DE60013689T3 - Verfahren zur Herstellung natürlich gefalteter und sekretierter Proteine - Google Patents

Verfahren zur Herstellung natürlich gefalteter und sekretierter Proteine Download PDF

Info

Publication number
DE60013689T3
DE60013689T3 DE60013689T DE60013689T DE60013689T3 DE 60013689 T3 DE60013689 T3 DE 60013689T3 DE 60013689 T DE60013689 T DE 60013689T DE 60013689 T DE60013689 T DE 60013689T DE 60013689 T3 DE60013689 T3 DE 60013689T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polypeptide
medium
arginine
periplasm
signal sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60013689T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60013689D1 (de
DE60013689T2 (de
Inventor
Dorothee Ambrosius
Rainer Rudolph
Jörg Schaeffner
Elisabeth Schwarz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8237962&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60013689(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of DE60013689D1 publication Critical patent/DE60013689D1/de
Publication of DE60013689T2 publication Critical patent/DE60013689T2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60013689T3 publication Critical patent/DE60013689T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas
    • Y10S435/877—Pseudomonas putida

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher, natürlich gefalteter und sezernierter Polypeptide nach Expression in prokaryotischen Zellen.
  • Proteinsynthese in prokaryotischen Organismen, welche ebenfalls als Translation bezeichnet wird, findet an den Ribosomen im Cytoplasma statt. Wenn rekombinante DNA in prokaryotischen Wirtsorganismen exprimiert wird, ist es häufig wünschenswert, dass das rekombinante Genprodukt oder Protein, das in diesem Prozess erhalten wird, aus dem Cytoplasma sezerniert wird durch die innere Bakterienmembran in den periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Sezernierte Proteine können dann von dem Periplasma in das Nährmedium z. B. durch osmotischen Schock freigesetzt werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die sezernierten Polypeptide häufig nicht die native, biologisch aktive Konformation bilden (Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456–463; Baynex, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 411–421).
  • In jüngerer Zeit sind molekulare Chaperone und Faltungskatalysatoren, wie etwa Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerasen oder Proteindisulfidisomerasen (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658 ) verwendet worden, um die Ausbeute von nativem rekombinantem Protein bei Faltung in vivo zu erhöhen (Thomas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 66 (1997) 197–238). In einigen Fällen kann dies zu beachtlichen Verbesserungen der Expression von z. B. Ribulosebisphophatcarboxylase (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature 337 (1989) 44–47), Humanprocollagenase (Lee & Olins, J. Biol. Chem. 267 (1992) 2849–2852) oder neuronaler Stickstoffoxidsynthase aus Ratten (Roman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428–8432) führen. In diesen Beispielen wurden GroEL/ES oder das DnaK-System von E. coli in dem Cytosol coüberexprimiert. Die positive Wirkung ist üblicherweise eine erhöhte Ausbeute des gewünschten Proteins in einer löslichen Form.
  • Die Coexpression von Chaperonen ist ebenfalls untersucht worden wenn rekombinante Proteine in das Periplasma von E. coli sezerniert werden. Jedoch wurde in diesem Fall nur eine Cytosolüberexpression von Chaperonen beurteilt, um die Sezernierung in das Periplasma zu optimieren (Perez-Perez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524–529; Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258–264; Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55–60). Frühere Versuche bei der Cosezernierung in E. coli betrafen nur Faltungskatalysatoren, wie etwa z. B. Proteindisulfidisomerase (PDI; Glockshuber et al., EP-A 0 510 658 ) oder Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerasen oder Dsb-Proteine aus E. coli (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77–83; Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol. 64 (1998) 4891–4896 und Schmidt et al., Prot. Engin. 11 (1998) 601–607). Kürzlich führte Coüberexpression des periplasmatischen Skp-Proteins zur Anzeige einer wirkungsvolleren Faltungsphase und höherer Ausbeute von Antikörperfragmenten, die ins Periplasma sezerniert werden (Bothman und Plückthun, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 376–380; Hayhurst und Harris, Prot. Expr. Purif. 15 (1999) 336–343).
  • Verbindungen, wie etwa Harnstoff oder Harnstoffderivate, Formamid, Acetamid oder L-Arginin werden in Verfahren zur in vitro-Renaturierung von unlöslichen Proteinaggregaten (Einschlusskörper) verwendet, welche während der cytoplasmatischen Expression von rekombinanter DNAin prokaryotischen Zellen gebildet werden. L-Arginin kann als ein Additiv beachtlich die Ausbeute von nativ gefalteten Proteinen bei der Renaturierung in vitro verbessern (Rudolph et al., US-Patent Nr. 5,593,865 ; Buchner & Rudolph, Bio/Technology 9 (1991) 157–162; Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (1992) 3075–3079; Lin & Traugh, Prot. Express. Purif. 4 (1993) 256–264; EP 725140 ).
  • Der Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von wasserlöslichen, natürlich gefalteten eukaryotischen Polypeptiden nach Expression in Prokaryoten, welches auf eine einfache Art durchgeführt werden kann und welches keine aufwändige in vitro-Nachbehandlung erfordert, wie etwa Solubilisierung, Reduktion und Renaturierung von Einschlusskörpern, Reduktion und Renaturierung.
  • Der Gegenstand wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, natürlich gefalteten eukaryotischen Polypeptids, das zwei oder mehrere Cysteine enthält, die durch Disulfidbrücken verbunden sind, durch kultivieren prokaryotischer Zellen,
    • a) worin die prokaryotischen Zellen einen Expressionsvektor enthalten, der für das Polypeptid codiert, das eine prokaryotische Signalsequenz am N-Terminus enthält,
    • b) unter Bedingungen, unter welchen das Polypeptid in das Periplasma oder das Medium sezerniert wird,
    • c) Abspalten der Signalsequenz und Isolieren des Polypeptids aus dem Periplasma oder dem Medium,
    worin das Kultivieren ausgeführt wird in der Gegenwart von Arginin oder einer Verbindung der allgemeinen Formel R2-CO-NRR1 (I), worin R und R1 Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte verzweigte oder unverzweigte C1-C4-Alkylkette bedeuten und
    R2 Wasserstoff, NHR1 oder eine gesättigte oder ungesättigte verzweigte oder unverzweigte C1-C3-Alkylkette bedeutet, worin die Konzentration von Arginin oder der Verbindung der allgemeinen Formel I mindestens 0,1 mol/l ist.
