JPH05500801A

JPH05500801A - アルツハイマーアミロイドポリペプチドを使用した薬学的組成物および処置方法

Info

Publication number: JPH05500801A
Application number: JP2509838A
Authority: JP
Inventors: コーデル，バーバラ; シリング，ジェームズ　ダブリュー．; 信彦勝沼
Original assignee: サイオス　インコーポレイテッド
Priority date: 1989-06-06
Filing date: 1990-06-04
Publication date: 1993-02-18
Also published as: JPH1121252A; EP0477269A4; JP2003192613A; WO1990014841A1; CA2058935C; US5187153A; EP0477269A1; CA2058935A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマーアミロイドポリペプチドを　した゛・８・組　およびル　。

良肚Δ立互本発明は、概して、薬学的組成物の分野およびそのような組成物を種々の疾患を処置するために使用する方法に関する。

詳細には、本発明は、クニツツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型塩基性プロテアーゼインヒビターに関連する疾患を治療するための、Ａ４１プロテアーゼを含有する薬学的組成物およびそのプロテアーゼのアナログに関する。

１１１五アルツハイマー病の人口統計学は次箪によく理解されつつある。統計によると、６５才以上のアメリカ人の５％を超える人々、および８５才以上のアメリカ人の１５％を超える人々がこの疾患で苦しんでいる（Ｃｒｏｓｓ、　Ａ、Ｊ、、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　（１９Ｂ２）８２ニア７−８０＋　Ｔａｒｒｙ、Ｒ，Ｄ、ら、＾ｎｎ　Ｎｅｕｒｏ！　（１９８３＞　１４：４９７−５０６）。

老人の長期看護施設での幽閉はこの疾患に起因し、専門の看護施設で死亡する人々の約６５％がこの疾患をわずらっていると思われる。

残念なことに、現在のところ、治療は実験的なものであり、診断も信転性がない。直接的な診断部がなく、示されている徴候に対して別の説明がなされる、陰性の結果に基づく一連の評価によって診断がなされている。死後の脳の生検によってこの疾患の存在が正確に査定され得るとすると、最近の結果は、生存者における現在の診断法では約２０％の割合の偽陽性があることを示す。

アルツハイマー病の存在を診断する直接的なアッセイ法を有することは、患者の適切な看護を可能にし、治療法を開発するのに非常に有用である。以下に述べる本発明は、この診断法を開発することを提供する。

アルツハイマー病の存在に伴う、生化学的および代謝的現象に関するある種の事実が知られている。アルツハイマー病の脳に見られる形態学的および病理組織学的な２つの変化は、神経原線維変化（ＮＦＴ）およびアミロイドの沈着である。

神経細胞内の神経原線維変化は他の退行性疾患にも存在するが、神経細胞間（軸索斑、ｎｅｕｒｉｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ）および毛細血管系周囲（血管斑、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐＬａｑｕｅｓ）の両方でのアミロイド沈着物の存在は、アルツハイマーの特徴と考えられる。これらのうちで、軸索斑に最も多く罹患しているようである（Ｐｒｉｃｅ、Ｄ、Ｌ、ら、Ｄｒｕ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８５）　ｉ：５９−６８）。

老人斑はまた、アルツハイマー病が進行する老齢のダウン症患者の脳にも見られる。

これらの老人斑の塊を構成するタンパク質は、部分的に精製され、配列が決定されている。死亡したアルツハイマー病患者の老人斑の多い脳が、本明細書文に「 β−アミロイドコアタンパク質」として引用する、約４．２ｋｄの「コア」ポリペプチド、アミロイドプラークコアタンパク質（ＡＰＣＰ）を抽出するのに使用されて来た。このペプチドはＧｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、らによって、β−タンパク質と命名された（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ（１９８４）　１２０：８８５−８９０）　ｏ　アミノ末端のアミノ酸配列は決定されており（Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、ら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　（１９８４）　１２２＋１１３１−１＋３５；　Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ，Ｌ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ　（１９８５）　８２：４２４５−４２５９）、２つのグループにより報告されているアミノ酸配列は、Ｇｌｅｎｎｅｒらが、アルツハイマー病大脳血管のアミロイドの１１位をグルタミンであるとしているのに対し、Ｍａｓｔｅｒｓらは１１位をグルタミン酸としていること以外は、同一である。さらに、前者は、大脳血管のアミロイドは独特のアミン末端を有すると報告しているが、後者は、アミロイドファブラークに見い出される形態は「不ぞろいの」アミノ末端を有する、すなわち、この原料から単離されたペプチドは、３．７、あるいは８位のアミノ酸がアミン末端から欠失していると報告している。両方のグループは、同じペプチドがアミロイドプラークコアおよび成人ダウン症をわずらっている人々の血管アミロイドに見い出されることを示し、１１位がグルタミン酸であると報告している。

β−アミロイドコアタンパク質に関するさらなる研究もまた、Ｒｏｈｅｒ、＾、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８６）　８３：２６６２−２６６６によってなされ、それは、タンパク質の完全なアミノ酸組成を示し、既知のタンパク質のそれのいずれとも相同しないことを証明した。しかし、得られた構成成分は明かにＡ１１ｓｏｐ。

Ｄ、ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　（１９８３）　２５９：３４８３５２のそれとも、Ｇ！ｅｎｎｅｒあるいはＭａｓｔｅｒｓ　（上述）により公表されたものとも一致しない。

Ｗｏｎ　ｇ、　Ｃ，Ｗ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：８７２９−８７３２は、Ｍａｓｔｅｒｓ　（上述）によって記載されたβ−７ミロイドフアタンパク質の最初の１０個のアミノ酸に相同する合成ペプチドがマウスで抗体を引き起こし得、これらの抗体がアミロイドが沈着している大脳血管の染色のみでなく、軸索斑の染色にも使用され得ることを示した。これらの結果は、Ａｌ１５ｏｐ、Ｄ、ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８６）　６８：２５２−２５６により、８−１７位のアミノ酸に相当する合成ペプチドに対するモクローナル抗体用いて確認された。従って、アルツハイマー病患者の脳の様々な位置に見られる斑タンパク質は概して、免疫反応性において類似するようである。洗浄剤およびカオトロピックエージェントのような一般に使用される多（の変性剤によって可溶化が達成され得ないことに示されるように、それは非常に不溶性である（Ｍａｓｔｅｒｓ、上述、Ａ１１ｓｏｐ、Ｄ、ら、上述）。

ある種の他のアミロイドタンパク質からの類推によって、β−アミロイドコアタンパク質は、末梢循環系あるいはリンパ系で前駆体から形成され得ると考えられている。アミロイドタンパク質の前駆体タンパク質の性質が知られている、既知の疾患関連アミロイド沈着物が６例ある：原発性アミロイド沈着物では、原料は免疫グロブリンのし鎖であり；続発性アミロイド−シスでは、前駆体はアミロイドタンパク質であり；家族性アミロイド多発性神経障害および老人性心性アミロイド−シスでは、プレアルブミンあるいはその変異体であり；甲状腺の髄質癌では、プロカルシトニンフラグメントであり；そして、遺伝性脳出血ではγ−トレースフラグメント（ｇａｍｍａ−ｔｒａｃｅ　ｆｒａＢｅｎ）　ｔである（例えば、Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、　■Ｌ■１」ｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９８０）　３０２：１２８３；　５ｌｅｔｔｏｎ、Ｋ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８１）　１９５：５６１；　Ｂｅｎｄｉｔｌら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　（１９７１）＋９：１６９；　５ｌｅｔｔｏｎ、Ｋ、ら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９７４）　４１：１１７；　５ｌｅＬｔｏｎ、に、ら、Ｌムｌ工赳（１９７６）　＋４３：９９３）。前述はリストの一部であり、甲状腺癌のアミロイドの前駆体としてのプロカルシトニンフラグメントに関する参考文献がさらに、少なくともいくつかある。一方で、あるいはさらに、そのようなβ−アミロイドコアタンパク質の前駆体は脳で産生され得る。

大きなタンパク質の構造内にβ−アミロイドコアタンパク質配列を有するタンパク質が存在することが報告されている（Ｋａｎｇ、Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２５ニア３３−７３６）。β−アミロイドコアタンパク質のインビボの潜在的前駆体であるこのタンパク質は、ヒト胎児脳組織ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンの配列から予想され、それは、β−アミロイドコアタンパク質のアミノ末端は５９７位から始まる、６９５個のアミノ酸配列からなる。上述した一連のことから類推すると、そのような前駆物質あるいはそのフラグメントは、アルツハイマー病患者の血清中に、罹患していない人と比較して区別し得るレベルで循環している。一方で、あるいはさらに、そのような差が脳を髄液中に検出し得る。

本発明に記載の新規な前駆体タンパク質の発見以来、類似のアミロイド前駆体タンパク質（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ旦：５３０−５３２　（１９８Ｂ＞）、またはやや大きい、７７０個のアミノ酸のアミロイド前駆体（Ｔａｎｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２８−５３０　（１９８８））の特性が他者によって記述されている。これらは全て、約５７個のアミノ酸挿入を含む。この特定の挿入配列は、多数のセリンプロテアーゼに特異的な多数のクニツツ型インヒビターとの相同性が高い。

１豆Δ！１５７個のアミノ酸のプロテアーゼインヒビターを含有する薬学的組成物およびこれらの組成物の使用が教示されている。

このプロテアーゼインヒビターは、Ａ４１と記載され、これはアルツハイマー病に関連するものである。Ａ４ｉプロテアーゼに加えて、他のアナログも教示されており、同様に、そのようなアナログを含有する薬学的組成物、およびクニッツ型塩基性プロテアーゼインヒビターに関連する種々の異常の処置におけるこれらの薬学的組成物の使用が教示されている。

例えば、Ａ４ｉプロテアーゼおよびそのアナログを含有する薬学的組成物は、プラスミンおよびトリプターゼを阻害し、さらに膵臓トリプシン、α−キモトリプシン、組織カリクレイン、および血清カリクレインを阻害する。ある疾患は、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼなどのプロテアーゼが循環系中へ全体的に放出することに関連する。したがって、Ａ４ｉおよびアナログを含有する薬学的組成物は、これらのプロテアーゼの活動を阻害し、そのような疾患の処置に使用され得る。

本発明の重要な目的は、プロテアーゼの放出に関連する疾患を処置するための認可された方法を提供することである。

この方法には、そのような疾患に苦しむ患者に、アミノ酸配Ｉ　ｌｅＳｅｒＡｒｇＴｒｐＴｙｒＰｈｅＡｓｐＶａｌＴｈｒＧｌｕＧｌｙＬｙｓＣｙｓＡｌａＰｒｏＰｈｅＰｈｅＴｙｒＧｌｙＧｌｙｃｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｎＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＡｓｐＴｈｒＧ１ｕＧｌｕＴｙｒＣｙｓＭｅｔＡｌａＶａｌＣｙｓＧｌｙＳｅｒＡｌａＺ　ｌｅであるタンパク質（またはそのアナログ）の薬学的に有効なＩ８投与することが含まれる。

本発明のさらに池の重要な目的は、上記のタンパク質と組み合わせて、薬学的に許容可能な担体および賦形剤材料を含有する薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに池の重要な目的は、繊維素溶解阻害活性を有している薬学的に許容可能な組成物を開示、および記載することである。これらの組成物は、繊維素溶解阻害に有効な責の上記のタンパク質と共に、薬学的に許容可能な担体および賦形剤材１′−１を含有する。

本発明の他の重要な目的は、薬学的組成物を提供すること、および被験体の創傷部位におけるフィブリン溶解を不活性化して創傷修復を促進するために有用であるこれらの組成物を使用する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、１ｌｒｌ栓溶解性を宵する薬学的組成物を提供することである。これらの組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤材料と組み合わせて、血栓溶解に有効な量の上記タンパク質を含有する。

本発明の重要な特徴は、本発明の薬学的組成物が疾患に関連する広範囲の生化学的反応の阻害に有用であることである。

本発明の利点は、本発明の組成物に使用されるタンパク質が毒性が無く、そして望ましくない副作用をもたらさないことである。

本発明のこれらの目的および他の目的、利点および特徴は、本明細書の一部を構成する添付の図面、並びにＤＮＡおよびアミノ酸配列を参照しつつ、以下にさらに詳述される構造、合成、処方、および使用法の詳細を読むに従って当業者に明らかとなるであろう。

区ｊ目口４座」己【吸図１は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４と命名された、β−アミロイド関連タンパク質の１−７５１位のアミノ酸をコードするｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。Ｋａｎｇらの配列からこのクローンを区別する１６８ｂｐ挿入物を下線で示す。

図２は、ＭａＳｔｅｒＳらによって記載されたβ−アミロイドコアタンパク質の最初の１８個のアミノ酸をコードする、ゲノムクローンのＤＮＡ配列を示す。さらに、それは、これらのアミノ酸の直前にある、開始コドンとして潜在的に使用されると考えられるメチオニンコドンをフードする。

図３は、その３゛側末端がβ−アミロイドの最初の４個のアミノ酸をフードする、λ５Ｍ２Ｗ４と命名されたｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。それはさらに、上述のように、これらのアミノ酸ノ直前のメチオニンコドンをコードスル。

図４は、９７＠のアミノ酸をコードする、λ５Ｍ２Ｗ３と命名されりｃＤＮＡクローンの塩基配列を示し、これらの最初の２６個は、Ｍａｓｔｅｒｓらによって記載されたβ−アミロイドコアタンパク質のＧＩＬ１３からＡｌａ２ｓの領域に相当する。

図５は、塩基配列および、λ５Ｍ２Ｗ４およびλ５Ｍ２Ｗ３から推定されるβ− アミロイド関連タンパク質の相当するアミノ酸配列を示す。

図６は、λ５Ｍ２Ｗ９β−アミロイドクローンのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。

図７は、λ５Ｍ２Ｗ３と１５Ｍ２Ｗ９との配列の比較を示す。

図８は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４のｍＲＮＡ、およびＫａｎｇらによって記載されたｌｌｌＲＮＡの、ヒト脳およびヒト培養細胞から単離されたＲＮＡ’ｓを用いて、各々の種類に特異的なオリゴヌク１／オチドブローブにハイブリダイズさせて得られる、ノーサンプロット上での検出を示す。

図９は、細菌でのβ−アミロイド関連タンパク質の生産のための、細菌発現ベクターの構築図を示す。

図１０は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４によってコードされるタンパク質の発現用組み換えワク／ニアウィルス発現ベクターの構築図を示す。

図１１は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４によってフードされるタンパク質の発現用の哺乳類細胞発現ベクターの構築図を示す。

図１２は、β−アミロイドコアタンパク質配列のすぐ上流にコードされるメチオニンが開始コドンとして使用される場合の、図５に記載されているβ−アミロイド関連タンパク質の生産のための発現ベクターの構築を示す。

図１３は、λＡＰＣＰＩ６８ｉ４の１６８ｂｐ挿入物にフードされるペプチドの、その多くが塩基性プロテアーゼに対して阻害作用を示すタンパク質のスーパーファミリーとの関連性を示す。そして、図１４は、トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーターの合成配列の構築、およびプラスミドｐＴＲＰ２３３の制限酵素部位地図を示す。

図１５は、β−アミロイド特異性ポリクローナル抗血清を用いる、７５１個のアミノ酸のβ−アミロイドタンパク質を産生ずるＣＶ−１細胞のウェスタンプロット分析の結果を示す。コントロールは、β−アミロイドをコードする配列を有しないｐｓｃｔｔワクシニアウィルスである。

図１６は、プロテアーゼインヒビター配列に融合させたｏｍｐＡシグナル配列（図１６Ａ）か、あるいはプロテアーゼインヒビター配列に融合させたｐｈｏＡシグナル配列（図１６Ｂ）のいずれかを宵する、キメラ遺伝子の構築に使用されるオリゴヌクレオチドの図である。星印は、各々の構築に使用される個々のオリゴヌクレオチドを示す。

１丑立２豊旦笠皿プロテアーゼイノヒビターおよびそのアナログを含有する本発明の薬学的組成物並びにその組成物を使用する方法を記載する前に、本発明が、記載する特定の処方または使用に限定されるものではないことを理解されたい。そのような処方および使用は、当然変更され得るからである。さらに、本明細書で使用される用語が特定の実施態様のみを記載するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。本発明の範囲は添付の請求の範囲にのみ限定されるからである。

本明細書および添付の請求の範囲に使用されているように、単数の形態である” ａ”、′　”、および”ｔｈｅ″は、　ｎ文脈において明らかに他の指示がない限り、複数の意味も含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、′ａ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　［ｎｈｉｂｉｔｏｒ”　（プロテアーゼインヒビター）という表現は、複数のそのようなプロテアーゼインヒビターの混合物を包含する。ａｎ　ａｎａｏｇ　ｏｆ　ａｎ　ｔｎｈｉｂｉｔｏｒ”　（インヒビターのアナログ）という表現は、複数のそのようなアナログの混合物を包含し１．。”　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｕｓｅ″ 　（使用方法）という表現は、当業者に既知であるような慢数の方法または本開示を読むに従って当業者に明らかとなるであろう複数の方法を包含する。

