KR100361049B1 - 천연적으로 폴딩 및 분비되는 단백질의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

배양은 아르기닌 또는 화학식 1 의 R2-CO-NRR1의 화합물 (식중, R 및 R1은 수소 또는 포화 또는 불포화 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 4 의 알킬 사슬을 나타내고,R2는 수소, NHR1또는 포화 또는 불포화된 분지 또는 비분지 탄소수 1 내지 3 의 알킬 사슬을 나타낸다.) 의 존재하에서 실행하는 것을 특징으로 하는, a) N-말단에 원핵성 시그널 서열을 함유하는 하기 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포를, b) 폴리펩티드가 외질(periplasm) 또는 배지로 분비되는 조건하에서 배양하고, c) 시그널 서열을 절단 및 외질 또는 배지로부터 폴리펩티드를 단리하는 것으로 이루어진, 디술피드 브릿지에 의해 연결된 둘 이상의 시스테인을 함유하는 천연적으로 접히는 수용성의 진핵성 폴리펩티드의 제조방법은 고수율로 원핵생물에서 폴리펩티드를 재조합 생산하는데 적합하다.

Description

천연적으로 폴딩 및 분비되는 단백질의 제조방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NATURALLY FOLDED AND SECRETED PROTEINS}
본 발명은 원핵세포에서 발현후 자연적으로 접혀지고 분비되는 수용성 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
또한 번역으로도 불리우는 원핵성 유기체에서의 단백질 합성은 세포질내 라이보솜에서 일어난다. 재조합 DNA 를 원핵성 숙주 유기체에서 발현시키는 경우, 종종 세포질로부터 상기 과정에서 수득한 재조합 유전자 생성물 또는 단백질을 내측세균벽을 통해 내측막과 외측막사이의 외질 공간으로 분비시키는 것이 바람직하다. 이어서 분비된 단백질은 예컨대 삼투압 쇼크로 외질로부터 영양배지로 방출시킬 수 있다. 이러한 과정의 단점은 분비된 폴리펩티드가 종종 천연의 생물학적활성 배위를 형성하지 않는다는 것이다 (Hockney, TIBTECH 12 (1994)456-463;Baynex, Curr. Opin.Biotechnol.10 (1999)411-421).
최근 분자 샤프롱(chaperone) 및 폴딩 촉매, 예컨대, 펩티딜-프롤릴-시스/트랜스아이소머라아제 또는 단백질 디술피드 아이소머라아제 (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) 가 인 비보(in vivo) 에서 폴딩시 천연 재조합 단백질의 수율을 증가시키는데 사용되어 왔다 (Thomas et al., Appl.Biochem. Biotechnol. 66 (1997)197-238). 몇몇의 경우에서, 이것은 래트로부터, 예컨대, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라아제 (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature 337 (1989)44-47), 인간 프로콜라게나아제 (Lee Olins, J.Biol.Chem. 267 (1992) 2849-2852) 또는 신경원 산화질소 신타아제 (Roman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428-8432) 의 발현에서 상당한 향상을 가져온다. 이런 예들에서, 대장균유래의 GroEL/ES 또는 Dnak 계는 사이토솔에서 공-과발현(co-overexpresssed)된다. 파지티브 효과는 통상적으로 가용성 형태의 목적 단백질의 증가된 수율이다.
또한 샤프롱의 공-발현은 재조합 단백질이 대장균의 외질로 분비되는 경우에나 조사되어왔다. 그러나, 이런 경우에서 단지 샤프롱의 사이토솔 과발현은 외질로의 분비를 최적화하기 위하여 평가되었을 뿐이다 (Perez-Perez et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.210 (1995)524-529; Sato et al., Biochem. Biophys Res.Commun. 202 (1994) 258-264; Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996)55-60). 대장균에서의 공분비에 대한 예전의 시도는 단지, 예컨대, 단백질 디술피드 아이소머라아제 (PDI; Glockshuber et al., EP-A 0510 658) 또는 펩티딜-프롤릴-시스/트랜스-아이소머라아제 또는 대장균 유래의 Dsb 단백질 (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993)77-83;Qiu et al., Appl.Environm.Microbiol. 64(1998)-4891-4896 and Schmidt et al., Prot.Engin. 11 (1998)601-607) 과 같은 폴딩 촉매에 관련된 것이었다. 최근에, 외질성 Skp 단백질의 공-과발현은 좀더 효율적인 상 디스플레이의 폴딩 및 외질로 분비되는 항체 단편의 좀더 높은 수율을 가져온다(Bothman and Pluckthun, Nat. Biotechnol.16 (1988) 376-380; Hayhurst and Harris, Prot. Expr. Purif. 15 (1999)336-343).
