JPH02211870A - 新規なポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明はグラスミノーゲン賦活体作用を有する新規なポ
リペプチド及びこれを含有する疾病制御用医薬に関する
ものである。

（従来技術及び技術的背景） 成熟したヒトの組織におけるプラスミノーゲン賦活体（
ｔＰＡ　）は、５２７のアミノ酸を含有し、分子量的６
８　ｋＤのポリペプチドである（「ネイチャーＪ　３０
１　（１９８３）　２１４−２２１頁のペニカ（Ｐｅｎ
ｎｉｃａ）らの論稿及びＰｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　（１９８４）　５３５５
−５３５９のニイ（Ｎｙ　）らの論稿）（添附図面１ａ
−１ｃ図参照］。この分子はドメインと称される数個の
明白に分けられた領域を有し、種々の機能が割当てられ
ている。Ｎ末端はフィブロネクチンの場合と合致するフ
ィンガー領域により形成されている。これに続いて、若
干の成長ファクタと類似する領域がある。これに続いて
２個のクリングルドメインがある。単一鎖分子が２個の
連鎖に分割される分割域に続いてプロテアーゼドメイン
があるが、これは活性中心を有し、他のセリンプロテア
ーゼと相同関係を有する。

組織プラスミノーゲン賦活体は、これを興味ある分子と
する若干の特性を有する。すなわち、とのｔＰＡはフィ
ブリンに対して高い親和性を有し、プラスミノーゲン賦
活性はフィブリンに依存する。

プロテアーゼとしてｔＰＡはプラスミノーゲンを分割し
てプラミンとし、これはフィブリンを切断して分解産物
とする。さらにｔＰＡ　、すなわち組織プラスミノーゲ
ン賦活体は、比較的短かい半減期を有し、この分子は迅
速に分解されて肝臓に至る。

これらファクタの効果は、ｔＰＡがことに生体内におい
て血餅でプラスミノーゲンを活性化してプラスミンとし
、フィブリ／を分割することにより、血管中における流
れを回復することである。従ってｔＰＡは例えば心筋梗
塞後の繊維素溶解治療に使用され得る。

（発明の要約） 本発明者らは式、ｔＰＡ　）−６４−Ｘ−ｔＰＡ　１’
ｔ２−　Ｉｆ？（式中、ｔＰＡｌ−ｉｓ及びｔＰＡｌｖ
ｚ−ｙｔｐｒはヒトの成熟組織プラスミノーゲン賦活体
のアミノ酸１−５４及び１７２−５２７を、又はアミノ
酸配列、−５ｅｔ−ｔＰＡ１７２ｌ−１？１　　、　−
ｔＰＡｓｉ−＋ｏｓ　　ｓ　　　４；ＰＡｓ＋ｔ−＋３
ｏ−Ａｒｇ−ｔＰＡ＋ｉ。

−１７１或はｔｐＡ、、−、□−ｔＰＡＩＨ１−１７１
を意味し、このｔＰＡ１７２ｌ−＋）蔦　、　　ｔＰＡ
、σ−！０６　、　　ｔＰＡ６Ｔ１−　Ｉ３６　　％　
　　ｔＰＡ　１４０−１月、ｔＰＡＩＩＩｌ−、□及び
ｔＰＡ、３＠−＋＋ｙ＋はヒトの成熟組織プラスミノー
ゲン賦活体のアミノ酸１１１−１７１．及び１３９−１
７１ならびにＮ末端及び／或はＣ末端においてｌ乃至６
のアミノ酸だけ短縮され或は伸張された配列のこれらの
対立遺伝子変異型或は誘導体を意味する）のポリペプチ
ドを新たに見出し、これが上述の点について改善された
特性を有することを発見した。

