MXPA00004007A - Procedimiento para la produccion de proteinas plegadas y secretadas en forma natural. - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso para la produccion de un polipeptido eucariotico plegado de forma natural, soluble en agua, que contiene dos o varias cisteinas unidas por puentes disulfuro, mediante cultivo de celulas procarioticas, a) en el cual las celulas procarioticas contienen un vector de expresion el cual codifica para el polipeptido el cual contiene una secuencia de senal procariotica en la parte N terminal, b) bajo condiciones bajo las cuales el polipeptido es secretado al periplasma o al medio, c) separar la secuencia de senal y aislar el polipeptido del periplasma o del medio, el cual esta caracterizado porque el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de la formula general I R2-CO-NRR1 (I) en la cual R y R1 representan hidrogeno o una cadena alquilo de C1-C4 saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R2 representa hidrogeno, NHR1 o una cadena alquilo de C1-C3 saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, el cual es adecuado para la produccion recombinante de polipeptidos en procariotes con un rendimiento elevado.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS PLEGADAS Y SECRETADAS EN FORMA NATURAL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un proceso para la producción de polipéptidos solubles en agua, plegados y secretados de manera natural, después de su expresión en células procarióticas . La sintesis de proteinas en organismos procaridticos, la cual también se denomina traducción, se lleva a cabo en los ribosomas en el citoplasma. Cuando se expresa ADN reco binante en organismos huéspedes procarióticos, con frecuencia es deseable secretar el producto del gen recombinante o la proteína que se obtiene en este proceso del citoplasma a través de la membrana bacteriana interna dentro del espacio periplasmático entre la membrana interior y exterior. Las proteinas secretadas pueden ser liberadas del periplasma al medio nutritivo, por ejemplo por choque osmótico. Una desventaja de este proceso es que los polipéptidos secretados con frecuencia no forman la conformación nativa y biológicamente activa (Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456 - 463; Baynex, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 411-421). Recientemente se han utilizado chaperones moleculares y catalizadores de plegado tales como peptidil-prolil- REF. 119281 cis/trans-iso erasas o proteína disulfuro isomerasas (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) para incrementar el rendimiento de proteína recombinante nativa cuando se pliega in vivo (Thomas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 66 (1997) 197-238) . En algunos casos, esto ha llevado a mejoría considerable en la expresión, por ejemplo de la ribulosa bifosfato carboxilasa (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature 337 (1989) 44-47), procolagenasa humana (Lee & Olins, J. Biol.