Ａ、Ｕ糞本明細書文に使用されるように、「β−アミロイドコアタ（＋９８５）　８２：４２４５−４２４Ｈ：　ヨＴ　ｋ！ｒ！されタタンパク貫を意味し、本明細書文でｒＭａｓｔｅｒｓら」として引用される。この約４ｋＤのタンパク質は、わずかに異なるアミノ末端を有する４つのペプチドの混合物として、配列分析によりアミノ末端において定義され、３つの小さいペプチドのアミノ末端は最も大きいペプチドのアミン末端に完全にコードされている。最も長い形態の最初の２８＠のアミノ酸は；入５ｐ１−人Ｌａ２−Ｇｌｕ３−Ｐｈｅ４−人ｒｇ５−Ｈｉｓ６−人ｓｐ７−５ｅｒＢ−ＧＬｙｇ−Ｔｙｒｌ□−Ｇｌｕｌ　１−Ｖａｌｌ　２−Ｈｉｓｌ　３− Ｈｉｓｌ　４−ＧＬｎｌ　５−Ｌｙｓ　１６−Ｌｅｕｌ　７−ＶａｌＩ　Ｂ−？ｈｅ１ｇ−Ｐｈｅ２□−人１ａ２１Ｇｌｕ２２−人５ｐ２３−Ｖａ１２４−Ｇｌｙ２５−５ｅｒ２６−５ｅｔ２７−人１ａ２Ｂ。

「β−アミロイド関連タンパク質あるいはβ−アミロイド関連ペプチド」を、それらの配列内に、上述で定義されたβ−アミロイドコアタンパク質の配列、あるいは上述で定義されたβ−アミロイドコアタンパク質の配列を必ずしも含まないようなタンパク質を有するタンパク質と定義する。１例として、この用語はＫａｎｇ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９Ｂ？＞　３２５ニア３３−７３６によって記載され、ここに「Ｋａｎｌら、１として定義するタンパク質に言及するのに使用され、それはその構造内の６９５ｇのアミノ酸のタンパク質の５９７位にβ −アミロイドコアタンパク質を有する。

別の例として、この用語は、図１に示すλ＾ＰＣＰ１６８ｉ４によってコート′ されるタンパク質を言い、その構造内の７５１ｆｆｌの′ｒアミノ酸タンパク質の６５３位にβ−アミロイドコアタンパク質を有する。

「免疫原性β−アミロイドコアペプチド」あるいは「免疫原性β−アミロイド関連ペプチド」とは、そのアミノ酸配列が、β−アミロイドコアタンパク質あるいはβ−アミロイド関連タンパク質のある領域に相同し、免疫した動物で抗体反応を引き起こし得るペプチドを言う。

「アルツハイマー病の遺伝的素質」とは、アルツハイマー病患者、あるいは′アルツハイマー病になる運命にある人のゲノムには見い出されるが、正常なく無病の）人にはない、同定可能な遺伝子の変異あるいは変化を言う。

本明細書において使用されるｒＡ４ｉＪは、バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ｉ４由来のポリヌクレオチドによりフードされる、新規なセリンプロテアーゼインヒビターに対応するポリペプチドを言う。Ａ４ｉポリペプチドは必ずしも物理的にこのバクテリオファージの発現生成物由来のものであるとは限らず、ペプチド合成、組み換えＤＮＡ技術またはこれらを組み合わせたものなど、池の方法で生成され得る。

「対応する（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）　Ｊとは、指定の配列に相同であるかまたは実質的に同等であることを意味する。

Ｂ、貼」１丑 β−アミロイドコアタンパク質あるいはβ−アミロイド関連タンパク質に相当するＤＮＡは、診断におけるプローブとして有用である。β−アミロイド関連タンパク質配列の一部をコードする配列、および隣接する非コード領域を含むβ−アミロイドコアタンパク質配列を有する、いくつかのＤＮＡをここに開示する。これらのＤＮＡ配列の全部あるいは部分は、無処置のプローブか、あるいはフラグメントのいずれかとして、診断に有用である。

特に、本発明は、図１に記載のヌクレオチド配列およびそれに相当する推定アミノ酸配列を含有する、β−アミロイド関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する。このＤＮＡ配列は、β−アミロイドコアタンパク質を含有する、約８２．６１０ダルトンのタンパク質をコードする。

図１に記載の、このβ−アミロイドタンパク質ｃＤＮＡ配列は、バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ｉ４から単離し得る。このヒト線維芽細胞ｃＤＮＡクローンは、ＳＶ４０で形質転換された線維芽細胞＜　５ｖａｏ）から標準法を用いて λｇｔｌｏ中に調製された、ｃＤＮＡライブラリーから得られた（Ｔｏｄａｒｏ、　Ｇ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９６６）１５３：１２５２−１２５４）。ｌ　ｇｔｌＯ−ＳＶ８０　ライブラリーは、標識ｔ　’Ｊゴヌクレオチドの混合物でスクリーニングされた。β−アミロイド関連配列を含有する２つの独特のファージが得られた；これらのβ−アミロイド関連配列をプラスミドベクターにサブクローニングし、その配列分析は、１６８ｂｐの挿入物が存在すること以外は、Ｋａｎｇらのβ−アミロイド関連タンパク質をコードする配列と共直線性（ｃｏ−１ｉｎｅａｒ）であることを示した。１６８ｂｐの挿入物はＫａｎｇらの配列のＶａｌｚｓｓのコドンを妨害し、その結果λＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパク質からこのアミノ酸が欠失する。ｔａａｂｐ挿入物は、妨害されたＶａ１２ｓｓコドンで増えた３ｂｐとともに、図１に下線で示される、新しい５７個のアミノ酸をコードする。このｔｌ入物の下流の図１の６５３位のコドンに、Ｍａｓｔｅｒｓらによって記載されたβ−アミロイドコアタンパク質のアミン末端のアスパラギン酸が位置する。λ＾ＰＣＰ１６８ｉ４クローンは、二９８７年７月１日にＡＴＣＣに受託番号４０３４７として寄託された。

特に有用なのは、λＡＰＣＰ１６８ｉ４中の５７個のアミノ酸をコードする配列、およびＫａｎｇらのβ−アミロイド関連タンパク質配列の「連結部位」の相当部位をコードする配列である。

例えば、１つの好ましい実施！Ｊ様は、上述で同定されたタンパク質の２８９位から３４５位の配列に相当するアミノ酸配列を有する、β−アミロイド関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する。従って、この実施態様は、アミノ酸配列が；であるβ−アミロイド関連クンバク質を包含する。

任意のフラグメントを含むこの特定のペプチドは、報告されている他の影響から本明ｉ［ｌＩＦ文のβ−アミロイド関連タンパク質を区別する。

別の好ましい実施響様において、本発明は、ＤＮＡ配列、および図１に記載のβ −アミロイド関連配列の２８４−Ｖａｌｚｓｓ−（２８９−３４５＞−３４９のアミノ酸配列に相当する推定アミノ酸配列を有する、β−アミロイド関連タンパク質を開示する（ここでは２８９位から３４５位の配列の欠失を意味する）。この特異的な領域に広がるオリゴヌクレオチドは、Ｋａｎｇらによって記載されているβ−アミロイド関連タンパク質の遺伝子変異体と、本発明のβ−アミロイド関連クンバク質とを区別する、タンパク質特異的診断試薬の生成に有用であろう。従って、この実施態様は、アミノ酸配列が；Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入１ａであるβ−アミロイド関連クンバク質を包含する。このペプチドの配列内に含まれる小さいペプチドもまた、有用であるかもしれない。

１６８ｂｐの挿入物および、Ｋａｎｇらが記載したβ−アミロイド関連タンパク質のこの領域の連結部位に特異的なオリゴヌクレオチドは合成され得、これらの２つの興なるタンパク質の■ＲＮＡの発現レベルの比較に使用し得る。例としては、オリゴ：２７３４と命名された、＋６８ｂｐの挿入物に特異的なオリゴヌクレオチド；および、連結部位に特異的なオリゴ：２７３３と命名されたオリゴをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ合成機でのホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉＬｅ）法を用いて合成した。

「連結部位」オリゴは、挿入物のいずれかの側の末端の１５ｂｐに相捕的であり、公表されているβ−アミロイド関連タンパク質配列とλＡＰＣＰ１６８ｉ４配列とを、１　ｓｂｐの完全な相補は不安定であるが、３０ｂｐの完全な相補は安定である、当業者の知るところのＰ！興的ハイブリダイゼーシッンの条件で、区別するのに使用される。これらのオリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、あるいは特異的配列の発現レベルを測定する７ノセイとして種々の原料からのｍＲＮＡのスクリーニングに使用される。

以下に述べる別の例は、アルツハイマー病の軸索斑における特徴である、β−アミロイドタンパク質配列の最初の１８個のアミノ酸（Ｍｅｃを念める！＝　１９１１？ｉｌ）をコードするゲノム配列である。クローンは、えＣｈａｒｏｎ　４へ中にＬａｖｎ、Ｒ，Ｍ　ら、Ｃｅ１ｌ　（１９７ｆｔ）　ｌｓ：１１５７−１１７４ｉ二Ｓ己載のゲ／ムライフ゛ラリ−からｉ専、図２１こ示すように、部分的に配列決定された。示されているように、ゲノムクローンの配列決定された部分は、以前に報告されているβ−アミロイドコアタンパク質の１−１８位のアミノ酸、およびその直前のメチオニンをコードする５７ｂｐのセグメントを含む。

１８位のアミノ酸のコドンの下流では、ゲノム配列は、報告されているβ−アミロイドコアタンパク質のアミノ酸配列から予想される配列と、コドン配列において異なっている。図４の配列にコードされるタンパク質を参照し、当分野で公知の知識を用いてこの領域に隣接する配列を調査することによると、この違いはイントロン配列にあるようである。λＳＭ２と命名されたこのクローンを、１９８６年１１月１３日にＡＴＣＣに寄託した。

ゲノムクローン（図２を参照）由来の旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｒｓａ　Ｉプローブを、標準法に従って、正常なヒト（心筋梗塞で死亡した５５才の男性）の脳の側頭葉および頭頂葉皮質がら、λｇｔｌｏ中に構築したｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡフラグメントを単離するのに使用した。単離した３つのｃＤＮＡクローンを一般的方法で配列決定し、β−アミロイド関連タンパク質をフードする領域を同定するために、３つの可能なリーディングフレームの各々にコードされる各々のアミノ酸配列に相対させた。λ５Ｍ２Ｗ４と命名された、そのうちの１つのクローンは、図３にあるように、β−アミロイドコアタンパク質の５゛末端のＡｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅのアミノ酸をコードする３°末端配列を含有し、それはこのクローンの完全な塩基配列を示す。Ａｓｐ１コドンの直前にメチオニンコドンがある。λ５Ｍ２Ｗ３と命名された２番目のクローンは、β−アミロイドコアタンパク質の３位および４位のアミノ酸をコードする、λ５Ｍ２Ｗ４クローンの３゛末端（ＥｃｏＲＩ制限酵素部位）と６ｂｐのオーバーラツプを有する５ °領域セグメント、およびβ−アミロイド関連タンパク質の残りをフードする９５個のコドンをさらに含有する。λ５Ｍ２Ｗ４およびλ５Ｍ２Ｗ３中の１００個のアミノ酸のタンパク質（Ｍｅｔを含む）のＤＮＡ配列を図５に示す。メチオニンは、たぶん、インビボで処理されること、および、従って、この図に示すβ− アミロイド関連タンパク質が、９９個のアミノ酸配列であり得ることは、もちろん、理解される。

３番目のｃＤＮＡクローンは、図５の３−４４位のアミノ酸領域中の１５個のヌクレオチドおよび４個のアミノ酸の違いによって示される、λ５Ｍ２Ｗ３と異なるβ−アミロイド関連タンパク質の一部をコードする。λ５Ｍ２Ｗ９と命名されたこのクローンのＤ　Ｎ　Ａ　配列および推定アミノ酸配列を図６に示す。λ５Ｍ２Ｗ３との比較を図本明細書に記載するｅＤＮＡクローンは、報告されている β−アミロイドコアタンパク質のアミノ末端配列を有する１００個のアミノ酸の β−アミロイド関連タンパク質である、完全なβ−アミロイド関連タンパク質、および他の所望のタンパク質を得るために発現し得るコード配列の構築を可能にする。これらの配列を、タンパク質の生産のために適当な発現ベクターに挿入し得る。図１のＤＮＡ配列のサブ配列を構築する方法の詳細、およびこの配列の細菌発現ベクターへの挿入を実施例２に示す。

簡単に説明すると、ｐＡＰｃｐＨ８−３と命名された、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ発現ベクターを、図１に記載の６５５位から７５１位のアミノ酸配列からナル融合タンパク質の発現のために構築した。Ｉ）ＡＰＣＰｌｌｇ−３ノ構築は、以下の３つのフラグメントをつなぐことによりなされた：　（１）骨格プラスミド（ｐＢＲ３２２の複製機能部、アンピシリン耐性遺伝子、トリプトファンプロモーターおよびオペレーター、リボゾーム結合部位、β−ガラクトンダーゼの構造遺伝子の７個のアミノ末端コドンとそれに続く６個のスレオニン残基をコードするＤＮＡ、および転写終止シグナルからなる）；（２）図１の配列の６５５位から７２８位のアミノ酸配列をコードする、ＥｃｏＲｌ−Ｈａｅｌｌフラグメント；および（３）図１の配列の７２９−７５１位のアミノ酸配列とそれに続く終止コドンをコードする合成フラグメント。

得られたベクターでＥ、　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０を形質転換し、トリプトファン濃度を下げた後、３−β−インドールアクリル酸を加えて融合タンパク質の発現を誘導した。得られたタンパク質は、一般的な精製法で精製し得、得られた精製物質は診断アッセイ用の抗体産生に使用可能である。

図１に記載のβ−アミロイド関連タンパク質の完全なコード配列の２つのサブフラグメントを、寄託されたλＡＰＣＰ１６８１４クローンから、ワタシニアウィルス発現ベクターである。　ｐｓｃｌｌに挿入してサブクローニングした。得られたベクター、ｐＦＬ４Ｔ４ＢＶの構築を図１Ｏに図説する。簡単に説明すると、図１に記載のタン・ぞり質の６５５７５１位のアミノ酸配列に広がる約１．０６キロベース（ｋｂ）のＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＯＥＭ−３”″（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃより市販）中にクローン化して、ｐ４Ｂ＋と命名された中間体ベクターを作製した。次に、β−アミロイド関連配列の３゛側非コ一ド配列の多くを除くために１）４Ｂ　ｌを旧ｎｄｌｌｌで消化した。得られたベクター、ｐ４Ｂ△Ｒ１をＥｅｏＲＩで消化し、λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の２０８８ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントにライゲートする前に、ｆｉ’ウン小腸アルカリフォスファターゼで処置してｐ４Ｔ４Ｂを作製した。図１に記載の全タンパク質コード配列に広がる２６７８ｂｐのフラグメントを作製するために、このプラスミドをＳｍａ　ｌおよびＸｍｎ　Ｉで消化した。

Ｃｏｃｈｒａｎ、Ｍ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：１９−２３に記載の真核細胞中間発現系（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いる、ａｙ−ｉサル賢臓細胞でのβ−アミロイド関連タンパク質を引き続き発現させるために、このＳｍａｌ−Ｘｍｎｌフラグメントにコードされる遺伝子を、周知のワクシニアウィルスベクター、ｐｓｃｌｌに挿入した。より一般的には、このベクターは、その配列をワクシニアウィルスゲノムに挿入した後、インビボでのタンパク質および抗体産生のために使用される（以下の「抗体作成」の項を参照のこと）。

同様に、哺乳類細胞ベクターを、本明細書文に記載のβ−アミロイドコアタンパク質あるいはβ−アミロイド関連タンパク質の発現に使用し得る。例えば、プラスミドｐｈＧＨ−ＳＶ（１０）　（ＥＰＡ　２１？、８２２．１９８７年４月１５日公開、ここに参考文献として引用する）は、ｐＵｃ８プラスミドの骨格、ｈＭＴ−１１ａ遺伝子プロモーターおよび制御配列、５Ｖ−４０ＤＮＡプロモーターおよびエンハンサ−エレメント、および、ｈＧＨ遺伝子のコーディング部分および３°制御配列を有する。このプラスミドは、ヒト成長ホルモンタンパク質のフード配列を除き、３′−非フード配列および制御配列をプラスミドに結合したまま残すために、Ｂａｍ旧およびＳｍａｌで消化し、Ｂａｍ旧リンカ−で処理され得る。この約５ｉｏｏ塩基対のＤＮＡフラグメントをゲルで精製し、Ｂａｍ旧リンカ−にライゲートする。Ｂａｍ旧による消化、ＤＮＡフラグメントの再精製、および、それに続（ライゲーションの結果、哺乳類細胞発現ベクターを含有し、構造配列および制御配列を有する、ｐＭＴＳＶ４０　ｐｏｌｙＡ　Ｂａｍと命名されたプラスミドを得る。ｐＭＴｓＶ４０　ｐａｌｙＡ　ＢａｎをＢａｌ１１旧で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび４つの全てのｄＮＴＰで修復した後、このベクターは、プラスミドｐ４Ｔ４Ｂの約２６７８ｂｐのＳｍａｌ−Ｘｍｎｌ制限フラグメントを挿入するのに使用し得る。実施例４に記載のように、得られたベクターは次に、ｃＨ０細胞での効果的なタンパク質発現に使用し得る。

さらに、図３に記載の、λ５Ｍ２Ｗ４クローンの配列情報は、λ５Ｍ２Ｗ３クローンに存在する配列と併せて、図５に記載のタンパク質をコードする哺乳類細胞発現ベクターを構築するのに使用される。