この新規のポリペプチドは、ｔＰＡのアミノ酸５４と１
７２の間で修飾される。

本発明はまた修飾ポリペプチドの暗号化を行なうＤＮＡ
配列ならびにこれらＤＮＡ配列を含有するベクターに関
する。

（発明の構成） 新規なポリペプチドは、公知の方法で遺伝子操作により
製造され得る。この構造の出発点はｃＤＮＡクローン（
以下においてｐＵＯｔＰＡと称する）であって、これは
ｔＰＡプラス５′−及び３′−非解読領域の暗号配列を
有する。Ａ蛋白質（ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）
は、リーダシーケンス及びプロシーケンスに続いて、Ｓ
ｅｒ　（１）と共に始まり、Ｐｒｏ　（５２７）で終る
。

ｐＵＯｔＰＡは以下のようにして分離される。すなわち
ヒトの子宮組織からｍＲＮＡが分離され、二本＠　ｃＤ
ＮＡに転写される。このｃＤＮＡを市販のクローニング
ベクターｐＵ０９に挿入してから、ｃＤＮＡライブラリ
ーを構成する。このために使用される処理法は、例えば
Ｏ３Ｈ３月マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）らの「モ
レキュラー　クローニング」に記載されている。このよ
うな遺伝子バンクの放射線標識オリゴヌクレオチドによ
るスクリーニングは、これまでにすでに広く使用されて
おり、また諸文献に記載されて〜・る方法である。この
方法を使用して暗号化領域及び隣接領域を含むｃＤＮＡ
クローンを分離することができる。

ｐＵＯｔＰＡのＤＮＡ配列部分は制限酵素を使用して容
易に入手できる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチ
ド、アダプター或は遺伝子断片と関連する場合に、上記
部分断片を使用して、本発明による新規なポリペプチド
を暗号化するＤＮＡ配列なりロ〜二／グすることができ
る。遺伝子断片或は合成りＮＡ配列の、クローニングベ
クター、例えば市販のプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵｏ
　８或は９、ｐＵｏ　１８或は１９、Ｍ　１３　ｍｐ　
１８或はＭ　１３　ｍｐ　１９との合体は、慣用法によ
り行なわれる。また遺伝子或は遺伝子断片に、化学的に
合成され、或はバクテリア、ファージ、真核細胞或はそ
のビールスから分離された適当な制御領域を給付するこ
とも可能である。このようにして得られたハイブリッド
プラスミドを適当な宿主生体に形質転換させ或は感染さ
せることも周知に属する。さらに、ポリペプチドを媒体
中に進入させ得る適当な信号配列をハイブリッドプラス
ミドに供与することも可能である。

哺乳動物細胞中における発現のために、発現されるべき
遺伝子、この場合は変性ｔＰＡ　ｃＤＮＡを、マウスの
メタロチオネイン或はウィルスＳＶ　４０プロモーター
の制御下に置くベクターを使用することができる。発現
に必要であるのは、メチオニン出発コドンとｔＰＡ遺伝
子のリーダシーケンス／プロシーケンスの存在である。

分離されたクローンは、エピゾームとしてのこれらベク
ターのコピーを有するか、或はゲノム中に一体化される
。例えばボヴインパピロマウイルスを基礎として外来遺
伝子を一体化し、発現するのがことに有利である。

バクテリア細胞における複製化のための暗号化を行なう
原核配列及び抗生物質耐性と関連してシャトルベクター
を構成することができる。プラスミドの構成及び増殖は
当初はバクテリア細胞内で行なわれる。次いで真核細胞
、例えばマウス繊維芽細胞系Ｃ１２７に転写される。他
の細胞系、例えば酵母、昆虫細胞、その他哩乳動物の０
ＨＯ１Ｌ及び２９３細胞のような細胞も発現のために使
用され得ることは云うまでもない。

これら真核性発現システムは、その生成物を効率的に、
一般に自然な形態で分泌できる利点を有する。さらにそ
の生成物の闘訳後修飾をなし得ることである。

そこで、組織プラスミノーゲン賦活体が真核細胞に発現
されるとぎ、これは配糖体側鎖をアミノ酸１１７．１１
８及び４４８　（Ａｓｎ　）において獲得する。

バクテリアは配糖体側鎖を合成することができない。バ
クテリアに発現されるｔＰＡ含有真核蛋白質の大部分及
びこれから派生する本発明ポリペプチドは、修飾封入体
として細胞中に現われ、蛋白質化学的手法で復元されね
ばならない。さらに、バクテリアは往々にして完成蛋白
質から本来的なアミノ酸メチオニンを除去することがで
きない。この問題点は分泌システムを使用することによ
り回避することができる。