Chem. 267 (1992) 2849-2852) o neuronal nitrógeno óxido sintasa de ratas (Román et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428-8432) . En estos ejemplos, se ha co-sobreexpresado el sistema GroEL/ES o el sistema DnaK de E. coli en el citosol. El efecto positivo habitualmente es un rendimiento aumentado de la proteína deseada en una forma soluble. La coexpresión de chaperones también se ha examinado con proteínas recombinantes que son secretadas en el periplasma de E. coli. Sin embargo, en este caso, únicamente se ha evaluado la sobreexpresión citosólica de chaperones con el fin de optimizar la secreción en el periplasma (Perez-Perez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524-529; Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258-264; Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55-60). Intentos previos de cosecreción en E. coli únicamente se han relacionado con catalizadores de plegado tales como por ejemplo, la proteína disulfuro isomerasa (PDI; Glockshuber et al., EP-A O 510 658) o las peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas o proteínas Dsb de E. coli (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77-83; Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol. 64 (1998) 4891-4896 y Schmidt et al., Prot. Engin. 11 (1998) 601 - 607). Recientemente, la co-sobreexpresión de la proteína Skp periplásmica ha llevado a un plegado más eficiente de exhibición de fase y un mayor rendimiento de los fragmentos de anticuerpo secretados al triplasma (Bothman and Plückthun, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 376-380; Hayhurst and Harris , Prot. Expr. Purif. 15 (1999) 336-343). Los compuestos tales como urea o derivados de urea, formamida, acetamida o L-arginina se utilizan en métodos para la renaturalización in vitro de agregados insolubles de proteína (cuerpos de inclusión) los cuales se forman durante la expresión citoplásmica de ADN recombinante en células procarióticas. La L-arginina es un aditivo que puede mejorar considerablemente el rendimiento de las proteínas plegadas de manera nativa en la renaturalización in vitro (Rudolph et al., patente U.S. No. 5,593,865; Buchner & Ruldolph, Bio/Technology 9 (1991) 157-162; Brinkmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 89 (1992) 3075-3079; Lin & Traugh, Prot. Express. Purif. 4 (1993) 256-264) . El objetivo de la invención es proporcionar un proceso para la producción de polipéptidos eucarióticos plegados naturalmente, solubles en agua después de la expresión en procariotes lo cual puede llevarse a cabo de una manera sencilla y lo cual no requiere un tratamiento posterior laborioso in vitro tal como solubilización, reducción y renaturalización de cuerpos de inclusión, reducción y renaturalización. El objetivo se obtiene por un proceso para la producción de un polipéptido eucariótico plegado naturalmente, soluble en agua, que contiene dos o varias cisteínas unidas por puentes disulfuro, por cultivo en células procarióticas, a) en el cual las células procarióticas contienen un vector de expresión el cual codifica para el polipéptido el cual contiene una secuencia de señal procariótica en la parte N terminal, b) bajo condiciones bajo las cuales se secreta el polipéptido al triplasma o al medio, . c) separar la secuencia de señal y aislar el polipéptido del periplasma o del medio en el que el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I en la cual R y R* representan hidrógeno o una cadena alquilo de Cx-C4 saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R2 representa hidrógeno, N?R? o una cadena alquilo de C-L-CS saturada o insaturada, ramificada o no ramificada. La concentración de arginina o del compuesto de la fórmula general I preferiblemente es de por lo menos 0.1 mol/l, pero también puede ser considerablemente mayor con la condición de que se asegure la solubilidad de arginina o del compuesto. La arginina o los compuestos de la fórmula general I preferiblemente se utilizan a una concentración de 0.1 a 1.5 mol/l. Se agregan preferiblemente formamida, acetamida, urea o derivados de urea tales como etilurea o metilurea, como compuestos de la fórmula general I, al medio nutriente que se utiliza para cultivar las células procarióticas. Se puede utilizar, por ejemplo, arginina como el clorhidrato o como otra forma titulada de la arginina base..Sin embargo, se utiliza preferiblemente L-arginina y se prefiere particularmente la forma de clorhidrato de L-arginina. En una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención, los reactivos reductores de tiol los cuales contienen grupos SH se agregan adicionalmente al medio nutriente (medio de fermentación) utilizado para cultivar las células procarióticas lo cual incrementa adicionalmente el rendimiento de la proteína producida de manera recombinante. Se agregan preferiblemente 0.1-15 mmol/l de reactivo tiol. De acuerdo con la invención, el término "reactivo tiol" significa un reactivo reductor (reducido) con grupos SH o una mezcla de reactivos reductores con grupos SH y reactivos oxidantes con grupos disulfuro. Las sustancias preferidas se reducen y oxidan glutation (GSH) , cisteína, cistina, N-acetilcisteína, cisteamina, ß-mercaptoetanoi y compuestos similares. Los reactivos tiol se pueden utilizar solos así como en mezclas. Los reactivos tiol tales como glutation (GSH) los cuales tienen un sólo grupo SH por molécula son particularmente adecuados . Se sabe que los reactivos tiol tales como glutation mejoran en rendimiento de proteínas plegadas nativamente cuando se expresen ADN recombinante en células procarióticas (Glockshuber et al. , EP-A 0 510 658) . En una modalidad preferida adicional del proceso de acuerdo con la invención, se sobreexpresan y cosecretan adicionalmente chaperones moleculares de la invención. De acuerdo con la invención, el término chaperones indica proteínas las cuales protegen otras proteínas no nativas impidiendo su agregación in vivo y promueven la formación de su conformación nativa. En la técnica anterior se utilizan chaperones moleculares para estabilizar proteínas y por lo tanto para protegerlas impidiendo la agregación e inactivación (Buchner et al., EP-A 0 556 726 Al). Preferiblemente, los chaperones dependientes de ATP del tipo HSP40 (masa molecular de ca. 40 kDa) o una proteína pequeña de choque térmico (sHSP) son las que se utilizan preferiblemente. La DnaJ es una proteína de choque térmico de 40 kDa la cual se produce en el citoplasma de E. coli y es parte de lo que se denomina el sistema chaperon Hsp70 (Bukau, B & Hor ich, A., Cell 92 (1998) 351-366) . DnaK (Hsp70) y GrpE también pertenecen a este sistema. Las proteínas particulares se pliegan en la conformación nativa por el sistema DnaK en un proceso dependiente de ATP (Schrdder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144; Langer et al., Nature 356 (1992) 683 - 689) . DnaJ protege a las proteínas no nativas impidiendo su agregación en ausencia de DnaK y ATP, y media un estado competente plegado (Schróder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144). Se ha demostrado que la coexpresión de DnaJ en el citosol puede llevar a un incremento en el rendimiento de la proteína soluble (Yokoyama et al . , Microbiol. Ferment. Technol. 62 (1998) 1205-1210). La cosecreción de un fragmento N terminal de DnaJ el cual comprende los aminoácidos 1-108 y en lo siguiente se denominará como el dominio J (Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227) es el que se prefiere adicionalmente. Los dominios J y un dominio rico en G/F el cual es el responsable de las interacciones con DnaK está localizado en esta región (Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139-244) . Hsp25 (por ejemplo de ratón) es un representante de proteínas pequeñas de choque térmico (Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209-213) las cuales son una clase ubicua de chaperones . La masa molecular de estas proteínas está entre 15 y 30 kDa. Durante el choque térmico existe una acumulación sustancial de sHsps en la célula (hasta 1% de la proteína celular total - Arrigo & Landry (1994), In Morimoto (Hrsg.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373) . Al igual que las proteínas DnaJ, sHsps tiene la propiedad de evitar la agregación de proteínas no nativas y de mantener estas en un estado competente y plegado (Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517-1520; Ehrsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221-229). El término "sobreexpresión" de acuerdo con la presente invención, significa un incremento en la expresión de proteínas secretadas tales como, por ejemplo, DnaJ y Hsp25 (preferiblemente en por lo menos 100%) en comparación con la expresión en el organismo huésped procariótico respectivo pero de tipo silvestre. Tal sobreexpresión se puede obtener, por ejemplo, cuando los genes (para la proteína, chaperón y/o péptido señal) están bajo el control de una señal de expresión procariótica fuerte, preferiblemente inducible (por ejemplo de un promotor lac o T7 o un derivado del mismo) . La construcción de secreción para la sobreexpresión de polipéptidos (proteínas) que incluyen regiones reguladoras (promotor y terminador) sobre el ADN recombinante preferiblemente se integra en el vector el cual codifica adicionalmente para la arginina-ARNt AGA/AGG el cual es raro en procariotes, o se coexpresa con un vector el cual codifica para este ARNt (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114). Esto permite la cosobreexpresión de proteínas respectivas dentro del periplasma bacteriano así como la transcripción del ARNtAr3AGAAGG, raro, el cual con frecuencia resulta en una síntesis aumentada de la proteína deseada en el organismo huésped bacteriano. Una secuencia de señal procariótica en el sentido de la invención se entiende como un fragmento de ácido nucleico el cual se deriva de procariotas, preferiblemente de bacterias gramnegativas y asegura que las proteínas unidas al péptido señal puedan penetrar a través de las membranas bacterianas interiores. Como un resultado, las proteínas se localizan en el periplasma o en el sobrenadante celular. Tales secuencias de señal habitualmente tienen una longitud de 18 30 aminoácidos y se describen, por ejemplo, en Murphy 6 Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt et al. (editores): Escherichia coli and Salmonella, Segunda Edición, Vol. l, ASM Press, Washington, 1996, p. 967-978. La separación de las secuencias de señal bacterianas puede producirse, por ejemplo, después de una secuencia Ala-X-Ala (von Heijne et al., J. Mol. Biol. 184 (1985) 99-105) . La estructura de una peptidasa de señal bacteriana se describe en Paetzel et al., Nature 396 (1988) 186-190. Las secuencias de señal que se utilizan preferiblemente son aquéllas que se separan nuevamente de la proteína deseada por proteasas localizadas en el periplasma de las células procarióticas. Alternativamente, tales proteasas se pueden agregar al sobrenadante celular o a la proteína aislada para separar la secuencia de señal . El proceso de acuerdo con la invención puede mejorar la expresión heteróloga de numerosas proteínas eucarióticas tales como, por ejemplo, proteasas, interferones, o hormonas proteínicas, anticuerpos o fragmentos de los mismos. El proceso es particularmente adecuado para la producción heteróloga de proteínas las cuales contienen por lo menos dos cisteínas unidas por un puente disulfuro en su estado nativo, especialmente cuando no tienen una secuencia de señal procariótica fusionada en la parte N terminal y se forman cuerpos de inclusión insolubles durante su expresión procariótica. El proceso es particularmente adecuado para proteínas las cuales contienen más de 5 puentes disulfuro en el estado nativo. Tal proteína es, por ejemplo, un activador de plasmindgeno recombinante (denominado como rPA en lo siguiente, Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299-311, patente US No. 5,223,256). rPA tiene 9 puentes disulfuro los cuales no se forman en el citosol reductor de E. coli. La localización periplásmica de la proteína y opcionalmente del chaperón se asegura por unión operativa con un péptido señal para penetrar las membranas bacterianas interiores .