  • Die Konzentration von Arginin oder der Verbindung der allgemeinen Formel I ist vorzugsweise mindestens 0,1 mol/l, kann jedoch beachtlich höher sein, vorausgesetzt, die Löslichkeit von Arginin oder der Verbindung ist sichergestellt. Arginin oder die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1,5 mol/l verwendet.
  • Formamid, Acetamid, Harnstoff oder Harnstoffderivate, wie etwa Ethylharnstoff oder Methylharnstoff werden vorzugsweise als Verbindungen der allgemeinen Formel I zu dem Nährmedium gegeben, das verwendet wird, um die prokaryotischen Zellen zu kultivieren. Arginin kann z. B. als das Hydrochlorid oder als eine andere titrierte Form der Argininbase verwendet werden. Jedoch wird L-Arginin vorzugsweise verwendet und die Hydrochloridform von L-Arginin ist besonders bevorzugt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden zusätzlich reduzierende Thiolreagenzien, die SH-Gruppen enthalten, zu dem Nährmedium (Fermentationsmedium) gegeben, das verwendet wird, um die prokaryotischen Zellen zu kultivieren, wodurch die Ausbeute von rekombinant erzeugtem Protein weiter erhöht wird. 0,1–15 mmol/l Thiolreagenz werden vorzugsweise zugegeben. Gemäß der Erfindung bedeutet der Ausdruck ”Thiolreagenz” entweder ein reduzierendes (reduziertes) Reagenz mit SH-Gruppen oder ein Gemisch aus reduzierenden Reagenzien mit SH-Gruppen und oxidierenden Reagenzien mit Disulfidgruppen. Bevorzugte Substanzen sind reduziertes und oxidiertes Glutathion (GSH), Cystein, Cystin, N-Acetylcystein, Cysteamin, β-Mercaptoethanol und ähnliche Verbindungen. Die Thiolreagenzien können einzeln als auch in Gemischen verwendet werden. Thiolreagenzien wie etwa Glutathion (GSH), die eine einzelne SH-Gruppe pro Molekül aufweisen, sind besonders geeignet. Thiolreagenzien, wie etwa Glutathion, sind dafür bekannt, dass sie die Ausbeute von nativ gefaltenen Proteinen verbessern wenn rekombinante DNA in prokyarotischen Zellen exprimiert wird (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658 ).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden molekulare Chaperone zusätzlich überexprimiert und cosezerniert. Chaperone verstehen sich entsprechend der Erfindung als Proteine, welche andere nicht-native Proteine vor Aggregation in vivo schützen und die Bildung ihrer nativen Konformation fördern. Molekulare Chaperone werden im Stand der Technik verwendet, um Proteine zu stabilisieren und sie so vor Aggregation und Inaktivierung zu schützen (Buchner et al., EP-A 0 556 726 A1 ). Vorzugsweise werden ATP-abhängige Chaperone des HSP40-Typs (Molekülmasse ca. 40 kDa) oder ein kleines Hitzeschockprotein (sHSP, small heat shock Protein) bevorzugt verwendet. DnaJ ist ein Hitzeschockprotein mit 40 kDa, welches in dem Cytoplasma von E. coli auftritt und ist ein Teil des sogenannten Hsp70 Chaperon-Systems (Bukau, B. & Horwich, A., Cell 92 (1998) 351–366). DnaK (Hsp70) und GrpE gehören ebenfalls zu diesem System. Besondere Proteine werden in die native Konformation durch das DnaK-System in einem ATP-abhängigen Prozess gefaltet (Schröder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137–4144; Langer et al., Nature 356 (1992) 683–689). DnaJ schützt nicht-native Proteine vor Aggregation in der Abwesenheit von DnaK und ATP und vermittelt einen faltungsfähigen Zustand (Schröder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137–4144). Es ist gezeigt worden, dass die Coexpression von DnaJ in dem Cytostol zu einer Erhöhung der Ausbeute von löslichem Protein führen kann (Yokoyama et al., Microbiol. Ferment. Technol. 62 (1998) 1205–1210). Die Cosezenerierung eines N-terminalen Fragments von DnaJ, welches die Aminosäuren 1–108 umfasst, und im Folgenden als die J-Domäne bezeichnet wird, ist zusätzlich bevorzugt (Kelley, TIBS 23 (1998) 222–227). Die J-Domänen und eine G/F-reiche Domäne, welche für Wechselwirkungen mit DnaK verantwortlich sind, sind in dieser Region lokalisiert (Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139–2144). WO 9818946 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen heterologer Polypeptide in Bakterien, worin sowohl das heterologe Polypeptid als auch die molekularen Chaperone, DsbA oder DsbC, in das Periplasma der Bakterien sezerniert werden. In einem weiteren Verfahren wird das heterologe Protein von dem Periplasma oder dem Medium isoliert, unter Verwendung eines chaotropen Mittels, wie etwa Harnstoff.
  • EP 885967 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines heterologen Proteins in Prokaryoten durch Cotransformation von DnaJ und Gewinnen des heterologen Proteins aus dem Kulturmedium.
  • Hsp25 (z. B. von der Maus) ist ein Vertreter der kleinen Hitzeschockproteine (Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209–213), welche eine ubiquitäre Klasse von Chaperonen sind. Die molare Masse dieser Proteine ist zwischen 15 und 30 kDa. Während des Hitzeschocks erfolgt eine wesentliche Akkumulation von sHsps in der Zelle (bis zu 1% des gesamten Zellproteins – Arrigo & Landry (1994), In Morimoto (Hrsg.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335–374). Ähnlich DnaJ-Proteinen haben sHsps die Eigenschaft, dass sie die Aggregation von nicht-nativen Proteinen verhindern und diese in einem faltungsfähigen Zustand halten (Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517–1520; Ehrsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221–229).