しかしながら遺伝子暗号の退化のために、他のＤＮＡ配
列、例えば新規ポリペプチド発現のために、異なるＤＮ
Ａ配列の化学的に合成された遺伝子を使用することもで
きる。

新規のポリペプチドは、公知法により化学的親和性及び
イオン交換クロマトグラフィーで培養基から除去精製さ
れ得る。

このポリペプチドは、強い血餅特異性、長い半減期、抑
止されたインヒビター結合及び／或は高い蛋白質分解活
性を有し、従って血栓崩壊に対して使用可能である。こ
の点に関する本発明ポリペプチドの効果は、ヒト組織プ
ラスミノーゲン賦活体よりも秀れている。

そこで、この新規のポリペプチドの少くとも１種類と、
薬学的に容認される担体或は結合剤を含有する医薬も、
また本発明の対象となる。この薬剤はこの新規のポリペ
プチドと、例えばプロウロキナーゼ、ウロキナーゼ或は
ストレプトキナーゼ或はこれらの誘導体のような他のフ
ィブリン溶解剤、及び他の薬学的蛋白質、例えば超酸化
ジスムターゼとの組合せも含まれる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、遺伝子操作に関しては、コールド、スプリング、ハー
バ−ラボラトリ−１９８２年刊、マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　）もの「モレキューラ−クローニング」を参
照され度い。

一ノの分離 ｔＰＡをもたらす、ヒトの子宮組織３０　ｆを、Ｕｌｔ
ｒａ［Ｆ］ −Ｔｕｒｒａｘ　　により、６Ｍのグアニジニウムチオ
シアナート、５　ｍＭのくえん酸ナトリウム（ｐＨ７，
０）、０．１　Ｍの２−メルカプトエーテル、０．５％
サルコシル中に均質分散させた。３０００　ｒｐｍ、遠
心分離で、細胞砕片を除去した。５．７Ｍの０ａｔ１緩
衝液を経て、１夜、４５，０００　ｒｐｍの遠心分離に
よりＲＮＡを除去した。ｐｏｌｙ　Ａ　含有ＲＮＡをス
タータとしてオリゴ（ｄＴ）１２−１８及びＡＭＶ逆転
写酵素を使用して、単一鎖ｃＤＮＡに転写した。第２鎖
はＥ、コリＤＮＡポリメラーゼエを使用して形成した。

酵素Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてＳａｌニリンカーを
二重鎖ｃＤＮＡに付着した。市販のプラスミドｐＵｃ！
　９を制限酵素Ｓａｌ工で直鎖化した。２個のＤＮＡを
連結−体化して、得られたハイブリッドをＥ、コリ株Ｈ
Ｂ１０１のＣａＯ１２処理反応性細胞の形質転換に使用
した０ 細胞を１００μｆ／−のアンピシリンを含有するＬＢ皿
に置き、３７°Ｃで１夜培養した。コロニーを０．５　
Ｎ　ＮａＯＨ／　１．５　Ｍ　Ｎａ１ｌを含浸したニト
ロセルロースフィルターに移し、８０℃で２時間焙焼し
て変異型ＤＮＡをフィルターに結合した。フィルターは
、あらかじめ、６　ｘ　５ＦｉＴ緩衝液（１ｘ　ＳＥＴ
　＝０．１５　Ｍ　Ｎａ１ｌ、１５　ｍＭ　）リス／Ｈ
ＯＩ、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）、０．１％Ｓ
ＤＳ及び５ｘデンハルト溶液（１００ｘデンハルト＝５
０−当りフィニル１２、ポリビニルピロリド／Ｉｆ、Ｂ
ＳＡ１ｆ）中において６８℃で４時間プレハイプリダイ
ゼイション処理した。以下の配列を有するｔＰＡ　ＤＮ
Ａの１７の塩基をそれぞれ含有する３種類のオリゴヌク
レオチド試料を作製した。