Se ha demostrado que una concentración de 0.4 mol/l de L-arginina y 5 mmol/1 del glutation (en el caso de cosecreción de DnaJ, dominio J, Hsp25 y scFv) o de 0.4 mol/l de L-arginina sin glutation (sin cosecreción de DnaJ) es óptima para la expresión de tal activador del plasminógeno. Con el fin de aislar la proteína rPA secretora en una forma funcional en E. coli, se fusiona el gen para esta proteína del plásmido pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) por métodos de ingeniería genética a una secuencia de señal procaríotica de bacteria gram-negativa, por ejemplo la secuencia de señal de pectato liasa B (PelB) de Erwinia carotovora. La fusión del gen se construye por clonación en el vector pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA) . Como un resultado, la expresión del gen está bajo el control del promotor T7. La secuencia de señal presente en la proteína de fusión media la secreción al periplasma. La secuencia de señal se separa durante o después de la secreción por una peptidasa localizada en la membrana interior. La proteína secretada después se puede plegar en el periplasma. Las condiciones oxidantes en este compartimiento permiten la formación de los puentes disulfuro (Wuelting and Plückthun, Mol. Microbiol. 12 (1994) 685-692). La adición inventiva de aditivos de bajo peso molecular que mejoran el plegado y los reactivos tiol en el medio nutritivo y la co-sobreexpresión simultánea de DnaJ, dominio J o Hsp 25 en el periplasma permite que se incremente el rendimiento de la proteína funcional en más de 100 veces. Otros ejemplos de polipéptidos de acuerdo con la invención son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tales como el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv, por ejemplo, contra la hormona estimulante de tiroide, TSH) . ScFvs son anticuerpos acortados los cuales están compuestos únicamente de las secciones variables (Fv) de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo los cuales pueden estar fusionados artificialmente via un enlazador peptidico corto (habitualmente Gly4Ser3) (Hudson, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 395-402). ScFvs normalmente tiene la misma afinidad por el antígeno que las cadenas Fv parentales, pero se puede sobreexpresar en E. coli.

Puesto que tiene puentes disulfuro intradominio estabilizante los cuales son esenciales para estabilidad, una expresión en el citosol habitualmente lleva a la formación de cuerpos de inclusión (Shibui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 352-357) . Se puede optimizar específicamente a ScFvs para unión a los antígenos deseados por mutaciones aleatorias y selección subsecuente por exhibición de fago (Alien et al., TIBS 20 (1995) 511-516; Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1998) 1-20) . La adición de GSH 5 mM y L-arginina 0.4 M permite que se mejore el rendimiento de ScFv-TSH funcional en 7 veces en el periplasma y 43 veces en el medio sobrenadante en comparación con los cultivos sin aditivos.

Los siguientes ejemplos, publicaciones y protocolos de secuencias y figuras aclaran más la invención, cuyo alcance protector resulta de las reivindicaciones de patente. Se debe entender que los métodos descritos son ejemplos los cuales aún describen la materia objeto de la invención, incluso después de modificaciones .

Descripción de la lista de secuencias SEC. DE IDENT. NO: 1 y 2 muestra la secuencia de parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-dnaJ el cual codifica para la proteína de fusión constituida de la secuencia señal OmpA y DnaJ junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) las cuales se amplifican a partir de pIN III ompA3-dnaJ. SEC. DE IDENT. NO: 3 y 4 muestran la secuencia de parte del plásmido de expresión pUBS520-dominio pIN-J el cual codifica para la proteína de fusión compuesta por la secuencia de señal OmpA y el dominio J junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) las cuales se amplifican a partir de pIN III ompA3-dnaJ. SEC. DE IDENT. NO: 5 y 6 muestran la secuencia de parte de la expresión del plásmido pUBS520-pIN-hsp25 la cual codifica para la proteina de fusión compuesta de la secuencia de señal OmpA y Hsp25 junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) los cuales se amplifican a partir de pIN III ompA3 - sp25. SEC. DE IDENT. NO: 7 y 8 muestran la secuencia de la parte de la expresión del plásmido pUBS520-scFvOx la cual codifica para la proteína de fusión compuesta por la secuencia de señal PelB y scFvOxazolon junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) las cuales se amplifican a partir de pHEN-scFv o pIN III ompA3. SEC. DE IDENT. NO: 9 y 10 muestran la secuencia de parte de la expresión del plásmido pET20b ( +) -rPA el cual codifica para la proteína de fusión compuesta por la secuencia de señal PelB y rPA.

Descripción de las figuras La figura 1 muestra la dependencia de la expresión de rPA nativa en el periplasma de E. coli con GSH 5 mM en la concentración de L-arginina y diversas construcciones de cosecreción. En la figura 2 muestra una comparación de la expresión de rPA en el periplasma de E. coli BL21 (DE3) cuando cosecreta con DnaJ y cuando se agregan al medio GSH 5 mM y diversas sustancias de bajo peso molecular que mejoran el plegado .

La figura 3 muestra una representación esquemática de la expresión del plásmido pUBS520-pIN-dnaJ. La figura 4 muestra una representación esquemática de la expresión del plásmido pUBS520-pIN-dominio J. * La figura 5 muestra una representación esquemática de la expresión del plásmido pUBS520-pIN-hsp25. La figura 6 muestra una representación esquemática de la expresión del plásmido pUBS520-scFvOx. La figura 7 muestra una representación esquemática de la expresión del plásmido pET20b(+) -rPA. La figura 8 muestra la dependencia de la expresión de scFv-TSH funcional sobre la concentración de L-arginina en presencia de GSH 5 mM en el periplasma y en el medio de cultivo.

Generalidades : Para la sobreexpresión periplásmica de DnaJ, el dominio J y Hsp25 en E. coli, el ADN el cual codifica para estas proteínas se fusiona por ingeniería genética a la secuencia de señal de la proteína A de membrana exterior (OmpA) de E. coli y la fusión se expresa en E. coli en un plásmido recombinante bajo el control del promotor lac-lpp. Como un resultado, las cadenas polipeptídicas de DnaJ y Hsp25 se transportan al periplasma del organismo huésped procariótico y son plegadas de manera nativa aquí . Su posición y plegado nativo se demuestra por proteólisis limitada con tripsina y mediante la prueba Western blot.

Ejemplo 1: Construcción del plásmido de expresión pIN III omp A3-dnaJ Las técnicas de genética molecular se basan en Ausubel et al. (ed.), J. Wiley & Sons, 1997, Curr. Protocols of Molecular Biology. Los oligonucleótidos se obtienen de las compañías MWG Biotech, Ebersberg o GIBCO Life Sciences, Eggenstein, DE. El gen el cual codifica para DnaJ, Gene Bank Acceso No. M 12565, se amplifica por PCR y se clona por medio de lo cual se generan sitios de separación por restricción EcoRI y Ba HI en el plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442. Se confirma la secuencia del fragmento clonado por PCR mediante secuenciado didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) . El plásmido resultante se denomina pIN-III ompA3-dnaJ. La secuencia de DnaJ expresado en el periplasma difiere del de la proteína tipo silvestre en que la secuencia polipeptídica comienza con Gly-Ile-Pro en vez de Met, por lo tanto, existe una extensión N-terminal de 2 aminoácidos. Por lo tanto, DnaJ está bajo el control del promotor lac-lpp el cual es inducido con IPTG (isopropil- ß-D-tiogalactósido) .

Ejemplo 2: * Construcción del plasmado de expresión pTJBS520-pIN-dnaJ La región del plásmido pIN III ompA3-dnaJ el cual codifica el operón lac-lpp, la secuencia de señal, el gen dnaJ y la región terminadora del operón se amplifican por medio de PCR (SEC. DE IDENT. NO: 1) . El producto de PCR se separa con endonucleasa de restricción BglII y se clona en el vector pUBS520 linealizado con la endonucleasa de restricción BamHI. El plásmido resultante se denomina pUBS520-pIN-dnaJ (figura 3) .