우레아 또는 우레아 유도체, 포름아미드, 아세트아미드 또는 L-아르기닌과 같은 화합물이 원핵세포내 재조합 DNA 의 세포질 발현동안 형성되는 불용성 단백질 응집체 (봉입체)의 인 비트로 재생을 위한 방법에서 사용된다. 첨가제로서의 L-아르기닌은 인비트로 재생에서 천연적으로 접히는 단백질의 수율을 상당히 향상시킬 수 있다 (Rudolph et al., US-Patent No. 5,593,865; Buchner Rudolph,Bio/Technology 9 (1991)157-162;Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad.Sci USA 89 (1992) 3075-3079;Lin Traugh, Prot.Express.Purif. 4(1993)256-264).
본 발명의 목적은 단순한 방식으로 실시할 수 있으며, 봉입체의 가용화, 환원 및 재생, 환원 및 재생과 같은 수고스런 인 비트로 후처리가 필요없는 원핵세포내 발현후 천연적으로 접히는 수용성의 진핵성 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1 은 5mM GSH 를 갖는 대장균의 외질에서의 천연 rPA 의 발현의 L-아르기닌 농도에 대한 의존성 및 다양한 공-분비 구축물을 보여준다.
도 2 는 DnaJ 와 공분비된 경우, 및 5mM GSH 및 폴딩을 향상시키는 다양한 저분자물질을 배지에 첨가하는 경우의 대장균 BL21(DE3)의 외질에서의 rPA 의 발현의 비교를 보여준다.
도 3 은 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ 의 개략도이다.
도 4 는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인의 개략도이다.
도 5 는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25 의 개략도이다.
도 6 는 발현 플라스미드 pUBS520-scFvOx의 개략도이다.
도 7 은 발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA 의 개략도이다.
도 8 은 외질 및 배양 배지내 5mM GSH 의 존재에서 L-아르기닌의 농도에 대한 기능성 scFv-TSH 의 발현의 의존성을 보여준다.
본 발명의 목적은 디술피드 브릿지로 연결된 둘 이상의 시스테인을 갖는 천연적으로 접히는 수용성의 진핵성 폴리펩티드의 제조방법에 의해 달성되고, 이 방법은
a) N-말단에서 원핵성 시그널 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 발현벡터를 함유하는 원핵세포를,
b) 폴리펩티드가 외질 또는 배지로 분비되는 조건하에서 배양하고,
c) 시그널 서열을 절단하고 외질 또는 배지로부터 폴리펩티드를 단리시키는 것으로 이루어지며,
여기에서, 배양은 하기 화학식 1 의 화합물 또는 아르기닌의 존재하에서 실시한다 :
R2-CO-NRR1
식중,
R 및 R1은 수소 또는 포화 또는 불포화된 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 4 의 알킬 사슬을 나타내고,
R2는 수소, NHR1또는 포화 또는 불포화된 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 3 의 알킬 사슬을 나타낸다.
화학식 1 의 화합물 또는 아르기닌의 농도는 바람직하게는 적어도 0.1 mol/l 이지만, 아르기닌 또는 상기 화합물의 용해도만 보장된다면 상당히 더 높을 수 있다. 아르기닌 또는 화학식 1 의 화합물은 바람직하게는 0.1 내지 1.5 mol/l 의 농도로 사용한다.
포름아미드, 아세트아미드, 우레아 또는 우레아 유도체, 예컨대, 에틸우레아 또는 메틸우레아가 바람직하게는 화학식 1 의 화합물로서 원핵세포를 배양하기 위하여 사용하는 영양 배지에 첨가된다. 아르기닌은 예컨대 히드로클로라이드 또는 아르기닌 염기의 다른 적정된 형태로서 사용할 수 있다. 그러나, L-아르기닌 이 바람직하게는 사용되고 L-아르기닌의 히드로클로라이드 형태가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 있어서, SH 기를 갖는 환원성 티올시약이 재조합적으로 생성된 단백질의 수율을 추가로 증가시키는 원핵세포를 배양하는데 사용하는 영양 배지(발효배지)에 추가로 첨가된다. 0.1- 15 mmol/l 티올 시약이 바람직하게는 첨가된다. 본 발명에 따른 용어 "티올 시약" 은 SH 기를 갖는 환원성(환원된)시약 또는 SH 기를 갖는 환원성 시약과 디술피드기를 갖는 산화성 시약의 혼합물을 의미한다. 바람직한 물질은 환원 및 산화된 글루타티온(GSH), 시스테인, 시스틴, N-아세틸시스테인, 시스테아민, β-머캅토메탄올 및 유사 화합물이다. 티올 시약은 단독 및 혼합하여 사용할 수 있다. 분자당 하나의 SH 기를 갖는 글루타티온 (GSH) 와 같은 티올 시약이 특히 적합하다. 글루타티온과 같은 티올시약은 재조합 DNA 가 원핵세포에서 발현되는 경우 천연적으로 접히는 단백질의 수율을 향상시키는 것으로 공지되어 있다 (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658).
