク質のこの独特な部分に対する抗血清を
生産するのに使用され得る。従って、免疫原性において
好適であると同定された部分を、一般的ペプチド合成法
によって合成し、キーホールリンピットヘモシアニンの
ような、適当な担体タンパク質に共有結合する。抗体
は、ウサギなどにおいて、一般的な方法でペプチド/タ
ンパク質複合体に対して産生される。免疫した動物での
抗体の存在は、マイクロタイタープレートにコートして
ELISAに使用する、免疫用合成ペプチドに対する免疫反
応性のような、標準的な方法によって検出する。
【００５６】抗体生産の他の方法は、実施例2の、細菌
によって生産されたβ-アミロイド関連融合タンパク質
を免疫原として使用する。このタンパク質の免疫原性
は、細菌によって生産された融合タンパク質に対する抗
血清の免疫反応性によって示される。
【００５７】さらに他の抗体産生法は、宿主動物への、
β-アミロイド関連タンパク質をコードする生の組み換
えワクシニアウイルスの接種による。そのような組み換
えウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと、本明細書
文に記載のpFL4T4BVのようなpSC11由来のベクターと
の、組み換えを含む確立された方法によって作製され
る。次に、これらの抗体は以下に述べる診断用アッセイ
に使用され得る。
【００５８】Ａ４ｉペプチドのような、β-アミロイド
関連タンパク質の異なる領域に由来するペプチドに対し
て特異的な抗体のパネルを、以下に述べるように、アル
ツハイマー病の診断アッセイに適当な抗体を同定するた
めに、アルツハイマー病患者の血清あるいは脳脊髄液中
に存在するβ-アミロイド関連タンパク質の免疫反応性
に関して、さらに分析する。
【００５９】E. 診断法および予後診断法 図３、4、および６に記載のβ-アミロイド関連タンパク
質のDNA配列は、死亡時にアルツハイマー病の兆候を示
していなかった、明かに正常な高齢の男性におもに由来
する。図１に記載のλAPCP168i4中の別のβ-アミロイド
関連タンパク質の配列は培養線維芽細胞に由来する。こ
れらの配列は、アルツハイマー病患者に見い出され、従
ってこの疾患の素質に関連するらしい、ゲノム配列中の
変異を同定するための基準を提供する。
【００６０】1. 予後診断法：アッセイは、被験体のア
ルツハイマー病の遺伝的素質を決定するのに使用され
る。これらのテストは、β-アミロイド遺伝子を有する
染色体の領域中の多型性を決定するための、患者のDNA
との比較研究に本発明のDNA配列を使用する。一方で、
あるいは同時に、本発明のDNA配列は、変化を決定する
ための核酸ハイブリダイゼーション分析に使用され得
る。この変化はβ-アミロイド関連タンパク質をコード
するDNAあるいはRNAの付加、欠失、変異、あるいは置換
を含むことを意味する。
【００６１】アルツハイマー病に相関するβ-アミロイ
ド関連タンパク質配列中の変化は、区別的プローブ結合
法によってアッセイし得る。当分野に公知の適当なハイ
ブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドプロ
ーブは相補する配列に結合するが、密接に関連している
が変化している配列には結合しない。
【００６２】１つのアッセイ法では、被験体から調製さ
れた核酸試料を、所定のハイブリダイゼーション条件で
各プローブとハイブリダイズさせ、特異的オリゴヌクレ
オチドヘの結合を試験した。変化、すなわちアルツハイ
マー病の素質を、１つのプローブには結合するが、他の
プローブには結合しないことによって確認する。プロー
ブ結合法は他の遺伝病に適用されているように、Conne
r, B.J.ら、 Proc NatlAcad Sci USA（1983）80:278-28
2。
【００６３】さらに、上述のゲノム配列あるいはcDNA配
列は、アルツハイマー病の遺伝的素質に関連する制限酵
素フラグメントの長さの多型性を同定するのに使用し得
る。先ず、正常および患者のゲノムの消化試料の両方か
らの制限酵素フラグメントの長さを同定するために、プ
ローブを使用する。次に、アルツハイマー病に相関する
制限酵素フラグメントの長さの変化を標準法による、遺
伝的スクリーニングに適用する。それでは、被験体のゲ
ノム材料を目的の（１つ、あるいは複数の）制限酵素で
消化し、サザンブロットでフラグメントのパターンを標
識プローブで決定する。
【００６４】２. 診断法: 種々の他の臨床的アミロイド
ーシスでは、アミロイドを生成するペプチドは、正常に
発現される遺伝子産物の変種である。これらのペプチド
は異常なタンパク質分解過程か、あるいは1次アミノ酸
配列の変化を生む遺伝的障害のいずれかによって変化し
た。家族性アミロイド多発性神経障害（FAP）のよう
な、正常な前駆体およびアミロイド生成性変種が循環系
に共存する、既知のアミロイドーシスがある。異常な遺
伝子産物の発現の異常な組織分布、あるいは、その発現
レベル、その配列、あるいはアルツハイマー病における
そのプロセシングでの、その他のある種の変化は、アミ
ロイド蓄積の病因に関して有意性を有するであろう。
【００６５】本発明の材料を使用する第一の診断テスト
は、正常な人と比較して、アルツハイマー病患者のβ-
アミロイドコアタンパク質あるいはβ-アミロイド関連
タンパク質が増加あるいは減少しているかを知るための
直接的抗体アッセイである。この方法では、上述のよう
にして得られた抗体を、アルツハイマー病であるとわか
っている人のタンパク質に対する特異的免疫反応性につ
いて、スクリーニングする。免疫反応性血清タンパク質
の存在は、固定相ELISA法のような標準的イムノアッセ
イ法により、決定される。β-アミロイドコアタンパク
質あるいはβ-アミロイド関連タンパク質の存在を知る
ためにアッセイされる体試料は、例えぱ、血清あるいは
脳脊髄液である。例えば、アミロイドがgamma-trace前
駆体から生成される疾患であるアミロイドーシスを伴う
遺伝性脳出血では、前駆体はイムノアッセイを用いて、
脳脊髄液中に検出し得る。この疾患を有する患者の前駆
体のレベルは低下しており、このことは、蓄積物形成の
間に使い果たされるという結論を導く。前駆体は、脳で
つくられ、従って脳脊髄液は適当な試料である。
【００６６】別の診断テストでは、β-アミロイド関連
タンパク質をコードするDNAは、適当なmRNAにハイブリ
ダイズし得るという長所によって、適当な標的細胞中
で、。β-アミロイド関連タンパク質をコードするmRNA
の合成の増加あるいは減少を検出するためのプローブと
して、まさに有用である。この方法の使用を示す例を、
以下の実施例5に示す。
【００６７】3番目の診断アッセイは、精製された組み
換えアミロイドタンパク質あるいは合成ヘプチドが固体
支持体に結合しているような標準的ELISA法を用いて、
アミロイドタンパク質に対する患者の血清中の抗体の検
出を可能にする。
【００６８】F. 治療法 本発明はさらに、アルツハイマー病の改善された治療的
処置を提供する。１つの治療的処置が、λAPCP168i4中
の168bp挿入物にコードされるＡ４ｉタンパク質の配列
によって提案される。
【００６９】1つのタンパク質の関連性の割合を他のも
のと比較して、Ａ４ｉタンパク質のアミノ酸配列が、ク
ニッツ型（Kunitz-type）塩基性プロテアーゼインヒビ
ターとして知られるタンパク質ファミリーに相同である
ことが、見い出された。３つのクニッツファミリーのタ
ンパク質に対する、挿入タンパク質セグメントの関連性
のレベルを図１3に示す。図１3で、（:）記号は比較さ
れる２つの配列の同一性を示し、（.）記号は、類似の
化学的性質を有するアミノ酸による置換を示す。
【００７０】比較によって、１文字のアミノ酸コードで
EVCS ... GSAIとして表される挿入物配列は、すべての
メンバーのクニッツファミリー（３つのみを例として示
す）に対して、その全長にわたって高度に関連性がある
ことが示された。図１３−１および１３−２に示される
３つの比較は、（１）トリプシン、プラスミン、および
穎粒球リソソームエラスターゼを阻害する分泌血漿タン
パク質である、ヒトトリプシンインヒビター（Wachter,
E. およびHochstrasser, K. Hoppe-Seyler'sZ Physio1
Chem(1981）362:1351-1355; Morii, M. およびTrav1s,
J. Bio1 ChemHoppe-Sey1er (1985) 366:19-21);（２）
トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびプ
ラスミンを阻害するウシトリプシンインヒビター（Hoch
strasser, K. および Wachter,E., Hoppe-Seyler's Z P
hysio1 Chem (1983) 364:1679-1687; Hochstrasser, K.
ら、 Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983) 364:1689-
1696)；および（３）トリプシン、カリクレイン、キモ
トリプシン、およびプラスミンを阻害するウシ血清塩基
性プロテアーゼインヒビター（およびその前駆体）（An
derson, S. およびKingston, I.B., Proc Nat Acad Sci
(USA) (1983) 80:6838-6842）。Ａ４ｉタンパク質配列
とのこの関連性の程度に基づく１つの解釈では、λAPCP
168i4タンパク質のこの領域は、インビボでプロテアー
ゼインヒビターとしての機能を有する。
【００７１】アルツハイマー病は、アミロイド斑の形成
に関連している。さらにアミロイドは、β-アミロイド
前駆体タンパク質のタンパク質分解の結果形成される。
Ａ４ｉタンパク質は、β-アミロイド前駆体の開裂を防
ぎ、従ってβ-アミロイドタンパク質の形成を防ぐと信
じられている。形成されるβ-アミロイドの量を減らす
ことで、斑形成を減らし得る。
【００７２】本発明は、上記の解釈にとらわれない。異
なる作用機序を介して、同じ結果（斑形成を減少させ
る）を与え得る、インヒビターの別の作用機序が提案さ
れ得る。Ａ４ｉタンパク質は、プロテアーゼインヒビタ
ーとして作用し得、そして、斑を分解するプロテアーゼ
を阻害する。インヒビターに対して特異的で、インヒビ
ターのプロテアーゼに対する作用をブロックし得る、ペ
プチドあるいは特異的抗体（モノクローナルあるいはポ
リクローナル）のような拮抗物質の投与は、斑が分解さ
れるのを促進し、そして治療的に有用である。
【００７３】Ａ４ｉインヒビター、またはペプチドある
いはペプチドでない、他のインヒビターは、軸索斑形成
を予防するか、あるいは形成された斑が容易に分解され
るのを促進させるような機序によりアルツハイマー病の
処置あるいは予防に使用し得る。投与の１つの方法は、
粘膜経由輸送のために提供され得るペプチドの経鼻輸送
を含み得、従って、胃腸管を避けるため、そこにはいる
ペプチドの崩壊が避けられる。経鼻輸送系は、約0.1-10
％(w/w)の濃度の範囲のフシジン酸誘導体あるいはポリ
オキシエチレンエーテルのような１つあるいはそれ以上
の賦形剤、および有効量のアジュバントとともにプロテ
アーゼインヒビターペプチドを含む溶液を処方すること
により、作成され得る。Ａ４ｉの効果は、インヒビター
を脳に局部的に輸送する能力に依存するかあるいは影響
され得る。脳への輸送が必要な場合、血液−脳関門に関
して特別の配慮がなされなければならない。大脳の血管
での物質の交換は、毛細血管床での交換とは異なるから
である。Ａ４ｉを、血管−脳関門を通過する物質の輸送
を高めることが知られている輸送用媒体に付着させるこ
とは、有用で有り得る。安定剤、保存剤および通常経鼻
輸送系中に存在する他の成分を随意添加し得る。ペプチ
ドの量は、その効力および生体内利用能によって変化し
得るが、約0.1-25％(w/w)の範囲であり得る。
【００７４】経鼻システムは、10-100μ１の溶液を、各
々の側の鼻孔内に１日に1-4回噴霧することにより投与
され得る。しかし、投与はそれより多くても少なくても
よく、特定の患者の必要性に応じて使用中に調整され得
る。他の輸送法には、薬学的に受容し得る賦形剤中のイ
ンヒビター溶液が含まれ、ここで、インヒビターは0.1-
25％(w/w)であり、脳髄膜液に、あるいは直接に脳に注
入することによって投与される。中枢神経系へのより局
所的な投与が好ましいと考えられている。しかし、もし
斑が全身的に蓄積する場合、インヒビターは、静脈注入
によって投与され得る。さらに、もしインヒビターがペ
プチドでない場合、経口投与が可能であり得る。
【００７５】Ａ４ｉタンパク質およびそのアナログは、
これらの特異性プロフィールに示されているように、ア
ルツハイマー病の処置以外にも利用能がある。例えば、
本発明のＡ４ｉは、プラスミンおよびトリプターゼを強
カに阻害すること、および膵臓のトリプシン、α−キモ
トリプシン、組織カリクレインおよび血清カリクレイン
をもまた阻害することが見いだされた。このインヒビタ
ーは、カイメース、膵臓エラスターゼ、α−トロンビ
ン、ウロキナーゼ、パパイン、あるいはカテプシンＢは
阻害しなかった。急性膵臓炎では、トリプシン、キモト
リプシン、およびエラスターゼのような消化プロテアー
ゼの膵臓からの全身性放出がある。１つ、あるいはそれ
以上のプロテアーゼインヒビターとともにＡ４ｉを全身
的に投与して、これらのプロテアーゼを不活性すること
は、膵臓炎を臨床的に処置するのに有用である。
【００７６】本発明のA4iインヒビターと約50％のアミ
ノ酸相同性を有する、ウシ由来のプロテアーゼインヒビ
ター、アプロチニンが、動物モデルで臨床的有用性を有