Ejemplo 3: Construcción del plás ido de expresión pUBS 520-pIN-dominio J Se insertan dos codones de extensión en el plásmido pUBS 520-pIN-dnaJ después del nucleótido 324 por medio del sistema de mutagénesis QuickChange (Promega, Mannheim, DE) de manera que únicamente se expresan los primeros 108 aminoácidos. La secuencia dé la región mutagenizada se determina por secuenciado didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) y la expresión del fragmento de proteína acortado se detecta mediante la prueba Western blotting y detección con anticuerpo contra DnaJ. El plásmido que se forma se denomina pUBS 520-pIN-dominio J (figura 4) .

Ejemplo 4: Construcción del plásmido pIN III ompA3-hsp25 El gen el cual codifica para Hsp25, Gene Bank Acceso No. : L 07577, se amplifica por PCR y se clona por medio de lo cual se generan sitios de separación por restricción EcoRI y BamHI en el plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442) . Se verifica la secuencia del fragmento de PCR clonado por secuenciado didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) . El plásmido resultante se denomina pIN III ompA3-hsp25. La secuencia de Hsp25 expresada en el periplasma difiere de la de la proteína de tipo silvestre en que la secuencia polipeptídica comienza con Gly-Ile-Leu en vez de Met, y por lo tanto existe una extensión N terminal de 2 aminoácidos. Por lo tanto, Hsp25 está bajo el control del promotor lac-lpp el cual es inducido con IPTG (isopropil- ß-D-tiogalactósido) .

Ejemplo 5 Construcción del plásmido de expresión pUBS520-pin-hsp25 La región del plásmido pIN III ompA3-hsp25 la cual codifica para el operón lac-lpp, la secuencia de señal, el gen hsp 25 y la región terminadora del operón se amplifican por medio de PCR (SEC. DE IDENT. NO: 5) . El producto de PCR se separa con la endonucleasa de restricción BglII y se clona en el vector pUBS520 linealizado con la endonucleasa de restricción BamHI . El plásmido resultante se denomina pUBS520-pIN-hsp25 (figura 5) .

Ejemplo 6: Construcción del plasmado de expresión pUBS520-scFvOx La coexpresión de un fragmento Fv de cadena sencilla el cual se dirige contra el hapteno oxazolon (scFvOxazolon; Fiedler and Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090-1093) el cual no tiene propiedades de chaperón, se examina como el control negativo. La región del plásmido pHEN-scFvOX la cual codifica para el promotor lac, la secuencia de señal pelB y el gen scfvox se amplifican por medio PCR. La región del plásmido pIN III omp A3 la cual codifica para el terminador lpp se amplifica en una segunda PCR. Los dos fragmentos se fusionan en una PCR subsecuente. El producto de la PCR (SEC. DE IDENT. NO: 7) que se forma de esta manera se separa con la endonucleasa de restricción BglII y se clona en el vector pUBS520 que se lineariza con la endonucleasa de restricción BamHI . El plásmido resultante se denomina pUBS520-scFvOx (figura 6) .

Ejemplo 7 Construcción de la expresión de plásmido pET20b (+) -rPA El gen del activador del plasminógeno (rPA) del vector plasmídico pA27fd7 (Kohnert et.al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) se amplifica con la ayuda del método PCR. El producto de PCR se separa" con las endonucleasas de restricción Ncol y BamHI y se clona en el vector plasmídico pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA) . El plásmido que codifica para una proteína de fusión el cual está compuesto de la secuencia de señal de PelB (pectato liasa de Erwinia carotovora) y rPA y la secreción de rPA en el periplasma se verifica por secuenciado didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE) . La construcción se denomina pET20b (+) -rPA (figura 7) . Se expresa rPA del plásmido bajo el control del promotor T7, la T7-ARN-polimerasa en la cepa de E. coli BL21 (DE3) está bajo el control del promotor lacUV5. La inducción se lleva a cabo al agregar IPTG. El rPA que se expresa en el periplasma difiere del activador de plasminógeno descrito por Kohnert et al . en que el segundo aminoácido (Ser) está sustituido por Ala.

Ejemplo 8; Expresión funcional de rPA en el periplasma de E. coli utilizando aditivos para el medio glutation y L-arginina Un cultivo estacionario durante la noche de E. coli BL21 (DE3) (Studier & Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130) el cual se ha transformado con pET20b(+) -rPA y pUBS520-pIN-dnaJ (cosecreción de DnaJ), un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) el cual se ha transformado con pET20b (+) -rPA y pUBS520-pIN-dominio J (cosecreción del dominio J) , un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) el cual ha sido transformado con pET20b (+) -rPA y pUBS520-pIN-hsp25 (cosecreción de Hsp25) y un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) el cual ha sido transformado con pET20b(+) -rPA y pUBS520-scFvOx (cosecreción de scFvOx) , un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) el cual ha sido transformado con pET20b (+) -rPA y pUBS520 o un cultivo durante la noche de E. coli BL21 (DE3) el cual ha sido transformado con pET20b(+) y pUBS520 (cultivo de control) se diluyen en una relación 1:50 en 100 ml de medio LB que contiene ampicilina (100 µg/ml) y canamicina (50 µg/ml, Fluka Chemica, New-Ulm, DE) y se agita a 24 °C y 170 rpm. Después de 3 h de crecimiento, se agregan alícuotas de 5 ml de cultivo a 10 ml de medio LB que contiene las cantidades mencionadas antes de ampicilina y canamicina y diversas concentraciones de GSH (0-10 mM, Fluka, DE) y clorhidrato de L-arginina (0-0,4 M, ICN) y cada una se induce con IPTG 1 mM (isopropil- ß-D-tiogalactósido, AppliChem, Darmstadt, DE) . Las células se agitan durante 21 h adicionales a 24 °C y 170 rpm, y se toma una muestra de 1 ml después de determinar la DO600. Este 1 ml de muestras de células se fracciona en recipientes de reacción Eppendorf mediante un protocolo modificado, de acuerdo con Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692-21699) . En detalle, se agregan 500 µl de amortiguador de fraccionamiento (NaCl 150 mM (Roth GmbH) , Tris/HCl 50 mM (Roth GmbH) , EDTA 5 mM (Biomol) y 1 mg/ml de sulfato de polimixina B (Sigma), pH 7.5) al sedimento celular, se agita durante 1 h a 10 °C en un termoagitador Eppendorf a 1400 rpm y después se centrifuga durante 15 min a 14 000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf enfriada a 10 °C para formar una fracción que contiene las proteínas periplásmicas solubles (sobrenadante) y una fracción residual (sedimento) .

Se determina la actividad de rPA de acuerdo con el método de Verheijen et al. Thromb. Haemostasis 48 (1982) 266-269) . Todas las concentraciones de rPA determinadas en los extractos celulares se estandarizan a suspensiones celulares de D0600 = 1 con el fin de corregir el error que se produce cuando se miden en amortiguadores diferentes .