본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 구현예에 있어서, 분자 샤프롱은 추가로 과발현되고 공분비된다. 샤프롱은 인 비보에서 응집으로부터 다른 비천연 단백질을 보호하고, 이들의 천연배위의 형성을 촉진시키는 단백질로서 본 발명에서는 의미한다. 분자 샤프롱은 종래기술에서 단백질을 안정화시켜 응집 및 불활성화로부터 단백질을 보호하기 위하여 사용하였다 (Buchner et al., EP-A 0 556 726 A1). 바람직하게는 HSP40 형(분자량 약 40kDa) 또는 소(小)열쇼크 단백질(sHSP) 의 ATP 의존성 사프롱이 사용된다. DnaJ 는 대장균의 세포질에서 발생하는 40kDa 열쇼크 단백질이고, 소위 Hsp70 사프롱계의 일부이다 (Bukau,B. Horwich, A., Cell 92 (1998)351-366). Dnak (Hsp70) 및 GrpE 는 또한 상기 계에 속한다. 특정 단백질은 ATP-의존성 공정에서 DnaK 계에 의해 천연배위로 접힌다 (Schroder et al., EMBO J.12(1993) 4137-4144; Langer et al., Nature 356 (1992)683-689).DnaJ 는 DnaK 및 ATP 가 부재하는 응집으로부터 비천연 단백질을 보호하고, 폴딩-컴피턴트(compentent) 상태를 조정한다 (Schroder et al., EMBO J.12(1993) 4137-4144). 사이토솔에서의 DnaJ 의 공발현은 가용성 단백질의 수율의 증가를 가져올수 있음이 알려져 있다 (Yokoyama et al., Microbiol. Ferment. Technol. 62 (1998) 1205-1210). 아미노산 1-108 를 함유하고 후에 J 도메인 (Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227)으로 칭하는 DnaJ 의 N-말단 단편의 공분비가 또한 바람직하다. DnaK 와의 상호작용과 관련되어 있는 J 도메인 및 G/F-풍부 도메인은 상기 영역에 위치한다 (Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139-2144).
Hsp25 (예, 마우스유래) 가 사프롱의 편재하는 종류인 대표적 소열쇼크 단백이다 (Gaestel et al., Eur.J.Biochem. 179 (1989) 209-213). 이런 단백질의 몰질량은 15 내지 30 kDa 이다. 열쇼크동안 세포에서 sHsps 가 실질적으로 축적된다 (총세포단백질의 1% 이하-Arrigo Landry (1994), In Morimoto (Hrsg.):The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373). DnaJ 단백질과 마찬가지로, sHsps 는 비천연성 단백질의 응집을 방지 및 폴딩-컴피턴트 상태에서 전술 단백질을 유지하는 특성을 갖는다 (Jakob et al., J. Biol.Chem. 268 (1993) 1517-1520; Ehrsperger et al., EMBO J.16 (1997) 221-229).
본 발명에 따른 용어 "과발현" 은 각각의 원핵성 숙주 유기체의 야생형에서의 발현과 비교하여, 예컨대, DnaJ 및 Hsp25 와 같은 분비된 단백질의 발현의 증가 (바람직하게는 적어도 100% 까지) 를 의미한다. 이러한 과발현은 예컨대 유전자 (단백질, 사프롱 및/또는 시그널 펩티드에 대한) 가 강력한 원핵성, 바람직하게는 유도성의 발현 시그널 (예컨대, lac 또는 T7 프로모터 또는 이의 유도체의) 의 조절하에 있는 경우 달성될 수 있다.
재조합 DNA 에 대한 조절 영역 (프로모터 및 종결자)를 포함하는 폴리펩티드(단백질)의 과발현을 위한 분비 구축물은 바람직하게는 원핵생물에서는 드문 아르기닌-tRNAAGA/AGG를 추가적으로 코딩하는 벡터에 통합되거나 또는 이러한 tRNA 를 코딩하는 벡터와 함께 공발현된다 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114). 이것은 각각의 단백질의 세균 외질로의 공-과발현 및 드문 tRNAArg AGA/AGG의 전사를 가능케하며, 이는 종종 세균 숙주 유기체내에서 목적 단백질의 증가된 합성을 가져온다.