分泌されたプロテアーゼインヒビターは、例えばインヒビター活性に対して高いアフィニティーを有するセリンプロテアーゼが結合したセファロースビーズのような、固体に支持されたアフィニティーマトリックスを用いて、細菌培養上清から、生物学的に活性で、再び折り畳まれた、実質上純粋な形態で回収し得る。この使用のための入手可能な酵素には、例えば、セリンプロテアーゼであるトリブ／ンおよびキモトリプ／ンかある。プロテアーゼインヒビターがビーズ上に捕捉されると、約１０から約５０の範囲のｐＨ１好ましくはｐＨ１，２５の低ｐＨｆｆｉ境のような酸性条件を用いて、タンパク質を溶出し得る。溶出されたタンパク質は実質的に純粋である。すなわち、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　（例えば、６０％アセトニトリル１０．１％トリフルオル酢酸溶出用勾配を用いる０４カラム）により、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは、少な（とも９５％が回収される。

Ｄ−良生ユ且災 β−アミロイドコアタンパク質およびβ−アミロイド関連タンパク質に対する抗体は、既知の方法で調製される。合成ペプチドを用いる例として、好適な免疫原性の領域を同定するために、極性および／あるいは荷電アミノ酸残基を有する、少なくとも約１０個のアミノ酸の長さの領域についてタンパク質配列が典型的に分析される。

他の例として、図１に示すＤＮＡ配列を、λＡＰＣＰ１６８ｉ４中の挿入配列、および、Ｋａｎｇらが記載のβ−アミロイド関連タンパク質とこの挿入物との連結部分に相当する配列に特異的なオリゴペプチドを設計するのに使用し得る。例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−＾１ａのような挿入された連結部分に広がるオリゴペプチドは、Ｋ８Ｂらがｌ８載のタンパク質の１、（。

の部分に対して特異的抗血清を生産するために、動物を免疫するのに使用され得る。λＡＰＣＰ１６８ｉ４の配列に関する知識を持たずにＫａｎｇらの配列を調査することは、当分野で公知のいかなる方法によっても、有用な試薬としてこのペプチドを同定するのに必要な情報を提供しないであろう。池の例として、ｔａａｂｐの挿入部分に存在する配列を表すために設計されたオリゴペプチドは、同様の方法で、ＡＰＣＰ１６８ｉ４のタンパク質のこの独特な部分に対する抗血清を生産するのに使用され得る。従って、免疫原性において好適であると同定された部分を、一般的ペプチド合成法によって合成し、キーホールリンビットヘモ／アニンのような、適当な担体タンパク質に共有結合する。抗体は、ウサギなどにおいて、一般的な方法でペプチド／タンパク質複合体に対して産生される。免疫した動物での抗体の存在は、マイクロタイタープレートにコートしてＥＬＩＳＡに使用する、免疫用合成ペプチドに対する免疫反応性のような、標準的な方法によって検出する。

抗体生産の池の方法は、実施例２の、細菌によって生産されたβ−アミロイド関連融合タンパク質を免疫原として使用する。

このタンパク質の免疫原性は、細菌によって生産された融合タンパク質に対する抗血清の免疫反応性によって示される。

さらに他の抗体産生法は、宿主動物への、β−アミロイド関連タンパク質をコードする生の組み換えワクシニアウィルスの接種による。そのような組み換えウィルスは、野生型ワクシニアウィルスと、本明細書文に君己載のｐＦＬ４Ｔ４Ｂ＋／のようなｐＳＣ１ｌ由来のベクターとの、組み換えを含む確立された方法によって作製される。次に、これらの抗体は以下に述べる診断用アツセイに使用され得る。

Ａ４ｉペプチドのような、β−アミロイド関連タンパク質の興なる領域に由来するペプチドに対して特異的な抗体のパネルを、以下に述べるように、アルツハイマー病の診断アッセイに適当な抗体を同定するために、アルツハイマー病患者の血清あるいは脳を髄液中に存在するβ−アミロイド関連タンパク質の免疫反応性に関して、ざらに分析する。

６０診　法および　後診断法図３．４、および６に記載のβ−アミロイド関連タンパク質のＤＮＡ配列は、死亡時にアルツハイマー病の兆候を示していなかった、明かに正常な高齢の男性におもに由来する。図１に記載のλＡＰＣＰ１６８ｉ４中の別のβ−７ミロイド関連タンパク質の配列は培養線維芽細胞に由来する。これらの配列は、アルツハイマー病患者に見い出され、従ってこの疾患の素質に関連するらしい、ゲノム配列中の変異を同定するための基準を提供する。

１、１１呈逝座：アッセイは、被験体のアルツハイマー病の遺伝的素質を決定するのに使用される。これらのテストは、β−アミロイド遺伝子を有する染色体の領域中の多型性を決定するための、患者のＤＮＡとの比較研究に本発明のＤＮＡ配列を使用する。一方で、あるいは同時に、本発明のＤＮＡ配列は、変化を決定するための核酸ハイブリダイゼーション分析に使用され得る。この変化はβ−アミロイド関連タンパク質をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ中の付加、欠失、変異、あるいは置換を含むことを意味する。

アルツハイマー病に相関するβ−アミロイド関連タンパク質配列中の変化は、区別的プローブ結合法によってアッセイし得る。当分野に公知の適当なハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドプローブは相補する配列に結合するが、密接に関連しているが変化している配列には結合しない。

１つのアッセイ法では、被験体がら調製された核酸試料を、所定のハイブリダイゼーション条件で各プローブとハイブリダイズさせ、特異的オリゴヌクレオチドへの結合を試験した。

変化、すなわちアルツハイマー病の素質を、１つのプローブには結合するが、池のプローブには結合しないことによって確認する。プローブ結合法は他の遺伝病に適用されているように、Ｃｏｎｎｅｒ、Ｂ、Ｊ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８３）　８０：２７８−２８２゜さらに、上述のゲノム配列あるいはｃＤＮＡ配列は、アルツハイマー病の遺伝的素質に関連する制限酵素フラグメントの長さの多型性を同定するのに使用し得る。先ず、正常および患者のゲノムの消化試料の両方からの制限酵素フラグメントの長さを同定するために、プローブを使用する。次に、アルツハイマー病に相関する制限酵素フラグメントの長さの変化を標準法による、遺伝的スクリーニングに適用する。それでは、被験体のゲノム材料を目的のく１つ、あるいは複数の）制限酵素で消化し、サザンブロノトでフラグメントのパターンを標識プローブで決定する。

２、縁販広’　Ｆｍ々の池の臨床的アミロイド蓄積スでは、アミロイドを生成するペプチドは、正常に発現される遺伝子産物の変種である。これらのペプチドは異常なタンパク質分解過程か、あるいは１次アミノ酸配列の変化を生む遺伝的障害のいずれかによって変化した。家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）のような、正常な前駆体およびアミロイド生成性変種が循環系に共存する、既知のアミロイド−シスがある。異常な遺伝子産物の発現の異常な組織分布、あるいは、その発現レベル、その配列、あるいはアルツハイマー病におけるそのプロセシングでの、その他のある種の変化は、アミロイド蓄積の病因に関して有意性を有するであろう。

本発明の材料を使用する第一の診断テストは、正常な人と比較シテ、アルツハイマー病患者のβ−アミロイドコアタンパク質あるいはβ−アミロイド関連タンパク質が増加あるいは減少しているかを知るための直接的抗体アッセイである。この方法では、上述のようにして得られた抗体を、アルツハイマー病であるとわかっている人のタンパク質に対する特異的免疫反応性について、スクリーニングする。免疫反応性血清タンパク質の存在は、固定相εＬＩＳＡ法のような標準的イムノアッセイ法により、決定される。

β−アミロイドコアタンパク質あるいはβ−アミロイド関連タンパク質の存在を知るためにアッセイされる体試料は、例えば、血清あるいは脳を１＆Ｉｉ液である。例えば、アミロイドがｇａｍｍａ−ｔｒａｃｅ前駆体から生成される疾患であるアミロイド−シスを伴う遺伝性脳出血では、前駆体はイムノアッセイを用いて、脳を髄液中に検出し得る。この疾手を有する患者の前駆体のレベルは低下しており、このことは、蓄積物形成の間に使い果たされるという結論を導く。前駆体は、脳でつくられ、従って脳を髄液は適当な試料である。

別の診断テストでは、β−アミロイド関連タンパク質をコードするＤＮＡは、適当なｍＲＮＡにハイブリダイズし得るという長所によって、適当な標的細胞中で、β−アミロイド関連タンパク質をコードするｍＲＮＡの合成の増加あるいは減少を検出するためのプローブとして、まさに有用である。この方法の使用を示す例を、以下の実施例５に示す。

３番目の診断アッセイは、精製された組み換えアミロイドタンパク質あるいは合成ペプチドが固体支持体に結合しているような１３ｍ的ＥＬＩＳＡ法を用いて、アミロイドタンパク質に対スる患者の血清中の抗体の検出を可能にする。

Ｆ−之１抜本発明はさらに、アルツハイマー病の改善された治療的処置を提供する。１つの治療的処置が、λＡＰＣＰ１６１１ｉ４中の１６８ｂｐ挿入物にコードされるＡ４ｉタンパク質の配列によって提案される。

１つのタンパク質の関連性の割合を他のものと比較して、Ａ４１タンパク質のアミノ酸配列が、クニノッ型（Ｋｕｎｆｔｚ−ｔｙｐｅ）塩基性プロテアーゼインヒビターとして知られるタンパク質ファミリーに相同であることが、見い出された。３つのクニノツファミリーのタンパク質に対する、挿入タンパク質セグメントの関連性のレベルを図１３に示す。図１３で、（ニ）記号は比較される２つの配列の同一性を示し、　（、）記号は、類似の化学的性質を有するアミノ酸による置換を示す。

比較によって、１文字のアミノ酸コードでＥＶＣ３、、、Ｇ５Ａｌとして表される挿入物配列は、すべてのメンバーのクニツツファミリー（３つのみを例として示す）に対して、その全長にわたって高度に関連性があることが示された。図１３−１および１３−２に示される３つの比較は、　（１）トリプシン、プラスミン、および顆粒球リソソームエラスターゼを阻害する分泌血漿タンパク質である、ヒトトリプシンインヒビター（Ｗａｃｈｔｅｒ、　Ｅ、およびＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、　Ｋ、　Ｈｏ　ｅ−Ｓｅ　ｌｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈ５ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８１）　３６２二Ｈ５１−１３５５ＨＭｏｒｉｉ、　Ｍ、およびＴｒａｖｉｓ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　Ｈｏ　ｅ−Ｓｅ　ｉｅｒ　（１９８５）　３６６：１９−２１）　：　（２）トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびプラスミンを阻害するウシトップシンインヒビター（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、に、およびＷａｃｈｔｅｒ、　Ｅ、、　Ｈｏ　ｅ−Ｓｅ　！ｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　Ｃｈａｍ（１９８３）　３６４：１６７９−１６８７；　Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、Ｋ、ら、Ｈｏ　ｅ−Ｓｅ　１ｅｒ１ユヱ■山二二二（１９８３）旦４：１６８９−１６９６）　；および（３）トリプシン、カリクレイン、キモトリプシン、およびプラスミンを阻害するラン血清塩基性プロテアーゼインヒビター（およびその前駆体）　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　ＳおよびＫｉｎｇｓｔｏｎ、　１．Ｂ、。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｔ　ＵＳＡ）　（１９８３）　８０：６８３８−６８４２）。Ａ４ｉタンパク質配列上のこの関連性の程度に基づく１つの解釈では、λＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパク質のこの領域は、インビボでプロテアーゼインヒビターとしての機能を有する。

アルツハイマー病は、アミロイド斑の形成に関連している。

さらにアミロイドは、β−アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解の結果形成される。Ａ４ｉタンパク質は、β−アミロイド前駆体の開裂を防ぎ、従って β−アミロイドタンパク質の形成を防ぐと信じられている。形成されるβ−アミロイドの量を減らすことで、斑形成を減らし得る。

本発明は、上記の解釈にとられれない。異なる作用機序を介して、同じ結果（斑形成を減少させる）を与え得る、インヒビターの別の作用機序が提案され得る。

Ａ４１タンパク質は、プロテアーゼインヒビターとして作用し得、そして、斑ヲ分解スルプロテアーゼを阻害する。インヒビターに対シテ特異的で、インヒビターのプロテアーゼに対する作用をブロックし得る、ペプチドあるいは特異的抗体（モノクローナルあるいはポリクローナル）のような拮抗物質の投与は、斑が分解されるのを促進し、そして治療的に有用である。

（以下余白）Ａ４ｉイノヒビター、またはペプチドあるいはペプチドでない、他のインヒビターは、軸索斑形成を予防するか、あるいは形成された斑が容易に分解されるのを促進させるような機序によりアルツハイマー病の処置あるいは予防に使用し得る。投与の１つの方法は、粘膜経由輸送のために提供され得るペプチドの経鼻輸送を含み得、従って、胃腸管を避けるため、そこにはいるペプチドの崩ｉが避けられる。経鼻輸送系は、約０．１−ｔｏ％（ｗ／ｖ）の１ｌｆＪｔの範囲のフシジン酸誘導体あるいはポリオキンエチレンエーテルのような１つあるいはそれ以上の賦形剤、および有効量の７ジニバントとともにプロテアーゼインヒビターペプチドを含む溶液を処方することにより、作成され得る。Ａ４ｉの効果は、インヒビターを脳に局部的に輸送する能力に依存するかあるいは影響され得る。脳への輸送が必要な場合、血液−脳関門に関して特別の配慮がなされなければならない。大脳の血管での物質の交換は、毛細血管床での交換とは異なるからである。Ａ４ｉを、血管−脳関門を通過する物質の輸送を高めることが知られている輸送用媒体に付着させることは、有用で有り得る。安定剤、保存剤および通常経鼻輸送系中に存在する他の成分を随意添加し得るロベブチドの量は、その効力および生体内利用能によって変化り、得るが、約０．１−２５％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。

経鼻システムは、ｔｏ−１ｏｏμｌの溶液を、各々の側の鼻孔内に１日に１−４回噴霧することにより投与され得る。しかし、投与はそれより多（でも少な（でもよく、特定の患者の必要性に応じて使用中に調整され得る。他の輸送法には、薬学的に受容し得る賦形剤中のインヒビター溶液が含まれ、ここで、インヒビターは０．１−２５％（ｗ／ｖ）であり、脳髄膵液に、あるいは直接に脳に注入することによって投与される。中枢神経系へのより局所的な投与が好ましいと考えられている。しかし、もし斑が全身的に蓄積する場合、インヒビターは、静脈注入によって投与され得る。さらに、もしインヒビターがペプチドでない場合、経口投与が可能であり得る。

Ａ４ｉタンパク質およびそのアナログは、これらの特異性プロフィールに示されているように、アルツハイマー病の処置以外にも利用能がある。例えば、本発明のＡ４１は、プラスミンおよびトリプターゼを強力に阻害すること、および膵臓のトリプシン、α−キモトリプシン、組織カリクレインおよび血清カリクレインをもまた阻害することが見いだされた。

このインヒビターは、カイメース、膵臓エラスターゼ、α−トロンビン、ウロキナーゼ、パパイン、あるいはカテプシンＢは阻害しなかった。急性肝臓炎では、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼのような消化プロテアーゼの膵臓からの全身性放出がある。１つ、あるいはそれ以上のプロテアーゼインヒビターとともにＡ４ｉを全身的に投与して、これらのプロテアーゼを不活性化することは、膵臓炎を臨床的に処置するのに有用である。

本発明のＡ４ｉインヒビターと約５０％のアミノ酸相同性を有する、ラン由来のプロテアーゼインヒビター、アプロチニンが、動物モデルで臨床的有用性を有することが見い出されている（Ｈ，Ｆｒ１ｚおよびＧ、　Ｗｕｎｄｅｒｅｒ、　ヒ邦」ＩＬｕ（１）、Ｎｏ、４　（１９ｇ３）　ｐｐ、　４７９−４９４）　ｏ　商漂名Ｔｒａｓｙｌｏｌで市販されているウシのインヒビターは、急性肺臓炎に関連する用途のためにヨーロッパに市場がある。Ａ４ｉがランインヒビターに優る一つの利点は、Ａ４ｉは、循環系中ではその大きい前駆体として低レベルで天然に存在することである。従って、Ａ４ｆは、アプロチニンやヒト以外に由来するその他のインヒビターでは起きるかもしれないアレルギーや免疫反応は起こさない。

Ａ４ｆの、プラズマプロテアーゼプラスミンおよびトリブターゼに対する、十分な親和性によって、特異的な凝固因子のインビボでの調節が可能になる。プラスミンは、フィブリンクロットを溶解する（すなわち、繊維素溶解）のに重要であり、一方、トリブターゼは、クロットの形成に関係している。Ａ４ｉの有効量の投与によって、クロット形成およびクロット溶解を調節することができる。

創傷治癒に用いられるフィブリン接着剤は、Ａ４１と置き換わり得るアプロチニンを含む。従って、Ａ４ｉポリペプチドは、創傷治癒が必要な組織の修復の補強に用いられ得る。

Ａ４ｉのプラスミンに対する強力な親和性によって、プラスミンの繊維素溶解活性が妨害されると考えられる。この活性は、Ａ４ｉが接着フィブリン（フィブリン接着剤）に用いられるときに、フィブリンで組織を結合させるため、そして出血箇所を塞ぐために特に効果的であり、手術の裂傷などからの組織の修復の前にそれが溶解するのを防ぐ。