Ejemplo 9: Expresión funcional de rPA en periplasma de E. coli utilizando mezclas de glutation con formamida, metilformamida, acetamida, metilurea y etilurea como aditivos de medio Un cultivo durante la noche estacionario de E. coli BL21 (DE) el cual se ha transformado con pET20b (+) -rPA y pUBS520-pIN-dnaJ (cosecreción de DnaJ) se cultiva como se establece en el Ejemplo 8. Los compuestos de fórmula I y en cada caso glutation 5 mM se agregan de manera aditiva al medio de cultivo. Se cultiva un cultivo control en LB sin aditivos. En la tabla 3 se incluyen los compuestos de la fórmula I y las concentraciones usadas. La preparación de muestra, el fraccionamiento del periplasma y la prueba enzimática para determinar la actividad de tPA se llevan a cabo como se establece en el Ejemplo 8.

Las tablas 1 y 2, y las figuras 1 y 2 muestran los resultados en la expresión de rPA. Tabla 1: Efecto de la L-arginina en el medio de fermentación, en el rendimiento de rPA nativa en el periplasma Proteína L-arginina OM L-arginina 0.2 M L-arginina 0.4 M cosecretada rPA en Factor de rPA en Factor de rPA en Factor de ng/ml*D060o estimulación ng/ml*DO600 estimulación ng/ml*DO600 estimulación - 0.030 ± 0.001 29 0.044 ± 0.090 20 0.170 ± 0.005 23 DnaJ 0.197 ± 0.019 29 0.730 ± 0.150 27 3.978 ± 1.000 18 dominio J 0.339 ± 0.007 16 0.625 ± 0.213 17 4.398 ± 0.165 15 Hsp25 0.053 ± 0.002 27 0.140 ± 0.001 17 2.850 ± 0.214 17 scFvOxazolon 0.041 ± 0.003 13 0.144 ± 0.047 8 0.713 ± 0.113 10 El cultivo se lleva a cabo en presencia de GSH 5 mM.

Tabla 2: Efecto de los diversos aditivos de bajo peso molecular en el medio de cultivo, sobre el rendimiento de rPA nativa en el periplasma de E. coli Aditivo Concentración Rendimiento de rPA, Factor de DOßoo en la Concentración en el medio en ng/ml*DOeoo en el estimulación cosecha de de GSH en el de cultivo periplasma células medio Sin aditivos - 0.153 24 4.52 O mM arginina 0.2 M 0.560 21 4.45 5 mM 0.4 M 3.880 17 1.78 5 mM formamida 0.6 M 0.208 17 4.96 5 mM l.O M 0.219 10 4.71 5 mM metilfopnamida 0.3 M 0.141 15 4.57 5 mM 0.6 M 0.790 17 1.04 5 mM acetamida 0.6 M 0.150 24 5.34 5 mM l.O M 1.321 16 1.57 5 mM meálurea 0.3 M 0.168 24 4.67 5 mM 0.6 M 0.830 22 4.59 5 mM etilurea 0.3M 0.266 23 4.20 5mM 0.6M 1.209 17 0.82 5mM Ejemplo 10: Expresión de un fragmento funcional de Fv de cadena sencilla con adición de glutation reducido y L-arginina al medio de cultivo Un cultivo durante la noche estacionario de E. coli BL21 (DE3) el cual ha sido transformado con un plásmido el cual codifica para un fragmento Fv de cadena sencilla de un anticuerpo contra TSH (patente US No. 5,614,367) y pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114) se diluye en una relación 1:50 en 100 ml de medio LB que contiene ampicilina (100 µg/ml) y canamicina (50 µg/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) y se agita a 24 °C a 170 rpm. Después de 3 h de crecimiento, se agregan alícuotas de 5 ml de cultivo a 10 ml de medio LB que contiene las cantidades mencionadas antes de ampicilina y canamicina y diversas concentraciones de GSH (0-10 M, Fluka) y clorhidrato de L-arginina (0-0.4 M, ICN) y cada una se induce con IPTG 1 mM (isopropil- ß-D-tiogalactósido, AppliChem, Darmstadt) . Las células se agitan durante 21 h adicionales a 24°C y 170 rpm, y se toma una muestra de 1 ml después de determinar la D0600. Estas muestras de células de 1 ml se fraccionan en recipientes de reacción Eppendorf de 2 ml por un protocolo modificado de acuerdo con Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692-21699) (véase ejemplo 8) . Además, se toma una mueetra del medio sabrenadart e (1 tet . La muestra'? se someten a una prueba ELISA para analizarlas para determinar los anticuerpos funcionales. La unión de scFv-TSH nativa a TSH se estandariza con scFv-TSH estándar, se purifica con el sistema RPAS (Pharmacia Biotech, Alemania) (una unidad corresponde a la unión de 1 µl de estándar a la placa de microtitulación recubierta con TSH) . La adición de L-arginina al medio de cultivo también tiene un efecto positivo en el rendimiento de scFv-TSH nativa en el periplasma y en el sobrenadante del medio de E. coli. La adición de L-arginina 0.4 M y GSH 5 mM permite que la cantidad de fragmento de anticuerpo que se detecta por medio de ELISA se incremente en 7 veces en el medio sobrenadante y en 43 veces en la fracción periplásmica en comparación con un cultivo con GSH 5 mM (figura 8) .