  • Der Ausdruck ”Überexpression” bedeutet gemäß der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der Expression sezernierter Proteine, wie etwa DnaJ und Hsp25 (vorzugsweise um mindestens 100%) im Vergleich zu Expression im Wildtyp des jeweiligen prokaryotischen Wirtsorganismus. Eine solche Überexpression kann z. B. erreicht werden wenn die Gene (für das Protein, Chaperon und/oder Signalpeptid) unter der Steuerung eines starken prokaryotischen, vorzugsweise induzierbaren Expressionssignals sind (z. B. eines lac- oder T7-Promotors oder eines Derivats davon).
  • Das Sezernierungskonstrukt für die Überexpression von Polypeptiden (Proteinen), welches Regulationsregionen (Promotor und Terminator) auf der rekombinanten DNA enthält, wird vorzugsweise in einen Vektor integriert, welcher zusätzlich für die Arginin-tRNA AGA/AGG codiert, welche in Prokaryoten selten ist, oder es wird coexprimiert mit einem Vektor, welcher für diese tRNA codiert (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109–114). Dies ermöglicht die Coüberexpression der jeweiligen Proteine in das Bakterienperiplasma als auch die Transkription der seltenen tRNA-Arg AGA/AGG, was häufig zu einer erhöhten Synthese des gewünschten Proteins in dem Bakterienwirtsorganismus führt.
  • Eine prokaryotische Signalsequenz im Sinne der Erfindung versteht sich als ein Nukleinsäurefragment, welches von Prokaryoten abgeleitet ist, vorzugsweise von gram-negativen Bakterien, und sicherstellt, dass Proteine, die an das Signalpeptid gebunden sind, durch die inneren Bakterienmembranen penetrieren können. Als ein Ergebnis sind die Proteine in dem Periplasma oder in dem Zellüberstand lokalisiert. Derartige Signalsequenzen haben üblicherweise eine Länge von 18 bis 30 Aminosäuren und werden z. B. beschrieben in Murphy & Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt et al. (Herausgeber): Escherichia coli and Salmonella, zweite Ausgabe, Band 1, ASM-Press, Washington, 1996, S. 967–978). Die Abspaltung von Bakteriensignalsequenzen kann z. B. nach einer Ala-X-Ala-Sequenz auftreten (von Heijne et al., J. Mol. Biol. 184 (1985) 99–105). Die Struktur der Bakteriensignalpeptidase ist beschrieben in Paetzel et al., Nature 396 (1998) 186–190. Es werden vorzugsweise Signalsequenzen verwendet, die von dem gewünschten Protein durch Proteasen wieder abgespalten werden, die in dem Periplasma von prokaryotischen Zellen lokalisiert sind. Alternativ können solche Proteasen zu dem Zellüberstand oder dem isolierten Protein hinzugegeben werden, um die Signalsequenz abzuspalten.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung kann die heterologe Expression zahlreicher eukaryotischer Proteine, wie etwa z. B. Proteasen, Interferone, Proteinhormone, Antikörper oder Fragmente davon, verbessern. Das Verfahren ist besonders geeignet für die heterologe Produktion von Proteinen, welche mindestens zwei Cysteine enthalten, die über eine Disulfidbrücke in ihrem nativen Zustand verbunden sind, im Besonderen wenn sie keine prokaryotische Signalsequenz aufweisen, die an den N-Terminus gebunden ist und unlösliche Einschlusskörper werden während ihrer prokaryotischen Expression gebildet. Das Verfahren ist besonders geeignet für Proteine, die mehr als 5 Disulfidbrücken im nativen Zustand enthalten. Ein solches Protein ist z. B. ein rekombinanter Plasminogenaktivator (im Folgenden als rPA bezeichnet, Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299–311, US-Patent Nr. 5,223,256 ). rPA weist 9 Disulfidbrücken auf, welche in dem reduzierenden Cystol von E. coli nicht gebildet werden.
  • Die periplasmatische Lokalisierung des Proteins und optional des Chaperons wird durch operative Verbindung mit einem Signalpeptid sichergestellt, um durch die inneren Bakterienmembranen durchzudringen.
  • Eine Konzentration von 0,4 mol/l L-Arginin und 5 mmol/l Glutathion (im Falle der Cosezernierung von DnaJ, J-Domäne, Hsp25 und scFv) oder 0,4 mol/l L-Arginin ohne Glutathion (ohne Cosezernierung von DnaJ) hat sich optimal für die Expression eines solchen Plasminogenaktivators erwiesen.
  • Zum Isolieren des Sezernierungs-rPA-Proteins in einer funktionellen Form in E. coli wurde das Gen für dieses Protein von dem Plasmid pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93–100) durch Gentechnikverfahren mit einer prokaryotischen Signalsequenz gram-negativer Bakterien fusioniert, z. B. mit der Signalsequenz von Pectat-Lyase B (PelB) von Erwinia carotovora. Die Genfusion wurde durchgeführt durch Klonieren in den Vektor pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA). Als ein Ergebnis ist die Genexpression unter der Kontrolle bzw. Steuerung des T7-Promotors. Die Signalsequenz, die in dem Fusionsprotein vorliegt, vermittelt die Sezernierung in das Periplasma. Die Signalsequenz wird während oder nach der Sezernierung durch eine Peptidase, die an der inneren Membran lokalisiert ist, abgespalten. Das sezernierte Protein kann sich dann im Periplasma falten. Die oxidierenden Bedingungen in diesem Kompartiment ermöglichen die Bildung von Disulfidbrücken (Wuelting und Plückthun, Mol. Micorbiol. 12 (1994) 685–692). Die erfindungsgemäße Zugabe von Additiven mit geringem Molekulargewicht, welche das Falten verbessern und von Thiolreagenzien in das Nährmedium und die gleichzeitige Coüberexpression von DnaJ, J-Domäne oder Hsp25 in dem Periplasma ermöglichen es, dass die Ausbeute von funktionellem Protein um mehr als das 100-fache erhöht wird.