することが見い出されている（H. FrizおよびG. Wunder
er, Drug Res 33(I), No.4(1983) pp.479-494）。商標
名Trasylo1で市販されているウシのインヒビターは、急
性膵臓炎に関連する用途のためにヨーロッパに市場があ
る。Ａ４ｉがウシインヒビターに優る一つの利点は、Ａ
４ｉは、循環系中ではその大きい前駆体として低レベル
で天然に存在することである。従って、Ａ４ｉは、アプ
ロチニンやヒト以外に由来するその他のインヒビターで
は起きるかもしれないアレルギーや免疫反応は起こさな
い。
【００７７】Ａ４ｉの、プラズマプロテアーゼプラスミ
ンおよびトリプターゼに対する、十分な親和性によっ
て、特異的な凝固因子のインビボでの調節が可能にな
る。プラスミンは、フィブリンクロットを溶解する（す
なわち、繊維素溶解）のに重要であり、一方、トリプタ
ーゼは、クロットの形成に関係している。Ａ４ｉの有効
量の投与によって、クロット形成およびクロット溶解を
調節することができる。
【００７８】創傷治癒に用いられるフィブリン接着剤
は、Ａ４ｉと置き換わり得るアプロチニンを含む。従っ
て、Ａ４ｉポリペプチドは、創傷治癒が必要な組織の修
復の補強に用いられ得る。Ａ４ｉのプラスミンに対する
強力な親和性によって、プラスミンの繊維素溶解活性が
妨害されると考えられる。この活性は、Ａ４ｉが接着フ
ィブリン（フィブリン接着剤）に用いられるときに、フ
ィブリンで組織を結合させるため、そして出血箇所を塞
ぐために特に効果的であり、手術の裂傷などからの組織
の修復の前にそれが溶解するのを防ぐ。
【００７９】Ａ４ｉポリペプチドのトリプターゼに対す
る強力な親和性によって、インヒビターが、インビボに
おけるプロトロンビン活性化を阻害し、抗凝結処置に直
接有用になる。Ａ４ｉの解離定数は、Ｋｉ＝２．２×１
０-10である。これは、マスト細胞のトリプターゼのア
ミダーゼ活性を効果的に阻害することが示されている、
マスト細胞トリプスタチン（ｔｒｙｐｓｔａｔｉｎ）が
トリプターゼ（ｔｒｙｐｔａｓｅ）に対して示す解離定
数として報告されているものと類似である（Kidoら、J
Biol Chem 263:18104-18107 (1988)）。従って、Ａ４ｉ
は、外部から投与される血栓啓解剤として用いられ得
る。
【００８０】一般的に、インヒビター組成物は、非接着
性手術用包帯にこの組成物を浸込ませることによって、
あるいは代わりに、この組成物を徐放性のマトリックス
中に取り込ませ、それを創傷部位にあてがうことによっ
て、創傷部位に適用される。薬学的組成物は、この精製
されたインヒビターから従来法で作られ得る。その際、
塩化ナトリウム、グルコース、マンニトール、アルブミ
ン、などの様な添加物を使用する場合としない場合があ
る。この組成物は、静脈内あるいは動脈内への注射ある
いは注入を含む非経口投与に最適である。
【００８１】得られた組成物は、適する用量で患者に投
与され得、そして急性および慢性の、異なる脈管床の血
栓塞栓閉塞症を防ぐために予防的に用いられ得る。この
ような閉塞症は、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓症、心筋
梗塞、脳卒中、動脈塞栓症、体外循環、および動静脈バ
イパス形成などの場合に起こる。この目的のために、Ａ
４ｉがトリプターゼに特異的に作用すること、そしてプ
ラスミンのインヒビターとしては十分でないことを保証
することが必要である。
【００８２】癌組織からの癌細胞の遊離におけるプラス
ミンの関与が観察されている。プラスミン及び他のプロ
テアーゼのＡ４ｉによる阻害は、腫瘍の成長を十分に減
少させるかあるいは防ぐ。
【００８３】正常組織にも見いだされるプロテアーゼが
過剰に作られ、そして組織の炎症および損傷に関与し得
る。プロテアーゼ放出の阻害によって、組織の損傷およ
び炎症が減少され得る。プロテアーゼの放出を引き起こ
すアレルギー反応もまたブロテアーゼ阻害の処置で影響
を受ける。
【００８４】本発明のＡ４ｉタンパク質のインヒビター
のさらに他の形態が本文に提供される。これらの他の形
態は、Ａ４ｉのアナログであって、57個のアミノ酸プロ
テアーゼインヒビターである。これらのアナログは、変
化したプロテアーゼ特異性を有するインヒビターを産生
するのに効果的な、少なくとも１つのアミノ酸の置換を
有する。P1と呼ばれる残基がプロテアーゼインヒビター
の特異性を決定するのに主要な役割を果たすことが知ら
れている。本発明の成熟分泌インヒビターでは、このP1
残基は、トリプシン様活性を有する酵素にこのインヒビ
ターを指し向けるArg13である。
【００８５】そのP1残基の修飾がインヒビターのプロテ
アーゼ活性を変化させることが示されているアプロチニ
ン（Gebhard, W.ら、in Proteinase Inhibitors、Barre
ttおよびSalvesin編、Amsterdam, N.Y., Osford: Elsev
ier 1986）からの類推で、本発明のインヒビターの部位
特異的変異誘発による改変は同様の結果を生む。キモト
リプシン活性を有する酵素の阻害促進のためには、本発
明のインヒビターのArg13を、Phe、Tyr、およびTrpのよ
うな芳香族アミノ酸で置換する；一方ヒトエラヌターゼ
活性を有する酵素を阻害する能力が促進されているイン
ヒビターを作製するためには、Arg13残基を、Leu、Met
およびVa1のような中性の疎水性アミノ酸で置換する。
【００８６】本発明のプロテアーゼインヒビターのアナ
ログを、当分野で公知のように部位特異的変異誘発法を
用いて、所望のアミノ酸をこの位置にコードする特異的
コドンを有する、オリゴヌクレオチドから構築する。そ
のようにして構築されたアナログの所望の活性を、トリ
プシン、キモトリプシンあるいはエラスターゼのような
適当な酵素を、Tan, N.H., Biochem (1977) 16:1531-15
41に記載のトリプシンあるいはキモトリプシンアッセ
イ、およびBarrett, A.J. (1981) in Methods inEnzymo
1ogy vo1.80, L. Lorand編、 Academic Press, New York
に記載のエラスターゼアッセイのような、個々のアッセ
イの１つにおける基準として用いて、アッセイする。ア
ナログの活性は、本発明の天然プロテアーゼインヒビタ
ーのそれと比較し得る。トリプシン（Ki=3x1O-9M）およ
びキモトリプシン（8.5x10-9Ｍ）に対する天然プロテア
ーゼインヒビターの阻害速度論（Ki）は、ナノモルの範
囲にあり、従って、かなり特異的である。
【００８７】G. 方法および材料 細胞の形質転換、ベクターの構築、メッセンジャーRNA
の抽出、cDNAライブラリーの調製などに使用される技術
のほとんどは、当分野で広く行われており、ほとんどの
技術者は、特定の条件および手順が記載されている標準
的原材料に精通している。しかし、便利なように、以下
の文節をガイドラインとする。
【００８８】宿主および制御配列 原核細胞系および真核細胞系の両方を、β-アミロイド
コアおよびβ-アミロイド関連配列の発現に使用し得
る；もちろん、クローニングの手順には原核細胞宿主が
最も便利である。最もよく使用される原核細胞は、E. C
o1iの種々の株に代表される；しかし、他の微生物株も
使用され得る。E. Co1i株は、これらのタンパク質をコ
ードする遺伝子を適当なシグナルペプチドと融合させる
と、β-アミロイドコアおよびβ-アミロイド関連タンパ
ク質ペリブラズマ（periplasm）に分泌し得、JE5505の
ようなリポタンパク質変異株（Kanamari, T. Gene (198
8) 66:295-300）のなどのある種のE. Co1i株は、キメ
ラタンパク質を直接培養液中に分泌する。
【００８９】宿主に適合する種に由来する、複製部位、
選択可能なマーカーおよび制御配列を有するプラスミド
ベクターが使用される；例えばE. Co1iは、Bolivarら、
Gene(1977) 2:95によるE. Co1i由来のプラスミド、pbR3
22の誘導体を用いて典型的に形質転換される。pBR322は
アンピシリンおよびテトラサクリン耐性遺伝子を有し、
従って、所望のベクターの構築で保持されるか、あるい
は破壊される、複数の選択可能なマーカーを提供する。
ここで、随意にオペレーターを有する転写開始プロモー
ターを、リボゾーム結合部位配列とともに含むと定義さ
れている、一般的に使用される原核細胞性制御配列に
は、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト
ース（1ac）プロモーター系（Changら、Nature（1977）
198:1056）、およびトリプトファン（trp）プロモータ
ー系（Goeddelら、Nucleic AcidsRes（1980）8:405
7）、およびラムダ由来PLプロモーターおよびN-遺伝子
リポゾーム結合部位（Shimatakeら、 Nature（1981）29
2:128）のような一般的に使用されるプロモーターが含
まれる。
【００９０】他の原核細胞性制御配列には、ペリプラズ
マヘのタンパク質の分泌を導くシグナル配列が含まれ
る。一般に使用される紬菌シグナルペプチドには、本発
明のプロテアーゼインヒビター配列に融合し得るompA
(Kikuchiら、 Nuc1eic Acids Res(1981) 9:5671-5678)
およびphoA (BeckおよびBremer, Nuc1eic Acids Res (1
980) 8:3011-3024) シグナルペプチドが含まれる。
【００９１】細菌に加えて、酵母のような真核細胞性微
生物もまた、宿主として使用し得る。多くの他の株ある
いは種が一般に入手可能であるが、Saccharomyces cerv
isiaeの実験株、パン酵母が最も使用される。例えば、B
roach, J.R., Meth Enz (1983) 101:307の2μ複製開始
点、あるいは他の酵母に適合する複製開始点（例えばSt
inchcombら、Nature（1979）282:39, Tschumper, G.
ら、Gene（1980）10:157およびC1arke, L. ら、Meth En
z (1983) 101:300）を使用するベクターが使用され得
る。酵母ベクターの制御配列には、解糖酵素合成のプロ
モーター（Hessら、J Adv Enzyme Reg (1968) 7:149; Ho
11andら、 Biochemistry (1978) 17:4900)が含まれる。
さらに、当分野で公知のブロモーターには、3-ホスホグ
リセレートキナーゼ（Hitzemanら、J Biol Chem（198
0）255:2073）が含まれる。成長条件および/あるいは遺
伝的背景に制御される転写の利点をさらに有する他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチ
トクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する
分解性酵素、α因子系、および、マルトースおよびガラ
クトース使用に責任のある酵素のプロモーター領域であ
る。さらに、終止配列がコード配列の3'末端にあること
が望ましいと考えられる。そのような終止配列は、酵母
由来の遺伝子のコード配列に続く3'非翻訳領域に見い出
される。
【００９２】もちろん、ポリペプチドをコードする遺伝
子を、多細胞性生物由来の培養真核宿主細胞中で発現す
ることもまた可能である。例えばAxelら、アメリカ合衆
国特許No. 4,399,216を参照のこと。これらの系は、イ
ントロンを切除し得る長所をさらに有し、従って、ゲノ
ムフラグメントを発現するのに直接使用し得る。有用な
宿主細胞株には、VEROおよびHeLa細胞、およびチャイニ
ーズハムスター卵巣（CHO）細胞が含まれる。そのよう
な細胞の発現ベクターには通常、哺乳類細胞に適合する
プロモーターおよび制御配列、例えぱ一般的に使用され
るSimian Virus40 (SV 40) (Fiersら、 Nature (1978) 2
73:113）の早期および後期プロモーター、あるいは、ポ
リオーマ、アデノウイルス2、ウシパピローマウイルス
あるいはトリサルコーマウイルス由来のプロモーターの
ような、他のウイルスプロモーターが含まれる。制御可
能なプロモーター、hMTII（Karin, M.ら、Nature（198
2）299:797-802) も使用され得る。哺乳類細胞宿主系形
質転換の総説がAxelによって記載されている（上述）。
さらに「エンハンサー」頷域も、発現を最適にするのに
重要であると現在では考えられる。これらは概して、非
コードDNA領域中のプロモーター領域の上流あるいは下
流に見い出される配列である。複製開始点は、必要なら
ば、ウイルス性原料から得られ得る。しかし、染色体へ
の取り込みが真核細胞でのDNA複製の一般的機序であ
る。
【００９３】形質転換 用いる宿主によって、形質転換はその細胞に適した標準
技術を用いて行われる。Cohen, S.N., Proc Nat1 Acad
Sci (USA) (1972) 69:2110に記載されているような、塩
化カルシウムを用いてのカルシウム処理、あるいは、Ma
niatisら、Mo1ecu1ar C1oning: A Laboratory Manual
(1982) Co1d Spring Harbor Press，p.254および Hanah
an, D., J Mol Biol (1983) 166:557-580 に記載されて
いるＲｂＣ１2法が、実質的に細胞壁を有する原核生物
あるいは他の紬胞に対して用いられる。このような細胞
壁のない哺乳類細胞には、必要に応じてWigler, M.