본 발명에 있어서의 원핵성 시그널 서열은 원핵생물, 바람직하게는 그람-음성 세균으로부터 유래하는 핵산 단편을 의미하며, 시그널 펩티드에 결합된 단백질은 내측 세균막을 통해 침투할 수 있도록 하여 준다. 그 결과 단백질은 외질내 또는 세포 상층액내 위치한다. 이러한 시그널 서열은 통상적으로 18-30 아미노산 길이를 갖고, 예컨대 문헌 [Murphy Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt et al. (editors):Eshcerichia coli and Salmonella, Second Edition, Vol. 1, ASM Press, Washington, 1996, p. 967-978] 에 기재되어 있다. 세균 시그널 서열의 절단은 예컨대, Ala-X-Ala 서열뒤에서 발생할 수 있다(von Heijne et al., J. Mol. Biol. 184 (1895)99-105).세균 시그널 펩티다아제의 구조는 Paetzel et al., Nature 396 (1998) 186-190 에 기재되어 있다. 원핵세포의 외질내 위치한 프로테아제에 의해 목적 단백질로부터 다시 절단된 시그널 서열이 바람직하게는 사용된다. 또는 이러한 프로테아제는 세포 상층액에 또는 단리된 단백질에 첨가하여 시그널 서열을 절단할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 예컨대 프로테아제, 인터페론, 단백질 호르몬, 항체 또는 이의 단편과 같은 수많은 진핵성 단백질의 이질성 발현을 향상시킬 수 있다. 이 방법은 특히 천연상태에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 적어도 2 개의 시스테인을 포함하는 단백질의 이질성 생산, 특히 단백질이 N-말단에 융합된 원핵성 시그널 서열이 없고, 불용성 봉입체가 이들의 원핵성 발현동안 형성된 경우에 적합하다. 이 방법은 특히 천연상태에서 5 개 이상의 디술피드 브릿지를 포함하는 단백질에 적합하다. 이러한 단백질은 예컨대 재조합 플라스미노겐 액티베이터이다 (이후 rPA 로 칭함, Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev.11 (1993) 299-311, US-Patent Nr. 5,223,256). rPA 는 대장균의 환원성 사이토솔내 형성되지 않는 9 개의 디술피드 브릿지를 갖는다.
단백질 및 임의적으로 사프롱의 외질 소재는 내측 세균막을 투과하는 시그널 펩티드와의 작동적 연결에 의해 확보된다.
0.4 mol/l L-아르기닌 및 5 mmol/l 글루타티온 (DnaJ, J 도메인, Hsp25 및 scFv 의 공비의 경우) 또는 글루타티온이 없는 (DnaJ 의 공분비없이) 0.4 mol/l L-아르기닌의 농도는 이러한 플라스미노겐 액티베이터의 발현을 위해서는 최적임이 입증되었다.
대장균에서 기능성 형태의 분비성 rPA 단백질을 분리시키기 위해서는, 플라스미드 pA27fd7(Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) 유래의 상기 단백질에 대한 유전자를 유전공학적 방법으로 그람-음성 세균의 원핵성 시그널 서열, 예컨대 에르위니아 카로토보라유래의 펙테이트 리아제 B(PelB) 의 시그널 서열에 융합시킨다. 유전자 융합물은 클로닝하여 벡터 pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA) 로 구축한다. 그 결과 유전자 발현은 T7 프로모터의 조절하에 놓이게 된다. 융합 단백질내 존재하는 시그널 서열은 외질로의 분비를 조정하게 된다. 시그널 서열은 내측막에 위치하는 펩티다아제에 의한 분비 동안 또는 후에 절단된다. 이어서 분비된 단백질은 외질내에서 접힐 수 있다. 이러한 구획내 산화조건은 디술피드 브릿지의 형성을 가능케한다 (Wuelting and Pluckthun, Mol.Microbiol.12 (1994) 685-692). 폴딩을 향상시키는 저분자량의 첨가제 및 티올 시약의 영양배지내의 독창적인 첨가 및 외질내 DnaJ, J-도메인 또는 Hsp25 의 동시적 공-과발현은 기능성 단백질의 수율을 100 배 이상으로 증가시킨다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 다른 예는 단일-사슬 Fv-단편 (scFv, 예컨대 항 티로이드 자극 호르몬, TSH) 와 같은 항체 또는 항체 단편이다. ScFvs 는 짧은 펩티드 링커 (통상적으로 Gly4Ser3) (Hudson, Curr. Opin Biotechnol.9 (1998) 395-402)를 통해 인공적으로 융합된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부 (Fv) 만으로 구성되어 있는 단축된 항체이다. ScFvs 는 통상적으로 패터널(paternal) Fv-가닥과동일한 항원에 대한 친화성을 가지나, 대장균에서 과발현될 수 있다. 이것은 안정성에 있어 필수적인 안정화 인트라도메인 디술피드 브릿지를 갖기 때문에, 사이토솔내 발현은 통상적으로 봉입체의 형성을 가져온다 (Shibui et al., Appl. Microbiol.Biotechnol.37 (1992) 352-357). ScFvs 는 무작위 돌연변이 및 후속 파아지 디스플레이 선별로 목적하는 항원을 결합시키기 위하여 특히 최적화시킬 수 있다 (Allen et al., TIBS 20 (1995) 511-516; Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1998)1-20). 5mM GSH 및 0.4 M L-아르기닌의 첨가는 기능성 ScFv-TSH 의 수율을 외질내에서 7 배 향상시키고, 첨가제가 없는 배양물과 비교하여 배지 상층액에서 43 배 향상시킨다.