  • Andere Beispiele von Polypeptiden gemäß der Erfindung sind Antikörper oder Antikörperfragmente, wie etwa Einzel-Ketten-Fv-Fragmente (scFv, z. B. gegen Thyroidstimulierungshormon, THS). ScFvs sind verkürzte Antikörper, welche nur aus den variablen Abschnitten (Fv) der schweren und leichten Kette eines Antikörpers aufgebaut sind, welche künstlich über einen kurzen Peptidlinker (üblicherweise Gly4 Ser3) fusioniert sind (Hudson, Curr. Opin Biotechnol. 9 (1998) 395–402). ScFvs besitzen normalerweise die gleiche Affinität für das Antigen wie die elterlichen Fv-Stränge, können jedoch in E. coli überexprimiert werden. Da sie stabilisierende Intradomänendisulfidbrücken aufweisen, welche wesentlich für die Stabilität sind, führt eine Expression in dem Cytosol üblicherweise zu der Bildung von Einschlusskörpern (Shibui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 352–357). ScFvs können speziell optimiert sein für das Binden des gewünschten Antigens durch statistische Mutationen und nachfolgende Phagendisplayselektion (Allen et al., TIBS 20 (1995) 511–516; Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1998) 1–20). Zugabe von 5 mM GSH und 0,4 ML-Arginin ermöglicht es, dass die Ausbeute von funktionellem ScFv-TSH um das 7-fache in dem Periplasma und das 43-fache in dem Mediumüberstand im Vergleich mit einer Kultur ohne Additive verbessert wird.
  • Die folgenden Beispiele, Veröffentlichungen, das Sequenzprotokoll und die Figuren erklären die Erfindung, den Schutzbereich, welcher aus den Patentansprüchen resultiert, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, welche immer noch den Gegenstand der Erfindung beschreiben, selbst nach Modifikationen.
  • Beschreibung des Sequenzprotokolls
  • SEQ ID Nr: 1 und 2 zeigen die Sequenz des Teils des Expressionsplasmids pUBS520-plN-dnaJ, welches für das Fusionsprotein codiert, aufgebaut aus der OmpA-Signalsequenz und DnaJ, zusammen mit den Regulationssequenzen (Promotor, Terminator), welche von plN III ompA3-dnaJ amplifiziert wurden.
  • SEQ ID Nr: 3 und 4 zeigen die Sequenz des Teils des Expressionsplasmids pUBS520-plN-J-Domäne, welches für das Fusionsprotein codiert, aufgebaut aus der OmpA-Signalsequenz und der J-Domäne zusammen mit den Regulationssequenzen (Promotor, Terminator), welche von plN III ompA3-dnaJ ampliziert wurden.
  • SEQ ID Nr: 5 und 6 zeigen die Sequenz des Teils des Expressionsplasmids pUBS520-plN-hsp25, welcher für das Fusionsprotein codiert, aufgebaut aus der OmpA-Signalsequenz und Hsp25, zusammen mit den Regulationssequenzen (Promotor, Terminator), welche von plN III ompA3-hsp25 amplifiziert wurden.
  • SEQ ID Nr: 7 und 8 zeigen die Sequenz des Teiles des Expressionsplasmids pUBS520-scFvOx, welcher für das Fusionsprotein codiert, aufgebaut aus der PelB-Signalsequenz und scFvOxazolon, zusammen mit den Regulationssequenzen (Promotor, Terminator), welche von pHEN-scFv oder plN III ompA3 amplifiziert wurden.
  • SEQ ID Nr: 9 und 10 zeigen die Sequenz des Teils des Expressionsplasmids pEP20b(+)-rPA, welcher für das Fusionsprotein codiert, aufgebaut aus der PelB-Signalsequenz und rPA.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Abhängigkeit der Expression von nativem rPA in dem Periplasma von E. coli mit 5 mM GSH von der L-Arginin-Konzentration und verschiedenen Cosezernierungskonstrukten.
  • 2 zeigt einen Vergleich der Expression von rPA in dem Periplasma von E. coli BL21(DE3) bei Cosezernieren mit DnaJ und wenn 5 mM GSH und verschiedene niedermolekulare Substanzen, die das Falten verbessern, zu dem Medium hinzugegeben werden.
  • 3 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pUBS520-plN-dnaJ.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung der Expressionsplasmid pUBS520-plN-J-Domäne.
  • 5 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pUBS520-plN-hsp25.
  • 6 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pUBS520-scFvOx.
  • 7 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pET20b(+)-rPA.
  • 8 zeigt die Abhängigkeit der Expression von funktionellem scFv-TSH von der Konzentration von L-Arginin in der Gegenwart von 5 mM GSH in dem Periplasma und in dem Kulturmedium.
  • Allgemeines:
  • Für die periplasmatische Überexpression von DnaJ, der J-Domäne und Hsp25 in E. coli wurde die DNA, welche für diese Proteine codiert, durch Gentechnik an die Signalsequenz des äußeren Membranproteins A (OmpA) von E. coli fusioniert und die Fusion wurde in E. coli auf einem rekombinanten Plasmid unter der Steuerung des lac-lpp-Promotors exprimiert. Als ein Ergebnis werden die Polypeptidketten von DnaJ und Hsp25 in das Periplasma des prokaryotischen Wirtsorganismus transportiert und werden dort nativ gefaltet. Ihre Lokalisierung und ihr natives Falten wurde durch begrenzte Proteolyse mit Trypsin und durch Western Blot gezeigt.
  • Beispiel 1
  • Aufbau des Expressionsplasmids plN III omp A3-dnaJ
  • Molekulare Gentechniken basierten auf Ausubel et al. (Herausgeber), J. Wiley & Sons, 1997, Curr. Protocols of Molecular Biology. Oligonukleotide wurden von den Firmen MWG Biotech, Ebersberg, oder GIBCO Life Sciences, Eggenstein, DE erhalten.
  • Das Gen, welches für DnaJ codiert, Gene Bank Hinterlegungsnr. M 12565, wurde durch PCR amplifiziert und mittels der dadurch erzeugten Restriktionsspaltungsstellen EcoRI und BamHI in das Expressionsplasmid plN III ompA3 kloniert (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437–2442). Die Sequenz des klonierten PCR-Fragments wurde durch Dideoxysequenzierung (LiCor DNA-Sequenzer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) bestätigt. Das resultierende Plasmid wurde als plN III ompA3-dnaJ bezeichnet. Die Sequenz von DnaJ, die in dem Periplasma exprimiert wird, unterscheidet sich von der des Wildtypproteins dadurch, dass die Polypeptidsequenz mit Gly-Ile-Pro anstelle von Met beginnt, folglich lag eine N-terminale Extension von 2 Aminosäuren vor. Folglich ist DnaJ unter der Kontrolle des lac-lpp-Promotors, welcher induziert wird mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid).