ら、Cell (1979) 16:777-785により改変された、Graham
および van der Eb, Virology(1978) 52:546, のリン
酸カルシウム沈降法が、用いられ得る。酵母の形質転換
は、Beggs, J.D., Nature (1978) 275:104-109 あるい
は Hinnen, A. ら、Proc Nat1 Acad Sci (USA) (1978)
75:1929の方法に従って行われ得る。
【００９４】ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を有する適切なベクタ
ーの構築には、当分野でよく知られている標準のライゲ
ーション法および制限酵素法を用いる。単離されたプラ
スミド、DNA配列、あるいは合成されたオリゴヌクレオ
チドは、所望の形態に切断され、適合され、そして再び
ライゲートされる。
【００９５】ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの
起源から得られる。骨格となるベクターおよび制御系
は、一般には、多くの配列の構築に用いられる、入手可
能な「宿主」ベクターに入っている。適切なコード配列
のために、最初の構築は、通常はそうであるが、ｃＤＮ
ＡライブラリーあるいはゲノムＤＮＡライブラリーから
適切な配列を回収することである。しかし、一旦配列が
判ると、別々のヌクレオチド誘導体から出発して、全遺
伝子配列をインビトロで合成することが可能である。大
きさのわかる長さ、例えば、５００−１０００ ｂｐの
遺伝子の、遺伝子全体の配列は、別々の重複する、相補
的なオリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレ
オチドトリホスフェートの存在下で、ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて１本鎖の重複しない部分につけることによっ
て、調製され得る。このアプローチは、配列の判ってい
る数種の遺伝子の構築にうまく用いられてきた。例え
ば、Edge, M.D., Nature (1981) 292:756; Nambair, K.
P.ら、 Science (1984)223:1299; Jay, Ernest, J Biol
Chem (1984) 259:6311を参照。
【００９６】合成オリゴヌクレオチドは、Edgeら、 Natu
re（前記）および Duckworthら、 Nuc1elc Acids Res(19
81) 9:1691に記載のホスホトリエステル法によって、あ
るいはBeaucage, S.L., およびCaruthers M.H., Tet Le
tts (1981) 22:1859および、Matteucci,M.D.およびCarut
hers, M.H., J Am Chem Soc (1981)103:3185に記載のホ
スホアミデート（phosphoramidite)法によって調製さ
れ、そして商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド
合成機を用いて調製され得る。アニーリングの前の１本
鎖のキナーゼ処理あるいは標識のためのキナーゼ処理
は、５０ｍＭ Tris，ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ
１2、５ｍＭ ジチオトレイトール、１−２ｍＭＡＴＰ、
１．７ｐｍｏ１ｅ、γ３２Ｐ−ＡＴＰ（２．９ｍＣｉ／
ｍｍｏ１ｅ）、０．１ ｍＭ スペルミジン、０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡの存在中で、過剰のキナーゼ、例えば、基
質１ｎｍｏ１ｅに対して約１０単位のポリヌクレオチド
キナーゼを用いて、達成される。
【００９７】所望のベクターの成分がこのように入手さ
れると、標準の制限酵素法およびライゲート法を用い
て、切断されたりライゲートされ得る。
【００９８】部位特異的ＤＮＡ切断は、適切な制限酵素
（あるいは複数の酵素）を用いて、当分野で一般的に理
解されている条件、および、商業的に入手可能な制限酵
素の生産者が明かにした説明の下に、処理することによ
って行われる。例えば、NewEng1and Bio1abs, Product
Cata1ogを参照。一般には、約１μｇのプラスミドある
いはＤＮＡ配列が、約２０μ１の緩衝液中１単位の酵素
によって切断される。本明細書の実施例では、典型的に
は、基質ＤＮＡの完全な消化を確実にするために、過剰
の制限酵素が用いられる。変法も用い得るが、約３７℃
で約１時間から２時問のインキュベーションが実用的で
ある。各々のインキュベーションの後、フェノール／ク
ロロホルムによる抽出でタンパク質を除去し、次いでエ
ーテルにより抽出し得、そしてエタノールで沈降されて
水性画分から核酸を回収した。もし所望であれば、標準
法を用いてポリアクリルアミドゲル、あるいはアガロー
スゲルの電気泳動により、切断した断片をサイズ分離し
得る。サイズ分離の一般的な記述は、Methods in Enzym
o1ogy（1980)65:499-560にある。
【００９９】制限酵素切断された断片は、E. Co1i DNA
ポリメラーゼIの大きな断片（クレノウ）で、４つのデ
オキシヌクレオチドトリフォスフェート（dNTPs）の存
在の下に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、５０ｍＭ
ＮａＣ１、６ｍＭ ＭｇＣ１2、６ｍＭ ＤＤＴ、および
０．１−１．０ｍＭ ｄＮＴＰ中で、２０から２５℃
で、約１５から２５分のインキュベーション時問におい
て、処理することによって平滑末端化され得る。クレノ
ウ断片は、５’側の１本鎖の突出部分を満たすが、たと
え４つのｄＮＴＰが存在しても、３’側の突き出でてい
る１本鎖部分は消化する。必要に応じて、突出の性質に
よる制限内で、ｄＮＴＰの１つのみ、あるいは選択され
たものを供給して選択的な補修がなされ得る。クレノウ
での処理後、混合物は、フェノール／クロロホルムで抽
出され、そしてエタノール沈澱される。Ｓ１ヌクレアー
ゼあるいはＢＡＬ−３１での、適当な条件下の処理は、
１本鎖の任意の部分の加水分解を生じる。
【０１００】ライゲーションは、下記の標準条件下およ
び温度で１５−５０μ１容量で行われる。例えば、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ ｐＨ ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣ
１2、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍ１ ＢＳＡ、１０
ｍＭ−５０ｍＭ ＮａＣ１、および４０μＭ ＡＴＰ、
０．０１／０．０２（Weiss）単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ、０℃（「突出末端」ライゲーション用）、あるい
は、１ｍＭ ＡＴＰ、０．３−０．６（Weiss）単位のＴ
４ ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」ライゲーシ
ョン用）のいずれか。分子間の「突出末端」ライゲーシ
ョンは、通常３３−１００μｇ／ｍ１のＤＮＡ総濃度
（５−１００ｎＭ最終総濃度）で行われる。分子間の平
滑末端ライゲーションは、１μＭ最終総濃度で行われ
る。
【０１０１】「ベクター断片」を用いるベクターの構築
では、ベクター断片は、普通、５’のリン酸基を除去し
て、ベクターの自己ライゲーションを防ぐために、細菌
のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）あるいはウシ腸の
アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理される。消化
は、ｐＨ８において、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，
１ｍＭ ＥＤＴＡで、ベクターのμｇ当り、約１単位の
ＢＡＰあるいはＣＩＰを用いて、６０℃で約１時問行わ
れる。核酸断片を回収するために、調製物は、フェノー
ル／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱される。
あるいは、再ライゲーションは、ベクターにおいて、き
らに別の制限酵素によるダブル消化および不必要な断片
の分離によって防ぎ得る。
【０１０２】配列の修飾を必要とするｃＤＮＡあるいは
ゲノムＤＮＡ由来のベクターの一部に、部位特異的プラ
イマーによる変位誘発が用いられ得る（Zol1er, M.J.
およびSmith, M. Nuc1eic Acid Res (1982) 10:6487-65
00 および Adelman, J.P.ら、DNA (1983) 2:183-193)。
このことは、変異きせる１本鎖のファージＤＮＡに所望
の変異を表す限られたミスマッチング以外は、相補的な
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてなされる。
要するに、その合成オリゴヌクレオチドはァージに相補
的な１本鎖の合成をなすためのプライマーとして用いら
れ、そして得られた部分的なあるいは完全な２本鎖のＤ
ＮＡはファージを維持する宿主紬菌中に形質転換され
る。形質転換された細菌の培養物は、ファージを有する
単細胞からプラークを形成するように、寒天の表面に植
えられる。
【０１０３】理論的には、新しいプラークの５０％は、
１本鎖で、変異体を有するファージを含育する。５０％
は、元来の配列を有する。得られたプラークは、キナー
ゼ処理された合成プライマーとのハイブリダイゼーショ
ン後に、正確にマッチした結合をなすが、元来の鎖との
ミスマッチは十分にふせぎ得る洗浄温度で洗浄される。
次に、プローブとハイブリダイズしたプラークは、取り
出されて、培養され、そしてＤＮＡが回収される。
【０１０４】構築物の確認 下記に示される構築において、プラスミドの構築に適切
なライゲーションは、Dr. M. Casadaban (Casadaban,
M.ら、 J Mo1 Biol (1980) 138:179-207)から得たE. Co1
i株 MC1061あるいは他の適切な宿主のライゲーション混
合物での、まず最初の形質転換により確認される。有用
な形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンある
いは他の抗生物質耐性によって選択されるか、あるいは
当分野では理解されているような、プラスミドの構築の
様式によって他のマーカーを使用して選択される。次
に、形質転換体からのプラスミドは、必要に応じて、ク
ロラムフェニコール増幅（Clewell, D.B., J Bacteriol
(1972) 110:667) 後に、Clewell, D.B.ら、Proc Nat1
Acad Sci(USA) (1969) 62:1159の方法に従って調製され
る。数個の小さなＤＮＡ調製物が、通常用いられる。例
えぱ、Ho1mes, D.S.ら、 Ana1 Biochem (1981) 114:193-
197 および Birnboim, H.C.ら、 Nuc1eic Acid Res (197
9) 7:1513-1523。 単離されたＤＮＡは、 Sanger, F. ら、
Proc Nat1 Acad Sci (USA)(1977) 74:5463、 さらに Me
ssingら、 Nucleic Acids Res（1981） 9：309に記載のジ
オキシヌクレオチド方法によって、あるいは Maxamら、
Methods in Enzymology（1980）65:499に記載の方法に
よって、制限酵素分析および／または配列分析がなされ
る。
【０１０５】本発明は、下記の実施例によってさらに説
明される。本発明の実施態様の説明のみを提供するもの
であって、本発明の範囲を制限するようには説明されて
いない。
【０１０６】
【実施例】実施例１ β-アミロイドコアタンパク質およびβ-アミロイド関連
タンパク質をコードするゲノムクローンおよびｃＤＮＡ
クローンの単離 Charon 4A λ-ファージ中のヒトゲノムライブラリー
を、２８個のアミノ酸配列のＮ末端配列の最初の１３個
のアミノ酸に相当する、変性した６倍の（six-fold deg
enerate) 38merプローブを用いてスクリーニングした。
このプローブは、
【０１０７】
【化８】
【０１０８】である。
【０１０９】ここで、１は、イノシンであって、ヒトゲ
ノムライブラリーをスクリーニングするときに用いる
と、λＳＭ２と称する、強くハイブリダイズするコロニ
ーを生じた。λＳＭ２ ＤＮＡは単離して、そして図２
に示される結果のように一部配列分析した。配列分折し
た部分は、ゲノムライブラリーから単離した、ファージ
に挿入された約１０−２０ｋｂの小さな断片のみであ
る。
【０１１０】プローブは、約２０１−２９４位を示すＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＲｓａＩ断片から構築した。ゲノムプロ
ープを、標準法を用いて、アルツハイマー病でない５５
才の男性の脳組織からの、λｇｔ１０中に調製したｃＤ
ＮＡライブラリーを、スクリーニングするために用い
た。λＳＭ２Ｗ４、λＳＭ２Ｗ３およびλＳＭ２Ｗ９と
称する３つのクローンを、同定した。
【０１１１】実施例２ 上記のゲノム配列およびｃＤＮＡ配列は、効果的な発現
系において組換えタンパク質を調製するのに用い得る。
ゲノムＤＮＡは、哺乳類細胞のようなイントロンをプロ
セスし得る細胞で用い得る。細菌細胞は、ｃＤＮＡ配列
の発現に用い得る。
【０１１２】β-アミロイド関連タンパク質の細菌での
発現および抗血清の生産 Ａ. プラスミドｐＡＰＣＰ１１８-３の構築 ヒトβ-アミロイド関連タンパク質（６５５−７５１）
に対するE. Co1i発現ベクターの構築は、３つのＤＮＡ
断片の結合が必要であった。（１）プラスミド骨格（複
製機能、アンピシリン耐性遺伝子、トリプトファンプロ
モーター／オペレーター、リボソーム結合部位、６個の
スレオニン残基がついたE. Co1iのβ-カラクトシダーゼ
のアミノ末端をコードするＤＮＡ（７個のアミノ酸）、
および転写終止シグナル）；（２）図１の６５５−７２
８位のアミノ酸をコードするβ-アミロイド関連ＤＮＡ
の断片、および（３）図１の７２９−７５１位のアミノ
酸および終止コドンＵＡＡをコードするβ-アミロイド
関連DNAの合成断片。
【０１１３】上記のプラスミド骨格は、ｐＴＲＰ８３−
１由来である。プラスミドｐＴＲＰ８３−１は、下記の
方法で構築した細菌で発現するプラスミドである。
【０１１４】１. 合成トリプトファンオペロンプロモー
ターおよびオペレ一ター調節配列の構築 図１４に示されている１０個のオリゴヌクレオチドを、
ホスホトリエステル法によって合成し、そして精製し
た。１と１０以外の、各々５００ｐｍｏ１のヌクレオチ
ドを個々に、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８、１
５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣ１2、２０μＣｉの
［λ-32Ｐ]-ＡＴＰ、およびポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｐ／Ｌ Biochemica1s）の２０単位を含有する２０μ
１中で、３０分問３７℃でリン酸化した。その後、さら
に、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ８、１５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣ１2、１．５ｍＭ ＡＴＰおよび
さらに２０単位のポリヌクレオチドキナーゼを含有する
１０μ１を添加し、その後３７℃で３０分問インキュベ
ートした。インキュベーション後、試料を１００℃で５
分問インキュベーションした。オリゴヌクレオチドの１
および１０の５００ｐｍｏ１を、ＡＴＰを含まない上記
の緩衝液で３０μ１に希釈した。
【０１１５】２本鎖の対をつくるオリゴヌクレオチド
（例えぱ図１４のオリゴヌクレオチオド１と２、３と４
など）の、各々１６．７ｐｍｏ１を混合して９０℃で２
分問インキュベートした後、徐々に室温まで冷却した。
次ぎに、各々の対を構築において他のものと組み合わ
せ、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノ
ール沈澱させた。オリゴヌクレオチド対は、５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣ１2、２０ｍ
Ｍ ＤＴＴを含有する３０μ１中で再構成し、５０℃で
１０分間加熱し、そして室温まで冷却して、その後、Ａ
ＴＰを添加して最終濃度０．５ｍＭにした。次に８００
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてその混合
物を１２．５℃で１２−１６時問インキュベートした。
【０１１６】ライゲーション混合物をフェノール／クロ
ロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。乾
燥させたＤＮＡを３０μ１に再生させ、EcoRIおよびPst
Iで、３７℃１時問消化した。混合物をフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させて、その後La
emmliら、Nature（1970）227:680 の方法に従って、８
％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって様々な
２本鎖ＤＮＡセグメントを分離した。ＤＮＡ断片は、湿
ゲルオートラジオグラフィーで可視化し、約１００ｂｐ
の長さに相当するバンドを切り出し、記載のように一夜
溶出した。切り出された合成ＤＮＡ断片は、同様にEcoR
IおよびPstIで消化されたプラスミドＭ１３−ｍｐ８あ
るいはＭ１３−ｍｐ９（MessingおよびVieira,（1982）
Gene 19：259-268）にライゲートし、そして設計された
配列を確認するためにジデオキシヌクレオチド配列分析
を行った。この設計された配列には、プロモーター（−
３５と−１０の領域）、およびトリプトファンオペロン
（ｔｒｐ）のオペレーター領域、およびトリブトファン
オペロンリーダーペプチドのリボソーム結合領域が含ま
れている。図１４に示されている配列のアナロク配列
は、E. Co1iでの異種タンパク質の発現に有用であるこ
とが立証された（Hal1ewe11, R.A. および Emtage, S.,
Gene (1980) 9:27-47, Ikehara, M. ら、 Proc. Nat1.