후술되는 실시예, 간행물, 서열 프로토콜 및 도면은 추가로 본 발명을 설명하며, 이의 보호 범위는 특허 청구범위로부터 발생한다. 기술된 방법은 수정후에서 조차 발명의 요지를 기술하는 실시예로서 이해되어야 한다.
서열목록의 설명
서열번호 1 및 2 는 pINIIIompA3-dnaJ 로부터 증폭된 조절 서열 (프로모터, 종결자)와 더불어 OmpA 시그널 서열 및 DnaJ 로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ 의 일부의 서열을 나타낸다.
서열번호 3 및 4 는 pINIIIompA3-dnaJ 로부터 증폭된 조절 서열 (프로모터, 종결자)와 더불어 OmpA 시그널 서열 및 J 도메인으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인의 일부의 서열을 나타낸다.
서열번호 5 및 6 은 pINIIIompA3-hsp25 로부터 증폭된 조절 서열 (프로모터,종결자)와 더불어 OmpA 시그널 서열 및 Hsp25 로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25의 일부의 서열을 나타낸다.
서열번호 7 및 8 은 pHEN-scFv 또는 pINIIIompA3 으로부터 증폭된 조절 서열 (프로모터, 종결자)와 더불어 PelB 시그널 서열 및 scFvOxazolon 으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드 pUBS520-scFvOx 의 일부의 서열을 나타낸다.
서열번호 9 및 10 은 PelB 시그널 서열 및 rPA 로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA 의 일부의 서열을 나타낸다.
총 론
대장균내에서 DnaJ, J-도메인 및 Hsp25 의 외질 과발현을 위해서는, 이러한 단백질을 코딩하는 DNA 를 유전공학적으로 대장균의 외측막 단백질 A(OmpA)의 시그널 서열에 융합시키고, 이 융합물을 대장균내 lac-lpp 프로모터의 조절하 재조합 플라스미드상에서 발현시킨다. 그 결과, DnaJ 및 Hsp25 의 폴리펩티드 사슬은 원핵성 숙주 유기체의 외질로 이동되어 거기에서 자연적으로 접히게 된다. 이들의 위치 및 천연 폴딩은 트립신에 의한 제한적 단백질 분해 및 웨스턴 블롯트에 의해 확인된다.
실시예 1 :
발현 플라스미드 pIN III omp A3-dnaJ 의 구축
분자 유전기술은 Ausubel et al. (ed.), J.Wiley Sons, 1997, Curr. Protocols of Molecular Biology 에 의거한다. 올리고뉴클레오티드는 MWG Biotech, Ebersberg 또는 GIBCO Life Sciences, Eggenstein (DE) 사로부터 수득한다.
DnaJ (Gene Bank Accession No. M 12565) 을 코딩하는 유전자는 PCR 로 증폭시키고, 이로부터 생성된 제한효소 절단 부위 EcoRI 및 BamHI 을 이용하여 발현 플라스미드 pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J.3(1984)2437-2442) 로 클로닝시킨다. 클론된 PCR 단편의 서열은 디데옥시 시퀀싱 (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) 으로 확인한다. 생성된 플라스미드는 pINIIIompA3-dnaJ 로 명명한다. 외질내에서 발현되는 DnaJ 의 서열은 폴리펩티드 서열이 Met 대신에 Gly-Ile-Pro 로 시작하여 2 아미노산의 N-말단 신장이 존재한다는 점에서 야생형 단백질의 서열과는 상이하다. 따라서, DnaJ 는 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드) 로 유도되는 lac-lpp 프로모터의 조절하에 놓인다.
실시예 2 :
발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ 의 구축
lac-lpp 오페론을 코딩하는 플라스미드 pIN III omp A3-dnaJ 유래의 영역, 시그널 서열, dnaJ 유전자 및 오페론의 종결자 영역은 PCR 로 증폭시킨다 (서열번호 1). PCR 산물은 제한 엔도뉴클레아제 BgIII 로 절단하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 로 선형화된 벡터 pUBS520 에 클론시킨다. 생성된 플라스미드는 pUBS520-pIN-dnaJ (도3) 으로 명명한다.