  • Beispiel 2:
  • Aufbau des Expressionsplasmids pUBS520-plN-dnaJ
  • Die Region aus dem Plasmid plN III ompA3-dnaJ, welche für das lac-lpp-Operon codiert, die Signalsequenz, das dnaJ-Gen und die Terminatorregion des Operons wurden mittels PCR (SEQ ID Nr: 1) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit der Restriktionsendonuklease BgIII gespalten und in den Vektor pUBS520 kloniert, linearisiert mit der Restriktionsendonuklease BamHI. Das resultierende Plasmid wurde als pUBS520-plN-dnaJ bezeichnet (3).
  • Beispiel 3:
  • Aufbau der Expressionsplasmid pUBS520-plN-J-Domäne
  • Die zwei Stopp-Codons wurden in die Plasmid PUBS 520-plN-dnaJ nach dem Nukleotid 324, mittels des QuikChange Mutagenesesystems (Promega, Mannheim, DE) insertiert, sodass nur die ersten 108 Aminosäuren exprimiert werden. Die Sequenz der mutagenisierten Region wurde durch Dideoxysequenzieren bestimmt (LiCor DNA-Sequenzer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) und die Expression des verkürzten Proteinsfragments wurde durch Western-Blotten und Nachweis mit einem Anti-DnaJ-Antikörper nachgewiesen. Das Plasmid, das gebildet wurde, wurde als PUBS 520-plN-J-Domäne bezeichnet (4).
  • Beispiel 4
  • Aufbau des Expressionsplasmids plN III ompA3-hsp25
  • Das Gen, welches für Hsp25 codiert, Gene Bank-Hinterlegungssnr.: L 07577, wurde durch PCR amplifiziert und mittels der hierbei erzeugten Restriktionsspaltungsstellen EcoRI und BamHI in das Expressionsplasmid plN III ompA3 kloniert (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437–2442). Die Sequenz des klonierten PCR-Fragments wurde durch Dideoxysequenzierung überprüft (LiCor DNA-Sequenzer 4000, MWG Biotech, Ebersberg). Das resultierende Plasmid wurde als plN III ompA3-hsp25 bezeichnet. Die Sequenz des in dem Periplasma exprimierten Hsp25 unterscheidet sich von derjenigen des Wildtypproteins dadurch, dass die Polypeptidsequenz mit Gly-Ile-Leu anstelle von Met beginnt, folglich lag eine N-terminale Extension von 2 Aminosäuren vor. Folglich ist Hsp25 unter der Kontrolle des lac-lpp-Promotors, welcher mit IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactosid) induziert wird.
  • Beispiel 5:
  • Aufbau des Expressionsplasmids pUBS520-plN-hsp25
  • Die Region aus dem Plasmid plN III ompA3-hsp25, welche für das lac-lpp-Operon codiert, die Signalsequenz, das hsp25-Gen und die Terminatorregion des Operons wurde mittels PCR amplifiziert (SEQ ID Nr: 5). Das PCR-Produkt wurde mit der Restriktionsendonuklease BgIII gespalten und in den Vektor pUBS520 kloniert, linearisiert mit der Restriktionsendonuklease BamHI. Das resultierende Plasmid wurde als pUBS520-plN-hsp25 bezeichnet (5).
  • Beispiel 6:
  • Aufbau des Expressionsplasmids pUbS520-scFv-Ox
  • Die Coexpression eines Einzelketten-Fv-Fragments, welches gegen das Hapten Oxazolon gerichtet ist (scFvOxazolon; Fiedler und Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090–1093), welches keine Chaperoneigenschaften aufweist, wurde als eine negative Kontrolle untersucht.
  • Die Region des Plasmids pHEN-scFvOx, welche für den lac-Promotor codiert, die Signalsequenz pelB und das scfvox-Gen wurden mittels PCR amplifiziert. Die Region des Plasmids plN III ompA3, welche für den lpp-Terminator codiert, wurde in einer zweiten PCR amplifiziert. Die beiden Fragmente wurden in einer nachfolgenden PCR fusioniert. Das PCR-Produkt (SEQ ID Nr: 7), das auf diese Art gebildet wurde, wurde mit der Restriktionsendonuklease BgIII gespalten und in den Vektor pUBS520 kloniert, der mit der Restriktionsendonuklease BamHI linearisiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pUBS520-scFvOx bezeichnet (6).
  • Beispiel 7:
  • Aufbau des Expressionsplasmids pET20b(+)-rPA
  • Das Gen eines Plasminogenaktivators (rPA) von dem Plasmidvektor pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93–100) wurde mit der Hilfe eines PCR-Verfahrens amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BamHI gespalten und in den Plasmidvektor pET20b(+) kloniert (Novagen Inc., Madison, USA). Das Plasmid codiert für ein Fusionsprotein, welches aufgebaut ist aus der Signalsequenz von PelB (Pectatlyase von Erwinia carotovora) und rPA, und die Sezernierung von rPA in das Periplasma wurde durch Dideoxysequenzierung überprüft (LiCor DNA-Sequenzer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE). Das Konstrukt wurde als pET20b(+)-rPA bezeichnet (7). rPA wird von dem Plasmid unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimiert, wobei die T7-RNA-Polymerase in dem Stamm E. coli BL21(DE3) unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors ist. Die Induktion wurde unter der Zugabe von IPTG durchgeführt. Das in dem Periplasma exprimierte rPA unterscheidet sich von dem von Kohnert et al. beschriebenen Plasminogenaktivator dadurch, dass die zweite Aminosäure (Ser) durch Ala substituiert ist.