Acad Sci USA(1984) 81:5956-5960)。 ２. プラスミドｐＴＲＰ２３３を含有する合成ｔｒｐ
プロモーター/オペレーターの構築 プラスミドｐＫＫ２３３−２（Amann, E. および Brosi
us, J., Gene (1985)40:183)をＮｄｅＩで完全に消化
し、 E. Co1i ポリメラーゼＩの５単位、クレノウフラグ
メント（Boehringer-Mannheim, Inc.)、 および4つのｄ
ＮＴＰ全部を加えた５０μＭを用いて、末端を平滑にし
た。これを２５℃で２０分間インキュベートした。フェ
ノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱させた
後、ＮｄｅＩで消化したＤＮＡ断片をライゲートして、
E. Co1i（Nakamura, K.ら、J Mo1Appl Genet（1982) 1:
289-299）に形質転換した。得られたＮｄｅＩ部位のな
いプラスミドをｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄｅと称した。
【０１１７】プラスミドｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄｅの
２０ｎｇを、ＥｃoＲＩおよびＰｓｔＩで完全に消化し
た後、仔ウシ腸ホスファターゼ処理を行った。Ｍ１３
ＲＦからのＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化による、
合成ｔｒｐプロモーター／オペレーター配列の５０ｎｇ
を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＫＫ−２３
３−２−Ｎｄｅの１０ｎｇと混合し、Ｔ４−ＤＮＡリカ
ーゼでライゲートした。その後、E. Co1i ＪＡ２２１
１ｐｐ- ／Ｉ’１ａｃＩに形質転換した。形質転換体
を、１００ｂＰのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成ｔｒｐプロ
モーター／オペレーターを含有するプラスミドＤＮＡの
存在をスクリーニングした。次に、適正なプラスミドを
単離し、ｐＴＲＰ２３３と称した。
【０１１８】ｐＴＲＰ２３３を、ＥｃｏＲＩで消化し、
末端をクレノウで平滑化し、そしてライゲートしてＥｃ
ｏＲＩ制限酵素部位を除去した。次に、プラスミドをＮ
ｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＮｄｅＩ部位
とＥｃｏＲＩ部位との間にβ-ｇａ１-（ｔｈｒ）６をコ
ードするＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントを挿入してプラスミドｐＴＲＰ８３−１をつくっ
た。
【０１１９】次に、プラスミドｐＴＲＰ８３−１をＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで
消化し、その消化物を、０．６％アガロースゲルで電気
泳動した（Maniatis, T. ら、pp. 157-160）。プラスミ
ドの骨格を含む大きいほうのフラグメントをゲルから溶
出した。次に、λＳＭ２Ｗ３由来のβ-アミロイド関連
配列を含むＥｃｏＲＩフラグメント（図１の６５５−７
５１位のアミノ酸および５００ｂｐの３’非翻訳配列に
相当する）を、ＨａｅＩＩ制限酵素エンドヌクレアーゼ
で消化し、１２％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を
行った。約２３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨａｅＩＩフラグ
メント（６５５−７２８位のアミノ酸をコードするβ-
アミロイド関連配列）を溶出した。７２８−７５１位の
アミノ酸をコードする図１のβ-アミロイド関連配列の
残りの部分を、図９に示した６つのオリゴデオキシヌク
レオチドを用いて調製した。１と６と以外の各々のオリ
ゴデオキシヌクレオチドの５００ｐｍｏ１ｅをそれぞれ
リン酸化した。対をなす（例えば、１と２、２と３）オ
リゴデオキシヌクレオチドの各々１６７ｐｍｏ１ｅを、
混合して、９０℃で２分問インキュベートした後、徐々
に室温まで冷却した。 次に、各々の対を他のものと合
わせて、フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタ
ノール沈澱させた。対は、５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐ
Ｈ８、１０ｍＭＭｇＣ１2、２０ｍＭＤＴＴを含有する
３０μ１に再生させ、５０℃で１０分問加熱し、室温に
なるまで放置した。ＡＴＰを最終濃度が０．５ｍＭにな
るように加え、８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加
して、その混合物を１２℃で１２−１６時間インキュベ
ートした。ライゲーションしたものを、１２％のポリア
クリルアミドゲルで電気泳動し、７９ｂｐのＨａｅＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ合成フラグメントを溶出した。
【０１２０】ｐＴＲＰ８３−１のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩプラスミド骨格、約２３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈ
ａｅ１Ｉ β−アミロイドｃＤＮＡフラグメント、およ
び７９ｂｐの合成ＨａｅＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ β-アミ
ロイドフラグメントを、１２℃で１２−１６時間ライゲ
ートした。E. Co1i 株ＭＣ１０６１を、ライゲーション
混合物（Maniatis, T. ら、pp. 250-251）で形質転換
し、得られたアンピシリン耐性コロニーを、１００μｇ
／ｍ１の硫酸アンピシリンを補充したＬ培地１ｍ１中
で、一夜、増殖させた。プラスミドＤＮＡを、アルカリ
溶解法（Maniatisら、 pp. 368-369) で調製した。プラ
スミドを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIＩIの消化によっ
て、適正な挿入物をスクリーニングした。約３００ｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを放出する
プラスミドをｐＡＰＣＰ１１８−３と称した。
【０１２１】B. β-アミロイド関連融合ポリペプチド
（６５５−７５１）の発現 プラスミドｐＡＰＣＰ１１８-３は、１１０個のアミノ
酸のβ-ガラクトシダーゼ-スレオニン-β-アミロイド関
連融合タンパク質を、E. Co1iトリプトファンプロモー
ター／オペレーターの制御の下に、発現する。E. Co1i
株 Ｗ３１１０は、プラスミドｐＡＰＣＰ１１８−３で
形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーの１つ
を、Ｍ９最小塩（Mi11er, J., Experiments in Mo1ecu1
ar Genet1cs,Co1d Spring Harbor Laboratory, Co1d Sp
ring Harbor, New York）に、グルコース（０．４
％）、チアミン（２μｇ／ｍ１）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ2
Ｏ（２００μｇ／ｍ１）、トリプトファン（４０μｇ／
ｍ１）、カザミノ酸（casamino acid）（０．５％）、
およびアンピシリン（１００μｇ／ｍ１）を補充した培
地中で、３７℃で１２−１６時問増殖した。トリプトフ
ァンを減少させた（４μｇ／ｍ１）新しい培地に、培養
物を１００倍に希釈して、２時間、発現を誘導させた
後、３-β-インドールアクリル酸を最終濃度２５μｇ／
ｍ１になるように添加した。β-ｇａ１-ｔｈｒ-β-アミ
ロイド（６５５−７５１）融合タンパク質の発現が、総
細胞タンパク質の１０−２０％のレベルで生じ、位相差
顕微鏡（１０００×倍率）によって可視化し得る封入体
の形態で存在する。３-β-インドールアクリル酸の添加
の６時間後に、遠心により細胞を回収し、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ-ＨＣ１、ｐＨ７．５で洗浄し、そして細胞のペ
レットを-２０℃で凍結した。
【０１２２】Ｃ. 抗血清調製用のβ-ｇａ１-ｔｈｒ-β-
アミロイド（６５５−７５１）融合タンパク質精製 培養物５００ｍ１からの細胞ペレットを、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ７．５、０．６Ｍ ＮａＣ１の４
０ｍ１中に再浮遊させ、リゾチーム８ｍｇ、プロテアー
ゼインヒビターフェニルメチルスルホニルフルオライド
（ＰＭＳＦ）およびアプロチニン（それぞれ０．５ｍＭ
および２５μｇ／ｍ１）とともに、４℃で１０分問イン
キュベートした。２種の界面活性剤溶液、すなわち、デ
オキシコール酸ナトリウム（１０％溶液４８０μ１）お
よびＮＰ-４０（２０％溶液２４０μ１）を加えて、さ
らに４Ｃで1０分間インキュベートした。細胞ペレット
を超音波処理して、細胞および遊離の封入体を破壊し
た。ＲＮＡナーゼ（１０μ１／ｍ１）とＤＮＡナーゼ
（１０μ１／ｍ１）とを加えて、その混合物を室温で３
０分間撹拝してＲＮＡおよびＤＮＡを消化した。封入体
（および、いくらかの細胞破片）を、５０００ｒｐｍで
１０分問遠心（ＳＡ６００ローター）して集めた。上清
を除去して、ペレットをタンパク質ゲル試料用緩衝液中
で２０分間煮沸して融合タンパク質を溶解した。次に、
融合タンパク質を１２％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動（Laemm1i, U.K., Nature (1970) 227:68
0）によって精製した。各々のゲルの端を切り出して、
クーマシブルーで染色し、１５キロダルトン（ｋＤ）の
融合タンパク質を可視化した。次に、融合タンパク質を
含むゲルの部分を切り出せ得るように、それらをゲルに
再配置した。次に、ポリアクリルアミドを、生理食塩水
を添加して、ポリアクリルアミドの湿気を保ちながら一
連の針（１６ゲージから２２ゲージで）で崩した。ポリ
アクリルアミド／融合タンパク質を崩したものを、ウサ
ギを免疫する直前に、アジュバンド［ＲＩＢＩ（ＲＡ
Ｓ）]と混合した。動物当り、約１５０−２００μｇの
融合タンパク質を、最初の免疫用に投与した。次の免疫
に５０−１００μｇの融合タンパク質を用いる。
【０１２３】Ｄ. β-ｇａ１-ｔｈｒ-β-アミロイド（６
５５−７５１）融合タンパク質を用いてのβ-アミロイ
ドｓｙｎｐｅｐ抗血清のウェスタンプロット分析 ３-β-インドールアクリル酸で誘導された、E. co1i Ｗ
３１１０（ｐＡＰＣＰ１１８−３）およびＷ３１１０
（ｐＴＲＰ８３−１）の培養物の細胞ペレットを、Laem
mli ゲル試料用緩衝液中で煮沸して、１２％ＳＤＳポリ
アクリルアミドの電気泳動を行った。第２の形質転換株
は、β-ｇａ１-ｔｈｒ-β-アミロイド（６５５−７４
１）融合以外の全タンパク質を含有する陰性コントロー
ルである。次に、ゲルをニトロセルロースに電気プロッ
トし、最初に免疫したウサギから得たＡＰＣＰ ｓｙｎ
ｐｅｐ抗血清とともにインキュベートして、次に、125
Ｉ−Ｓｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡとと
もにインキュベートして結合抗体を同定した（Johnson,
DAら、Ｇene Ana1 Tech (1984）1:３）。これらのニト
ロセルロースフィルターからオートラジオグラムを描
き、抗ＡＰＣＰ３血清と融合タンパク質との交差反応活
性を示したＳｙｎｐｅｐ ＡＰＣＰ３は、融合タンパク
質のβ-アミロイド部分に含まれる、図１の７０５−７
１９位のアミノ酸を含有する。さらに他のβ-アミロイ
ドｓｙｎｐｅｐ抗血清についても交差反応性を観察し
た。
【０１２４】実施例３ 生きた組換えワクシニアウイルスを用いてのβ-アミロ
イド関連タンパク質に対するポリクローナルおよびモノ
クローナル抗体の産生 １. プラスミドｐＦＬ４Ｔ４Ｂの構築 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するた
めのプラスミドの構築は、図１０に図示されている。プ
ラスミドｐＧＥＭ−３TM（Promega-Biotec）は、Maniat
isら、に従って、ＥｃｏＲＩ消化し、仔ウシ腸のホスフ
ァターゼで処理した。λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の精製
された１．０６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの５０ｎ