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(1591) <400> 1 TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA 60 CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT 120 TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT 180 TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG 240 GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT 300 GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT 360 TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACÁ GCT ATC GCG 412 Met Lys Lys Thr Ala lie Ala 1 5 ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT 460 lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly lie 10 15 20 CCA GCT AAG CAA GAT TAT TAC GAG ATT TTA GGC GTT TCC AAA ACÁ GCG 508 Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu lie Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala 25 30 35 GAA GAG CGT GAA ATC AGA AAG GCC TAC AAA CGC CTG GCC ATG AAA TAC 556 Glu Glu Arg Glu lie Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Mee Lys Tyr 40 45 50 55 CAC CCG GAC CGT AAC CAG GGT GAC AAA GAG GCC GAG GCG AAA TTT AAA 604 His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys 60 65 70 GAG ATC AAG GAA GCT TAT GAA GTT CTG ACC GAC TCG CAA AAA CGT GCG 652 Glu lie Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala 75 80 85 GCA TAC GAT CAG TAT GGT CAT GCT GCG TTT GAG CAA GGT GGC ATG GGC 700 Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Glp Gly Gly Me Giy 90 95 100 GGC GGC GGT TTT GGC GGC GGC GCA GAC TTC AGC GAT ATT TTT GGT GAC 748 Gly Gly Gly Phß Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp He Phe Gly Asp 105 110 115 GTT TTC GGC GAT ATT TTT GGC GGC GGA CGT GGT CGT CAA CGT GCG GCG 796 Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly Ara Gly Arg Glr. Arg Ala Ala 120 125 130 135 CGC GGT GCT GAT TTA CGC TAT AAC ATG GAG CTC ACC CTC GAA GAA GCT 844 Are; Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Mee Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala 140 145 150 GTA CGT GGC GTG ACC AAA GAG ATC CGC ATT CCG ACT CTG GAA GAG TGT 892 Val Arg Gly Val Thr Lys Glu He Arg He Pro Thr Leu Glu Glu Cys 155 160 165 GAC GTT TGC CAC GGT AGC GGT GCA AAA CCA GGT ACÁ CAG CCG CAG ACT 940 Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr Gln Pro Gin Tnr 170 175 180 TGT CCG ACC TGT CAT GGT TCT GGT CAG GTG CAG ATG CGC CAG GGA TTC 988 Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Mee Arg Glp Gly Phe 185 190 195 TTC GCT GTA CAG CAG ACC TGT CCA CAC TGT CAG GGC CGC GGT ACG CTG 1036 Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Tr.r Leu 200 205 210 215 ATC AAA GAT CCG TGC AAC AAA TGT CAT GGT CAT GGT CGT GTT GAG CGC 1084 He Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His Gly Hxs Gly Arg Val Giu Arg 220 225 230 AGC AAA ACG CTG TCC GTT AAA ATC CCG GCA GGG GTG GAC ACT GGA GAC 1132 Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys He Pro Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp 235 240 245 CGC ATC CGT CTT GCG GGC GAA GGT GAA GCG GGC GAG CAT GGC GCA CCG 1180 Arg He Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro 250 255 260 GCA GGC GAT CTG TAC GTT CAG GTT CAG GTT AAA CAG CAC CCG ATT TTC 1228 Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro He Phe 265 270 275 GAG CGT GAA GGC AAC AAC CTG TAT TGC GAA GTC CCG ATC AAC TTC GCT 1276 Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro He Asn Phe Ala 280 285 290 295 ATG GCG GCG CTG GGT GGC GAA ATC GAA GTA CCG ACC CTT GAT GGT CGC 1324 Mee Ala Ala Leu Gly Gly Glu He Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg 300 305 310 GTC AAA CTG AAA GTG CCT GGC GAA ACC CAG ACC GGT AAG CTA TTC CGT 1372 Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg 315 320 325 ATG CGC GGT AAA GGC GTC AAG TCT GTC CGC GGT GGC GCA CAG GGT GAT 1420 Mee Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Glr. Gly Asp 330 ' 335 340 TTG CTG TGC CGC GTT GTC GTC GAA ACÁ CCG GTA GGC CTG AAC GAA AGG 1468 Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr Pro Val Gly Leu Asr. Glu Arg 345 350 355 CAG AAA CAG CTG CTG CAA GAG CTG CAA GAA AGC TTC GGT GGC CCA ACC 1516 Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr 360 365 370 375 GGC GAG CAC AAC AGC CCG CGC TCA AAG AGC TTC TTT GAT GGT GTG AAG 1564 Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys 380 385 ' 390 AAG TTT TTT GAC GAC CTG ACC CGC TAA GGATCCGGCT GAGCAACGAC 1611 Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg * 395 400 GTGAACGCAA TGCGTTCCGA CGTTCAGGCT GCTAAAGATG ACGCAGCTCG TGCTAACCAG 1671 CGTCTGGACA ACATGGCTAC TAAATACCGC AAGTAATAGT ACCTGTGAAG TGAAAAATGG 1731 CGCACATTGT GCGACATTTT TTTTGTCTGC CGTTTACCGC TACTGCGTCA CGCGTAACAT 1791 ATTCCCTTGC TCTGGTTCAC CATTCTGCGC TGACTCTACT GAAGGCGCAT TGCTGGCTGC 1851 GGGAGTTGCT CCACTGCTCA CCGAAACCGG 1881 <210> 2 <211> 400 <212> PRT <213> E. coli <400> 2 Mee Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu He 20 25 30 Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr 35 40 45 Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu 65 70 75 80 Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala 85 90 95 Phe Glu Gln Gly Gly Mee Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Phe Ser Asp He Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Mee 130 135 140 Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Arg Gly Val Thr Lys Glu He Arg 145 150 155 160 He Pro Thr Leu Glu Glu Cys Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys 165 170 175 Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln 180 185 190 Val Gln Mee Arg Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His 195 200 205 Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu He Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His 210 215 220 Gly His Gly Arg Val Glu Arg Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys He Pro 225 230 235 240 Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp Arg He Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu 245 250 255 Ala Gly Glu His Gly Ala Pro Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln 260 265 270 Val Lys Gln His Pro He Phe Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys 275 280 285 Glu Val Pro lie Asn Phe Ala Mee Ala Ala Leu Gly Gly Glu He Glu 290 295 300 Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr 305 310 315 320 Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg Mee Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val 325 330 335 Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr 340 345 350 Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Glr. 355 360 365 Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys 370 375 380 Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg * 385 * 390 395 400 <210> 3 <211> 1881 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> CDS <222> (392) ... (790 <400> TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA 60 CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT 120 TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT 180 TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG 240 GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT 300 GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT 360 TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACÁ GCT ATC GCG 412 Met Lys Lys Thr Ala He Ala 1 5 ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT 460 He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly He 10 15 20 CCA GCT AAG CAA GAT TAT TAC GAG ATT TTA GGC GTT TCC AAA ACÁ GCG 508 Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu He Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala 25 30 35 GAA GAG CGT GAA ATC AGA AAG GCC TAC AAA CGC CTG GCC ATG AAA TAC 556 Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Mee Lys Tyr 40 45 50 55 CAC CCG GAC CGT AAC CAG GGT GAC AAA GAG GCC GAG GCG AAA TTT AAA 604 His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys 60 65 70 GAG ATC AAG GAA GCT TAT GAA GTT CTG ACC GAC TCG CAA AAA CGT GCG 652 Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala 75 80 85 GCA TAC GAT CAG TAT GGT CAT GCT GCG TTT GAG CAA GGT GGC ATG GGC 00 Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Giy Mee Gly 90 95 100 * GGC GGC GGT TTT GGC GGC GGC GCA GAC TTC AGC GAT ATT TTT GGT GAC 748 Gly Gly Gly Phe Gl Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp He Phe Gly Asp 105 ' 110 115 GTT TTC GGC GAT ATT TTT GGC GGC GGA CGT GGT CGT TAA TAG 790 Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg * * 120 125 130 GCGGCGCGCG GTGCTGATTT ACGCTATAAC ATGGAGCTCA CCCTCGAAGA AGCTGTACGT 850 GGCGTGACCA AAGAGATCCG CATTCCGACT CTGGAAGAGT GTGACGTTTG CCACGGTAGC 910 GGTGCAAAAC CAGGTACACA GCCGGAGACT TGTCCGACCT GTCATGGTTC TGGTCAGG7G 970 CAGATGCGCC AGGGATTCTT CGCTGTACAG CAGACCTGTC CACACTGTCA GGGCCGCGGT 1030 ACGCTGATCA AAGATCCGTG CAACAAATGT CATGGTCATG GTCGTGTTGA GCGCAGCAAA 1090 ACGCTGTCCG TTAAAATCCC GGCAGGGGTG GACACTGGAG ACCGCATCCG TCTTGCGGGC 1150 GAAGGTGAAG CGGGCGAGCA TGGCGCACCG GCAGGCGATC TGTACGTTCA GGTTCAGG7T 1210 AAACAGCACC CGATTTTCGA GCGTGAAGGC AACAACCTG7 ATTGCGAAG7 CCCGATCA.-.C 1270 TTCGCTATGG CGGCGCTGGG TGGCGAAATC GAAGTACCGA CCCTTGAÍGG TCGCGTCAAA 1330 CTGAAAGTGC CTGGCGAAAC CCAGACCGGT AAGCTATTCC GTATGCGCGG TAAAGGCG7C 1390 AAGTCTGTCC GCGGTGGCGC ACAGGGTGAT TTGCTGTGCC GCGTTGTCGT CGAAACACC3 1450 GTAGGCCTGA ACGAAAGGCA GAAACAGCTG CTGCAAGAGC TGCAAGAAAG CTTCGGTGGC 1510 CCAACCGGCG AGCACAACAG CCCGCGCTCA AAGAGCTTC7 TTGATGGTGT GAAGAAGT77 1570 TTTGACGACC TGACCCGCTA AGGATCCGGC TGAGCAACGA CGTGAACGCA ATGCGTTCCG 1630 ACGTTCAGGC TGCTAAAGAT GACGCAGCTC GTGCTAACCA GCGTCTGGAC AACATGGC7A 1690 CTAAATACCG CAAGTAATAG TACCTGTGAA GTGAAAAATG GCGCACATTG TGCGACATTT 1750 TTTTTGTCTG CCGTTTACCG CTACTGCGTC ACGCGTAACA TATTCCCTTG CTCTGGTTCA 1810 CCATTCTGCG CTGACTCTAC TGAAGGCGCA TTGCTGGCTG CGGGAGTTGC TCCACTGC7C 1870 ACCGAAACCG G 1881 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> E. coli <400> 4 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu He 20 25 30 Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr 35 40 45 Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu 65 ' 70 75 80 Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala 85 90 95 Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Phe Ser Asp He Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Arg Gly Arg 130 <210> 5 <211> 1379 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> CDS <222> (392) ... (1090 <400> 5 TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA 60 CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT 120 TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT 180 TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG 240 GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT 300 GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT 360 TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACÁ GCT ATC GCG 412 Met Lys Lys Thr Ala He Ala 1 5 ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT 460 He Ala Val Ala Le^Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly He 10 .' 