Ａ４ｉポリペプチドのトリプターゼに対する強力な親和性によって、インヒビターが、インビボにおけるプロトロンピノ活性化を阻害し、抗凝結処置に直接有用になる。Ａ４ｉの解離定数は、Ｋｉ＝２．２ＸＩＯ−”である。これは、マスト細胞のトリプターゼのアミダーゼ活性を効果的に阻害することが示されている、マスト細胞トリプスタチン（ｔｒｙｐｓｔａｔｉｎ）がトリブターゼ（ｔｒｙｐｔａｓｅ）に対して示す解離定数として報告されているものと類似である（Ｋｉｄ。

ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６３＋１８１０４−１８１０７　（１９８８））。従って、Ａ４１は、外部から投与される血栓溶解剤として用いられ得る。

一般的に、インヒビター組成物は、非接着性手術用包帯にこの組成物を漫込ませることによって、あるいは代わりに、この組成物を徐放性のマトリックス中に取り込ませ、それを創傷部位にあてがうことによって、創傷部位に適用される。

薬学的組成物は、この精製されたインヒビターから従来法で作られ得る。その際、塩化ナトリウム、グルコース、マンニトール、アルブミン、などの様な添加物を使用する場合としない場合がある。この組成物は、静脈内あるいは動脈内への注射あるいは注入を含む非経口投与に最適である。

得られた組成物は、適する用量で患者に投与され得、そして急性および慢性の、異なる脈管床の血栓塞栓閉塞症を防ぐために予防的に用いられ得る。このような閉塞症は、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症、心筋梗塞形成、発作、動脈塞栓、体外循環、および動静脈バイパス形成などの場合に起こる。この目的のために、Ａ４ｉがトリプターゼに特異的に作用すること、そしてプラスミンのインヒビターとしては十分てないことを保証することか必要である。

癌組織からの癌細胞の遊離におけるプラスミンの関与が観察されている。プラスミン及び他のプロテアーゼのＡ４ｉによる阻害は、腫瘍の成長を十分に減少させるかあるいは防ぐ。

正常組織にも見いだされるプロテアーゼが過剰に作られ、そして組織の炎症および損傷に関与し得る。プロテアーゼ放出の阻害によって、組織の損傷および炎症が減少され得る。

プロテアーゼの放出を引き起こすアレルギー反応もまたプロテアーゼ阻害の処置で影響を受ける。

本発明のＡ４１タンパク質のインヒビターのさらに他の形態が本文に提供される。これらの他の形態は、Ａ４ｉのアナログであって、５７個のアミノ酸プロテアーゼインヒビターである。これらのアナログは、変化したプロテアーゼ特異性を有するインヒビターを産生するのに効果的な、少なくとも１つのアミノ酸の置換を有する。Ｐｌと呼ばれる残基がプロテアーゼインヒビターの特異性を決定するのに主要な役割を果たすことが知られている。本発明の成熟分泌インヒビターでは、このＰ１残基は、トリプシン様活性を有する酵素にこのインヒビターを指し向けるＡ＃＋３である。

そのＰ＋１４基の修飾がインヒビターのプロテアーゼ活性を変化させることが示されているアプロチニン（Ｇｅｂｈａｒｄ、Ｗ、ら、ｉｎ　ＰｒｏＬｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＢａｒｒｅｔｔおよびＳａｌｖｅｓｉｎｍ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｎ、Ｙ、、０ｘｆｏｒｄ：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　１９８６）からの類推で、本発明のインヒビターの部位特異的変異誘発による改変は同様の結果を生む。キモトリブ／ノ活性を有する酵素の阻害促進のためには、本発明のイノヒビターのＡｒｇ＋３を、Ｐｈｅ、　Ｔｙｒｓ　およびＴｒｐのような芳香族アミノ酸で置換する；一方、ヒトエラスターゼ活性を有する酵素を阻害する能力が促進されているインヒビターを作製するためには、Ａｒｇ＋３残基を、Ｌｅｕ、　ＭｅｔおよびＶａｌのような中性の疎水性アミノ酸で置換する。

本発明のプロテアーゼインヒビターのアナログを、当分野で公知のように部位特異的変異誘発法を用いて、所望のアミノ酸をこの位置にコードする特異的コドンを有する、オリゴヌクレオチドから構築する。そのようにして構築されたアナログの所望の活性を、トリプシン、キモトリプシンあるいはエラスターゼのような適当な酵素を、Ｔａｎ、Ｎ、Ｈ，、Ｂｌｏｃｈｅｉ　（１９７７）　１１５＋１５３１−１５４１に記載のトリプシンあるいはキモトリプシンアッセイ、およびＢａｒｒｅＬｔ、　Ａ、Ｊ、（１９８１＞　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｕＰ１１■ｖｏ１．８０．　Ｌ、　Ｌｏｒａｎｄａ：、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載のエラスターゼアッセイのような、個々のアッセイの１つにおける基準として用いて、アッセイする。アナログの活性は、本発明の天然プロテアーゼインヒビターのそれと比較し得る。トリプシン（Ｋｉ冨３ｙｉＯ−９Ｍ）およびキモトリプシン（８，５ｘｌＯ−’Ｍ）に対する天然プロテアーゼインヒビターの阻害速度論（Ｋｉ）は、ナノモルの範囲にあり、従って、かなり特異的である。

細胞の形質転換、ベクターの構築、メツセンジャーＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製などに使用される技術のほとんどは、当分野で広く行われており、はとんどの技術者は、特定の条件および手順が記載されている標準的原材料に精通している。しかし、便利なように、以下の文節をガイドラインとする。

主および郵御配夕１原核細胞系および真核細胞系の両方を、β−アミロイドコアおよびβ−アミロイド関連配列の発現に使用し得る；もちろん、クローニングの手順には原核細胞宿主が最も便利である。最もよく使用される原核細胞は、Ｅ、　ｃｏユの種々の株に代表される；しかじ、他の微生物株も使用され得る。Ｅ、　ｃｏｌｉ株は、これらのタンパク質をコードする遺伝子を適当なシグナルペプチドと融合させると、β−アミロイドコアおよびβ−アミロイド関連タンパク質ベリプラズマ（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に分泌し得、ＪＥ５５０５のようなりボタンバク貫変異株（Ｋａｎａｍａｒｉ、　Ｔ、　Ｇｅｎｅ　（１９８８）　５６＋２９５−３００＞（７）などのある種（７）　Ｅ、　ｃａｌ　ｉ株は、キメラタンパク質を直接培養液中に分泌する。

宿主に適合する種に由来する、複製部位、選択可能なマーカーおよび制御配列を宵するプラスミドベクターが使用される；例えばＥ、　ｃｏｌｉは、Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　（１９７７＞　２−：９５によるＥ、　ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて典型的に形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピンリンおよびテトラサクリン耐性遺伝子を有し、従って、所望のベクターの構築で保持されるか、あるいは破壊される、複数の選択可能なマーカーを提供する。ここで、随意にオペレーターを有する転写開始プロモーターを、リボゾーム結合部位配列とともに含むと定義されている、一般的に使用される原核細胞性制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　１９８：１０５６）、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、■虹ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　８：４０５７）、およびラムダ由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボゾーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２：１２８）のような一般的に使用されるプロモーターが含まれる。

他の原核細胞性制御配列には、ペリプラズマへのタンノくり質の分泌を導くシグナル配列が含まれる。一般に使用される細菌シグナルペプチドには、本発明のプロテアーゼインヒビター配列に融合し得るｏｍｐＡ　（Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｎｕｃ　ｅｔｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８１）　ｉ：５６７１−５６７１１）およびｐｈｏＡ　（ＢａｃｋおよびＢｒｅｗｅｒ、　ＮｕｃＩｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　ｊｊ：３０１１−３０２４）シグナルペプチドが含まれる。

細菌に加えて、酵母のような真核細胞性微生物もまた、宿主として使用し得る。

多くの他の株あるいは種が一般に入手可能であるが、江二加二１匹且ｃ　ｅ　ｒ　ｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａ　ｅの実験株、ノくン酵母が最も使用される。例えば、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　１０１：３０７の２７１復製開始点、あるいは池の酵母に適合する復製開始点く例えばＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２８２：３９．　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ、　Ｇ、ら、Ｇｅｎｅ　（１９８０）　ｌｏ：１５７およびＣ１ａｒｋｅ、Ｌ、ら、鼠ｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　＋０１：３００）を使用するベクターが使用され得る。酵母ベクターの制御配列には、解糖酵素合成のプロモーター（ｌｌｅｓｓら、Ｊ　Ａｄｖ　ＥｎｚＥ１ユ４．！、　（１９６８）　７：１４９；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅ肚旦互（１９７８）　ｊ７：４９００）が含まれる。さらに、当分野で公知のプロモーターには、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８０＞　２５５：２０７３）が含まれる。

成長条件および／あるいは遺伝的背景に制御される転写の利点をさらに有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、α因子系、および、マルトースおよびガラクトース使用に責任のある酵素のプロモーター領域である。さらに、終止配列がコード配列の３°末端にあることが望ましいと考えられる。そのような終止配列は、酵母由来の遺伝子のコード配列に続り３゛非翻訳領域に見い出される。

もちろん、ポリペプチドをコードする遺伝子を、多細胞性生物由来の培養真核宿主細胞中で発現することもまた可能である。例えばＡｘｅｌら、アメリカ合衆国特許Ｎｏ、　４，３９９，２１６を参照のこと。これらの系は、イントロンを切除し得る長所をさらに有し、従って、ゲノムフラグメントを発現するのに直接使用し得る。有用な宿主細胞株には、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ）１０）細胞が含まれる。

そのような細胞の発現ヘクターには通常、哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列、例えば一般的に使用される５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０　（ＳＶ　４０）　（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７ユ：１１３）の早期および後期プロモーター、あるいは、ポリオーマ、アデノウィルス２、ウンバピローマウイルスあるいはトリサルフーマウイルス由来のプロモーターのような、他のウィルスプロモーターが含まれる。制御可能なプロモーター、ｈＭＴｌｌ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ呟Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９ニア９７− ８０２）も使用され得る。哺乳類細胞宿主系形質転換の総説がＡｘｅｌによって記載されている（上述）。さらに「エンノーンサー」領域も、発現を最適にするのに重要であると現在では考えられる。これらは概して、非コードＤＮＡ領域中のプロモーター領域の上流あるいは下流に見い出される配列である。ｙＩＬ！！開始点は、必要ならば、ウィルス性原料から得られ得る。しかし、染色体への取り込みが真核細胞でのＤＮＡ複製の一般的機序である。

覧１ｋＡ用いる宿主によって、形質転換はその細胞に適した標準技術を用いて行われる。

Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ■ＳＡ＞　（１９７２）　６９：２１１０に記載されているような、塩化カルシウムを用いてのカルシウム処理、あるいは、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａＬｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、２５４および）Ｉａｎａｈａｎ、　Ｄ、、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）出：５５７−５８０に記載されているＲｂＣ１２法が、実質的に細胞壁を有する原核生物あるいは他の細胞に対して用いられる。このような細胞壁のない哺乳類細胞には、必要に応じてＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　（１９７９）　＋６：７７７−７８５により改変された、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　■胆茂■（１９７８）　５２：５４６．のリン酸カルシウム沈降法が、用いられ得る。酵母の形質転換は、Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７５：１０４−１０９あるいはＨｉｎｎｅｎ。

Ａ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７８）　７５：１９２９の方法に従って行われ得る。

ニムムニΔ且且所望のコード配列および制御配列を有する適切なベクターの構築には、当分野でよく知られている標準のライゲーション法および制限酵素法を用いる。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、あるいは合成されたオリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断され、適合され、そして再びライゲートされる。

ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの起源から得られる。骨格となるベクターおよび制御系は、一般には、多くの配列の構築に用いられる、入手可能な「宿主」ベクターに入っている。適切なコード配列のために、最初の構築は、通常はそうであるが、ｃＤＮＡライブラリーあるいはゲノムＤＮＡライブラリーから適切な配列を回収することである。しかし、一旦配列が判ると、別々のヌクレオチド誘導体から出発して、全遺伝子配列をインビトロで合成することが可能である。大きさのわかる長さ、例えば、５００−１０００　ｂｐの遺伝子の、遺伝子全体の配列は、別々の重複する、相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて１本鎖の重複しない部分につけることによって、：Ａ製され得る。このアプローチは、配列の判っている数種の遺伝子の構築にうまく用いられてきた。例えば、Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９１１１）　２９ユニ７５６；Ｎａｍｂａｉｒ、Ｋ、Ｐ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３：１２９９：　Ｊａｙ、Ｅｒｎｅｓｔ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８４）　２５９：６３１１を参照。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｅｄ　ｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（前記）およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　ｉ：１６９１に記載のホスホトリエステル法によって、あるいはＢｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、　Ｌ、　、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ　Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ　（１９８１）　２２：１８５９および、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｄ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９８１）１０３＋３１８５に記載のホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によって調製され、そして商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。　アニーリングの前の１本鎖のキナーゼ処理あるいはｔ！識のためのキナーゼ処理は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５ｍＭ　ジチオトレイトール、１−２ｍＭ　ＡＴＰ、１．７ｐｍ。

ｌ　ｅ、７３２　Ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣＩ／ｍｍｏ　１　ｅ）、０゜１　ｍＭ　スペルミジン、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡの存在中で、過剰のキナーゼ、例えば、基質１　ｎｍｏ　Ｉ　ｅに対して約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて、達成される。

所望のベクターの成分がこのように入手されると、標準の制限酵素法およびライゲート法を用いて、切断されたりライゲートされ得る。

部位特異的ＤＮＡ切断は、適切な制限酵素（あるいは複数の酵素）を用いて、当分野で一般的に理解されている条件、および、商業的に入手可能な制限酵素の生産者が明かにした説明の下に、処理することによって行われる。例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを参照。

一般には、約１μｇのプラスミドあるいはＤＮＡ配列が、約２０μｌの緩衝液中１単位の酵素によって切断される。本明細書の実施例では、典型的には、基質ＤＮＡの完全な消化を確実にするために、過剰の制限酵素が用いられる。変法も用い得るが、約３７℃で約１時間から２時間のインキュベーションが実用的である。各々のインキュベーションの後、フェノール／クロロホルムによる抽出でタンパク質を除去し、次いでエーテルにより抽出し得、そしてエタノールで沈降されて水性画分から核酸を回収した。もし所望であれば、標準法を用いてポリアクリルアミドゲル、あるいはアガロースゲルの電気泳動により、切断した断片をサイズ分離し得る。サイズ分離の一般的な記述は、Ｍｅｔｈ　ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０）６５二４９９−５６０にある。

制限酵素切断された断片は、Ｅ、ｃｏ−ＬＬＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片（フレ／つ）で、４つのデオキシヌクレオチドトリフォスフ、　−ト（ｄｌｌＴＰｓ）の存在の下に、５０ｍＭ　ＴｒｌｓｐＨ７，６，５０ｍＭ　ＮａＣ＋、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６ｍＭＤＤＴ、および０．１−１　０ｍＭ　ｄＮＴＰ中で、２０から２５°Ｃで、約１５から２５分のインキュベーション時間において、処理することによって平滑末端化され得る。

フレノウ断片は、５′側の１本鎖の突出部分を満たすが、たとえ４つのｄＮＴＰが存在しても、３°側の突き出でている１本鎖部分は消化する。必要に応じて、突出の性質による制限内で、ｄ　ＮＴＰの１・つのみ、あるいは選択されたものを供給して選択的な補修がなされ得る。フレ／つでの処理後、混合物は、フェノール／クロロホルムで抽出され、そしてエタノール沈澱される。Ｓ１ヌクレアーゼあるいはＢＡＬ、−３１での、適当な条件下の処理は、１本鎖の任意の部分の加水分解を生じる。

ライゲーションは、下記の標準条件下および温度で１５−５０μｌ容量で行われる。例えば、２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ　ＮａＣ１，および４０μＭ　ＡＴＰ、０．０１１０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、０°Ｃ（ｒ突出末端」ライゲーション用）、あるいは、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、１４ ℃（「平滑末端」ライゲーション用）のいずれか。分子間の「突出末端」ライゲーシヨンは、通常３３−１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ総濃度（５−１００ｎＭ最終総濃度）で行われる。分子間の平滑末端ライゲージ１ンは、１μＭ最終総濃度で行われる。

「ベクター断片」を用いるベクターの構築では、ベクター断片は、普通、５゛のリン酸基を除去して、ベクターの自己ライゲーシヨンを防ぐために、細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）あるいはウシ腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理される。消化は、ｐＨ８において、約１０ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡで、ベクターのμｇ当り、約１単位のＢＡＰあるいはＣＩＰを用いて、６０　’Ｃで約１時間行われる。核酸断片を回収するために、調製物は、フェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱される。あるいは、再ライゲージコンは、ベクターにおいて、さらに別の制限酵素によるダブル消化および不必要な断片の分離によって防ぎ得る。

配列の修飾を必要とするｃ　Ｄ　Ｎ　ＡあるいはゲノムＤ　Ｎ　Ａ由来のベクターの一部に、部位特異的プライマーによる変位誘発が用いられ得る（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ、およっぴＳｍ１ｔｈ、　Ｍ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　（１９８２）　ｌｏ：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、Ｐ、ら、喝（１９８３）　ｉ：１８３−１９３）。このことは、変異させる１本鎖のファージＤＮＡに所望の変異を表す限られたミスマツチング以外は、相補的な合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いてなされる。要するに、その合成オリゴヌクレオチドはアージに相補的な１本鎖の合成をなすためのプライマーとして用いられ、そして得られた部分的なあるいは完全な２本鎖のＤＮＡはファージを維持する宿主細菌中に形質転換される。形質転換された細菌の培養物は、ファージを有する単細胞からプラークを形成するように、寒天の表面に植えられる。