ｇを、１０ｎｇのＥｃｏＲＩ消化のｐＧＥＭ−３TMと混
合して、総容量２０μ１で、２５℃、３０分間、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼとともにインキュベートした。E. co1i株
ＭＣ１０６１をＣａＣ１2法による形質転換用に適合す
る（competent）ようにし、ライゲーション混合物によ
って形質転換した。得られたアンピシリン耐性コロニー
を、２ｍ１のＬ-ａｍｐ培地中で一夜増殖し、プラスミ
ドＤＮＡをTriton溶解法で調製した（Maniatisら）。Ｈ
ｉｎｄＩIＩによる消化によって、プラスミドが適正な
配置にあるかスクリーニングした。１５０から３７００
ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを有するプラス
ミドを選んでｐ４ＢＩと称した。得られたプラスミドｐ
４ＢＩを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化してＴ４リガーゼで２
５℃、３０分間再ライゲートし、適合させたＭＣ１０６
１細胞をライゲーション混合物で形質転換した。Ｅｃｏ
ＲＩ消化によって、プラスミドが１３０ｂｐのＨｉｎｄ
IＩIフラグメントを欠損していることをスクリーニング
した。１つのＥｃｏＲI部位を含むプラスミドを選択し
て、ｐ４Ｂ△ＲIと称した。１０ｎｇのプラスミドｐ４
Ｂ△ＲIをＥｃｏＲＩ消化し、仔ウシ腸のアルカリホス
ファターゼで処理して、λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の、
精製した約２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント１００ｎｇ
にライゲートした。ライゲーション混合物を、適合され
たＭＣ１０６１細胞を形質転換するのに用いた。得られ
たアンピシリン耐性コロニーをＬ−ａｍｐ培地中で一夜
増殖し、プラスミドDNAを調製した。プラスミドをＢａ
ｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの消化により、適正な配置
にあるかスクーニングした。１．５ｋｂのＢａｍＨＩフ
ラグメントおよび約１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントを有するプラスミドを選んで、ｐ４
Ｔ４Ｂと称した。プラスミドｐ４Ｔ４ＢをＳｍａＩおよ
びＸｍｎIで消化し、得られた約２．７ｋｂのフラグメ
ントを0．８％アガロースから溶出した後、エタノール
沈澱させ、真空下に乾燥させてｄＨ2０に再浮遊きせ
た。
【０１２５】５μｇのワクシニアウイルスの発現ベクタ
ーｐＳＣ１１（Chakrabartiら、 Mo1Ce11 Bio1 (1985)
5:3403-3409）を、ＳｍａＩで完全に消化した後、仔ウ
シ腸のホスファターゼで処理した。ｐ４Ｔ４Ｂ由来の、
精製した約２．７ｋｂのＳｍａＩ-ＸｍｎＩフラグメン
ト５００ｎｇを、ＳｍａＩ消化したｐＳＣ１１の５０ｎ
ｇと混合して、総容量２０μ１で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
とともに１５℃で、一夜１６時問インキュベートした。
E. co1i株 ＭＣ１０６１をライゲーション混合物で形質
転換した。得られたアンピシリン耐性コロニーを一夜増
殖させ、プラスミドＤＮＡを、急速煮沸法により単離し
た（Maniatisら）。ＥｃｏＲI消化によって、プラスミ
ドが挿入されて適正に配置しているかスクリーニングし
た。約２５００ｂｐおよび約６００ｂｐのＥｃｏＲＩフ
ラグメントの両方を有するプラスミドを選んで、ｐＦＬ
４Ｔ４ＢＶと称した。
【０１２６】β-アミロイド関連タンパク質の全長に対
するモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、Yilm
a, T. ら、（Hybridoma(1987) 6:329-337）に記載され
ている新規な方法を用いて発生させる。要するに、この
方法は、免疫化あるいはスクリーニングの工程での抗原
（タンパク質）の精製の必要がない、特定のタンパク質
に対する抗体の生産を可能にする。この方法は、遺伝子
工学的に単離遺伝子を有するようにされ得る、ワクシニ
アウイルスのクローニングベクター（Smithら、Nature
(1983) 302:490-495）を用いる。次に、感染する組換え
ワクシニアウイルスをマウスを免疫するのに用い得る。
感染の後２週間目に、Koh1erおよびMi1stein Nature (1
973) 256:495により開発された古典的な研究に記載され
ているように、マウスを殺して、モノクローナル抗体生
産のためにその脾細胞をミエローマ細胞に融合した。あ
るいは、ウサギは、ポリクローナル抗血清を生じるよう
に、感染性ワクシニアウイルスの組換え体で一般的に免
疫され得る。
【０１２７】プラスミドｐ４Ｔ４ＢＶ１０μｇを、標準
法（Mackettら、J Virol (1984) 49:857-864）に従っ
て、野生型ワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１サ
ルの腎臓紬胞をトランスフェクトするのに用いる。ＴＫ
- 組換え体を、２５μｇ／ｍ１ブロモデオキシウリジン
（ＢＵｄＲ）の存在下に、ＴＫ- 細胞におけるプラーク
アッセイによって単離する。ｐＳＣ１１ワクシニアウイ
ルスの発現ベクターの場合のように、青色の生成物を伴
うプラークアッセイ用に、１ｍｌ当り３００μｇのＸ−
Ｇａ１を横たえたアガロースにおいて、３７℃、４−６
時間後、プラークが認められる。プラークは２から３回
続けて精製される。組換えウイルスからのＤＮＡを、制
限酵素エンドヌクレアーゼ分析、およびλＡＰＣＰ１６
８ｉ４由来の32Ｐニック翻訳された２０９１ｂｐのＥｃ
ｏＲＩフラグメントとのＤＮＡハイブリダイゼーション
によって、推測した構造を確認する。
【０１２８】λＡＰＣＰ１６８ｉ４のβ-アミロイド関
連ｃＤＮＡ配列全体を有する組換えウイルスを単離し、
増幅して高力価（１×１０8-9ｐｆｕ／ｍ１）にする。
これらの組換えウイルスは、ウサギおよびマスを免疫し
て、次ぎに、十分に確立された方法を用いて、全長β-
アミロイド関連タンパク質に対する、それぞれのポリク
ローナル抗体およびノモクローナル抗体を生産するのに
用いるか、あるいは、組換えタンパク質の直接の発現に
用いられ得る。種々の抗血清を、β-アミロイド関連タ
ンパク質のウイルス組換え体によって感染させた、35Ｓ
-メチオニン標識のＣＶ−１細胞由来の適正な大きさの
タンパク質を特異的に免疫沈降させる能力、あるいは、
放射標識のアミノ酸に曝されていない同様の細胞の、変
性されたタンパク質をウェスタンブロットで検出する能
力のいずれかをスクリーニングする。
【０１２９】実施例４ β-アミロイド関連タンパク質（１−７５１）の培養哺
乳類細胞での発現 哺乳類細胞でのβ-アミロイド関連タンパク質の発現を
促進するために、ヒトメタロチオネンＩＩ（ｈＭＴＩ
Ｉ）遺伝子由来の強く調節されたpuブロモーターに、タ
ンパク質のコードセグメントを融合するようにプラスミ
ドを構築する。この方法、は２っの工程において行われ
る。最初に、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ制限酵素による
ｐｈＧＨ−ＳＶ（１０）の消化によって、ｐｈＧＨ−Ｓ
Ｖ（１０）ベクターから、発現ベクターｐＭＴＳＶ４０
ｐｏ１ｙＡ Ｂａｍが由来される。その後、DNAポリメ
ラーゼＩ（クレノウフラグメント）とともにインキュベ
ートして平滑末端分子をつくる。次に、平滑末端を、Ｂ
ａｍＨＩリンカーにライゲートし、ＢａｍＨＩで切断し
て、再びライゲートして環状にする。この工程で、ｍＲ
ＮＡの３’非翻訳領域の大部分および、推定上の３’転
写終止シグナルとプロセッシングシグナルとをコードす
るゲノム配列以外のｐｈＧＨ−ＳＶ（１０）由来のヒト
成長ホルモンのゲノム配列の全てが除去される。哺乳類
細胞での発現構築用に、ｐＭＴＳＶ４０ｐｏ１ｙＡ Ｂ
ａｍをＢａｍＨＩ消化し、次に、４つの全ヌクレオチド
トリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼＩとともに
インキュベートして平滑末端をつくる。次に、このフラ
グメントを、ｐ４Ｔ４Ｂ（前述）由来の精製した２６７
８ｂｐのＳａｍＩ−ＸｍｎIフラグメントにライゲート
する。この組換え分子を、形質転換によりＭＣ１０６１
に導入する。
【０１３０】チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）-Ｋ１を、１０％胎児ウシ血清を加えた、Ｆ１２培
地とＤＭＥ培地との１：１混合物からなる培地中で増殖
させる。全細胞を、組換え発現ベクターとｐＳＵ２：Ｎ
ＥＯ（Southern, P. ら、J Mo1 Appl Genet(1982）1：3
27-341）とを同時に形質転換する。ｐＳＶ２：ＮＥＯ
は、ネオマイシンアナログＧ４１８に対して耐性を獲得
する機能性遺伝子を含有する。形質転換において、５０
０ｎｇのｐＳＶ２：ＮＥＯと、５μｇの組換えベクター
とを、６０ｍｍディシュ中のＣＨＯ細胞に付与して、Gr
aham, F. L. およびVan der Eb, A.J. Virology (197
3）52:456-467に記載されているようにリン酸カルシウ
ム-DNA共沈澱させる。Southernらが記載のように、抗生
物質Ｇ４１８中で細胞を増殖すると、β-アミロイド関
連ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現する容量のある発現
ベクターＤＮＡを含有する、安定にトランスフェクトさ
れたＣＨＯ細胞群を生ずる。
【０１３１】実施例５ β-アミロイド関連タンパク質（６５２−７５１）の培
養哺乳類細胞での発現 β-アミロイド関連タンパク質の生産のためにコードす
る哺乳類細胞発現ベクターは、下記の図１２に示される
ように構築し得る。図１０のｐ４Ｂ△Ｒｌベクターは、
ＥｃｏＲＩよる消化によって直鎖化される。このベクタ
ーを、下記の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドと
混合する。
【０１３２】
【化９】
【０１３３】そして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてラ
イゲートする。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩ部位の後ろにλＳＭ２Ｗ４のＭｅｔ
−Ａｓｐ−Ａ１ａコドンを再構築し、その後ろに他のＥ
ｃｏＲＩ部位がある。
【０１３４】E. co1i株 ＤＨ１の適合させた細胞を、混
合物で形質転換して、Ｌ−Ａｍｐプレートでの増殖によ
り、アンピシリン耐性菌を選択した。ＥｃｏＲＩ部位に
適当な配置で挿入したオリゴヌクレオチド対を含有する
形質転換体を、標準のスクリーニング法によって選択し
て、ｐ△Ｗ４／Ｗ３と称した。プラスミドＤＮＡ ｐ△
Ｗ４ Ｗ３を、ＳｍａＩおよびＸｍｎＩで消化して、図
５に記載されているβ-アミロイド関連タンパク質をコ
ードする配列を除去し、適正な断片をゲル精製法によっ
て単離する。
【０１３５】次に、この断片を、上記実施例４に記載し
たように、ＢａｍＨIで直鎖化して平滑末端化した、哺
乳類細胞発現ベクターｐＭＴＳＶ４０ｐｏ１ｙＡ Ｂａ
ｍに挿入し得る。得られたベクター、ｐＭＴ−ＡＰＣＰ
（６５２−７５１）は、β-アミロイド関連タンパク質
（６５２−７５１）の生産に用い得る。
【０１３６】実施例６ β-アミロイド前駆体の哺乳類細胞での発現 実施例４および５の概要は、ヒトβ-アクチンプロモー
ターにより作動されるβ-アミロイド関連タンパク質
（１−７５１）の発現系の構築である。ほぼ同等の構築
物を、ｐ４Ｔ４Ｂ（前述実施例３に記載）由来の、５’
非翻訳領域から１１６ｂｐを欠損している、精製した２
５４８ｂｐのＳｍａＩ−ＸｍｎＩフラグメントを用いて
調製した。このフラグメントを、哺乳類紬胞での発現で
ネオマイシ選択し得るマーカー、および細菌の形質転換
体の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を有するプラ
スミドの、ヒトβ-アクチンプロモーターの後ろのＳａ
１Ｉ部位に挿入した。このベクター、ｐＨｂＡＰｒ−１
−ｎｅｏは、Gunningら、（Proc Nat'1 Acad Sci USA
（1987）84:4831-4835）に記載されていて、元来のベク
ターのＥｃｏＲＩ部位を除去して、元来から存在するＳ
ａ１Ｉ，ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩクローニン
グ部位に加えてＥｃｏＲＩ部位を有する新しいポリリン
カーで、元来のポリリンカー領域を置換して改変されて