실시예 3 :
발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인의 구축
두개의 종결 코돈을 QuickChange 돌연변이 시스템 (Promega, Mannheim, DE)를 이용하여 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ 의 뉴클레오티드 324 뒤에 삽입하여 단지 첫번째 108 아미노산만이 발현되도록 하게 한다. 돌연변이된 영역의 서열은 디데옥시 시퀀싱 (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) 로 결정하고, 단축된 단백질 단편의 발현은 웨스턴 블롯 및 항-DnaJ 항체로 검출한다. 형성된 플라스미드는 pUBS520-pIN-J-도메인으로 명명한다 (도4).
실시예 4 :
발현 플라스미드 pIN III ompA3-hsp25 의 구축
Hsp25 (Gene Bank Accession No : L07577) 를 코딩하는 유전자를 PCR 로 증폭하고, 이렇게 하여 생성된 제한효소 절단부위 EcoRI 및 BamHI 를 이용하여 발현 플라스미드 pIN III ompA3(Ghayreb et al., EMBO J.3(1984) 2437-2442) 에 클론시킨다. 클론된 PCR 단편의 서열은 디데옥시 시퀀싱 (LicorDNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) 으로 체크한다. 생성된 플라스미드는 pIN III ompA3-hsp25 로 명명한다. 외질내 발현되는 Hsp25 의 서열은 폴리펩티드 서열이 Met 대신에 Gly-IIe-Leu 로 시작하여 2 개의 아미노산의 N-말단 신장이 존재한다는 점에서 야생형 단백질과는 상이하다. 따라서 Hsp25 는 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드) 로 유도되는 lac-lpp 프로모터의 조절하에 놓인다.
실시예 5 :
발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25 의 구축
lac-lpp 오페론, 시그널 서열, hsp25 유전자 및 오페론의 종결자 영역을 코딩하는 플라스미드 pIN III ompA3-hsp25 유래의 영역은 PCR 를 이용하여 증폭시킨다 (서열번호:5). PCR 산물은 제한 엔도뉴클레아제 BgIII 으로 절단하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 로 선형화된 벡터 pUBS520 에 클론시킨다. 생성된 플라스미드는 pUBS520-pIN-hsp25 으로 명명한다 (도 5).
실시예 6 :
발현 플라스미드 pUBS520-scFvOx 의 구축
샤프롱 특성을 갖지 않는 햅텐 옥사졸론 (scFvOxazolon;Fiedler and Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090- 1093) 에 대한 단일사슬 Fv 단편의 공발현을 음성 대조군으로서 조사한다.
lac 프로모터, 시그널 서열 pelB 및 scfvox 유전자를 코딩하는 플라스미드 pHEN-scFvOx 유래의 영역을 PCR 을 이용하여 증폭시킨다. lpp 종결자를 코딩하는 플라스미드 pIN III ompA3 유래의 영역은 두번째 PCR 에서 증폭시킨다. 이 두개의 단편을 후속 PCR 에서 융합시킨다. 이 방식으로 형성된 PCR 산물 (서열번호 7) 을 제한 엔도뉴클레아제 BgIII 으로 절단하고 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 로 선형화시킨 벡터 pUBS520 으로 클론시킨다. 생성된 플라스미드는 pUBS520-scFvOx 으로 명명한다 (도 6).
실시예 7 :
발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA 의 구축
플라스미드 벡터 pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93- 100) 유래의 플라스미노겐 액티베이터 (rPA) 의 유전자는 PCR 방법을 이용하여 증폭시킨다. PCR 산물은 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BamHI 으로 절단하여,플라스미드 벡터 pET20b(+)(Novagen Inc., Madison, USA) 로 클론시킨다. 이 플라스미드는 PelB (Erwinia carotovora 유래의 펙테이트 리아제) 및 rPA 의 시그널 서열로 구성된 융합 단백질을 코딩하며, rPA 의 외질로의 분비는 디데옥시 시퀀싱 (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE) 으로 체크한다. 이 구축물을 pET20b(+)-rPA 로 명명한다(도 7). rPA 는 T7 프로모터의 조절하 플라스미드로부터 발현되며, 대장균 BL21(DE3) 균주내 T7-RNA-폴리머라아제는 lacUV5 프로모터의 조절하에 있다. 유도는 IPTG 를 첨가하여 실행한다. 외질에서 발현되는 rPA 는 두번째 아미노산 (Ser) 이 Ala 로 치환된다는 점에서 Kohnert et al 에 의해 기술된 플라스미노겐 액티베이터와는 상이하다.