  • Beispiel 8:
  • Funktionelle Expression von rPA in dem Periplasma von E. coli unter Verwendung der Mediumadditive Glutathion und L-Arginin
  • Eine stationäre Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3) (Studier & Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113–130) welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520-plN-dnaJ (Cosezernierung von DnaJ), eine Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520-plN-J-Domäne (Cosezernierung der J-Domäne), eine Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520-plN-hsp25 (Cosezernierung von Hsp25), eine Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520-scFvOx (Cosezernierung von scFvOx), eine Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520 oder eine Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+) und pUBS520 (Kontrollkultur), wurde verdünnt in einem Verhältnis von 1:50 in 100 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) und bei 24°C und mit 170 UpM geschüttelt. Nach 3 h Wachstum wurden 5 ml Aliquote der Kultur zu 10 ml LB-Medium gegeben, enthaltend die oben genannten Mengen Ampicillin und Kanamycin und verschiedene Konzentrationen GSH (0–10 mM, Fluka, DE) und L-Arginin HCl (0-0,4 M, ICN) und jede wurde mit 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid, AppliChem, Darmstadt, DE) induziert. Die Zellen wurden für weitere 21 h bei 24°C und 170 UpM geschüttelt und eine 1 ml-Probe wurde nach Bestimmen der OD600 entnommen. Diese 1 ml-Zellproben wurden in 2 ml-Eppendorf Reaktionsbehältern durch ein modifiziertes Protokoll gemäß Jacobi et al. fraktioniert (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692–21699). Im Einzelnen wurden 500 μl Fraktionierungspuffer (150 mM NaCl (Roth GmbH), 50 mM Tris/HCl (Roth GmbH), 5 mM EDTA (Biomol) und 1 mg/ml Polymyxin B Sulfat (Sigma), pH-Wert 7,5) zu dem Zellpellet gegeben, für 1 h bei 10°C auf einem Eppendorf Thermoschüttler bei 1400 UpM geschüttelt und dann für 15 min bei 14.000 UpM in einer auf 10°C gekühlten Eppendorf Mikrozentrifuge zentrifugiert, um eine Fraktion zu bilden, die die löslichen Periplasmaproteine (Überstand) und eine Rückstandsfraktion (Pellet) enthielt.
  • Die Aktivität von rPA wurde gemäß dem Verfahren von Verheijen et al., Thromb. Haemostasis 48 (1982) 266–269) bestimmt.
  • Alle bestimmten rPA-Konzentrationen in den Zellextrakten wurden auf Zellsuspensionen mit OD600 = 1 standardisiert, um den Fehler zu korrigieren, der auftritt, wenn in verschiedenen Puffern gemessen wird.
  • Beispiel 9:
  • Funktionelle Expression von rPA in dem Periplasma von E. coli unter Verwendung von Gemischen von Glutathion mit Formamid, Methylformamid, Acetamid, Methylharnstoff und Ethylharnstoff als Mediumadditive.
  • Eine stationäre Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit pET20b(+)-rPA und pUBS520-plN-dnaJ (Cosezernierung von DnaJ) wurde wie in Beispiel 8 angegeben, kultiviert. Verbindungen der Formel I und in jedem Falle 5 mM Glutathion wurden zusätzlich zu dem Kulturmedium zugegeben. Eine Kontrollkultur wurde in LB ohne Additive kultiviert. Die Verbindungen der Formel I und die verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 2 angegeben. Die Probenherstellung, Periplasmafraktionierung und der Enzymtest auf tPA-Aktivität wurden wie in Beispiel 8 angegeben, durchgeführt.
  • Die Tabellen 1 und 2 und die 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der rPA-Expression. Tabelle 1: Wirkung von L-Arginin in dem Fermentationsmedium auf die Ausbeute von nativer rPA in dem Periplasma
    Cosezerniertes Protein 0 ML-Arginin 0,2 ML-Arginin 0,4 ML-Arginin
    rPA in ng/ml*OD/600 Stimulationsfaktor rPA in ng/ml*OD600 Stimulationsfaktor rPA in ng/ml*OD600 Stimulationsfaktor
    - 0,030 ± 0,001 29 0,044 ± 0,090 20 0,170 ± 0,005 23
    DnaJ 0,197 ± 0,019 29 0,730 ± 0,150 27 3,978 ± 1,000 18
    J-Domäne 0,339 ± 0,007 16 0,625 ± 0,213 17 4,398 ± 0,165 15
    Hsp25 0,053 ± 0,002 27 0,140 ± 0,001 17 17
    scFvOxazolon 0,041 ± 0003 13 0,144 ± 0,047 8 0,713 ± 0,113 10
  • Die Kultivierung wurde in der Gegenwart von 5 mM GSH durchgeführt. Tabelle 2: Wirkung von verschiedenen Additiven mit niederem Molekulargewicht in dem Kultivierungsmedium auf die Ausbeute von nativem rPA in dem Periplasma von E. coli
    Additiv Konzentration in dem Kulturmedium Ausbeute rPA in ng/ml*OD600 in dem Periplasma Stimulationsfaktor OD600 bei Zellernte Konzentration von GSH in dem Medium
    ohne Addivite - 0,153 24 4,52 0 mM
    Arginin 0,2 M 0,560 21 4,45 5 mM
    0,4 M 3,880 17 1,78 5 mM
    Formamid 0,6 M 0,208 17 4,96 5 mM
    1,0 M 0,219 10 4,71 5 mM
    Methylformamid 0,3 M 0,141 15 4,57 5 mM
    0,6 M 0,790 17 1,04 5 mM
    Acetamid 0,6 M 0,150 24 5,34 5 mM
    1,0 M 1,321 16 1,57 5 mM
    Methlyharnstoff 0,3 M 0,168 24 4,67 5 mM
    0,6 M 0,830 22 4,59 5 mM
    Ethylharnstoff 0,3 M 0,266 23 4,20 5 mM
    0,6 M 1,209 17 0,82 5 mM
  • Beispiel 10:
  • Expression eines funktionellen Einzelketten-Fv-Fragments unter Zugabe von reduziertem Glutathion und L-Arginin zu dem Kulturmedium
  • Eine stationäre Übernachtkultur E. coli BL21(DE3), welche transformiert worden ist mit einem Plasmid, welches codiert für ein Einzelketten Fv-Fragment eines Anti-TSH-Antikörpers ( US-Patent Nr. 5,614,367 ) und pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109–114) wurde in einem Verhältnis von 1:50 verdünnt in 100 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) enthielt und bei 24°C und 170 UpM geschüttelt. Nach 3 h wachsen wurden 5 ml Aliquote der Kultur zu den 10 ml LB-Medium, enthaltend die oben genannten Mengen Ampicillin und Kanamycin und verschiedene Konzentrationen von GSH (0–10 mM, Fluka) und L-Arginin HCl (0–0,4 M, ICN) gegeben und jedes wurde mit 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactosid, AppliChem, Darmstadt) induziert. Die Zellen wurden für weitere 21 h bei 24°C und 170 UpM geschüttelt und eine 1 ml-Probe wurde nach Bestimmung der OD600 entnommen. Diese 1 ml-Zellproben wurden in 2 ml-Eppendorf Reaktionsbehältnissen durch ein modifiziertes Protokoll gemäß Jacobi et al. fraktioniert (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692–21699) (siehe Beispiel 8). Zusätzlich wurde eine Probe des Mediumüberstands (1 ml) entnommen. Die Proben wurden einem ELISA-Test unterzogen, um sie auf funktionelle Antikörper zu untersuchen.