いる。この改変されたベクターは、ｐＡＸｎｅｏＲであ
る。このｐＡＸｎｅｏＲベクターを、Ｓａ１Iで直鎖化
し、末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント
を用いて満たして平滑末端分子をっくった。２５４８ｂ
ｐのＳｍａＩ-ＸｍＩ β-アミロイドフラグメントを、
Ｔ４リガーゼを用いてベクターに平滑末端でライゲート
した。組換え分子を、形質転換によってE. co1i株 ＭＣ
１０６１に導入し、適切な配置にあるクローンを増幅し
た。同等の構築を、Kangら（上記）の記載の６９５β-
アミロイド配列を用いて行った。この配列には、ヒトβ
-アクチンプロモーターの制御の下に、６９５のアミロ
イドタンパク質が配置されている。
【０１３７】ｐＡＸｎｅｏ／７５１β-アミロイド、あ
るいはｐＡＸｎｅｏ／６９５β-アミロイドの総ＤＮＡ
の６００μｇ、または両プラスミド構築物の同量混合物
を、ＢＴＸトランスフェクター１００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ
の無菌の使い捨てキュベット、および通常のキュベトホ
ルダーを用いて、エレクトロポレーションによって、１
０7個のＣＨＯ細胞へ導入した（Neumann, J Membrane B
iol (1972)10:279; Zimmerman, Biophys J (1973) 13:1
005-1013）。外来ＤＮＡを受け入れるＧ４１８耐性の細
胞を、GibcoのＧ４１８を５００μｇ／ｍ１用いて、標
準のプロトコール（上記のSouthern, 1982）によって選
択した。
【０１３８】３回のトランスフェクションの各々から、
Ｇ４１８耐性の陽性のトランスフェクトされた細胞のプ
ールを、β-アミロイド前駆体タンパク質に関して特徴
づけた。血清を含まない培地の５ｍ１を含有する各々の
プールからの約２×１０6個の細胞を、３７℃で４８時
間インキュベートした。馴化培地を除去して、トリクロ
ロ酢酸を最終濃度１０％になるように添加してタンパク
質を沈澱させた。細胞を擦り落として回収し、リン酸緩
衝化生理食塩水で洗浄し、５０ｕ１の緩衝液に再浮遊さ
せて３０倍濃度にした。各々の試料の２５ｕ１を１２．
５％のポリアクリルアミドゲルにかけた（Laemmli，Nat
ure(1970）277:680-685）。β-アミロイド前駆体を、標
準法と、実施例３に記載したβ-アミロイド７５１ｃＤ
ＮＡを有する組換えワクシニアウイルスによって生じ
た、β-アミロイド特異的ポリクローナル抗体とを用い
て、ウェスタンブロット分析（Towbin, Proc Nat'l Aca
d Sci USA (1979）76:4350-4354）で検出した。典型的
には、約１１０,０００ダルトンのβ-アミロイド前駆体
の大部分が、培養培地に放出されていて、ごく少量のタ
ンパク質が細胞に結合していることが見いだされる。こ
の結果は、β-アミロイドタンパク質は分泌されたプロ
ホルモンであると提案する、A11sopら、 (ProcNat1 Aca
d Sci USA (1988) 85:2790-2794) の仮説を支持してい
る。組換え発現されたβ-アミロイドタンパク質の、１
１０，０００ダルトンの明かな分子量は、他の研究者
（Dyrks, Tら、EMB0 J（1988) 7(4)：949-957）が、イ
ンビトロ転写／翻訳系を用いて観察したものと類似す
る。
【０１３９】実施例３に記載されているようにワクシニ
アウイルスにクローンされたβ-アミロイド７５１タン
パク質を、さらにβ-アミロイドタンパク質の発現の性
質を確かめた。精製組換えウイルスを、血清を含まない
状態でＭＯＩ１で１０６個のＣＶ−１紬胞を感染させる
のに用いた。ウイルスによる感染の１８時間後、細胞お
よび上清の両方を回収して、ポリアクリルアミド電気泳
動にかけ、そして上記のポリクローナル抗血清を用いた
ウェスタンブロットに供した。図１５に示されているよ
うに、β-アミロイドの１１０，０００ダルトンのタン
パク質は、細胞に結合されているよりも馴化培地中に存
在することが見いだされた。
【０１４０】実施例７ β-アミロイド関連タンパク質のｍＲＮＡ種の遺伝的な
変形体を区別するアッセイ オリゴヌクレオチドプローブを用いての、β-アミロイ
ド関連タンパク質のｍＲＮＡ種の遺伝的な変形体を区別
する能力が、ここに証明される。
【０１４１】アルツハイマー病の診断アッセイは、β-
アミロイド関連タンパク質あるいはそのmRNAの２つのよ
く似た遺伝的な変形体間を区別し、そしてこれらのタン
パク質あるいはｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量する
形態をとる。図８は、診断アッセイの基準を提供するた
めに、本発明の配列の使用の例を提供している。
【０１４２】総細胞ＲＮＡあるいは細胞質ＲＮＡを、培
養によるヒト細胞から、あるいは、核を除去したまたは
除去していない（それぞれに、紬胞質ＲＮＡあるいは総
ＲＮＡ）、ヒトの脳組織（アルツハイマー病の脳あるい
は正常の脳）から、Maniatisらの記載のようにグアニジ
ンチオシアネート／ＣｓＣ１法によって調製した。図８
の番号に相当する試料は、（１）神経芽細胞腫および線
維芽細胞の混合培養物であるＩＭＲ-３２細胞（ＡＴＣ
Ｃ＃ＣＣＬ１２７）からの総ＲＮＡ、；（２）正常線維
芽細胞であるＭＲＣ５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）
からの総ＲＮＡ、；（３）類上皮細胞であるHela細胞
（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２．２）からの総ＲＮＡ、；（４）
ＭＲＣ５細胞からの細胞質ＲＮＡ；（５）He1a細胞から
の細胞質ＲＮＡ；（６）前骨髄細胞白血病細胞であるＨ
Ｌ−６０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２４０）からの総ＲＮ
Ａ、；（７）１２-テトラ-デカノイル-ホルボール-１３
-アセテートで処理してマクロファージヘの細胞分化を
誘発した、ＨＬ−６０細胞からの総ＲＮＡ；（８）正常
な小脳試料からの総ＲＮＡ；（９）正常前頭葉皮質試料
からの総ＲＮＡ；（１０）アルツハイマー病患者の前頭
葉皮質からの総ＲＮＡ；および（１１）正常側頭葉皮質
からの総ＲＮＡ；である。ＲＮＡを、オリゴ-ｄＴセル
ロースクロマトグラフィーで分画にわけ、ホルムアルデ
ヒドアガロースゲル電気泳動にかけて、そしてニトロセ
ルロースヘブロットトランスファーした（全て、Maniat
isらの記載のように）。標準のプロトコールに従って、
フィルターを加熱し、プレハイブリダイズし、そして指
標プローブにハイブリダイズした。
【０１４３】指標プローブは、（１）上記本発明の詳細
な説明のところで記載したような、Kangらの配列に対し
て特異的な３０塩基のオリゴヌクレオチド＃２７３３で
ある連結部；（２）図１および上記のβ-アミロイド関
連配列に対して特異的な６０塩基のオリゴヌクレオチド
＃２７３４である挿入部分；および（３）プラスミドｐ
ＨＦＢＡ−１から単離された、１８００ｂｐのヒトアク
チンｃＤＮＡ挿入物（Ponte, Pら、 Nuc Acids Res (198
4) 12:1687-1696)；である。オリゴヌクレオチドプロー
ブを、生産者の指示に従って、ターミナルトランスフェ
ラーゼとともにインキュベートして［32Ｐ]-ｄＣＴＰで
末端標識した。アクチン挿入物は、ニック翻訳によって
［32Ｐ]-ＣＴＰで放射標識した。ハイブリダイゼーショ
ン後、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたフィル
ターを、５５℃、１ｘＳ.Ｓ．Ｃ.で洗浄した。アクチン
にハイブリダイズしたフィルターを、５５℃、０．１×
Ｓ．Ｓ．Ｃ。で洗浄した。次に、フィルターをＸ線フィ
ルムに曝し、オートラジオグラムを得た。挿入プローブ
は、試される全試料において、図１に記載のβ-アミロ
イド関連タンパク質ｍＲＮＡを検出する。連結部ブロー
プは、ＨｅＬａおよびＭＲＣ５以外の全細胞において、
Kangらの記載のβ-アミロイド関連タンパク質ｍＲＮＡ
を検出する。アクチンプローブは、全細胞における、豊
富なＲＮＡにハイブリダイズすることが期待される対照
プローブである。
【０１４４】実施例８ β-アミロイド関連タンパク質（２８９−３４５）のバ
クテリアでの発現 A. プラスミドpAPCP125-2の構築 実施例２の教示に従って、β-アミロイド関連タンパク
質（289-345）用の合成遺伝子を組み立てた。三対のオ
リゴデオキシリボヌクレオチド（図９−４）から、E. c
o1iの高度に発現されている遺伝子の好ましいコドンを
選択し用い、そして、融合タンパク質からポリペプチド
が放出される様に、アミノ酸289(G1u）の前にヒドロキ
シルアミン解裂部位（Asn-G1y）を挿入した。発現ベク
ターpTRP83-1を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHin
dIIIで消化し、そして、直鎖化したプラスミドを、0.6
％アガロースゲルで精製した。50μｇのプラスミドDNA
および200μｇの合成遺伝子DNAを、T4 DNAリガーゼでラ
イゲーションして修復体を得、そして、E. co1i MC1061
をこの修復体で形質転換した。アンピシリン耐性のコロ
ニーを、100μg/m1のアンピシリンを含んだＬ培地中で
一晩成長させ、そしてアルカリ性のプラスミド調製物を
得た。この得られたプラスミドDNAは、約350bPの断片が
放出されるかどうかによりベクター内にこの遺伝子が挿
入されたのを確認するために、BamHI制限エンドヌクレ
アーゼで消化された。この合成遺伝子の挿入物を受け取
った一つのプラスミドを、pAPCP125-2と命名した。
【０１４５】B. β-アミロイド関連癒合ポリペプチド(2
89-345)の発現 このプラスミドpAPCP125-2は、E. co1iのトリプトファ
ンプロモーター/オペレーターの制御下で、74個のアミ
ノ酸のβ-ガラクトシダーゼ-スレオニン-β-アミロイド
関連融合タンパク質を発現する様にデザインされてい
る。E. co1i株W3110を、プラスミドpAPCP125-2で形質転
換し、そして得られたアンピシリン耐性のコロニーの一
つを、実施例２に記述した様に成長させた。終濃度が25
μg/m1となる様に、３-β-インドールアクリル酸を加え
ることにより、発現を誘導した。５時間の誘導後、１m1
の細胞培養物を取り出し、遠心分離により回収し、次に
標準的な方法に従い、100μ1のLaemm1iのタンパク質試
料緩衝液中で沸騰させ、16％のSDS-ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動にかけた。封入体の形成は、位相差顕微
鏡（1000x）により評価される。発現レベルは、ゲルの
クーマシーブルー染色後、デンシトメーター走査による
タンパク質バンドの強度の定量により算出される。タン
パク質精製に使用される細胞は、遠心分離で回収し、10
mMのTris-HC1緩衝液、pH7.5で洗浄し、そして、細胞ペレ
ットは、必要とされるまで-20 ℃で凍結保存した。
【０１４６】C. β-gal-thr-β-アミロイド関連タンパ
ク質(289-345)の精製 この融合タンパク質は、β-ga1-thr-β-アミロイド関連
（655-751）融合タンパク質（実施例２）で記述した様
に、PMSFおよびアプロチニンなしで、精製された。２Ｍ
尿素から麦台まり４Ｍ尿素に終わる一連の洗浄により、
他のタンパク質は除去され、そして、封入体中に観察さ
れる融合タンパク質はさらに富む様になる。さらなる精
製を所望するならば、この融合タンパク質を、６から８
Ｍの尿素に可溶化し、ゲル濾過あるいはイオン交換クロ
マトグラフィーの工程を含める。もし所望しないなら
ば、この融合タンパク質を、Moksら、Biochem (1987) 2
6:5239-5244 に記載されている条件下で、６Ｍのグアニ
ジン塩酸塩およびヒドロキシルアミンに可溶化し、Asn
残基とG1y残基の問で開裂し、Gly残基をアミノ末端に持
ったβ-アミロイド関連タンパク質（289-345）を放出さ
せる。開裂されたペプチドは、逆相の高圧液体クロマト
グラフィー、イオン交換あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィーにより精製する。この精製されたβ-アミロイド
関連タンパク質を、次に、TanおよびKaiserのJ Org Che
m（1976）41：2787および Biochemistry(1977) 16:1531
-1541に記述された方法により、還元し、再酸化し、６
個のCys残基の間のジスルフィド結合を再形成する。こ
れらの方法により、やはり６個のCys残基を有し、E. co
1i中で製造される、ウシ膵臓のトリプシンインヒビター
（アvon Wilcken-Bergmann EMBO (1986) 5:3219-322