실시예 8:
배지 첨가제 글루타티온 및 L-아르기닌을 이용하여 대장균의 외질내 rPA 의 기능성 발현
pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-dnaJ (DnaJ 의 공-분비) 로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) (Studier Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130) 밤샘(overnight) 정치 배양물, pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-J-도메인 (J-도메인의 공-분비) 에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 배양물, pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-hsp25 (hsp25의 공-분비) 에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 배양물, pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-scFvOx (scFvOx의 공-분비) 에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 배양물, pET20b(+)-rPA 및 pUBS520 에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 배양물 또는 pET20b(+) 및 pUBS520(대조군 배양) 에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 배양물을 암피실린 (100㎍/ml) 및 카나마이신 (50㎍/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) 를 함유하는 100ml LB-배지내 1:50 의 비율로 희석시키고, 24℃ 및 170rpm 으로 진탕시킨다. 3 시간 육성후, 배양물의 5ml 분량을 전술된 양의 암피실린 및 카나마이신 및 다양한 농도의 GSH (0-10mM, Fluka, DE) 및 L-아르기닌 HCl (0-0.4M, ICN) 을 함유하는 10ml LB 배지에 첨가하고, 각각을 1mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드, AppliChem, Darmstadt, DE) 로 유도시킨다. 이 세포를 24℃ 에서 170 rpm 으로 21 시간 더 진탕시키고 1 ml 시료를 취하여 OD600을 측정한다. 이러한 1ml 세포 시료를 Jacobi et al (J.Biol.Chem. 272 (1997) 21692-21699) 에 따라 수정된 프로토콜로 2ml 에펜도르프 반응용기에서 분별시킨다. 상세히는 500㎕ 분별화 버퍼 (150mM NaCl (Roth GmbH), 50mM Tris/HCl (Roth GmbH), 5mM EDTA (Biomol) 및 1 mg/ml 폴리마이신 B 술페이트 (Sigma), pH 7.5) 를 세포 펠릿에 가한후, 1400rpm 으로 에펜도르프 써머세이커상에서 10℃ 로 1 시간동안 진탕하고, 이어서 10℃ 로 냉각시킨 에펜도르프 마이크로원심분리기에서 14000rpm 으로 15 분간 원심분리시켜 가용성 외질성 단백질 (상층액) 및 잔류 분획 (펠릿) 을 함유하는 분획을 형성시킨다.
rPA 의 활성은 Verheijen et al (Thromb. Haemostasis 48 (1982) 266-269) 의 방법에 따라 측정한다..
세포 추출물내 모든 측정된 rPA 농도는 OD600=1 의 세포 현탁액으로 표준화시켜 상이한 버퍼에서 측정시 발생하는 오차를 정정시킨다.
실시예 9 :
배지 첨가제로서 포름알데히드, 메틸포름아미드, 아세트아미드, 메틸우레아 및 에틸우레아와 글루타티온의 혼합물을 이용하여 대장균의 외질내 rPA 의 기능성 발현
pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-dnaJ (DnaJ 의 공-분비) 로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 의 밤샘 정치 배양물은 실시예 8 에서 언급한 바와 같이 배양한다. 화학식 1 의 화합물 및 각각 경우에서 5mM 글루타티온을 배양물 배지에 추가적으로 첨가한다. 대조군 배양물은 첨가제없이 LB 에서 배양시킨다. 화학식 1 의 화합물 및 사용한 농도는 표 2 에 열거하였다. 시료 제조, 외질 분획화 및 tPA 활성에 대한 효소 시험을 실시예 8 에 언급된 바같이 실시한다.
표 1 및 2 및 도 1 및 2 는 rPA 발현의 결과를 보여준다.
외질내 천연 rPA 의 수율에 대한 발효 배지내 L-아르기닌의 영향
공-분비된단백질 0ML-아르기닌 0.2ML-아르기닌 0.4ML-아르기닌
rPAng/ml*OD600 자극인자 rPAng/ml*OD600 자극인자 rPAng/ml*OD600 자극인자
- 0.030±0.001 29 0.044±0.090 20 0.170±0.005 23
DnaJ 0.197±0.019 29 0.730±0.150 27 3.978±1.000 18
J도메인 0.339±0.007 16 0.625±0.213 17 4.398±0.165 15
Hsp25 0.053±0.002 27 0.140±0.001 17 2.850±0.214 17
scFv옥사졸론 0.041±0.003 13 0.144±0.047 8 0.713±0.113 10
배양은 5mM GSH 의 존재하 실시한다.