５’　ＴＧＯＡＧＡＴＣＡＣ！ＴＴＧＧＴＡＡ　３’５
’　０ＯＡＧＧＯＣ！０ＡＧＴＧＯＯＴＧＧ　３’５’
　ＴＯＯＡＧＴＣＯＧＧＣＡＧＯＴＧＣ！　３’これら
試料ヲ５′においてγ−”Ｐ　−ＡＴＰで標識した。こ
の試料を６　ｘ　ＳＥＴ　、　０．１％ＳＤＳ、５ｘデ
ンハルト溶液及び１０％テキストランスルフアートを含
有する溶液中で上記処理したフィルタと共に軽く振とう
しつつ４２℃で１夜培養した。４２°Ｃにおいてフィル
タを６　ｘ　ＳＥＴ　／　０．１％ＳＤＳで数回洗浄し
、乾燥し、Ｘ線フィルムに被曝させた。スクリーニング
で放射線応答するクローンを分離してさらに培養した。

以後ｐＵｃ！ｔＰＡと称する１個のクローンは約２．１
　ｋｂのサイズで、５′−及び３′−非暗号化領域（第
２図）と共に暗号化領域を有する挿入体を含有する。ｐ
ＵＯｔＰＡからのプラスミドＤＮＡはりゾチーム消化、
バクテリア培養のＳＤＳ　／アルカリ処理、次いでＣ！
ｓｏｌ勾配遠心分離により作製された。

実施例　２ 繊維芽細胞に発現され、テストに附された。

出発材料はプラスミドｐＵＯｔＰＡ　（第２図）であっ
て、あらかじめ制限酵素エンドヌクレアーゼで切断され
た。ＤＮＡは種々の混合物でエキソヌクレアーゼＢＡＬ
　３１により０乃至１０分処理された（第３図）。反応
はいずれの場合もｌ１ＧＴＡで停止された。

ＤＮＡはアルコールで沈澱せしめられ、洗浄され、次い
でマングビーンヌクレアーゼで処理された（平滑末端）
。フェノ−Ｊｖ／クロロホルム抽出及び他のアルコール
による沈澱処理に続いて、ＤＮＡはＴ４リガーゼと再結
合されＥ、コリＯＭＫ　６０３に転換された。

プラスミドは形質転換体から分離され、ＦｉｃｏＲ工で
切断された。このようにして種々の大きさのｔＰＡ遺伝
子を同定することができた。解読枠（アミノ識配列）を
決定するために若干のｔＰＡ遺伝子が大ぎさの異なるも
のを除いて配列された。連続解読枠を有する除去変異体
はプラスミドｐｃＬ２８Ｘｈｏ　ＢＰＶにクローン化さ
れ（第４図）、マウスの出発材料はプラスミドｐＵｃｔ
ＰＡ　（第２図）であって、これは１種類の混合物でＮ
ａｒ工によりあらかじめ切断された。次いで第２の混合
物でＮａｒ　Ｉ及びＳｔｙ工により予備切断が行なわれ
た（第４図）。

比較的大きいバンド（はぼ４１５０の塩基対＝ベクトル
バンド＋ｔＰＡ　３’末端）がアガロースゲルで上記第
１混合物から分離された。

バンド４５７塩基対がアガロースゲル（＝ベクターのＮ
ａｒ工／　Ｓ＆ｌ工断片及びｔＰＡ　５’末端）で上記
第２混合物から分離された。

この両断片をタレノーポリメラーゼで処理し、５′突出
末端を充填して平滑末端とした。これにより短少化ｔＰ
Ａ遺伝子の解読枠中に残留することが保証された。フェ
ノール／クロロホルム抽出及びこれに次ぐアルコール沈
澱後、両断片はＴ　４１Ｊガーゼにより相結合され、Ｅ
、コリＯＭＫ　６０３に形質転換された。プラスミドが
若干の形質転換体から得られ、制限酵素（例えばＡｖａ
工）で分析される。