5）。
【０１４７】実施例９ インヒビタータンパク質の構築および発現 二つのキメラタンパク質の各々をコードするDNA配列は
合成オリゴヌクレオチドから構成した。使用したこのオ
リゴヌクレオチドの配列を、図１６に示す。phoAシグナ
ルペプチドの配列（図１６B）は、Kikuchiら（前出）か
ら、ompAシグナルペプチドの配列（図１６A）は、Beck
およびBremer（前出）から得た。各オリゴヌクレオチド
を、キナーゼで処理した（5'末端の外側の２個を除
く）。
【０１４８】phoＡあるいはompAにいづれかをコードし
ている8つのオリゴヌクレオチドの全てを、一緒に混合
しリガーゼで処理した。予想した長さの新しいバンド（
〜250bp）が、分析用ゲルに現れた。次に、このライゲ
ーション構築物を、ベクターpTRP233のNdel-HindIII部
位にライゲーションして入れた。このライゲーションさ
れたベクターを、E. co1iMC1061株にトランスフェクト
し、そして、AmpR（アンピシリン耐性）のコロニーを選
択した。プラスミドのミニプレップ（少量調製物）は、
正しい制限酵素地図を有する組み換えプラスミドである
ことを示した。DNAのミニプレップをW3110株およびJE55
05株のトランスフェクションに用いた。この３つの株を
各々、小スケールで培養し、成長させ、そして、IAAで
一晩誘導した。培養上清の、トリプシン阻害活性を調べ
た。トリプシンを、合成基質N-ベンゾイル-D-アルギニ
ン-p-ニトロアニリンを加水分解してp-ニトロアニリン
(pNA)を放出する能力に関して試験する。 時間を関数に
したpNAの放出は、 分光光度計でモニターし易く、そし
て、トリプシン活性を定量的に測定し得る。トリプシン
に結合し、トリプシンにより基質が加水分解されるのを
阻止する能力により、このインヒビターはこのアッセイ
で検出される。JE5505のompAおよびphoAの両構築物の阻
害活性は培養培地中に検出されたが、W3110あるいはMC1
061からは検出されなかった。phoA構築物の発現レベル
が、より高いようなので、以下の実験にはこの構築物の
みを用いた。
【０１４９】培地中のインヒビターレベルを試験し、そ
して、インヒビターの合成速度を、35S-メチオニンをイ
ンヒビタータンパク質に取り込ませることによりモニタ
ーする、タイムコースの実験を行った。この実験によ
り、IAAによる誘導後４時問から６時問の間に、この合
成が０に減退し、一方、誘導の８時間後まで、培地中に
インヒビタータンパク質が蓄積された。この遅延は、タ
ンパク質がペリプラズマから外膜を通り培地中へ拡散す
るために要する時間を表すと推測される。培地中のイン
ヒビターのレベルは、誘導後８時間から２４時問まで安
定である様に見える。
【０１５０】実施例１０ インヒピタータンパク質の精製 phoAで形質転換したE. coli JE5505の5Ｌの培養を一晩
成長させ、OD550=0.1の時点で誘導し、IAAで誘導して８
時間後に回収した。細胞は遠心で落とし、捨てた。この
上清を、8μmおよびO.45μmのフィルターを通して濾過
し、トリプシンセファローズアフイニテイーカラム（総
量1０m1のセファローズ、セファローズ上に6mg/m1のト
リプシン、流速5m1/min、4℃）を通した。このカラム
を、0.3Mの塩化ナトリウム（NaC1）および0.01Mの塩化
カルシウム（CaC12）を含んだ、0.1Mの酢酸ナトリウム
緩衝液、pH4で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質
を除去した。このインヒビターを、0.1M塩酸-0.5MNaC1-
0.01 M CaC12の緩衝液、pH1.25で溶出した。あるいは、
アフィニティーマトリックスとして、トリプシンアフィ
ニティーカラムの代わりに、トリプシンビーズ懸濁液も
使用し得る。５ＬのE. coli JE5505の上清に、約20m1の
トリプシンセファロースビーズ懸濁液を加え、ミキサー
で緩やかに撹拝した（300rpm、１時間、室温）。この混
合物を、シンターガラス漏斗に注ぎ入れ、そして、この
液体をビーズから吸引した。約4Lの20 mMの Tris-HC1、
pH7.5を用いて、この粒子を再平衡化し、そして次に、
0.1M酢酸-0.3mM NaC1、pH4.5で洗浄した。このビーズを
20mMのTris-HCl、pH7.5を用いて再平衡化し、そして次
に、プロテアーゼインヒビターを、約80m1の0.1M HC1-
0.5MNaC1、pH1.25を用いて溶出した。この溶出物は、約
2.5m1の2 M Tris塩基、pH10.0を用いて中和した。トリ
プシンアフィニティーカラムの溶出物を、20％アセトニ
トリル-0.1％トリフルオロ酢酸-80％水で平衡化した、
Ｊones ChromatographyのAPEX-WPR buty1 HPLC カラム
（内径1cm x 25cm）に注入した。60％アセトニトリル/
0.1％ TFA/H2Oへの直線的なグラジェントを行い、この
インヒビターを溶出した。このインヒビターは、主要ピ
ーク（ピーク4）および小さいピーク（ピーク2）中に溶
出した。トリプシン阻害試験で、両方とも活性であり、
アミノ酸配列決定装置（ピーク4は40サイクル、ピーク2
は49サイクル）で両方は相同であると見られ、そして、
両方ともA4インヒビターと予測されるアミノ酸組成であ
った。ピーク2を10 mMのDTT(ジチオスレイトール）で処
理すると、ピーク2の部分的なピーク4への転喚が起こ
り、ピーク2はメチオニンの酸化により生じたことを示
唆している。各場合に、内因性のE. coliシグナルペブ
チダーゼが、図１６の矢印で示された、予想した部位で
キメラタンパク質を開裂した。質量スペクトル(MS)分析
では、ピーク4は6,267ダルトンの分子質量を有し、３つ
のジスルフィド結合を持った完全な長きのA4iの予測値
である6,267.7に非常に近い値であった。形成された各
々のS-S結合は、2H+分（=2ダルトン)の質量減少をもた
らすので、S-Sの数が評価できる。 ピーク2は、ピーク4よ
りも80ダルトン大きい異なるMSのピークを与え、酸化を
裏付けた。このタンパク質をトリプシンセファローズァ
フィニティーカラムから溶出するために用いた酸性の条
件が、メチオニンの酸化を促進するが、トリプシンセフ
ァローズアフィニティーカラムから溶出した後、例えば、
pHが約8から約11の範囲の、好ましくはpH1O.Oの2MのTris
塩基の様な緩衝溶液を用いた迅速な中和により、ピーク
2の形成は最小化されている。
【０１５１】実施例１１ Ａ４阻害活性 セリンプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼに対す
るＡ４インヒビターの効果を次のようにして調べた。ト
リプシン（17,000ユニット/mg、ブタの膵臓から）、第
Ｘａ因子およびα−トロンビン（Dr. Iwanagu, Kyushu
University, Fukuoka, Japan より提供）、トリプター
ゼおよびキマーゼ（双方ともラットの腹腔内マスト細胞
からKido et a1., Arch Biochem Biophys 239:436-443
（1985）に記載されているように精製）、α-キモトリ
プシン（0.75 U/mg、ウシの膵臓から）、エラスターゼ
（33U/mg、ブタの膵臓から）、パパイン、カテプシンＢ
（ラットの肝臓からTowatari et a1., Eur J Biochem 1
03:279-289（1979）に記載のように精製）、プラスミン
（0.16U/mg、ヒトの血漿から）、ウロキナーゼ（0.75U/
mg、ヒトの腎臓細胞から、Sigma Chemica1 Co.）、組織
カリクレイン（50U/mg、ブタの膵臓から）、または血漿
カリクレイン（9.4U/mg、ヒトの血漿から）を、ウシ血
清アルブミン（0.1mg/m1）を含有する全体積1.5mlの緩
衝液中で種々の濃度のインヒビターと共にブレインキュ
ベートした。緩衝液としては、トリプシン、プラスミン
およびウロキナーゼには0.1 M Tris-HC1、pH7.5を、キ
マーゼおよびα-キモトリプシンには0.1 M Tris-HC1、p
H8.0を、第Ｘａ因子およびα-トロンビンには10 mM CaC
12を含有する0.1M Tris-HC1、pH8.0を、トリプターゼ
Ｍには0.1M Tris-HCl、pH8.5を、血漿および組織カリク
レインにはO.1M Tris-HC1、pH7.8を、エラスターゼには
0.1M Tris-HC1、pH7.0を、パパインおよびカテプシンＢ
には1mM EDTAと4mMシステインとを含有する50mMアセテ
ート、pH6.0を使用した。２５℃で５分問ブレインキュ
ベートした後に、表１に示されている7.5μ1の濃度20mM
の蛍光発光性基質を加えて、自動温度調節で２５℃に維
持した石英キュベット内で各プロテアーゼの残存活性を
測定した。基質から放出された７-アミノ-４-メチルク
マリンの量を、前記のKido et a1.(1988)により報告さ
れたように、Hitachiの蛍光分光光度計、６５０−１０
ＭＳ型内で、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍ
にて蛍光法で測定した。タンパク質濃度は、Smith et a
l., AnalBiochem.150:76-85(1985)に記載されたよう
に、バイシンコニン酸（bicinchoninic acid）タンパク
アッセイ試薬で測定した。
【０１５２】種々のプロテアーゼに対するＡ４インヒビ
ターのＫｉ値は、基質の加水分解の初期速度のラインウ
ィーバー・バークブロットから求め、表１に示した。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】このＡ４インヒビターはヒトの血漿からプ
ラスミン（Ki = 7.5 x 1C-11 M)、 およびラットの肥満
マスト紬胞からのトリプターゼＭ（Ki = 2.2 x 1O
-10M）を強力に阻害した。さらに膵臓トリプシン（Ki =
2.7 x 10-9M）、α-キモトリプシン（Ki = 8.5 x1O
-9M）、並びに血漿および組織カリクレイン（各々 Ki =
7.4 x1 O-8Mおよび 2.8 x 1O-8M）を阻害したが、キマ
ーゼおよび膵臓エラスターゼを阻害することはなかっ
た。第Ｘａ因子（Ki = 2.57 x 1O-6M）をやや阻害した
が、α-トロンビン、ウロキナーゼ、パパインあるいは
カテプシンＢを阻害することはなかった。
【０１５５】実施例１２ トリプシン阻害 トリプシン（３０ｐＭ）を、ウシ血清アルブミン（0.1m
g/m1）を含有する0.1MTris-HC1、pH7.5中で、種々の濃
度（３〜２４ｐＭ）の精製されたＡ４ｉインヒビターと
共に２５℃にて５分間ブリインキュベートした。Boc-Ph
e-Ser-Arg-MCAを基質としてトリプシンの残存活性を測
定した。
【０１５６】精製されたＡ４ｉインヒビターによるトリ
プシン阻害のプロットは、Ａ４ｉインヒビターとのトリ
プシンとの１：１分子反応を示した。
【０１５７】実施例１３ ＩＶの薬学的組成物 0.001％のトゥイーン８０レッド（Tween 80 red）およ
び0.01％〜1％のアルブミンまたはマンニトールを含有
するリン酸緩衝化生理食塩水に上記のＡ４ｉおよび／ま
たはそのアナログを溶解させると、注射に適した静注用
処方が得られる。
【０１５８】実施例１４ 局部用薬学的組成物 薬学的に有効な本発明の局部用組成物は、好ましくは包
帯剤の形態をとる。このような包帯剤は、擦過創を受け
た組織の被覆剤として一般に使用される軟膏に類似した
外用薬的塗布剤である。Ａ４ｉタンパク質および／また
はそのアナログは石油ガーゼに添加することができる。
石油ガーゼは、無菌融解白油を事前に切断した無菌ガー
ゼに、ガーゼ２０グラムに対して石油６０グラムの割合
で添加することによって調製したものである。Ａ４ｉタ
ンパク質またはアナログは、特定の患者の必要に応じた
量だけガーゼに添加され得る。しかし、そのようなタン
パク質の添加量は、一般的にガーゼ２０グラムおよび石
油６０グラムに対して約１〜１０グラムの範囲で比較的
少量である。感染防止を捕助するために包帯剤に局部用
抗性物質成分を添加し得る。
【０１５９】実施例１５ 局部用クリーム 創傷および擦過傷を受けた組織の治療に有用でありかつ
Ａ４ｉタンパク質およびそのアナログとの経皮的および
経粘膜的浸透を得るために有用である局部用クリーム
は、種々の不活性賦形剤材料をＡ４ｉタンパク質および
／またはそのアナログと混合することによって調製でき
る。その割合は一般にタンパク質１〜１０重量％に対し
て賦形剤約９０〜９９重量％である。賦形剤材料は、好
ましくは粘滑薬である。これは、特に粘膜および擦過創
を受けた組織の刺激を緩和するために主として用いられ
る保護剤である。有用な粘滑薬には、粘漿薬、ガム、デ
キストリン、スターチ、特定の糖、多価グリコールがあ