理論的には、新しいプラークの５０％は、１本鎖で、変異体を有するファージを含有する。５０％は、元来の配列を有する。得られたプラークは、キナーゼ処理された合成プライマーとのハイブリダイゼーシ讐ン後に、正確にマツチした結合をなすが、元来の鎖とのミスマ・ノチは十分にふせぎ得る洗浄温度で洗浄される。次に、プローブとハイブリダイズしたプラークは、取り出されて、培養され、そしてＤＮＡが回収される。

１１１ぽ）ｍに下記に示される構築において、プラスミドの構築に適切なライゲージｇンは、Ｄｒ、Ｍ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　（Ｃａｓａｄａｂａｎ、　Ｍ、ら、Ｌ上ｏＩ　Ｂｌｏｉ　（１９８０）　１３１１１７９−２０７）から得たＥ、　ｃｏ旦株ＭＣ１０６１あるいは池の適切な宿主のライゲーシヲン混合物での、まず最初の形質転換により確認される。有用な形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンあるいは他の抗生物質耐性によって選択されるか、あるいは当分野では理解されているような、プラスミドの構築の様式によって他のマーカーを使用して選択される。次に、形質転換体からのプラスミドは、必要に応じて、クロラムフェニフール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、　、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　（１９７２）　＋１０：６６７）後に、Ｃ１ｅｖｅ１１．　Ｄ、Ｂら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ幻η二鈷ニーΩ盈υ−（１９６９）　６２：１１５９の方法に従って調製される。

数個の小さなりＮＡａ製物が、通常用いられる。例えば、ＨＯｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、ら、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８１）　１１４：１９３−１９７およびＢｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９７９）　７：１５１３−１５２３゜単離されたＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｅｔＵＳＡ）　＜１９７７）　７４：５４６３、さらにＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（＋９８１）　！：３０９に記載のジオキシヌクレオチド方法によって、あるいはＭａＸａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０）　５５：４９９に記載の方法によって、制限酵素分析および／または配列分析がなされる。

本発明は、下記の実施例によってさらに説明される。本発明の実施態様の説明のみを提供するものであって、本発明の範囲を制限するようには説明されていない。

失１ヱＤニーアミロイドコアタンパク　および　−アミロイロｌｌＬヱ二り　をコードするゲノムクローンおよびｃＤＮＡクローンΔ！阻Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ　λ−フｒ−ジ中のヒトゲノムライブラリーを、２８個のアミノ酸配列のＮ末端配列の最初の１３個のアミノ酸に相当する、変性した６倍の（ｓｉｘ−ｆｏｌｄ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）　３８　ｍｅｒプローブを用いてスクリーニングした。このプローブ゛は、３’ＣＴＧＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＸＣＣＧＡＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴ−５’である。

ここで、ｌは、イ／ンンであって、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするときに用いると、λＳＭ２と称する、強くハイブリダイズするコロニーを生じた。λＳＭ２　ＤＮＡは単離して、そして図２に示される結果のように一部配列分析した。配列分析した部分は、ケノムライブラリーから単離した、ファージに挿入された約１Ｏ−２０ｋｂの小さな断片のみである。

プローブは、約２０１−２９４位を示すＨｆｎｄｌＩＩ／Ｒｓａｌ断片から構築した。ゲノムプローブを、標準法を用いて、アルツハイマー病でない５５才の男性の脳組織からの、λｇｔｌｏ中に［Ｒしたｃ　ＤＮＡライブラリーを、スクリーニングするために用いた。λ５Ｍ２Ｗ４、λ５Ｍ２Ｗ３およびλ５Ｍ２Ｗ９と称する３つのクローンを、同定した。

１立五主上記のゲノム配列およびｃＤＮＡ配列は、効果的な発現系ニオイて組換えタンパク質を調製するのに用い得る。ゲノムＤＮＡは、哺乳類細胞のようなイントロンをプロセスし得る細胞で用い得る。細菌細胞は、ｃＤＮＡ配列の発現に用い得る。

一アミロイド　タンパク　の　でのおよび　′のＡ、プラスミド　ＡＰＣＰｌ　１８−３のヒトβ−アミロイド関連タンパクｊｆ（６５５−７５１）に対するＥ、　ｃｏｌｉ発現ベクターの構築は、３つのＤＮＡ断片の結合が必要であった。（１）プラスミド骨格（複製機能、アンビアリン耐性遺伝子、トリプトファンプロモーター／オペレーター、リポソーム結合部位、６個のスレオニン残基がついたＥ、　ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼの７ミノ末端をコードするＤＮＡ　（７個のアミノ酸）、および転写終止シグナル）；　（２）図ｌの６５５−７’２８位のアミノ酸をコードするβ−アミロイド関連ＤＮＡの断片、および（３）図１の７２９−７５１位のアミノ酸朽よび終止コドンＵＡＡをコードするβ−アミロイド関連ＤＮＡの合成断片。

上記のプラスミド骨格は、ｐＴＲＰ８３−１由来である。

プラスミドｐＴＲＰ８３−１は、下記の方法で構築した細菌で発現するプラスミドである。

１、Ａトリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーター　節配夕１の　メ図１４に示されている１０個のオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法によって合成し、そして精製した。１と１０以外の、各々５００ｐｍｏｌのヌクレオチドを個々に、６０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ、ｐＨ８，１５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭＭｇＣ１２，２０μＣｉの［λ−３２Ｐ　］　−Ａ　Ｔ　Ｐ、およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ　／　Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２０単位を含有する２０μｌ中で、３０分間３７℃でリン酸化した。その後、さらに、６０ｍＭ　Ｔｒ　ｌ　５−ＨＣＩＳ　ｐＨ８，１５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２，１，５ｍＭ　ＡＴＰおよびさらに２０単位のポリヌクレオチドキナーゼを含有する１０μｌを添加腰　その後３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーンジン後、試料を１００℃で５分間インキュベーションした。オリゴヌクレオチドの１および１０の５００ｐｍｏｌを、ＡＴＰを含まない上記の緩衝液で３０μｌに希釈した。

２本鎖の対をつくるオリゴヌクレオチド（例えば図１４のオリゴヌクレオチド１と２．３と４など）の、各々１６．７ｐｍｏ　ｌを混合して９０℃で２分間インキュベートした後、徐々に室温まで冷却した。次ぎに、各々の対を構築において他のものと組み合わせ、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈澱させた。オリゴヌクレオチド対は、５ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２，２０ｍＭ　ＤＴＴを含有する３０μｍ中で再構成し、５０℃で１０分間加熱し、そして室温まで冷却して、その後、ＡＴＰを添加して最終７ｓ度０．５ｍＭにした。次に８００単位の７４　ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてその混合物を１２．５℃で１２−１６時間インキュベートした。

ライゲーシブン混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。乾燥させたＤＮＡを３０μ！に再生させ、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ’ｌおよびＰｓｔｌで、３７℃１時間消化した。混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させて、その後Ｌａｅ＋ｎ＋ｎｌｉら、■Ｌ！Ｌｌ（１９７０）　２２７：６８０の方法に従って、８％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって様々な２本鎖ＤＮＡセグメントを分離した。ＤＮＡ断片は、湿ゲルオートラジオグラフィーで可視化し、約１００ｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、記載のように一夜溶出した。切り出された合成りＮＡ断片は、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉで消化されたプラスミドＭ１３−ｍｐ８あるいはＭｌにライゲートし、そして設計された配列を確偲するためにジブオキ／ヌクレオチド配列分析を行った。この設計された配列には、プロモーター（−３５と−１０の領域）、およびトリプトファンオペロン（ｔｒｐ）のオペレーター領域、およびトリプトファンオペロンリーダーペプチドのリポソーム結とが立証された（Ｈａｌｌｅｖｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、および、Ｅｍｔａｇｅ、　Ｓ、、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　ｉ：２７−４７．　Ｉｋｅｈａｒａ、Ｍ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｅ４臣（１９８４）　８１・５９５６−５９６０）。

２、プラスミド　ＴＲＰ２３３を　るΔ　ｔｒ　ブロモ−−オペレー　−の　１プラスミドｐＫＫ２３３−２　（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、およびＢｒｏｓｉｕｓ。

Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　（１９８５）　４０：１８３）をＮｄｅｌで完全に消化し、Ｅ、　ｃ。

１１ポリメラーゼＩの５単位、フレノウフラグメント（１３ｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｃ、）、および４つのｄＮＴＰ全部を加えた５０ μＭを用いて、末端を平滑にした。これを２５℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱させた後、ＮｄｅＴで消化したＤＮＡ断片ヲライゲートシて、Ｅ、、　ｃｏ１４　（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｋ、ら、Ｌ且１−５狙ｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）　ｌ：２８９−２９９＞に形質転換した。得られたＮｄｅ１部位のないプラスミドをｐＫＫ−２３３−２ −Ｎｄ　ｅと称した。

プラスミドｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄ　ｅの２０ｎｇを、Ｅｃ。

ＲＩおよびＰｓｔｌで完全に消化した後、仔つシ腸ホスファターゼ処理を行った。Ｍｌ３　ＲＦからのＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌでの消化による、合成Ｕプロモーター／オペレーター配列の５０ｎｇを、ＥｃｏＲｒおよびＰｓｔｌで消化したｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄ　ｅのｌｏｎｇと混合し、Ｔ　４−Ｄ　ＮＡリガーゼでライゲートした。その後、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ａ２２１１１）Ｉ）−／Ｉ’ 　１ａｃＩに形質転換した。形質転換体を、１００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ１合成ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するプラスミドＤＮＡの存在をスクリーニングした。次に、適正なプラスミドを単離し、ｐＴＲＰ２３３と称した。

ｐＴＲＰ２３３を、Ｅｃ’ｏＲＩで消化し、末端をフレノウで平滑化し、そしてライゲートしてＥｃｏＲＩ制限酵素部位を除去した。次に、プラスミドをＮｄｅｌおよびＨｉｎｄｌＩＩで消化して、Ｎｄｅ１部位とＥｃｏＲＩ部位との間にβ −ｇａ　Ｉ−（ｔｈｒ）６をコードするＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｒフラグメントを挿入してプラスミドｐＴＲＰ８３−１をつくった。

次に、プラスミドｐＴＲＰ８３−１をＥｃｏＲＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、その消化物を、０．６％アガロースゲルで電気泳動した（Ｍａｎｉａｔｔｓ、　Ｔ、ら、ｐｐ、　１５７−１６０）　ｅ、プラスミドの骨格を含む大きいほうのフラグメントをゲルから溶出した。次に、λ５Ｍ２Ｗ３由来のβ−アミロイド関連配列を含むＥｃｏＲＩフラグメント（図１の６５５ −７５１位のアミノ酸および５００ｂｐの３′非翻訳配列に相当する）を、ＨａｅＩＩ制限酵素エンドヌクレアーゼで消化し、１２％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を行った。

約２３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈａ　ｅ　Ｉ　Ｉフラグメント（６５５−７２８位のアミノ酸をコードするβ−アミロイド関連配列）を溶出した。７２８−７５１位のアミノ酸をコードする図１のβ−アミロイド関連配列の残りの部分を、図９に示した６つのオリゴデオキシヌクレオチドを用いて調製した。１と６と以外の各々のオリゴデオキシヌクレオチドの５００μｍｏｌｅをそれぞれリン酸化した。対をなす（例えば、１と２．２と３）オリゴデオキシヌクレオチドの各々１６７ｐｍｏｆｅを、混合して、９０℃で２分間インキコベートした後、徐々に室温まで冷却した。次に、各々の対を他のものと合わせて、フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノール沈澱させた。対は、５ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＩ％　ｐＨ８，１０ｍＭＭｇｃｔ２．２０ｍＭＤＴＴを含有する３０μｍに再生させ、５０°Ｃで１０分間加熱し、室温になるまで放置した。ＡＴＰを最終濃度が０．５ｍＭになるように加え、８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加して、その混合物を１２℃で１２−１６時間インキュベートした。ライゲージ９ンしたものを、１２％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、７９ｂｐのＨａｅＩ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ　Ｔ　［合成フラグメントを溶出した。

ｐＴＲＰ８３−１のＥｃｏＲｒ−Ｈｉｎｄｒ　Ｉｆプラスミド骨格、約２３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈａ　ｅ　Ｉ　Ｔ　β−アミロイドｃＤＮＡ７ラグメント、および７９ｂｐの合成Ｈａｅｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ　β−アミロイドフラグメントを、１２℃で１２−１６時間ライゲートした。Ｌ１且■株ＭＣ１０６１を、ライゲージ−、ｙ混合物（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、ｐｐ、　２５０−２５１）で形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーを、１００μｇ　／　ｍ　ｌの硫酸アンビンリンを補充したし培地１ｍｌ中で、−夜、増殖させた。プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、ｐｐ、　３６ｇ−３６９）　で調製した。プラスミドを、ＥｃｏＲｒおよびＨＩｎｄｌＩＩの消化によって、適正な挿入物をスクリーニングした。約５ｏｏｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを放出するプラスミドをｐＡＰｃＰ１１プラスミドｐＡＰｃＰ　１１８−３は、１１０個のアミノ酸のβ−ガラクトシダーゼ−スレオニン− β−アミロイド関連融合タンパク質を、Ｅ、　ｃｏｌｉ　トリプトファンプロモーター／オペレーターの制御の下に、発現する。Ｅ、　ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０は、プラスミドｐＡＰＣＰ　ｌ　ｌ　８−３で形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーの１つを、Ｍ９最少塩（Ｍ口１ｅｒ、　Ｊ、　、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に・　グルコース（０，４％）、チアミン（２μｇ／ｍｌ）、Ｍｇ５Ｏａ　・７Ｈ２０（２００μｇ／ｍ　ｌ）、トリプトファン（４０μｇ／ｍｌ）、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）　（０、５％）、およびアンピンリン（１００μｇ　／　ｍ　Ｉ　）を補充した培地中で、３７°Ｃで１２−１６時間増殖した。トリプトファンを減少させた（４μｇ／ｍｌ）新しい培地に、培養物を１００倍に希釈して、２時間、発現を誘導させた後、３−β−インドールアクリル酸を最終濃度２５μｇ’ｍ＋になるように添加した。β−ｇａｌ−ｔｈｒ−β−アミロイド（６５５−７５１）融合タンパク質の発現が、総細胞タンパク質の１０−２０％のレベルで生じ、位相差顕微鏡（１０００ｘ倍率）によって可視化し得る封入体の形態で存在する。３−β−インドールアクリル酸の添加の６時間後に、遠心により細胞を回収し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩＳ　ｐＨ７，５で洗浄し、そして細胞のベレットを一２０℃で凍結した。

ｃ、几　−製　の　−ａｌ−ｔｈｒ−−アミロイド　６５５−７５１　融合タンパク　の培養物５００ｍ１からの細胞ペレットを、１０ｍＭＴｒｌｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，０，６Ｍ　ＮａＣ１の４０ｍ１中に再浮遊させ、リゾチーム８ｍｇ、プロテアーゼインヒビターフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＦＭＳ　Ｆ）およびアプロチニン（それぞれ０．５ｍＭおよび２５μｇ／ｍりとともに、４℃で１０分間インキュベートした。２種の界面活性剤溶液、すなわち、デオキシコール酸ナトリウム（１０％溶液４８０μｌ）およびＮＰ−４０（２０％溶液２４０μ Ｉ）を加えて、さらに４°Ｃで１０分間インキュベートした。細胞ペレットを超音波処理して、細胞および遊離の封入体を破壊した。ＲＮＡナーゼ（ｌ　Ｏμｌ　／　ｍ　ｌ　）とＤＮＡナーゼ（１０μｌ　／　ｍ　ｌ　）とを加えて、その混合物を室温で３０分間攪拌してＲＮＡおよびＤＮＡを消化した。封入体（および、いくらかの細胞破片）を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心（Ｓへ６００ローター）して集めた。上清を除去して、ペレットをタンパク質ゲル試料用［ｉ液中で２０分間煮沸して融合タンパク質を溶解した。次に、融合タンパク質を１２％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０＞　２２７：６８０）によって精製した。各々のゲルの端を切り出して、クーマシブルーで染色し、１５キロダルトン（ｋＤ）の融合タンパク質を可視化した。次に、融合タンパク質を含むゲルの部分を切り出せ得るように、それらをゲルに再配置した。次に、ポリアクリルアミドを、生理食塩水を添加して、ポリアクリルアミドの湿気を保ちながら一連の針（１６ゲージから２２ゲージで）で崩した。ポリアクリルアミド／融合タンパク質を崩したものを、ウサギを免疫する直前に、アジュバント［ＲＩ　Ｂ　Ｉ　（ＲＡＳ）　］と混合した。動物当り、約１５０−２００μｇの融合タンパク質を、最初の免疫用に投与した。次の免疫に５０−１００μｇの融合タンパク質を用いる。