短少化ｔＰＡ遺伝子のＤＮＡはチエツクのため配列され
、次いでクローンでプラスミドｐＯＬ　２８　Ｘｈｏ　
ＢＰＶ（第４図参照）、マウス繊維芽細胞中に発現し、
テストされた。

サルウィルス５ｖ４０のＤＮＡを制限酵素Ｂ　ａｍＨ工
及びＢｃｌ　Ｉで切断し、０．２４　ｋｂ断片をゲル電
気泳動で作製した（第５図参照）。末端を４種類のデオ
キシヌクレオチドトリホスファ−）　ｄＡＴＰ　、　　
ｄｃＴＰ　。

ｃｌＧＴＰ、　ｄＴＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼ
エのクレノー断片を使用して充填した。次いでＸｈｏｌ
エリ／カーが連結された。

これと併行して市販のベクターｐＵｏ　１８が酵素Ｓｍ
ａ工により直鎖化され、次いで同様にＸｂａ工が連結さ
れた。このベクター（ｐＵｏ　１８　Ｘｈｏ　）のＤＮ
ＡをＸｂａ工で直鎖化し、アルカリ性ホスファターゼで
処理し、０．２４　ｋｂのＸｈｏ工ＳＶ　４０断片（上
述したところを参照ンと連結した。これによりｐｓｖｐ
Ａが得られた。

このｐＳＶｐＡ　ＤＮＡをあらかじめＸｂａ工で切断し
、上述同様４種類のｄＮＴＰａの存在下にクレノーポリ
メラーゼと共に培養された。ゲル電気泳動により０．２
４　ｋｂの断片が分離された。

同時にＯｒ、＋　２８　Ｘ及びｐＢ　２−２の連結（Ｄ
ＮＡ　６　（１９８７）　４６１−７２頁、レディ（Ｒ
ｅ＋ｌｙ　）らの論稿参照）により得られた真核性発現
ベクターＣＬ　２８ＸｈｏＢＰＶを制限酵素Ｘｂａ工で
部分的に切断した。

すなわち培養が時間的に制限され、生成分子は２個のＸ
ｂａ　Ｉ認識配列のうちの１個のみにおいて切断され、
従って直鎖化されている（第６図参照）。

この混合物を上述のようにタレノーポリメラーゼ及び（
ｌＮＴＰ８と反応させた。次〜・でゲル電気泳動で直鎖
分子を分離した。

この直鎖ｐＯＬ　２８　Ｘｈｏ　ＢＰＶ断片をＳＶ　４
０からの予備処理０．２４　ｋｂ断片に連結した。形質
転換及び溶菌液によるスクリーニング後、Ｘｈｏ工位置
から３′方向に約０．１５　ｋｂの距離にある前Ｘｂａ
工位置に５７４０断片を保持するクローンが分離された
。このＤＮＡ　（ｐＯＬ　２８　Ｘｈｏ　ＢＰＶ　−Ｅ
ＪＶｐｏ　ｌ　ｙ　Ａ　）は「原」遺伝子のＳＶ　４０
転写停止信号を保持した。

ＰＣ！Ｌ　２８　Ｘｈｏ　ＢＦＶ　−ＥＪＶｐｏ　１．
　ｙ　ＡからのプラスミドＤＮＡは制限酵素Ｘｂａ工で
直鎖化され、アルカリ性ホスファターゼで処理された。

同時にｐＵＯｔＰＡ−ＯＴＸ、　−ＣＴＮ、　−ＯＴＴ
、　−ＣＴＦｇ、　−０ＴａＩＦ。

ＯＴＶ　（実施例２及び３で得られた）を酵素５ａｌＩ
で切断し、約２．１　ｋｂサイズの挿入体を作製した（
第７図）。両断片を、Ｔ４リガーゼを使用して連結した
。形質転換及び溶菌液処理後、変異ｔＰＡＤＮＡのみを
正確な配向で含有するクローンを分離した。ｐＯＬ２８
　ＢＰＶ　−ｔ−ＰＡ　−ＯＴＸ、　　−ＯＴＮ、　　
−ＯＴＴ。