15 20 CTC ACC GAG CGC CGC GTG CCC TTC TCG CTG CTG CGG AGC CCG AGC TGG 508 Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp 25 30 35 GAA CCA TTC CGG GAC TGG TAC CCT GCA CAC AGC CGC CTC TTC GAT CAA 556 Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala His Ser Arg Leu Phe Asp Glr. 40 45 50 55 GCT TTC GGG GTG CCC CGG TTG CCC GAT GAG TGG TCG CAG TGG TTC AGC 604 Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser 60 65 70 GCC GCT GGG TGG CCC GGA TAC GTG CGC CCG CTG CCC GCC GCG ACC GCC 652 Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala 75 80 85 GAG GGC CCC GCG GCG GTG ACC CTG GCC GCA CCA GCC TTC AGC CGA GCG 700 Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala 90 95 100 CTC AAC CGA CAG CTC AGC AGC GGG GTC TCG GAG ATC CGA CAG ACG GCT 748 Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val Ser Glu He Arg Gln Thr Ala 105 110 115 GAT CGC TGG CGC GTG TCC CTG GAC GTC AAC CAC TTC GCT CCG GAG GAG 796 Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Glu Glu 120 125 ' 130 135 CTC ACÁ GTG AAG ACC AAG GAA GGC GTG GTG GAG ATC ACT GGC AAG CAC 844 Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val Val Glu He Thr Gly Lys His 140 145 150 GAA GAA AGG CAG GAC GAA CAT GGC TAC ATC TCT CGG TGC TTC ACC CGG 892 Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr He Ser Arg Cys Phe Thr Arg 155 160 165 AAA TAC ACG CTC CCT CCA GGT GTG GAC CCC ACC CTA GTG TCC TCT TCC 940 Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser 170 175 180 CTA TCC CCT GAG GGC ACÁ CTT ACC GTG GAG GCT CCG TTG CCC AAA GCA 988 Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala 185 190 195 GTC ACG CAG TCA GCG GAG ATC ACC ATT CCG GTT ACT TTC GAG GCC CGC 1036 Val Thr Gln Ser Ala Glu He Thr lie Pro Val Thr Phe Giu Ala Arg 200 205 210 215 GCC CAA ATT GGG GGC CCA GAA GCT GGG AAG TCT GAA CAG TCT GGA GCC 1084 Ala Gln He Gly Gly Pro Glu Ala Gly Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala 220 225 230 AAG TAG GATCCGGCTG AGCAACGACG TGAACGCAAT GCGTTCCGAC GTTCAGGCTG 1140 Lys * CTAAAGATGA CGCAGCTCGT GCTAACCAGC GTCTGGACAA CATGGCTACT AAATACCGCA 1200 AGTAATAGTA CCTGTGAAGT GAAAAATGGC GCACATTGTG CGACATTTTT TTTGTCTGCC 1260 GTTTACCGCT ACTGCGTCAC GCGTAACATA TTCCCTTGCT CTGGTTCACC ATTCTGCGCT 1320 GACTCTACTG AAGGCGCATT GCTGGCTGCG GGAGTTGCTC CACTGCTCAC CGAAACCGG 1379 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> E. coli <400> Met Lys Lys Thr Ala He Ala lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser 20 25 30 Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala 35 40 45 His Ser Arg Leu Phe Asp Gln Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp 50 55 60 Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg 65 70 75 80 Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala 85 90 95 Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val 100 105 110 Ser Glu He Arg Gln Thr Ala Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val 115 120 125 Asn His Phe Ala Pro Glu Glu Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val 130 135 140 Val Glu He Thr Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr 145 150 155 160 He Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp 165 170 175 Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val 180 . 185 190 Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala Val Thr Gln Ser Ala Glu He Thr He 195 ' 200 205 Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg Ala Gln He Gly Gly Pro Glu Ala Gly 210 215 220 Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala Lys 225 230 <210> 7 <211> 1256 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> CDS <222> (199) .. (969) <400> GATCTGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATGTTG7 GTGGAATTGT GAGCGGATAA 60 CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTTGC'ATG CAAATTCTAT 120 TTCAAGGAGA CAGTCATAAT GAAATACCTA TTGCCTACGG CAGCCGCTGG ATTGTTATTA 180 CTCGCGGCCC AGCCGGCC ATG GCC GAG GTC AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA 231 Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly 1 5 10 GGC TTA GTG CAG CCT GGA GGG TCC CGG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT 279 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Le-_ Ser Cys Ala Ala Ser 15 20 25 GGA TTC ACT TTC AGT AGC TTT GGA ATG CAC TGG GTT CGT CAG GCT CCA 327 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Mee His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 GAG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA TAT ATT AGT AGT GGC AGT AGT ACC 375 Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr He Ser Ser Gly Ser Ser Thr 45 50 55 ATC TAC TAT GCA GAC ACÁ GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC 423 He Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp 60 65 70 75 AAT CCC AAG AAC ACC CTG TTC CTG CAA ATG ACC AGT CTA AGG TCT GAG 471 Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Mee Thr Ser Leu Arg Ser Giu 80 85 90 GAC ACG GCC ATG TAT TAC TGC GCA AGA GAT TAC GGG GCT TAT TGG GGC 519 Asp Thr Ala Mee Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly 95 . 100 105 CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA 567 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Giy Giy 110 ' 115 120 GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 615 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Glu Leu Thr Gln Ser Pro 125 130 135 GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 663 Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Mee Thr Cys Ser 140 145 150 155 GCC AGT TCA AGT GTA AGG TAC ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAG TCA GGC 711 Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly 160 165 170 ACC TCC CCC AAA AGA TGG ATT TAT GAC ACÁ TCC AAA CTG TCT TCT GGA 759 Thr Ser Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly 175 180 185 GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 807 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 190 195 200 ACÁ ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 855 Thr He Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 205 210 . 215 CAG TGG AGT AGT AAT CCA CTC ACT TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG 903 Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Giu 220 225 230 235 CTG AAA CGG GCG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG 951 Leu Lye Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu 240 245 250 AAT GGG GCC GCA TAG TAA CTGAGCAACG ACGTGAACGC AATGCGTTCC 999 Asn Gly Ala Ala * * 255 GACGTTCAGG CTGCTAAAGA TGACGCAGCT CGTGCTAACC AGCGTCTGGA CAACATGGCT 1059 ACTAAATACC GCAAGTAATA GTACCTGTGA AGTGAAAAAT GGCGCACATT GTGCGACATT 1119 TTTTTTGTCT GCCGTTTACC GCTACTGCGT CACGCGTAAC ATATTCCCTT GCTCTGGTTC 1179 ACCATTCTGC GCTGACTCTA CTGAAGGCGC ATTGCTGGCT GCGGGAGTTG CTCCACTGCT 1239 CACCGAAACC GGAGATC 1256 <210> 8 <211> 257 <212> PRT <213> E. coli <400> Mßt Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala Tyr He Ser Ser Gly Ser Ser Thr He Tyr Tyr Ala Asp 50. 55 60 Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Aßp He Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala He Met Ser Ala 130 135 140 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 145 150 155 160 Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 165 170 175 Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Ser Mee 195 200 205 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn 210 215 220 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala 225 230 235 240 Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Aia 245 250 255 <210> 9 <211> 1137 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> CDS <222> (1) ... C (1137) <400> ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 GCC CAG CCG GCG ATG GCC ATG GCT TAC CAA GGA AAC AGT GAC TGC TAC 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Mee Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr 20 25 30 TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG 144 Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser 35 40 45 GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT 192 Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met He Leu He Gly Lys Val 50 55 60 TAC ACÁ GCA CAG AAC CCC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT 240 Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys Kis 65 70 75 80 AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG 288 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys Hie Val 85 90 95 CTG ACG AAC CGC AGG CTG ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC 336 Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys 100 105 110 TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA 384 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg He Lys 115 120 125 GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC 432 Gly Gly Leu Phe Ala Asp He Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala He 130 135 140 TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC 480 Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly 145 150 155 160 ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG 528 He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln 165 170 175 GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACÁ TAC 576 Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val He Leu Gly Arg Thr Tyr 180 " 185 190 CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA. TAC 624 Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr 195 200 205 ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG 672 He Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala 210 215 220 CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC 720 Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser 225 230 235 240 GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GAC CTG CAG CTG CCG GAC 768 Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp 245 250 255 TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT 816 Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser 260 265 270 CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA 864 Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro 275 280 285 TCC AGC CGC TGC ACÁ TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACÁ GTC ACC GAC 912 Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp 290 295 300 AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC 960 Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asr. 305 310 315 320 TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG 1008 Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu 325 330 335 AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC 1056 Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly He He Ser Trp Gly Leu Gly 340 345 350 TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC 1104 Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asr. Tyr 355 360 365 CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 1137 Leu Asp Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro * 370 375 <210> 10 <211> 379 <212> PRT <213> E. coli <400> 10 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr 20 25 30 Phß Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser 35 40 45 Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met He Leu He Gly Lys Val 50 55 60 Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His 65 70 75 80 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val 85 90 95 Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys 100 105 110 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg He Lys 115 120 125 Gly Gly Leu Phe Ala Asp He Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala He 130 135 140 Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly 145 150 155 160 He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln 165 170 175 Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val He Leu Gly Arg Thr Tyr 180 185 190 Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr 195 200 205 He Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala 210 215 220 Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser 225 230 235 240 Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp » 245 250 255 Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser 260 265 270 Pro Phe Tyr Ser GI4 Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro 275 280 285 Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp 290 295 300 Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn 305 310 315 320 Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu 325 330 335 Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly 340 345 350 Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr 355 360 365 Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro 370 375 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el gue resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la producción de polipéptidos eucarióticos solubles en agua, plegados de forma natural, que contienen una o varias cisteínas unidas por puentes disulfuro, al cultivar células procarióticas, a) en el cual las células procarióticas contienen un vector de expresión el cual codifica para el polipéptido el cual contiene una secuencia de señal procariótica en la parte N terminal, b) bajo condiciones bajo las cuales se secreta el polipéptido al periplasma o al medio, c) separar la secuencia de señal y aislar el polipéptido del periplasma o del medio en el que el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I en la cual R y Rj representan hidrógeno o una cadena alquilo de L-C^ saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R2 representa hidrógeno, NHRa o una cadena alquilo de C-L-CJ saturada o insaturada, ramificada o no ramificada.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza la arginina como el clorhidrato o como otra forma titulada.

3. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el reactivo diol reductor se agrega al medio nutriente.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se utiliza glutation como el reactivo tiol reductor.

5. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia de señal se deriva de una bacteria gramnegativa.

6. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la célula procariótica contiene un vector de expresión adicional el cual codifica para un chaperón molecular.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el chaperón molecular es ADN J de E. coli o HSP25.

8. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el ADN que codifica para el chaperón molecular está en unión operativa con un fragmento de ADN el cual codifica para un péptido señal para penetrar la membrana bacteriana interior.

9. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el ADN que codifica para el chaperón molecular secretado y/o para la proteína secretada está bajo el control de una señal de expresión inducible.

10. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, interferón, hormona proteínica o una proteasa. SECRETADAS EN FORMA NATURAL - l RESUMEN PE LA INVENCIÓN Se describe un proceso para la producción de un polipéptido eucariótico plegado de forma natural, soluble en agua, que contiene dos o varias cisteínas unidas por puentes disulfuro, mediante cultivo de células procarióticas, a) en el cual las células procarióticas contienen un vector de expresión el cual codifica para el polipéptido el cual contiene una secuencia de señal procariótica en la parte N terminal, b) bajo condiciones bajo las cuales el polipéptido es secretado al periplasma o al medio, O separar la secuencia de señal y aislar el polipéptido del periplasma o del medio, el cual está caracterizado porque el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I Rj-CO-NRRj. (I) en la cual R y Rx representan hidrógeno o una cadena alquilo de Cx-C4 saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R2 representa hidrógeno, NHR.. o una cadena alquilo de C1-Ca saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, el cual es adecuado para la producción recombinante de polipéptidos en procariotes con un rendimiento elevado.