Ｄ、−ａｌ−ｔｈｒ−−アミロイド１６５５−７５ｕＪ。

ム　ンパク　を　いての　−アミロイドｓ　ｎ　ｅ　”°のウェス　ンブロノト３−β−インドールアクリル酸で誘導された、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　（ｐＡＰｃＰｌ　１８−３）およびＷ３１１０　（ｐＴＲＰ８３−１）の培養物の細胞ペレｙ）を、Ｌａｅｍｍｌｉゲル試料用緩衝液中で煮沸して、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドの電気泳動を行った。第２の形質転換株は、β−ｇａｌ−ｔｈｒ−β−アミロイド（６５５−７４１）融合以外の全タンパク質ルロースに電気プロットし、最初に免疫したウサギから得たＡＰＣＰ　５ｙｎｐｅｐ抗血清とともにインキュベートして、次に、１２５１−３ｔａｐｈｙｌ　ｏｃｏｃｃｕｓのプロティンＡとともにインｔユベ、−トして結合抗体を同定した（　Ｊｏｈｎｓｏｎ。

ＤＡ、ら、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ　（１９８４）　１＋３）。これらのニトロセルロースフィルターからオートラジオグラムを描き、抗ＡＰＣＰ３血清と融合タンパク質との交差反応活性を示した５ｙｎｐｅｐ　ＡＰＣＰ３は、融合タンパク質のβ−アミロイド部分に含まれる、図１の７０５−７１９位のアミノ酸を含有する。さらに他のβ−アミロイド５ｙｎｐｅｐ抗血清についても交差反応性を観察した。

Ｋ亘皿主生きた組　えワク／ニアウィルスを　いての−アミロイド　タンパク　に交・するポリクローナルおよびモノクローナル　の１、プラスミド　ＦＬ４７４Ｂのポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生ずるためのプラスミドの構築は、図１Ｏに図示されている。プラスミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ−３”″　（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１こ従って、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　消化し、仔つシ腸のホスファターゼで処理した。λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の精製された１、０６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの５０ｎｇを、１０ｎｇのＥｃｏＲ■消化のｐＧＥＭ−３”　と混合して、総容量２０μｌで、２５°Ｃ１３０分間、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼとともにインキュベートした。Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＭＣｌ０６１をＣａＣｌ２法による形質転換用に適合する（　ｃｏｍｐｅＬｅｎＬ）ようにし、ライゲーション混合物によって形質転換した。得られたアンピシリン耐性コロニーを、２ｍｌのし−ａ　ｍ　ｐ培地中で一夜増殖し、プラスミドＤＮＡをＴｒｉｔｏｎ溶解法で調製した（Ｍａｎｉａｔｆｓら）。Ｈｌ　ｎｄＩＩＩによる消化によって、プラスミドが適正な配置（こあるかスクリーニングした。１５０から３７００ｂｐのＨｉ　ｎｄＩＩ＋制限フラグメントを有するプラスミドを選んで９４ＢＩと称した。得られたプラスミドｐ４ＢＩを、ＨｌｎｄｌＩＩで消化してＴ４リガーゼで２５℃、３０分間再ライゲートし、適合させたＭＣ１０６１細胞をライゲーション混合物で形質転換した。ＥｃｏＲＩ消化によって、プラスミド力（１３０ｂｐのＨ１ｎｄｒｌｌフラグメントを欠損して（Ｘることをスクリーニングした。１つのＥｃｏＲ１部位を含むプラスミドを選択して、ｐ４ＢΔＲ１と称した。１０ｎｇのプラスミドｐ４ＢΔＲ１をＥｃｏＲＩ消化し、仔つシ腸のアルカリホスファターゼで処理して、λＡＰＣＰ１６８１４由来の、精製した約２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント１０１００ｎこライゲートした。ライケージジン混合物を、適合されｔこＭＣ１０６１細胞を形質転換するのに用０た。得られたアンビシ１ノン耐性コロニーをＬ−ａｍｐ培地培地−夜増殖し、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩＩの消化により、適正な配置にある力）スクーニンク゛した。

１．５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントおよび約１．５ｋｔ）のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌ　ｌ　！フラグメントを有するプラスミドを選んで、ｐ４７４Ｂと称した。プラスミドｐ４Ｔ４ＢをＳｍａｌおよびＸｍｎＩで消化し、得られた約２．７ｋｔ）のフラグメントを０．８％アガロースから溶出した後、エタノール沈澱させ、真空下に乾燥させてｄＨｚｏｌこ再浮遊させた。

５μｇのワク／ニアウィルスのＲ現ベク９−ｐｓｃｌ　１　（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８５）　５：３４０３−３４０９）　を、　５ｒｎａｌで完全に消化した後、仔つン腸のホスファターゼで処理した。ｐ４Ｔ、ｓｓ由来の、精製した約２．７ＫｂのＳｍａＩ−ＸｍｎＩフラグメント５００ｎｇを、ｓｍａＨ？’！（ヒしたｐｓＣｌｌの５０ｎｇと混合して、総容量２０μｍで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとともに１５℃で、−夜１６時間インキコベートした。Ｅ、　ｅａｌｉ株ＭＣ１０６１をライダ・−シラン混合物で形質転換した。得られたアンピシリン耐性コロニーを一夜増殖させ、プラスミドＤＮＡを、急速煮沸法１こより単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。ＥｃｏＲＩ７ｇ化（こよて、プラスミド力く挿入されて適正に配置しているかスクリーニング゛した。約２５００ｔ）ｐおよび約６００ｂｐのＥｃｏＲＩフラク゛メントの両方を有するプラスミドを選んで、ｐＦＬ４Ｔ４ＢＶと称しプこ。

β−アミロイド関連タン／　Ｘ＋り質の全長ζこ対するモノクローナルおよびポリクローナル抗（本は、Ｙｉｌｍａ、Ｔ、ら、　（Ｕ垣±ｌｏｍａ（１９８７）　ｉ：３２９−３３７）に記載されて（Ｘる新規な方法を用（１て発生させる。

要するに、この方法（±、免疫イしある（λルまスクリーニングの工程での抗原（タンノくり質）の精製の必要力くな０、特定のタンパク質に対する抗体の生産を可能（こする。この方法は、遺伝子工学的に単離遺伝子を有するよう（こされ管尋る、ワクシニアウィルスをマウスを免疫するの（こ用１．％？尋る。感染の後２週間目に、Ｋｏｈ　ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｉ組江（１９７３）　ｊｊｉ；４９５により開発された古典的な研究（こ君己載されてＩｌ）るよう：こ、マウスを殺して、モノクローナル抗体生産のためにその胛細胞をミエローマ細胞に融合した。ある０（よ、ウサギ（よ、ポリクローナル抗血清を生じるように、感染性ワクシニアウィルスの組換え体で一般的に免疫され得る。

（以下余白）プラスミドｐ４７４８Ｖ１０μｇを、標準法（Ｍａｃｋｅｔｔら、！　Ｖｉｒｏｌ　（１９８４）　４９：８５７−８６４）　ｌ；：従ッテ、野生型ｒ）’）シニ７’）イルスで感染させたＣＶ−１サルの腎臓細胞をトランスフェクトするのに用いる。ＴＫ−組換え体を、２５μｇ　／　ｍ　１ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）の存在下に、ＴＫ−細胞におけるプラークアッセイによって単離する。ｐｓｃｔｔワタシニアウイルスの発現ベクターの場合のように、青色の生成物を伴うプラークアッセイ用に、１ｍｌ当り３００μｇのＸ−Ｇａ１を横たえたアガロースにおいて、３７℃、４−６　時間後、プラークが認められる。プラークは２から３回続けて精製される。組換えウィルスからのＤＮＡを、制限酵素エンドヌクレアーゼ分析、およびλＡＰＣＰ１６８１４由来の３２ｐニツク關訳された２０９１ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントとのＤＮＡハイブリダイゼーションによって、推測した構造を確認する。

λＡＰＣＰ１６８ｉ４のβ−アミロイド関連ｃＤＮＡ配列全体を有する組換えウィルスを単離し、増幅して高力価（１×１０”−９ｐ　ｆ　ｕ／　ｍ　１　）にする。これらの組換えウィルスは、ウサギおよびマスを免疫して、次ぎに、十分に確立された方法を用いて、全長β−アミロイド関連タンパク質に対する、それぞれのポリクローナル抗体およびノモクローナル抗体を生産するのに用いるか、あるいは、組換えタンパク質の直接の発現に用いられ得る。種々の抗血清を、β −アミロイド関連タンパク質のウィルス組換え体によって感染させた、３６Ｓ− メチオニン標識のＣＶ−１細胞由来の適正な大きさのタンパク質を特異的に免疫沈降させる能力、あるいは、放射標識のアミノ酸に曝されていない同様の細胞の、変性されたタンパク質をウェスタンプロットで検出する能力のいずれかをスクリーニングする。

ｉ立皿土哺乳類細胞でのβ−アミロイド関連タンパク質の発現を促進するために、ヒトメタロチオ不ンｌ　ｒ　（ｈＭＴ　Ｉ　Ｉ　）　遺伝子由来の強く調節されたプロモーターに、タンパク質のコードセグメントを融合するようにプラスミドを構築する。この方法、は２つの工程において行われる。最初に、ＢａｍＨＩおよびＳｍａ　Ｉ制限酵素によるｐｈＧＨ−ＳＶ　（１０）の消化によって、ｐｈＧＨ− ３Ｖ　（Ｉ　Ｏ）ベクターから、発現ベクターｐＭＴｓＶ４０　ｐｏｌｙＡ　Ｂａｍが由来される。その後、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）とともにインキュベートして平滑末端分子をつくる。次に、平滑末端を、Ｂ　ａｍＨＩリンカ−にライゲートし、ＢａｍＨＩで切断して、再びライゲートして環状にする。この工程で、ｍＲＮＡの３°非翻訳領域の大部分および、推定上の３ ′転写終止シグナルとプロセッシングシグナルとをコードするゲノム配列以外のｐｈＧＨ−３Ｖ　（１０）由来のヒト成長ホルモンのゲノム配列の全てが除去される。哺乳類細胞での発現構築用に、ｐＭＴＳＶ４０ｐｏｌｙＡ　Ｂａｍ８ＢａｍＨＩ消化し、次に、４つの全ヌクレオチドトリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼ■とともにインキュベートして平滑末端をつくる。次に、このフラグメントを、ｐ４７４Ｂ（前述）由来の精製した２６７８ｂｐのＳａｍ！−Ｘｍｎｌフラグメントにライゲートする。この組換え分子を、形質転換によりＭＣ１０６１に導入する。

チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）−Ｋｌを、１０％胎児つ／血清を加えた、Ｆ１２培地とＤＭＥ培地との１＝１混合物からなる培地中で増殖させる。全細胞を、組換え発現ベクターとｐ　Ｓ　Ｕ　２　：　Ｎ　Ｅ　Ｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、ら、Ｊ　Ｍｏｌ狂吐ユ飢旦（１９８２）　ｌ：３２７−３４１）とを同時に形質転換する。ｐＳＶ２：　ＮＥＯは、ネオマイシンアナログＧ４１８に対して耐性を獲得する機能性遺伝子を含有する。形質転換において、５００ｎｇのｐＳＶ２：　ＮＥＯと、５μｇの組換えベクターとを、６０ｍｍディシニ中のＣＨＯ細胞に付与して、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ、■組ｍ■（１９７３＞　５２：４５６−４６７に記載されているようにリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱させる。５ｏｕｔｈｅｒｎらが記載のように、抗生物質Ｑ４１８中で細胞を増殖すると、β−アミロイド関連ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現する８賃のある発現ベクターＤＮＡを含有する、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞群を生ずる。

Ｋ血丘旦一アミロイド　連タンパク　（６５２−７５１）の培　哺乳類細胞での発 β−アミロイド関連タンパク質の生産のためにフードする哺乳類細胞発現ベクターは、下記の図１２に示されるように構築し得る。図１０のｐ　４．　Ｂ△Ｒ１ベクターは、ＥｃｏＲＩよる消化によって直鎖化される。このベクターを、下記の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドと混合する。

５　’　−ＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧ−３’３　’　−ＧＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＧＴＣＴＴＡＡ−５’そして、Ｔ４ＤＮ、Ａリガーゼを用いてライゲートする。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＣ０ＲＩおよびＳｍａ　Ｉ部位の後ろにλ５Ｍ２Ｗ４のＭｅ　ｔ−Ａ　ｓ　ｐ−Ａ　ｌ　ａコドンを再構築し、その後ろに池のＥｃｏＲ１部位がある。

Ｅ、　ｅｏｌｉ株ＤＨＩの適合させた細胞を、混合物で形質転換して、Ｌ−Ａｍｐプレートでの増殖により、アンピシリン耐性菌を選択した。ＥｃｏＲ１部位に適当な配置で挿入したオリゴヌクレオチド対を含有する形質転換体を、標準のスクリーニング法によって選択して、ｐΔＷ４／Ｗ３と称した。プラスミドＤＮＡ　ｐΔＷ４／Ｗ３を、Ｓｍａ　ＩおよびＸｒｒ＋ｎｌで１肖化して、図５に記載されているβ−アミロイド関連タンパク質をコードする配列を除去し、適正な断片をゲル精製法によって単離する。

次に、この断片を、上記実施例４に記載したように、ＢａｍＨＩで直鎖化して平滑末端化した、哺乳類細胞発現ベクタ−ｐＭＴｓＶ４０ｐｏｌｙＡ　Ｂａｎに挿入し得る。得られたベクター、ｐＭＴ−ＡＰＣＰ　（６５２−７５１）　は、β −７ミロイド関連タンパク質（６５２−７５１）の生産に用い得る。

支立Δ亙一アミロイドｉ　の薯　での実施例４および５の概要は、ヒトβ−アクチンプロモーターにより作動されるβ −アミロイド関連タンパク質（１−７５１）の発現系の構築である。はぼ同等の構築物を、ｐ４Ｔ４Ｂ（前述実施例３に記載）由来の、５′非翻訳領域から１１６ｂｐを欠損している、精製した２５４８ｂｐのＳｍａｌ−ＸｍｎＩフラグメントを用いて調製した。このフラグメントを、哺乳類細胞での発現でネオマイシ選択し得るマーカー、および細菌の形質転換体の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドの、ヒトβ−アクチンプロモーターの後ろのＳｃｉ１部位に挿入した。このベクター、ｐＨｂＡＰｒ−Ｌ−ｎｅｏは、Ｇｕｎｎｉｎｇら、　（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８７）■＋４８３１−４８３５）に記載されていて、元来のベクターのＥｃ。

ＲＩ部位を除去して、元来から存在する５ａｌｌ、ＨｉｎｄＩＩ！、およびＢａｍＨＩクローニング部位に加えてＥｃ。

Ｒ１部位を有する新しいポリリンカーで、元来のポリリンカー領域を置換して改変されている。この改変されたベクターは、ｐＡＸｎｅｏＲである。このｐＡＸｎｅｏＲベクターを、Ｓａｌ＋で直鎖化し、末端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて満たして平滑末端分子をつくった。２５４８ｂｐのＳｍａｌ−Ｘｍｌ　β−アミロイドフラグメントを、Ｔ４リガーゼを用いてベクターに平滑末端でライゲートした。

組換え分子を、形質転換によってＥ、　ｃｏｌｉ株ＭＣｌ０６１に導入し、適切な配置にあるクローンを増幅した。同等の構築を、Ｋａｎｇら（上記）の記載の６９５β−アミロイド配列を用いて行った。この配列には、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御の下に、６９５のアミロイドタンパク質が配置されている。

ｐＡＸｎｅｏ／７５１　β−アミロイド、あるいはｐＡＸｎｅ　ｏ　／　６９５　β−アミロイドの総ＤＮＡの６００　ｕ　ｇ、または両プラスミド構築物の同Ｎａ合物を、ＢＴＸトランスフェ’）９−　１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄの無菌の使い捨てキュベツト、および通常のキュベトホルダーを用いて、エレクトロポレーシヲンによって、１０７個のＣＨ○細胞へ導入した（　Ｎｅｕｍａｎｎ、　Ｊ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ　（１９７２）１０：２７９−２９０：　Ｚｉｎ＋ｍｅｒｍａｎ、　■」止■Ｊ　（１９７３）　１３：１００５−１０１３）。外来ＤＮＡを受け入れるＧ４１８耐性の細胞を、ＧｉｂｃｏのＧ４１８を５００　 μｇ　／　ｍ　ｌ用いて１、標準のブＯ）：＋−ル（上記の５ｏｕｔｈｅｒｎ、　１９８２）によって選択した。

３回のトランスフエフシロンの各々から、Ｇ４１８耐性の陽性のトランスフェクトされた細胞のプールを、β−７ミロイド前駆体タンパク質に関して特徴づけた。血清を含まない培地の５ｍｌを含有する各々のプールからの約２Ｘ１０６個の細胞を、３７°Ｃで４８時間インキュベートした。馴化培地を除去して、トリクロロ酢酸を最終濃度１０％になるように添加してタ：ノバク質を沈澱させた。細胞を擦り落として回収し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、５０ｕｌの緩衝液に再浮遊させて３０倍濃度にした。各々の試料の２５ｕ１を１２．５％のポリアクリルアミドゲルにかけた（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２７７：６８０−６８５）ｏ　β−アミロイド前駆体を、標準法と、実施例３に記載したβ−アミロイド７５１　ｃＤＮＡを有する組換えワタシニアウイルスによって生じた、β−アミロイド特異的ポリクローナル抗体とを用いて、ウェスタンプロット分析（Ｔｏｖｂｉｎ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｉ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　０３人　（１９７９）　７６：４３５０−４３５４）で検出した。典型的には、約１１０．０００ダルトンのβ−アミロイド前駆体の大部分が、培養培地に放６されていて、ごく少量のタンパク質が細胞に結合していることが見いだされる。この結果は、β〜ルアミロイドタンパクは分泌されたプロホルモンであると提案する、Ａ１１ｓｏｐら、（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ（巳ＳＡ　（１９８８）旺：２７９０−２７９４）の仮説を支持している。組換え発現されたβ−アミロイドタンパク質の、１１０，０００ダルトンの明かな分子量は、他の研究者（Ｄｙｒｋｓ、　Ｔ、ら、ＥＭＢＯ−Ｊ　＜１９８８）　？（４）：９４９−９５７）が、インビトロ転写／翻訳系を用いて観察したものと類似する。