−ＣＴＦｇ　、　−ＯＴａ？　、　−ＣＴ’Ｖ　００１
２７１細胞（ＡＴＯＯ、細胞系及びハイプリドーマのカ
タログ、１９８５年第５版、１４２頁、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ
。

２６　（１９７８）　２９２　）を、カルシウムホスフ
ァート共沈澱法（「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｊ　５２　（１
９７３）　４５６頁、グローバーエＲＬブレス１９８５
年刊Ｉ　ＤＮＡクローニングＪＩ巻１４３頁以降及び２
１３頁）により、ＢＰＶ発現プラスミドでトランフエク
ション、すなわちＤＮＡ感染させた。

５　ｘ　１０”のＣ１２７エ細胞を６０鴎ペトリ皿中の
ＤＭＥＭ　（ドウルペツコの変性イーグルス媒体）＋１
０％ｙｅｓ　（仔牛血清）に接種した。翌日媒体を２５
ｍＭのＨＩＣＲＰＥＳ　＋　１０％Ｆａｓを含有するＭ
ＥＭ　（変性イーグルス媒体）に変えた。１０μ２のＣ
ｓ０１精製プラスミドＤＮＡを使用してＯａホスファー
ト共沈体を形成し、Ｃ１２７エ細胞上に注意深く載置し
た。トランスフェクション、すなわちＤＮＡ感染の効果
はグリセロールショック処理により著しく高められた。

このため沈澱物の載置から４時間後に細胞から媒体を吸
引除去した。ｌ）Ｑｍペトリ皿に対して１５％グリセロ
ール／　ＨＢＳ　（「ＤＮＡクローニング」■巻１５２
頁）２−で室温において３分間培養した。

グリセロール／　ＨＢＳ溶液を吸引除去し、細胞を３−
のＤＭＥＭ　−）−１０％ＦＣ８で洗浄した。この細胞
をＤＭＫＭ　＋　１０％ｙｅｓにより３７℃７％ＣＯ宜
において培養した。１週間に３回この媒体を吸引除去し
、新しい媒体と交換した。

ＢＦＶゲノムを含有するＤＮＡ感染細胞は、２−３週間
後形質転換細胞集落であることが確認すれた。

上述したｔＰＡムティンを形質発現する細胞集落は、カ
ゼイン寒天被覆（後記）により確認された。

３７℃、７％ＣＯ，で２乃至３時間培養した後、溶菌帯
域が半透明カゼイン寒天中でｔＰＡ発現細胞が位置する
点として明らかに認められた。カゼイン寒天を除去後、
これら点部分に存在する細胞をクローニングシリンダ法
（「ＤＮＡクローニング」８巻２２０頁）で分離した。

得られた細胞系をＤＭＥＭ　＋１０％ｌＰＯ３で標準法
により培養した。細胞系が密集体となった後、血清を含
まないＤＭＥＭ中に保持した。この血清を含まない細胞
培養基からのｔＰＡムテイ／浮遊物はさらに精製される
ことができる。

上述した寒天被覆試験には以下の溶液が必要とされる。

（１）８％のスキムミルク水溶液を１００℃で３０分間
沸騰させ、水浴中で３７℃に冷却した溶液、（２）低融
点アガローゼの２％濃度のＰＥＳ溶液をオートクレーブ
加熱し、水浴で３７℃に冷却し、濃縮ＤＭＥＭを１：１
の割合で添加した溶液、（３）　０．６４　ｆのプラス
ミノーゲンを１−の水に溶解し、上記溶液（２）１６ｍ
、上記溶液４ｄ及びプラスミノーゲン溶液０．４−をピ
ペットで置針混合して寒天被覆剤を調製し、水浴で３７
℃に保持する。

テストのため６０闘ベトリ皿中で細胞を血清を含まない
媒体で２回洗浄する。次いで２−の寒天被覆剤をピペッ
トで各ペトリ皿に入れる。これを放冷し、室温で寒天を
固化させる。次いで３７°Ｃ１７％ＣＯ，で２乃至３時
間培養し、溶菌帯域の寸法及び数を測定する。