る。粘液自体が天然の粘滑薬である。合成粘液クリーム
は当業者に既知のものであり、局部塗布剤としてタンパ
ク質と結合する賦形剤べ一ス材料として作用し得る。
【０１６０】実施例１６ 眼病用処方 擦過創を受けた眼組織の治療のために、Ａ４ｉタンパク
質および／またはそのアナログを含有する眼病用処方を
調製することができる。そのような眼病用処方が、１〜
１０重量％のＡ４ｉタンパク質および／またはそのアナ
ログを従来のコンタクトレンズ用湿潤液に加えることに
よって調製し得るからである。そのような溶液は水とポ
リビニルアルコールとを含む。ポリビニルアルコールは
コンタクトレンズによって一般に引き起こされる刺激か
ら眼を保護する粘滑薬として作用する。
【０１６１】本発明の作製および使用に関する好ましい
実施態様を記述したが、本発明から逸脱することなく、
種々の変更および改変がなされ得ることは認められる。
【０１６２】以下の培養物は特許を目的に、American T
ype Cu1ture Co11ection (ATCC), Rockvi11e, MD, USA
に寄託されている。バクテリオファージ、ファージλSM
2、λSM2W9、およびλAPCP168i4は、「微生物の寄託に
関する国際的認識に関するブダペスト条約」（ブダペス
ト条約）に規定された条件の下に寄託された。
【０１６３】培養物 受託番号 寄託の日付 λSM2 40729 1986年11月13日 SM2W4 40299 1986年12月29日 SM2W3 40300 1986年12月29日 λSM2W9 40304 1987年 1月29日 λAPCP168i4 40347 1987年 7月 1日 寄託された株が取得出来るということを、自国の特許法
に基づいた、政府の権威の下に保証された権利に違反し
た、本発明を実施する権利ライセンス、であると解釈し
てはならない。
【０１６４】
【発明の効果】 クニッツ（Kunitz）型塩基性プロテア
ーゼインヒビターに関連する疾患を治療するための、Ａ
４ｉプロテアーゼを含有する薬学的組成物およびそのプ
ロテアーゼのアナログを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１−１】 λAPCP168i4と命名された、β-アミロイ
ド関連タンパク質の1-751位のアミノ酸をコードするcDN
Aクローンの塩基配列を示す。Kangらの配列からこのク
ローンを区別する168bp挿入物を下線で示す。
【図１−２】 図１−１の続きである。
【図１−３】 図１−２の続きである。
【図１−４】 図１−３の続きである。
【図２−１】 Mastersらによって記載されたβ-アミロ
イドコアタンパク質の最初の18個のアミノ酸をコードす
る、ゲノムクローンのDNA配列を示す。さらに、それ
は、これらのアミノ酸の直前にある、開始コドンとして
潜在的に使用されると考えられるメチオニンコドンをコ
ードする。
【図２−２】 図２−１の続きである。
【図３−１】 その3'側末端がβ-アミロイドの最初の
４個のアミノ酸をコードする、λSM2W4と命名されたcDN
Aクローンの塩基配列を示す。それはさらに、上述のよ
うに、これらのアミノ酸の直前のメチオニンコドンをコ
ードする。
【図３−２】 図３−１の続きである。
【図４−１】 97個のアミノ酸をコードする、λSM2W3
と命名されたcDNAクローンの塩基配列を示し、これらの
最初の26個は、Mastersらによって記載されたβ-アミロ
イドコアタンパク質のGlu3からAla28の領域に相当す
る。
【図４−２】 図４−１の続きである。
【図５】 塩基配列および、λSM2W4およびλSM2W3から
推定されるβ-アミロイド関連タンパク質の相当するア
ミノ酸配列を示す。
【図６】 λSM2W9β-アミロイドクローンのヌクレオチ
ドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図７−１】 λSM2W3とλSM2W9との配列の比較を示
す。
【図７−２】 図７−１の続きである。
【図８】 λAPCP168i4のmRNA, およびKangらによって
記載されたmRNAの、ヒト脳およびヒト培養細胞から単離
されたRNA'sを用いて、各々の種類に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブにハイブリダイズさせて得られる、
ノーザンブロット上での検出を示す。
【図９−１】 細菌でのβ-アミロイド関連タンパク質
の生産のための、細菌発現ベクターの構築図を示す。
【図９−２】 図９−１の続きである。
【図９−３】 図９−２の続きである。
【図９−４】 図９−３の続きである。
【図１０】 λAPCP168i4によってコードされるタンパ
ク質の発現用組み換えワクシニアウイルス発現ベクター
の構築図を示す。
【図１１】 λAPCP168i4によってコードされるタンパ
ク質の発現用の哺乳類細胞発現ベクターの構築図を示
す。
【図１２】 β-アミロイドコアタンパク質配列のすぐ
上流にコードされるメチオニンが開始コドンとして使用
される場合の、図５に記載きれているβ-アミロイド関
連タンパク質の生産のための発現ベクターの構築を示
す。
【図１３−１】 λAPCP168i4の168bp挿入物にコードさ
れるペプチドの、その多くが塩基性プロテアーゼに対し
て阻害作用を示すタンパク質のスーパーファミリーとの
関連性を示す。そして、
【図１３−２】 図１３−１の続きである。
【図１４】 トリプトファンオペロンプロモーターおよ
びオペレーターの合成配列の構築、およびプラスミドpT
RP233の制限酵素部位地図を示す。
【図１５】 図１5は、β-アミロイド特異性ポリクロー
ナル抗血清を用いる、751個のアミノ酸のβ-アミロイド
タンパク質を産生するCV-1細胞のウェスタンブロット分
析の結果を示す。コントロールは、β-アミロイドをコ
ードする配列を有しないpSC11ワクシニアウイルスであ
る。
【図１６】 プロテアーゼインヒビター配列に融合させ
たompAシグナル配列（図１6A）か、あるいはプロテアー
ゼインヒビター配列に融合させたphoAシグナル配列（図
１6B）のいずれかを有する、キメラ遺伝子の構築に便用
されるオリゴヌクレオチドの図である。星印は、各々の
構築に使用される個々のオリゴヌクレオチドを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年４月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１−１】 λAPCP168i4と命名された、β-アミロイ
ド関連タンパク質の1-751位のアミノ酸をコードするcDN
Aクローンの塩基配列を示す。Kangらの配列からこのク
ローンを区別する168bp挿入物を下線で示す。
【図１−２】 図１−１の続きである。
【図１−３】 図１−２の続きである。
【図１−４】 図１−３の続きである。
【図１−５】 図１−４の続きである。
【図２−１】 Mastersらによって記載されたβ-アミロ
イドコアタンパク質の最初の18個のアミノ酸をコードす
る、ゲノムクローンのDNA配列を示す。さらに、それ
は、これらのアミノ酸の直前にある、開始コドンとして
潜在的に使用されると考えられるメチオニンコドンをコ
ードする。
【図２−２】 図２−１の続きである。
【図３−１】 その3'側末端がβ-アミロイドの最初の
４個のアミノ酸をコードする、λSM2W4と命名されたcDN
Aクローンの塩基配列を示す。それはさらに、上述のよ
うに、これらのアミノ酸の直前のメチオニンコドンをコ
ードする。
【図３−２】 図３−１の続きである。
【図４−１】 97個のアミノ酸をコードする、λSM2W3
と命名されたcDNAクローンの塩基配列を示し、これらの
最初の26個は、Mastersらによって記載されたβ-アミロ
イドコアタンパク質のGlu3からAla28の領域に相当す
る。
【図４−２】 図４−１の続きである。
【図５】 塩基配列および、λSM2W4およびλSM2W3から
推定されるβ-アミロイド関連タンパク質の相当するア
ミノ酸配列を示す。
【図６】 λSM2W9β-アミロイドクローンのヌクレオチ
ドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図７−１】 λSM2W3とλSM2W9との配列の比較を示
す。
【図７−２】 図７−１の続きである。
【図８】 λAPCP168i4のmRNA, およびKangらによって
記載されたmRNAの、ヒト脳およびヒト培養細胞から単離
されたRNA'sを用いて、各々の種類に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブにハイブリダイズさせて得られる、
ノーザンブロット上での検出を示す。
【図９−１】 細菌でのβ-アミロイド関連タンパク質
の生産のための、細菌発現ベクターの構築図を示す。
【図９−２】 図９−１の続きである。
【図９−３】 図９−２の続きである。
【図９−４】 図９−３の続きである。
【図１０】 λAPCP168i4によってコードされるタンパ
ク質の発現用組み換えワクシニアウイルス発現ベクター
の構築図を示す。
【図１１】 λAPCP168i4によってコードされるタンパ
ク質の発現用の哺乳類細胞発現ベクターの構築図を示
す。
【図１２】 β-アミロイドコアタンパク質配列のすぐ
上流にコードされるメチオニンが開始コドンとして使用
される場合の、図５に記載きれているβ-アミロイド関
連タンパク質の生産のための発現ベクターの構築を示
す。
【図１３−１】 λAPCP168i4の168bp挿入物にコードさ
れるペプチドの、その多くが塩基性プロテアーゼに対し
て阻害作用を示すタンパク質のスーパーファミリーとの
関連性を示す。そして、
【図１３−２】 図１３−１の続きである。
【図１４】 トリプトファンオペロンプロモーターおよ
びオペレーターの合成配列の構築、およびプラスミドpT
RP233の制限酵素部位地図を示す。
【図１５】 図１5は、β-アミロイド特異性ポリクロー
ナル抗血清を用いる、751個のアミノ酸のβ-アミロイド
タンパク質を産生するCV-1細胞のウェスタンブロット分
析の結果を示す。コントロールは、β-アミロイドをコ
ードする配列を有しないpSC11ワクシニアウイルスであ
る。
【図１６】 プロテアーゼインヒビター配列に融合させ
たompAシグナル配列（図１6A）か、あるいはプロテアー
ゼインヒビター配列に融合させたphoAシグナル配列（図
１6B）のいずれかを有する、キメラ遺伝子の構築に便用
されるオリゴヌクレオチドの図である。星印は、各々の
構築に使用される個々のオリゴヌクレオチドを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ 5/10 ＡＣＢ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/99 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 593215117 2450 ＢＡＹＳＨＯＲＥ ＰＡＲＫＷＡ Ｙ，ＭＯＵＮＴＡＩＮ ＶＩＥＷ，ＣＡＬ ＩＦＯＲＮＩＡ 94043，Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ジェームズ ダブリュー． シリング アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301 パロ アルト，バイロン ストリート 247 (72)発明者 勝沼 信彦 徳島県徳島市蔵本町３

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】炎症を抑制するための薬学的に許容可能な
    組成物であって、薬学的に許容可能な担体；配列 【化１】 のタンパク質；および該配列中の１３位のアルギニンで
    あるアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているタンパク
    質アナログ；を含有する、組成物。
  2. 【請求項２】セリンプロテアーゼ活性阻害を有する、請
    求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記他のアミノ酸が中性の疎水性アミノ酸
    である、請求項２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記タンパク質アナログにより阻害される
    前記セリンプロテアーゼが、エラスターゼであり、そし
    て前期中性の疎水性アミノ酸が、バリンである、請求項
    ３に記載の組成物。
JP9342118A 1989-06-06 1997-11-26 アルツハイマーアミロイドポリペプチドを使用した薬学的組成物および処置方法 Withdrawn JPH1121252A (ja)

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