대장균의 외질내 천연 rPA 의 수율에 대한 배양 배지내 다양한 저분자량 첨가제의 영향
첨가제 배양배지내농도 외질내rPA의수율ng/ml*OD600 자극인자 세포수거시OD600 배지내GSH의농도
무첨가제 - 0.153 24 4.52 0mM
아르기닌 0.2M 0.56 21 4.45 5mM
0.4M 3.880 17 1.78 5mM
포름알데히드 0.6M 0.208 17 4.96 5mM
1.0M 0.219 10 4.71 5mM
메틸포름아미드 0.3M 0.141 15 4.57 5mM
0.6M 0.790 17 1.04 5mM
아세트아미드 0.6M 0.150 24 5.34 5mM
1.0M 1.321 16 1.57 5mM
메틸우레아 0.3M 0.168 24 4.67 5mM
0.6M 0.830 22 4.59 5mM
에틸우레아 0.3M 0.266 23 4.20 5mM
0.6M 1.209 17 0.82 5mM
실시예 10 :
환원된 글루타티온 및 L-아르기닌의 배양 배지 첨가에 의한 기능성 단일 사슬 Fv 단편의 발현
항-TSH 항체 (미국특허 제 5,614,367 호) 의 단일 사슬 Fv 단편을 코딩하는 플라스미드 및 pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989)109-114)로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 밤샘 정치 배양물을 암피실린 (100㎍/ml) 및 카나마이신 (50㎍/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) 를 함유하는 100ml LB-배지에 1:50 의 비율로 희석시켜 24℃ 및 170rpm 에서 진탕시킨다. 3 시간 육성후, 배양물 5ml 분량을 전술한 양의 암피실린 및 카나마이신 및 다양한 농도의 GSH (0-10mM, Fluka) 및 L-아르기닌 HCl (0-0.4 M, ICN) 를 함유하는 10 ml LB 배지에 첨가하여 각각을 1mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드, AppliChem, Darmstadt) 로 유도시킨다. 세포들은 24℃ 및 170rpm 에서 21 시간동안 더 진탕시키고, 1ml 시료를 취하여 OD600을 측정한다. 이 1 ml 세포 시료는 Jacobi et al. (J.Biol.Chem.272 (1997) 21692-21699) 에 따라 수정된 프로토콜로 2ml 에펜도르프 반응용기에서 분획화시킨다 (실시예 8 참조). 또한 배지 상층액 (1ml) 의 시료를 취한다. 이 시료는 ELISA 시험을 하여 기능성 항체에 대하여 분석한다.
TSH 에 대한 천연 scFv-TSH 의 결합은 scFv-TSH Standard 로 표준화시키고 RPAS-시스템 (Pharmacia Biotech, Germany) 으로 정제한다 (1 단위는 1㎕ standard의 TSH 로 도포된 마이크로적정 플레이트에의 결합에 해당한다). L-아르기닌의 배양배지로의 첨가는 또한 외질 및 대장균의 배지 상층액내 천연 scFv-TSH 의 수율에 긍정적인 영향을 미친다. 0.4 M L-아르기닌 및 5mM GSH 의 첨가는 ELISA 를 이용하여 검출한 일정량의 항체 단편을 배지 상층액에서 7 배 및 5mM GSH 를 갖는 배양물과 비교한 외질 분획에서 43 배 증가시킨다 (도8).
참고자료 목록
본 발명에 의해 단순한 방식으로 실시할 수 있으며, 봉입체의 가용화, 환원 및 재생, 환원 및 재생과 같은 수고스런 인 비트로 후처리가 필요없는 원핵세포내 발현후 천연적으로 접히는 수용성의 진핵성 폴리펩티드의 제조방법이 제공된다.

Claims (3)

  1. 디술피드 브릿지로 연결된 둘 이상의 시스테인을 갖는 천연적으로 접히는 수용성 진핵성 폴리펩티드의 제조방법에 있어서,
    a) N-말단에서 원핵성 시그널 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 발현벡터를 함유하는 원핵세포를,
    b) 폴리펩티드가 외질 또는 배지로 분비되는 조건하에서 배양하고,
    c) 시그널 서열을 절단하고 외질 또는 배지로부터 폴리펩티드를 단리시키는 것으로 이루어지며,
    여기에서, 배양은 하기 화학식 1 의 화합물 또는 아르기닌의 존재하에서 실시하는 방법 :
    [화학식 1]
    R2-CO-NRR1
    식중,
    R 및 R1은 수소 또는 포화 또는 불포화 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 4 의 알킬 사슬을 나타내고,
    R2는 수소, NHR1또는 포화 또는 불포화 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 3 의 알킬 사슬을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 아르기닌은 히드로클로라이드로서 또는 다른 적정된 형태로 사용하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 환원성 티올 시약을 영양 배지에 첨가하는 방법.
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