実施例　６ 新規ポリペプチドの分離 無菌濾過及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ”　　ｓｏの添加後
、エリトリナトリプシン阻害剤セファロース（ＥＴエセ
ファロース　ｌ　ｃｍ　×３　ｃｍ　）上アフイニテイ
クロマトグラフイーにより、実施例５で得られた血清を
含まない細胞培養浮遊物からｔＰＡムティンを分離した
。ＥＴエアフイニテイーマトリックス調裂のため、５■
のＩＴ工を１−の０ＮＢｒ活性化セフアロース４Ｂに合
併した。このゲル材料を２０　ｍＭのＮａホスファート
、０．１５　Ｍ　Ｎａ１ｌ、Ｏ、Ｏ’　１％Ｔｖｒｅｅ
ｎ”　８０、ｐＨ７，０で平衡化させてから細胞培養浮
遊物を載置した。載置後、ゲル材料を同じ緩衝液で処理
して、非特定的に結合された材料を除去した。特定的に
結合されたムチ−（７Ｙ　Ｏ，Ｉ　Ｍのグリセリン、０
．１　Ｍのアルギニン／　ＨＣＩ　、　　０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ”　８０　。

ｐＨ３，０で溶出し、脱着した。結合溶出物をｏ、ｉＮ
水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５，０に調整した。

或は溶出物を２０　ｍＭのナトリウムホスファート、２
５０　ｍＢ＋のＩＪａＣｌ、ｎ、ｏｉ％Ｔｗｅｅｎ■８
０の３倍量で希釈し、ｐ！！７．０に馬整した。分離ム
チンをさらに精製するため、蛋白質溶液を２０　ｍＭの
ナトリウムホスファ−）、２５０　ｍＭのＭａｉｌ、０
．０１％Ｔｗｅｅｎ”８０　、　ｐ）Ｈ７，０で平衡化
したリジンセファロ−ヌカ２ム（）　＝ｔｍ　×？　ｃ
ｔａ　）に装荷した。非特定的に結合さ３１．り材料ン
２０　ｚＭのナトリウムホスファート、Ｑ、（１１（’
のＴ、ｔｅｓ・ａ”　’ｉ１７２　、、　ｐＨ６，５で
洗浄除去した。

特定的に結合されたムティンを２０　ｍＭのナトリウム
スルファ−）、０．４Ｍのアルギニン、　０．０１％の
Ｔｖｅｅｎ”　８０　、　ｐＨ６，５で脱着した。最後
に蛋白質溶液を２０　ｍＭのナトリウムホスファート、
０゜ＩＭのアルギニン、０．０１％のＴｗｅｅｒＰ８０
　、　ｐＨ５，０に対して透析し、使用されるまで一２
０℃で貯蔵した。

実施例６により得られた５−１０μｇのムティンをＳＤ
Ｓゲル電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜上に
移送した。０．１％のＴｗｅｅｎ”　２０、ｐＨ７，４
を含有するＰＢＳ緩衝液（２ｍＭのホスファート、１５
０　ｍＭのＮａ１ｌ、ｐＨ７，４）で飽和した後、この
ニトロセルロース膜をペルオキシダーゼに結合されたグ
リフオニアシンプリシフオリアからのレクチンで２時間
培養した。ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１５０　
ｍＭのＭａｉｌ、ｐＨ７，４）を使用して非結合材料を
除去した後、ニトロセルロースＹ　５０　ｍＭのトリス
、１５０ｍＭのＭａｉｌ、０．０２％のＨ２Ｏ，及び０
．５η／−の４−クロル−１−ナフトール中で５−１０
分培養した。積極的反応が５分以内に蛋白質バンドの青
色化に可視的となった。次いでニトロセルロース膜を水
中に移して反応を停止した。