  • Das Binden von nativen scFv-TSH an THS wurde mit scFv-TSH-Standards standardisiert, gereinigt mit dem RPAS-System (Pharmacia Biotech, Germany) (eine Einheit entspricht der Bindung von 1 μl Standards an die Mikrotiterplatte, die mit TSH beschichtet ist). Die Zugabe von L-Arginin zum Kulturmedium hatte ebenfalls eine positive Wirkung auf die Ausbeute von nativem scFv-TSH in dem Periplasma und dem Mediumüberstand von E.coli. Die Zugabe von 0,4 ML-Arginin und 5 mM GSH ermöglichte es die Menge Antikörper-Fragment, die mittels ELISA nachgewiesen wurde, um das 7-fache in dem Mediumüberstand und das 43-fache in der Periplasmafraktion zu erhöhen im Vergleich mit einer Kultur mit 5 mM GSH (8).
  • Literaturstellen
    • Allen et al., TIBS 20 (1995) 511–516
    • Arrigo & Landry (1994) In Morimoto (Hrsg.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335–373
    • Ausubel et al. (Hrsg.) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, 1997 Baynex, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 411–421
    • Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55–60
    • Bothman und Plückthun, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 376–380
    • Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109–114
    • Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (1992) 3075–3079
    • Buchner & Rudolph, Bio/Technology 9 (1991) 157–162
    • Bukau, B. & Horwich, A., Cell 92 (1998) 351–366
    • Ehrsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221–229
    • EP-A 0510658
    • EP-A 0 556 726
    • Fiedler und Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090–1093
    • Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209–213
    • Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437–2442
    • Goloubinoff et al., Nature 337 (1989) 44–47
    • Hayhurst und Harris, Prot. Expr. Purif. 15 (1999) 336–343
    • Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456–463
    • Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1998) 1–20
    • Hudson, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 395–402
    • Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692–21699
    • Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517–1520
    • Kelley, TIBS 23 (1998) 222–227
    • Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77–83
    • Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93–100
    • Langer et al., Nature 356 (1992) 683–689
    • Lee & Olins, J. Biol. Chem. 267 (1992) 2849–2852
    • Lin & Traugh, Prot. Express. Purif. 4 (1993) 256–264
    • Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299–311
    • Murphy & Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt et al. (Hrsg.): Escherichia coli and Salmonella, zweite Ausgabe, Band 1, ASM Press, Washington, 1996, S. 967–978
    • Paetzel et al., Nature 396 (1998) 186–190
    • Perez-Perez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524–529
    • Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol. 64 (1998) 4891–4896
    • Roman et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 92 (1995) 8428–8432
    • Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258–264
    • Schmidt et al., Prot. Engin. 11 (1998) 601–607
    • Schröder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137–4144
    • Shibui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 352–357
    • Studier & Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113–130
    • Thomas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 66 (1997) 197–238
    • US-Patent Nr. 5,223,256
    • US-Patent Nr. 5,593,865
    • US-Patent Nr. 5,614,367
    • Verheijen et al., Thromb. Haemostasis 48 (1982) 266–269
    • Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139–2144
    • Wuelting und Plückthun, Mol. Microbiol. 12 (1994) 685–692
    • Yokoyama et al., Microbiol. Ferment. Technol. 62 (1998) 1205–1210

Claims (10)

  1. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, natürlich gefalteten eukaryotischen Polypeptids, das zwei oder mehrere Cysteine enthält, die durch Disulfidbrücken verbunden sind, durch Kultivieren prokaryotischer Zellen, a) worin die prokaryotischen Zellen einen Expressionsvektor enthalten, der für das Polypeptid codiert, das eine prokaryotische Signalsequenz am N-Terminus enthält, b) unter Bedingungen, unter welchen das Polypeptid in das Periplasma oder das Medium sezerniert wird, c) Abspalten der Signalsequenz und Isolieren des Polypeptids aus dem Periplasma oder dem Medium, worin das Kultivieren ausgeführt wird in der Gegenwart von Arginin oder einer Verbindung der allgemeinen Formel I R2-CO-NRR1 (I), worin R und R1 Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte verzweigte oder unverzweigte C1-C4-Alkylkette bedeuten und R2 Wasserstoff, NHR1 oder eine gesättigte oder ungesättigte verzweigte oder unverzweigte C1-C3-Alkylkette bedeutet, worin die Konzentration von Arginin oder der Verbindung der allgemeinen Formel I mindestens 0,1 mol/l ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 worin Arginin als das Hydrochlorid oder als eine andere titrierte Form verwendet wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin ein reduzierendes Thiolreagens zu dem Nährmedium gegeben wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Glutathion (GSH) als reduzierendes Thiolreagens verwendet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, worin die Signalsequenz von gramnegativen Bakterien stammt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die prokariotische Zelle einen zusätzlichen Expressionsvektor enthält, der für ein molekulares Chaperon codiert.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das molekulare Chaperon DNAJ von E. coli oder HSP25 ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, worin die rekombinante DNA, die für das molekulare Chaperon codiert, in operativer Verknüpfung mit einem DNA-Fragment ist, das für ein Signalpeptid zum Penetrieren der inneren Bakterienmembran codiert.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin die DNA, die für das sezernierte molekulare Chaperon und/oder für das sezernierte Protein codiert, unter der Kontrolle eines induzierbaren Expressionssignals steht.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Polypeptid ein Antikörper, Antikörperfragment, Interferon, Proteinhormon oder eine Protease ist.