実施例３に記載されているようにワタシニアウイルスにクローンされたβ−ア！、ｏイド７５１タンパク質を、さらにβ−アミロイドタンパク質の発現の性貫を確かめた。精製組換えウィルスを、血清を含まない状態でＭＯＩ　１で１０６個のＣＶ−１細胞を感染させるのに用いた。ウィルスによる感染の１８時間後、細胞および上清の両方を回収して、ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、そして上記のポリクローナル抗血清を用いたウェスタンプロットに供した。図１５に示されているように、β−アミロイドの１１０．０００ダルトンのタンパク質は、細胞に結合されているよりも馴化培地中に存在することが見いだされた。

ＩＬ五ニーアミロイド　゛　タンパク　のｍ　Ｒ町Ｌ１２１旦皿互ｆｆ遵」］］超ＬＬ虹 −二丸盃オリゴヌクレオチドプローを用いての、β−アミロイド関連タンパク質のｍＲＮＡｆｉｔの遺伝的な変形体を区別する能力が、ここに証明される。

アルツハイマー病の診断アッセイは、β−アミロイド関連タンパク質あるいはそのｍＲＮＡの２つのよく似た遺伝的な変形体間を区別し、そしてこれらのタンパク質あるいはｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量する形態をとる。図８は、診断アッセイの基準を提供するために、本発明の配列の使用の例を提供している。

総細胞ＲＮＡあるいは細胞質Ｒ，Ｎ　Ａを、培養によるヒト細胞から、あるいは、核を除去したまたは除去していない（それぞれに、細胞質ＲＮＡあるいは総ＲＮＡ）、ヒトの脳ａ１ｍ（アルツハイマー病の脳あるいは正常の脳）から、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記載のようにグアニジンチオシアネー）／ＣｓＣ１法によって調製した。図８の番号に相当する試料は、（１）神経芽細胞腫および線維芽細胞の混合培養物であるＩＭＲ−３２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１２７）からの総ＲＮＡ、；（２）正常線維芽細胞であるＭ　ＲＣ５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）がらの総ＲＮＡ、；（３）類上皮細胞であるＨｅ１ａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２．２）からの総ＲＮＡ、；（４）ＭＲＣ５細胞がらの細胞質ＲＮ　Ａ　；　（５）Ｈｅｌａ細胞からの細胞質ＲＮＡ；（６）前骨髄細胞白血病細胞であるＨＬ− ６０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２４０）からの総ＲＮＡ、；（７Ｎ２−テトラ−デカノイル−ホルボール−１３−アセテートで処理してマクロファージへの細胞分化を誘発した、ＨＬ−６０細胞からの総ＲＮＡ；（８）正常な小脳試料からの総ＲＮＡ；（９＞正常前頭葉皮質試料からの総ＲＮＡ；（１０）アルツハイマー病患者の前頭葉皮質からの総ＲＮＡ；および（１１）正常側頭葉皮質からの総ＲＮＡ；である。ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーで分画にわけ、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動にかけて、そシテニトロセルロースヘブロノトトランスファーした（全て、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記載のように）。標準のプロトコールに従って、フィルターを加熱し、プレハイブリダイズし、そして指標プローブにハイブリダイズした。

指標プローブは、〈１〉上記本発明の詳細な説明のところで記載したような、Ｋａｎｇらの配列に対して特異的な３ｏ塩基のオリゴヌクレオチド＃２７３３である連結部；（２）図１および上記のβ−アミロイド関連配列に対して特異的な６ｏ塩基のオリゴヌクレオチド＃２７３４である挿入部分；および（３）プラスミドｐＨＦＢＡ−１から単離された、ｔｓｏｏｂｐのヒトアクチンＣＤＮＡ挿入物（Ｐｏｎｔｅ、　Ｐ、ら、Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８４）　１２：１６８７−１６９６）　；である。オリゴヌクレオチドプローブを、生産者の指示に従って、ターミナルトランスフェラーゼとともにインキュベートして［３２Ｐコーｄ　ＣＴＰで末端標識した。アクチン挿入物は、ニック翻訳によって［３２ＰＩ−ＣＴＰで放射標識した。ハイブリダイイーシコン後、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたフィルターを、５５°Ｃ％ＩＸＳ、Ｓ、Ｃ，で洗浄した。アクチンにハイブリダイズしたフィルターを、５５°ｃ、ｏ、ｉｘｓ、ｓ、ｃ、で洗浄した。次に、フィルターをＸ線フィルムに曝し、オートラジオグラムを得た。挿入プローブは、試される全試料において、図１に記載のβ−アミロイド関連タンパク質ｍＲＮＡを検出する。連結部プローブは、ＨｅＬａおよびＭＲＣ５以外の全細胞において、！［ａｎｇらの記載のβ−アミロイド関連タンパク質ｍＲＮＡを検出する。

アクチンプローブは、全細胞における、豊富なＲＮＡにハイブリダイズすることが期待される対照プローブである。

実施例２の教示に従って、β−アミロイド関連タンパク質（２８９−３４５＞用の合成遺伝子を組み立てた。三対のオリゴデオキシリボヌクレオチド（図９Ｄ＞から、Ｅ、　ｃｏｌｉの高度に発現されている遺伝子の好ましいコドンを選択し用い、そして、融合タンパク質からポリペプチドが放出される様に、アミノ酸２８９（Ｇｌｕ）の前にヒトロキ／ルアミン解裂部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）を挿入した。発現ベクターｐＴＲＰ８３−１を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化し、そして、直鎖化したプラスミドを、０．６％アガロースゲルで精製した。５０μｇのプラスミドＤＮＡおよヒ２００μｇの合成遺伝子ＤＮＡを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでライゲーションして修復体を得、そして、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１をＣ１７）８体で形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーヲ、１００μｇ／ｌｌのアンピシリンを含んだし培地中で一晩成長させ、そしてアルカリ性のプラスミド調製物を得た。この得られたブラスミ）’　ＤＮＡは、約３５０　ｂｐの断片が放出されるかどうかによりベクター内にこの遺伝子が挿入されたのを確認するために、Ｂａｎ旧制限エンドヌクレアーゼで消化された。この合成遺伝子の挿入物を受け取った一つのプラスミドを、ｐＡＰｃＰ１２５−２と命名した。

Ｂ、　−アミロイド　４ポリペプチド２８９−３４５のこのプラスミドｐＡＰｃＰ１２５−２は、Ｅ、　ｃｏｌｔのトリブトファンプ０モーター／オペレーターの制御下で、７４個のアミノ酸のβ−ガラクトシダーゼースレオニンーβ−アミロイド関連融合タンパク質を発現する様にデザインされている。Ｅ、　ｃｏｌｔ株Ｗ３１１０を、プラスミドｐＡＰｃＰ！２５−２で形質転換味　ぞしで得られた７ンビシリン耐性のコロニーの一つを、実施例２に記述した様に成長させた。

終濃度が２５μｇ／ｍｌとなる様に、３−β−インドールアクリル酸を加えることにより、発現を誘導した。５時間の誘導後、１　ｍｌの細胞培養物を取り出し、遠心分離により回収し、次にＩＳ的な方法に従い、１００μｌのＬａｅｍｍｌｉのタンパク質試料緩衝液中で沸騰させ、１６％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。封入体の形成は、位相差顕微鏡（１０００ｘ）により評価される。発現レベルは、ゲルのクーフシ−ブルー染色後、デンシトメーター走査によるタンパク質バンドの強度の定量により算出される。タンパク質精製に使用される細胞は、遠心分離で回収し、１０　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、ｐｉ（７，５で洗浄し、そして、細胞ペレットは、必要とされるまで一２０’Ｃで凍結保存した。

Ｃ３−ａｌ−ｔｈｒ−−アミロイド　゛　タンパク　２８９−３４５のこの融合タンパク質は、β−ｇａｌ−ｔｈｒ−β−アミロイド関連（６５５−７５１）融合タンパク質（実施例２）で記述した様に、ＰＭＳＦおよびアプロチニンなしで、精製された。°２Ｍ尿素から始まり４Ｍ尿素に終わる一連の洗浄により、他のタンパク質は除去され、そして、封入体中に観察される融合タンパク質はさらに富む様になる。さらなる精製を所望するならば、この融合タンパク質を、６から８Ｍの尿素に可溶化し、ゲル濾過あるいはイオン交換クロマトグラフィーの工程を含める。もし所望しないならば、この融合タンパク質を、Ｍｏｋｓら、Ｂｆｏｃｈｅｍ　（１９ｇ？）　！ｉ＋５２３９−５２４４に記載されている条件下で、６Ｍのグアニジン塩酸塩およびヒドロキシルアミンに可溶化し、Ａｓｎ残基とａｔｙ残ド関連タンパク質（２８９−３４５）を放出させる。開裂されたペプチドは、逆相の高圧液本クロマトグラフィー、イオン交換あるいはゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する。この精製されたβ−アミロイド関連タンパク質を、次に、ＴａｎおよびＫａｉ　ｓｅｒのＬｌ玉二加シ（１９７６）　４１２７８７およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７７）　１６二１５３１−１５４１に記述された方法により、還元し、再酸化し、６個のＣｙｓ残基の間のジスルフィド結合を再形成する。これらの方法により、やはり６個のＣｙｓ残基を有し、Ｅ、　ｃｏｌｉ中で製造される、ウシ膵臓のトップシンインヒビター（アプロチニン）の再酸化が成功している（ｖａｎ　Ｗｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎｎ　ＥＭＢＯ（１９！１６）互：３２１９−３２２５）。

Ｌ１丘ｌインヒビタータンパク　の　築および二つのキメラタンパク質の各々をコードするＤＮＡ配列は合成オリゴヌクレオチドから構成した。使用したこのオリゴヌクレオチドの配列を、図１６に示す。ｐｈｏＡシグナルペプチドの配列（図１６Ｂ）は、Ｋｉｋｕｃｈｉら（前出）から、ｏｍｐＡシグナルペプチドの配列（図１６Ａ＞は、ＢｅａｋおよびＢｒｅｍｅｒ　（前出）から得た。

各オリゴヌクレオチドを、キナーゼで処理した（５・末端の外側の２個を除く）。

ｐｈｏＡあるいはｏｍｐＡにいづれかをコードしている８つのオリゴヌクレオチドの全てを、−緒に混合しりガーゼで処理した。

予想した長さの新しいバンド（−２５０ｂｐ）が、分析用ゲルに現れた。次に、このライケー７−１ノ構築物を、ベクターｐＴＲＰ２３３のＮｄｅｌ−Ｈｉｎｄｌ　ｌ　１部位にライゲーションして入れた。このライゲーションされたベクターを、Ｅ、　ｃｏｌｉＭｃ１０６１株にトランスフェクトし、そして、Ａｍｐ” 　（アンピシリン耐性）のコロニーを選択した。プラスミドのミニプレツブ（少量調製物）は、正しい制限酵素地図を宵する組み換えプラスミドであることを示した。ＤＮＡのミニプレ、プをＷ３１１０株およびＪＥ５５０５株のトランスフェクンヨンに用いた。この３つの株を各々、小スケールで培養し、成長させ、そして、ＩＡＡで一晩誘導した。培養上清の、トップシン阻害活性を調べた。トリプシンを、合成基質Ｎ−ベンゾイル−Ｄ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンを加水分解Ｌｒｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出する能力に関して試験する。時間を関数にしたｐＮＡの放出は、分光光度計でモニターし易く、そして、トリプシン活性を定量的に測定し得る。トリプシンに結合し、トリプシンにより基質が加水分解されるのを阻止する能力により、このインヒビターはこのアッセイで検出される。ＪＥ５５０５のｏｍｐＡおよびｐｈｏＡの両構築物の阻害活性は培養培地中に検出されたが、Ｗ３１１０あるいはＭＣ１０６１からは検出されなかった。ｐｈｏ＾構築物の発現レベルが、より高いようなので、以下の実験にはこの構築物のみを用いた。

培地中のインヒビターレベルを試験し、そして、インヒビターの合成速度を、３５Ｓ−メチオニンをインヒビタータンパク質に取り込ませることによりモニターする、タイムコースの実験を行った。この実験により、ＩＡＡによる誘導後４時間から６時間の間に、この合成がＯに減退し、一方、誘導の８時間後まで、培地中にインヒビタータンパク質が蓄積された。ごの遅延は、タンパク質がペリプラズマから外膜を通り培地中へ拡散するために要する時間を表すと推測される。培地中のインヒビターのレベルは、誘導後８時間から２４時間まで安定である様に見える。

支直匠上皇インヒビタータンパク　の　製ｐｈｏＡで形質転換したＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＥ５５０５の５Ｌの培養を一晩成長させ、０Ｄｓ５１１＝０．１の時点で誘導し、ＩＡＡで誘導して８時間後に回収した。細胞は遠心で落とし、捨てた。この上清を、８μｍおよび０．４５μｍのフィルターを通して濾過し、トリプシンセファローズアフィニティーカラム（総量１０　ｍｌのセファローズ、セファローズ上に６　ｍｇ／＋ｌのトリプシン、流速５　ｗ＋ｌ／ｗｉｎ、　４℃）を通した。このカラムを、０．３Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣ１）および０．０１　Ｍの塩化カル／ラム（ＣａＣＩ２＞を含んだ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。このインヒビターを、０．１Ｍ塩酸−０，５ＭＮａＣ１ −０，ＱＩ　Ｍ　ＣａＣｌ２の緩衝液、ｐＨ１２ｓで溶出した。あるいは、アフィニタ・イーマトリックスとして、トリプシンアフィニティーカラムの代わりに、トリブシノビーズ懸濁液も使用し得る。５１．のｉｌ、　ｃｏｌｔ　ＪＥ５５０５の上清に、約２０　ｍｌのトリプシンセファロースビーズ懸濁液を加え、ζ キサ−で緩やかに攪拌した（３００　ｒｐｍ、１時間、室温）。この混合物を、シンターガラス漏斗に注ぎ入れ、そして、この液体をビーズから吸引した。

約４Ｌの２０　ｍλ（のＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５を用いて、この粒子を再平衡化し、そして次に、Ｏ，１Ｍ酢酸−０，３ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐｌ（４，５で洗浄した。このビーズを２０　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩＳｐｌ（７，５を用いて再平衡化し、そして次に、プロテアーゼインヒビターを、約８０ｍ１の０．１　Ｍ　ＨＣｌ−０，５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ１，２５を用いて溶出した。この溶出物は、約２．５ｍｌの２　Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ１０，０を用いて中和した。

トリプシンアフィニティーカラムの溶出物を、２０％アセトニトリル−０，１％トリフルオロ酢酸−８０％水で平衡化した、Ｊｏｎｅｓ　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙのＡＰＥＸ−ＷＰＲｂｕｔｙｌ　ＨＰＬＣカラム（内径１　ｃｍ　ｘ　２５ｃｍ）に注入した。６０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０ヘノ直線的なグラジェントを行い、このインヒビターを溶出した。

このインヒビターは、主要ピーク（ピーク４）および小さいピーク（ピーク２）中に溶出した。トリプシン阻害試験で、両方とも活性であり、アミノ酸配列決定装置（ピーク４は４０サイクル、ピーク２は４９サイクル）で両方は相同であると見られ、そして、両方ともＡ４インヒビターと予測されるアミノ酸組成であった。

ピーク２を１０　ｍＭのＤＴＴ　（ジチオスレイトール）で処理すると、ピーク２０部分的なピーク４への転換が起こり、ピーク２はメチオニンの酸化により生じたことを示唆している。各場合に、内因性のＥ、　ｅｏｌｉシグナルベブチグーゼが、図１６の矢印で示された、予想した部位でキメラタンパク質を開裂した。質量スペクトル（ＭＳ）分析では、ピーク４は６．２６７ダルトンの分子質量を有し、３つのジスルフィド結合を持った完全な長さのＡ４＋の予測値である６、　２６７、７に非常に近い値であった。形成された各々のＳ−３結合は、２１（’分（・２ダルトン）の質量減少をもたらすので、Ｓ−３の数が評価できる。

ピーク２は、ピーク４よりも８ｏダルトン大きい異なるＭＳのピークを与え、酸化を裏付けた。このタンパク質をトリプシンセファローズアフィニティーカラムから溶出するために用いた酸性の条件が、メチオニンの酸化を促進するが、トリプシンセファローズアフィニティーカラムから溶出した後、例えば、ｐｉが約８から約１１の範囲の、好ましくはｐＨ１０，０の２ＭのＴｒｉｓ塩基の様な緩衝溶液を用いた迅速な中和により、ピーク２の形成は最小化されている。