オリゴサツカリド残渣は、第８図に示されるようにβ−
結合サブターミナルガラクトース残渣に結合されたα−
結合ガラクトース残渣を含有する。

このα−ガラクトース残渣は６′ガラクトースに優勢的
に存在する（糖残渣ナンバリングの８図参照）。

他のサブターミナルガラクトース残渣はシアリン酸或は
他のα−結合ガラクトースの何れかにより置換されてい
る。

【図面の簡単な説明】

添附図面中筒１図はヒト組織プラスミノーゲン賦活体の
配列を示す図面、 第２図は本発明ポリペプチドの出発材料であるプラスミ
ドｐＵｃｔＰＡを説明する図面、第３図は実施例２にお
ける上記出発材料の処理を説明する図面、 第４図は実施例２に相当するが、これとは異なる実施例
３の処理を説明する図面、 第５図は実施例４における修飾ｔＰＡ　ＤＮＡの形質発
現用ベクターを構成する処理の一部を説明する図面、 第６図は上記処理の他の一部を説明する図面、第７図は
上記処理のさらに他の一部を説明する図面、 第８図はオリゴサツカリドの構成を説明する図面である
。 代理人弁理士　　１）　　代　　　熱　　　治Ｇａｌ　
　　　＋ｗ　　ガラクトース Ｍａｎ　　　舞　マンノース ＧｌｃＮＡｃ　’＊　Ｎ−７ｑすＪＬ／グルコＴ？ＶＦ
ｕｃ　　　−フコース Ｓｌａ　　　　ｍ　　シアソン町（ ＾ｓｎ　　　ｓ　　プス１リイン 手続補正書（方式） ５．補正命令の日付 平成１年 ２月２６日 （発進口） 平成２年 １月２４日 ６、補正の対象

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）式、ｔＰＡ＿１＿−＿５＿４−Ｘ−ｔＰＡ＿１＿
   ７＿２＿−＿５＿２＿７（式中、ｔＰＡ＿１＿−＿５＿
   ４及びｔＰＡ＿１＿７＿２＿−＿５＿２＿７はヒトの成
   熟組織プラスミノーゲン賦活体のアミノ酸１−５４及び
   １７２−５２７を、Ｘはアミノ酸配列、−Ｓｅｒ−ｔＰ
   Ａ＿１＿１＿１＿−＿１＿７＿１、−ｔＰＡ＿５＿５＿
   −＿１＿０＿５、−ｔＰＡ＿５＿５＿−＿１＿３＿０−
   Ａｒｇ−ｔＰＡ＿１＿４＿０＿−＿１＿７＿１或はｔＰ
   Ａ＿５＿５＿−＿１＿２＿５−ｔＰＡ＿１＿３＿９＿−
   ＿１＿７＿１を意味し、このｔＰＡ＿１＿１＿１＿−＿
   １＿７＿１、ｔＰＡ＿５＿５＿−＿１＿０＿５、ｔＰＡ
   ＿５＿５＿−＿１＿３＿０、ｔＰＡ＿１＿４＿０＿−＿
   １＿７＿１、ｔＰＡ＿５＿５＿−＿１＿２＿５及びｔＰ
   Ａ＿１＿３＿９−＿１＿７＿１はヒトの成熟組織プラス
   ミノーゲン賦活体のアミノ酸、１１１−１７１、５５−
   １０５、５５−１３０、１４０−１７１、５５−１２５
   及び１３９−１７１ならびにＮ末端及び／或はＣ末端に
   おいて１乃至６のアミノ酸だけ短縮され或は伸張された
   配列のこれらの対立遺伝子変異型或は誘導体を意味する
   ）のポリペプチド。
2. （２）請求項（１）によるポリペプチドを暗号化するＤ
   ＮＡ配列。
3. （３）請求項（１）によるポリペプチドを暗号化するた
   めの遺伝子配列を有するベクター。
4. （４）請求項（１）による少くとも１種類のポリペプチ
   ドを、場合により薬学的に容認される担体乃至結合剤中
   に、含有する医薬。
5. （５）請求項（４）による医薬であつて、請求項（１）
   による少くとも１種類のポリペプチドと、他のフィブリ
   ン溶解剤との組合せを含有する医薬。