DE60013689T 1999-04-26 2000-04-19 Verfahren zur Herstellung natürlich gefalteter und sekretierter Proteine Expired - Lifetime DE60013689T3 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99107412 1999-04-26
EP99107412A EP1048732A1 (de) 1999-04-26 1999-04-26 Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE60013689D1 DE60013689D1 (de) 2004-10-21
DE60013689T2 DE60013689T2 (de) 2005-09-29
DE60013689T3 true DE60013689T3 (de) 2011-02-17

Family

ID=8237962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60013689T Expired - Lifetime DE60013689T3 (de) 1999-04-26 2000-04-19 Verfahren zur Herstellung natürlich gefalteter und sekretierter Proteine

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6309861B1 (de)
EP (2) EP1048732A1 (de)
JP (1) JP3691722B2 (de)
KR (1) KR100361049B1 (de)
CN (1) CN1231594C (de)
AT (1) ATE276369T1 (de)
CA (1) CA2304437C (de)
DE (1) DE60013689T3 (de)
DK (1) DK1054063T4 (de)
ES (1) ES2228331T5 (de)
JO (1) JO2253B1 (de)
MX (1) MXPA00004007A (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1077263A1 (de) 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
US6955910B2 (en) 2000-11-14 2005-10-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for large scale production of recombinant DNA-derived TPA or K2S molecules
US7087412B2 (en) 2000-11-14 2006-08-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for large scale protein production in prokaryotes
GB0027782D0 (en) * 2000-11-14 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Int Methods fro large scale protein productio in prokaryotes
GB0027779D0 (en) * 2000-11-14 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Int Methods for large scale production of recombinant dna-derived tpa or k2s molecules
JP2002306163A (ja) * 2001-04-11 2002-10-22 Chemo Sero Therapeut Res Inst 大腸菌を宿主とする遺伝子組換えヒトトロンビンの調製方法
US20090053786A1 (en) * 2007-07-09 2009-02-26 Yung-Hsiang Kao Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides
EP2905342A4 (de) * 2012-10-03 2016-03-16 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verfahren zur verhinderung von polypeptidreduktion durch zusatz von aminosäure zu einem flüssigen kulturmedium
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
KR102606210B1 (ko) 2017-04-27 2023-11-24 주노 테라퓨틱스 게엠베하 올리고머 입자 시약 및 이의 사용 방법
CN111320700B (zh) * 2018-12-15 2022-12-06 上海渔霁生物技术有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌a蛋白及其制备方法与应用
CN110734480B (zh) * 2019-11-07 2021-08-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757013A (en) * 1983-07-25 1988-07-12 The Research Foundation Of State University Of New York Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US5453363A (en) 1985-10-23 1995-09-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes
DE3537708A1 (de) * 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
ATE140731T1 (de) * 1988-01-11 1996-08-15 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
DE4113750A1 (de) * 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
US5639635A (en) * 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5789199A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
FR2729972B1 (fr) † 1995-01-31 1997-04-18 Sanofi Sa Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine
JPH09173078A (ja) * 1995-09-14 1997-07-08 Tadayuki Imanaka 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法
US6027888A (en) † 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
JP3344618B2 (ja) * 1997-06-20 2002-11-11 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 シャペロン発現プラスミド

Also Published As

Publication number Publication date
JO2253B1 (en) 2004-10-07
CN1272550A (zh) 2000-11-08
DE60013689D1 (de) 2004-10-21
CN1231594C (zh) 2005-12-14
JP2000316591A (ja) 2000-11-21
DE60013689T2 (de) 2005-09-29
KR100361049B1 (ko) 2002-11-18
EP1054063A3 (de) 2001-01-10
EP1054063B2 (de) 2010-09-22
DK1054063T3 (da) 2004-12-13
EP1048732A1 (de) 2000-11-02
US6309861B1 (en) 2001-10-30
CA2304437C (en) 2004-11-09
DK1054063T4 (da) 2010-11-29
KR20010029665A (ko) 2001-04-06
EP1054063A2 (de) 2000-11-22
MXPA00004007A (es) 2002-06-04
ATE276369T1 (de) 2004-10-15
JP3691722B2 (ja) 2005-09-07
EP1054063B1 (de) 2004-09-15
ES2228331T5 (es) 2011-01-27
ES2228331T3 (es) 2005-04-16
CA2304437A1 (en) 2000-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60021318T2 (de) Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten Proteinen durch Co-Sekretion von molekularen Chaperonen
DE60013689T3 (de) Verfahren zur Herstellung natürlich gefalteter und sekretierter Proteine
EP0510658B1 (de) Verbesserung der Ausbeute bei der Sekretion von disulfidverbrückten Proteinen
CA2605140C (en) Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein
US20150376245A1 (en) Methods and compositions relating to crm197
US20100145033A1 (en) Novel orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhpth) (1-34)
AU610135B2 (en) Polypeptides with activity against gram-positive and gram-negative bacteria
US20180057823A1 (en) Expression Vector
DE60219632T2 (de) Verfahren zur herstellung von matrizen-dna und verfahren zur proteinherstellung in einem zellfreien proteinsynthesesystem unter verwendung davon
EP0422049A4 (en) Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium
Malik et al. Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to E. coli ecotin
RU2316590C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД АРЕНИЦИН МОРСКОГО КОЛЬЧАТОГО ЧЕРВЯ Arenicola marina, И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО АРЕНИЦИН
Ghasemi et al. Using L-arabinose for production of human growth hormone in Escherichia coli, studying the processing of gIII:: hGH precursor
EP0667394A2 (de) Rekombinanter Antikörper von transformierten Bacillus-Bakterien hergestellt
KR20210148288A (ko) 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현
MONTAZER et al. Frequency of bovine lymphocyte antigen DRB3. 2 alleles in Sarabi cows
JP2020162428A (ja) 毒性タンパク質の活性を阻害するペプチドのスクリーニング方法及び毒性タンパク質の製造方法
Malik A novel strategy for the periplasmic production of heterologous proteins in E. coli
DE102005050732A1 (de) Periplasmatische Produktion therapeutisch relevanter Proteine durch Fusion an Escherichia coli Ecotin

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8366 Restricted maintained after opposition proceedings