支敷匹上土ＬＬ延！五二セリンプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼに対するＡ４インヒビターの効果を次のようにして調べた。トリプシン（１７，０００ユニツ）　／ｉｇ、ブタの膵臓から）、第Ｘａ因子およびα−トｏ７ビン（Ｄｒ、Ｉｖａｎａｇｕ、　Ｋｙｕｓｈｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｆｕｋｕｏｋａ、　Ｊａｐａｎより提供）、トリプターゼおよびキマーゼ（双方ともラットの腹腔内マスト細胞からＫｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ　Ｂｌｏｃ■Ｌ山μ±■±：４３６−４４３（１９８５）に記載されているように精製）、α−キモトリプシン（０，７５０／ｍｇ、ウシの膵臓から）、エラスターゼ（３３０７ｍｇ、ブタの膵臓から）、パパイン、カテブシ７Ｂ（ラットの肝臓からＴｏｖａｔａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｒａ１０２：２７９−２８９　（１９７９）ニ記載のように精製）、プラスミン（０゜１６０７ｍｇ、ヒトの血漿から）、ウロキナーゼ（０，７５Ｕ／＋ｇ１　ヒトの腎臓細胞か呟Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、組織カリクレイ７　（５００７ｍｇ、ブタの膵臓から）、または血漿カリクレイン（９，４Ｕ／ｎｇ、ヒトの血漿から）を、ウシ血清アルブミン（０，１ｍｇ／ｍｌ）を含有する全体積１．５１の緩衝液中で種々の濃度のインヒビターと共にブレインキュベートした。緩衝液としては、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼにはＯ，ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１％ｐＨ７，５を、キマーゼおよびα−キモトリプシンには０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、ｐ）１８．０を、第Ｘａ因子およびα−トロンビンには１０　ｍＭ　ＣａＣｌ２を含有するＯ、　ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ、ｐＨ８，０を、トリブターゼＭにはＯ，ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，５を、血漿および組織カリクレインにはＯ，ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ、ｐＨ７，８を、エラスターゼには０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，０を、パパインおよびカテプシンＢには１ｍＭ　ＥＤＴＡと４１１ＩＭシスティンとを含有する５０ＩＩＩＭアセテート、ｐＨ６，０を使用した。２５℃で５分間プレインキコベートした後に、表１に示されている７、５μｍの濃度２０　ｍＭの蛍光発光性基質を加えて、自動温度調節で２５゛Ｃに維持した石英キュベツト内で各プロテアーゼの残存活性を測定した。基質から放出された７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、前記のＫｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ｇ）により報告されたように、）ｌｉｔａｃｈｉの蛍光分光光度計、６５０−１０ＭＳ型内で、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍにて蛍光法で測定した。タンパク質濃度は、Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５０　：　７６−８５　（１９８５）に記載されたように、パイシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）タンパクアッセイ試薬で測定した。

種々のプロテアーゼに対するＡ４インヒビターのＫｉ値は、基質の加水分解の初期速度のラインライ−バー・バークプロットからめ、表１に示した。

（以下余白）表１７゛ロチ７−セ゛　基質＠　ｐＨＫｉ値Ｍトリフ°ノン　Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　？、５　２．７トリブターセ゛　Ｍ　Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　８．５　０．２２第Ｘａ因子　Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　８．０　２５？、０α−トロンヒ゛ン　ＢｏＣ−Ｖａ　ｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　８．０　Ｎ１ｂ４ｖ−セ゛　ＳｕｅＣ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ　８．０　Ｎｌａ−キモトリブノ７　Ｓｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ　８．０　８．５エラスターセ゛　Ｓｕｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＭＣＡ　７．ＯＮ＋プラスミン　Ｂｏａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ　７．５　０．０７５つｏ４ナーセ゛　Ｇｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　（引ｔ？）　７．５　Ｎ！血漿カリクレイン　Ｚ’−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　？、８　７３．９組織カリクレイン　Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　７．８　２Ｂ、４八 °バイン　Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　６．ＯＮｌカテフ゛ンン　Ｂ　Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　６．ＯＮｌａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｊｏｎ、　０ｓａｋａ、　Ｊａｐａｎより提供ｂＮＩ、Ａ４インヒビターの濃ｆｉｊ：１μＭでは阻害は生じないＣ５ｕｃ−、スクシニル− ｄ　ｌ−、ペンジルオキシカルポニルこのＡ４インヒビターはヒトの血漿からプラスミン（Ｋｉ　＝７．５　Ｘ　１０ −”　Ｍ）　、およびラットの肥満マスト細胞からのトリブターゼＭ　（Ｋｉ　Ｉ＋２．２　ｘ　１０１０−ｌ８を強力に阻害した。さらに膵臓トリプシン（Ｋｉ　＝２．７　Ｘ　１０−９Ｍ）、α−キモトリブ／ン（Ｋｉ・８．５　ｘ　ｔｏ−’　Ｍ）、並びに血漿および組織カリクレイン（各々Ｋｉ　□　７．４　Ｘ　１０−８Ｍおよび２．８　ｘ　１０−”　Ｍ）を阻害したが、牛マーゼおよび膵臓エラスターゼを阻害することはなかった。第Ｘａ因子（Ｘｉ　□　２．５７　ｘ　１０−’　Ｍ）をやや阻害したが、α−トロンビン、ウロキナーゼ、パパインあるいはカテプシンＢを阻害することはなかった。

支皿丘上主二去ヱ＞＞回置トリプシン（３０ｐＭ）を、ウシ血清アルブミン（０，１■ｇ／ｍｌ）を含有する０、１　Ｍ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５中で、種々の濃度（３〜２４９Ｍ）の精製されたＡ４１インヒビターと共に２５℃にて５分間ブリインキュベートした。Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質としてトリプシンの残存活性を測定した。

精製されたＡ４ｉインヒビターによるトリプシン阻害のプロットは、Ａ４！インヒビターとのトリプシンとの１：１分子反応を示した。

Ｋ敷鳳工主ＩＶ　の　・　畳白、ｏ、ｏｏｔ％のトウビーン８０レツド（Ｔｗｅｅｎ　８０　ｒｅｄ）および０．０１％〜１％のアルブミンまたはマンニトールを含有するリン酸緩衝化生理食塩水に上記のＡ４ｉおよび／またはそのアナログを溶解させると、注射に適した静注用処方が得られる。

爽且ｌユ」− 局部　・碍　組成物薬学的に有効な本発明の局部用組成物は、好ましくは包帯剤の形態をとる。このような包帯剤は、擦過創を受けた組織の被覆剤として一般に使用される軟膏に類似した外用薬的塗布剤である。Ａ４ｉタンパク質および／またはその゛ｒアナログ石油ガーゼに添加することができる。石油ガーゼは、無菌融解白油を事前に切断した無菌が・−ゼに、ガーゼ２０グラムに対して石油６０グラムの割合で添加することによって調製したものである。Ａ４ｉタンパク質またはアナログは、特定の患者の必要に応じた量だけガーゼに添加され得る。しかし、そのようなタンパク質の添加量は、一般的にガーゼ２０グラムおよび石油６０グラムに対して約１〜１０グラムの範囲で比較的少量である。感染防止を補助するために包帯剤に局部用抗性物質成分を添加し得る。

去Ｊ１引上」− 敬１豆ムエニ玉創傷および擦過傷を受けた組織の治療に有用でありかつＡ４１タンパク質およびそのアナログとの経皮的および経粘膜的浸透を得るために有用である局部用クリームは、種々の不活性賦形剤材料をＡ４ｉタンパク賃および／またはそのアナログと混合することによってＸＬａできる。その割合は一般にタンパク質１〜１０重量％に対して賦形剤約９０〜９９重量％である。賦形剤材料は、好ましくは粘滑薬である。これは、特に粘膜および擦過創を受けた組織の刺激を緩和するために主として用いられる保護剤である。有用な粘滑薬には、粘漿薬、ガム、デキストリン、スターチ、特定の糖、多価グリコールがある。粘液自体が天然の粘滑薬である。合成粘液クリームは当業者に既知のものであり、局部塗布剤としてタンパク質と結合する賦形剤ベース材料として作用し得る。

夾嵐匹上上匙旌亙処方擦過創を受けた眼組轍の治療のために、Ａ４１タンパク質および／またはそのアナログを含有する眼病用処方を調製することができる。そのような眼病用処方が、１〜１０重量％のＡ４１タンパク質および／またはそのアナログを従来のコンタクトレンズ用湿潤液に加えることによって調製し得るからである。そのような溶液は水とポリビニルアルコールとを含ム。ポリビニルアルコールはコンタクトレンズによって一般に引き起こされる刺激から眼ｆｔ深護する粘滑薬として作朋する。

本発明の作製および使用に関する好ましい実施態様を記述１−だが、本発明から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得ることは認められる。

以下の培養物は特許を目的に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ。

＋１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、　Ｒｏｃｋｖｔｌｌｅ、　ＭＤ、　ＵＳＡに寄託されている。ノ＜クテリオファージ、ファージλＳＭ２．１５Ｍ２Ｗ９、およびλＡＰＣＰ１６８ｉ４は、「微生物の寄託に関する国際的認識に関するブダペスト条約」（ブダペスト条約）に規定された条件の下に寄託された。

培」１匁　受ｌヨＥ団　寄上ｊ目１住 λＳＭ２　４０２７９　１９８６年１１月１３日５Ｍ２Ｗ４　４０２９９　１９ｇ６年１２月２９日５Ｍ２Ｗ３　４０３００　１９８６年１２力２９日λ５Ｍ２Ｗ９　４０３０４　１．９８７年１月２９日λＡＰＣＰ１６Ｂ＋４　４０３４７　１９８７年７月　１日寄託された株が取得出来るということを、自国の特許法に基づいた、政府の権威の下に保証された権利に違反した、本発明を実施する権利ライセンス、であると解釈し°Ｃはならない。

ｗｕｅ　ｃｏロク　ヘＱｗ　＋ａＣ５−ローーーＥ−４ニ　ロトΦ　１０Φ　− Ｕ；　さぺＸ０＆４Ｑ４−ｈＪ　ｐ−１＠り　ヘペト　ヘ−−８）４６Ｇ　＋− １−ロク　ａｖｒ　＜”：ｓ？、α　ｌ−４市　←・トド　〇〉　トド　ゴご　８Ｓヨ３　＜−〇　乏・　０ｈｗ　！４ｔａＵ　・ＣＪ：ｌ：　＆４ｕ　Ｅ４！４りＣ５：Ｉ　ロ１　Φ■　ぺΦ　Ｏコ ←Φ　ロー　トド　ベート−２ご　＜＜　ベト　ロロ叶１　Ｉ３　さ■　ミ要くコ　（ＪＷ　ＣＪＣ：　＜ロトの　トド（Ｊ　ｈａ　（ｓ　乏；　０゛＜Ｏｕｌ　−：　炬β　００トドＣＪＧＬＩ　１，５０　ロＱ＜Ｎｈａ　＜’５　−φ　ぺ− Ｅ＠＝トΦ　ペー　トド？ＣＬ＋　ｕｔ、、ｌ　（Ｊエ　ロ〉 υコ　〇−υ−−０トΦ　トド　ベト　Ｑ− Ｑ−ロ〉トド　リ− （ＪＷ　ｌｉ、＋ロ　Ｉ−ＩＱｌ　ロφ（＞　υ−＜１！−４）４　ＣＪ−Φぺ　乏ごトΦ　ト−ロ　Ｑコ ←−（−＜・　トΦ ＜ｍ　ｕｃ　ｈ　ｕｔａ＜・　トド　ベコ　０偽トート喝　！−１ｖ　ローベＨロ＞　ｕｖ　ｈｈ話　臼　・・　ぺ− Ｕ嘘　Ｃ５Ｃ：！−１（Ｊ　ＣＪローψ　＜ｏ　＜ｃｎ　！−１α ぺ一　〇−〇− Ｕエ　。２　６４　１錠ｈｗ　Ｃ：ｌコペー　トロ　ヨＥ、　＜ａｚト− （Ｊ　：！：　Ｅ＠　Ｊ　（ｉ−＋１−＋−ｏｏ’＋Ｃり＞　中＞　＜＜　３Ｂト市　トド　ロー１トｆ８゜の８ト〜　−の〇ミ３　と５５：　ｅ　￥ｒフトψ　トリ　Ｑ〉￥ｒ　ε　、、、５♀ トｏ、　ｏｏ　Ｌ）＞ＬＪ　ｕ　ｇｕ！：　に　ロ　じじ　０じ　Ｑ　Ｑ　じ）−＋　←　←トリ　＊　Ｌ：ｌ＋、：１ヨ　ヨ　・・（ＪＬＪ　ｕ己　三　°′ Ｌ、５　ｃＬ５　ロＩ／ＩＩ／１に２　＝乏　；な蝙８　。　閂ｕ　Ｑ　リ　ロ　−− ｈ　ｓ−ａｘ＜５５　旨　旨　ＬＪＬＩｔ５　ロ　ロ　ロｎ　い　ｎ　艶　ｎ　か誹　ン　ユ　ユ　ユ　ユＦＩＧ、　８Ａ。

Ａ４７５．−ワクチンウ４ノｂスｔ；分゛〜としγこＣＶ４５ｆＪＥ１已ＦＩＧ、１５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．繊維素溶解阻害活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な賦形剤；およびアミノ配配列が：【配列があります】であるタンパク質の繊維素溶解阻害に有効な量；を含有する、組成物。
２．被験体の創傷部位におけるフィブリン溶解を不活性化する方法であって、修復を要する創傷部位に、有効な量の請求項１に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する方法。
３．前記薬学的に許容可能な組成物が接着性フィブリンとの組み合わせで投与される、請求項２に記載の方法。
４．血栓溶解活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な賦形剤中に分散した血栓溶解に有効な量のタンパク質を含有しており、該タンパク質のアミノ酸配列が：【配列があります】である、組成物。
５．被験体におけるプロトロンビン活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の請求項４に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
６．抗炎症活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な賦形剤中に分散した抗炎症作用に有効な量のタンパク質を含有しており、該タンパク質のアミノ酸配列が：【配列があります】である、組成物。
７．被験体における炎症を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の請求項６に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
８．抗癌作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な賦形剤中に分散した有効な量のタンパク質を含有しており、該タンパク質のアミノ酸配列が：【配列があります】である、組成物。
９．被験体における腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍成長を伴う被験体に、薬学的に有効な量の請求項８に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
１０．請求項１に記載の繊維素溶解阻害活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、前記タンパク質が、単離された天然の、クローン化された組み換えあるいは合成の、生物学的に活性の、再び折り畳まれた、実質的に精製されたタンパク質である、組成物。
１１．繊維素溶解阻害活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが繊維素溶解阻害に有効な量存在する、組成物。
１２．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的に許容可能な組成物。
１３．繊維素溶解阻害活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が中性疎水性アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが繊維素溶解阻害に有効な量存在する、組成物。
１４．前記中性疎水性アミノ酸がロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群より選択される、請求項１３に記載のタンパク質。
１５．被験体の創傷部位におけるフィブリン溶解を不活性化する方法であって、修復を要する創傷部位に、薬学的に有効な量の請求項１３に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
１６．前記薬学的に許容可能な組成物が接着性フィブリンとの組み合わせで投与される、請求項１５に記載の方法。
１７．請求項４に記載の血栓溶解活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、前記タンパク質が、単離した天然の、クローン化された組み換えまたは合成の、生物学的に活性の、再び折り畳まれた、実質的に精製されたタンパク質である、組成物。
１８．血栓溶解活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】　の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが血栓溶解に有効な量存在する、組成物。
１９．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的に許容可能な組成物。
２０．血栓溶解活性を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が中性疎水性アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログの量が血栓溶解に有効な量存在する、組成物。
２１．前記中性疎水性アミノ酸がロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群より選択される、請求項２０に記載のタンパク質。
２２．被験体における血餅を溶解するかあるいは防止する方法であって、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の請求項１８に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
２３．前記薬学的に許容可能な組成物が、へバリンとの組み合わせで投与される、請求項２２に記載の方法。
２４．請求項６に記載の抗炎症作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、前記タンパク質が、単離した天然の、クローン化された組み換えまたは合成の、生物学的に活性の、再び折り畳まれた、実質的に精製されたタンパク質である、組成物。
２５．抗炎症作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体と；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが炎症の阻害に十分な量存在する、組成物。
２６．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項２５に記載の薬学的に許容可能な組成物。
２７．抗炎症作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が中性疎水性アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが炎症の阻害に十分な量存在する、組成物。
２８．前記中性疎水性アミノ酸がロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群より選択される、請求項２７に記載のタンパク質。
２９．被験体における炎症を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の請求項２５に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
３０．前記薬学的に許容可能な組成物が、非ステロイド系抗炎症薬剤との組み合わせで投与される、請求項２９に記載の方法。
３１．請求項８に記載の抗癌作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、前記タンパク質が、単離した天然の、クローン化された組み換えまたは合成の、生物学的に活性の、再び折り畳まれた、実質的に精製されたタンパク質である、組成物。
３２．抗腫瘍発生作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが腫瘍発生活性の阻害に十分な量存在する、組成物。
３３．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項３２に記載の薬学的に許容可能な組成物。
３４．抗癌作用を有する薬学的に許容可能な組成物であって、薬学的に許容可能な担体；および【配列があります】の配列中の１３位のアルギニンに対応するアミノ酸が、中性疎水性アミノ酸に置換されたタンパク質アナログ；を含有し、該アナログが腫瘍発生の活性の阻害に十分な量である、組成物。
３５．前記中性疎水性アミノ酸がロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群より選択される、請求項３４に記載のタンパク質。
３６．被験体における発癌作用を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の請求項３２に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
３７．前記薬学的に許容可能な組成物が抗癌薬との組み合わせで投与される、請求項３６に記載の方法。