CN1240839C - 一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达外源蛋白的新型通用载体，这种通用载体是建立在大肠杆菌促折叠相关蛋白FkpA的基础之上的融合和共表达载体；一种用于高效可溶表达抗膀胱癌单链抗体(PG)的表达载体pTFP1以及用于高效可溶表达纤维素结合域(CBD)和PG所构成的融合蛋白CBD-PG的表达载体pTBNP1F；以及一种含有上述通用的高效可溶表达载体的宿主细胞。

Description

一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体系统

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及一种可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达外源蛋白的新型通用载体；这种表达载体的构建方法；以及含有该种载体的宿主细胞。

技术背景

大肠杆菌作为外源蛋白的表达体系具有许多独特的优点，比如，大肠杆菌遗传背景清楚，细胞生长迅速，发酵周期短，易于筛选和操作，并且表达系统较为丰富。但是，一个不容忽视的问题就是，许多在大肠杆菌中表达的外源蛋白都以没有活性的形式聚集，这种没有活性的形式就是包涵体。从包涵体出发，必须经过一定条件的变性、再折叠复性，才能得到所需的活性蛋白产物。而这些过程所需要的条件往往需要针对不同的外源蛋白进行优化，同时，这一变性、复性过程比较繁杂，而且产量比较低。

大肠杆菌蛋白的正确折叠是由内部和外部因素共同驱动完成的。越来越多的证据表明，在蛋白质的折叠过程中，至少有三个最主要的晚期事件，即二硫键的形成，脯氨酸的异构化和亚单位的组装。这些过程直接决定了蛋白质最终的正确结构能否形成。在大肠杆菌中，这些过程都由蛋白质二硫键形成相关蛋白、脯氨酸顺反异构酶和分子伴侣催化完成。

为促进外源蛋白的可溶表达，人们采取过多种方式，如与葡萄球菌蛋白A(SPA)融合表达，与谷胱甘肽(GST)融合表达，与硫氧环蛋白(Thioredoxin)融合表达等。由于这些蛋白都不是大肠杆菌折叠途径所需的，只能起到部分的促可溶作用，因而效果自然有限，对于许多蛋白，甚至根本没有作用。将外源蛋白基因与适当的信号肽序列相连，这样的表达产物有望通过信号肽的引导而分泌到大肠杆菌周质腔，并且在这里得到进一步的折叠，产物甚至可以分泌到胞外培养基中。然而，事实证明，有时信号肽不能有效引导蛋白分泌，有时蛋白分泌到周质腔中也形成无活性的包涵体。这说明，仅有信号肽还不足以使外源蛋白以可溶形式表达。大肠杆菌通用分子伴侣，如GroEL/ES，在大肠杆菌蛋白折叠过程中起着很重要的作用。GroEL/ES主要通过与蛋白肽链折叠过程中形成的中间体结合，从而抑制这些中间体经由暴露在表面的疏水氨基酸残基而形成非特异性聚集体。但是仅仅具有分子伴侣功能的GroEL/ES，虽然在实际应用中对某些蛋白起到了促可溶效果，但对许多外源蛋白的测试，并未取得理想的结果。这是由于蛋白质的分泌和折叠都是相当复杂的过程，仅有信号肽或仅有分子伴侣都不足以使得外源蛋白正确折叠。折叠酶类和分子伴侣在这些过程中发挥着极为重要的作用。

发明内容

发明概述

本发明人在长期的科研实践中，令人意外地发现采用既有折叠酶功能，又有分子伴侣功能的促折叠相关蛋白FkpA能有效解决了外源蛋白的可溶表达问题，并且对于本发明中使用的所有外源蛋白都取得了非常理想的促可溶效果。

因此，在本发明的一个方面，提供一种用基因工程方法通过将促折叠相关蛋白FkpA引入到大肠杆菌表达载体上而构建的大肠杆菌通用的高效可溶表达载体。

在本发明的另一个方面，提供一种含有用于构建大肠杆菌通用的高效可溶表达载体的宿主细胞。

在本发明的另一个方面，提供了一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体pTFA和pTRFA。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于高效可溶表达抗膀胱癌单链抗体PG的表达载体pTFP1。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于高效可溶表达抗膀胱癌单链抗体PG和纤维素结合域(CBD)所构成的融合蛋白CBD-PG的表达载体pTBNP1F。

在本发明的另一个方面，提供了一种含有通用的高效可溶表达载体pTFA或者pTRFA的宿主细胞，所述的宿主细胞优选地为大肠杆菌。

在本发明的另一个方面，提供了一种含有pTFP1或者pTBNP1F载体的宿主细胞，所述的宿主细胞优选地为大肠杆菌。

在本发明的另一个方面，提供了一种构建上述各种载体的方法，包括将促折叠相关蛋白FkpA引入到大肠杆菌表达载体上的步骤。

在本发明的另一个方面，提供了一种以可溶形式高效表达外源蛋白的方法，其特征在于利用上述的通用的高效可溶表达载体。

但是，在本说明书的上下文，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

附图说明

图1为本发明所构建的新型通用融合和共表达载体的示意图(基于FkpA的融合表达载体pTFP1和共表达载体pTBNP1F的结构示意图)。

图2为本发明所构建的新型通用融合表达载体的构建过程简图。

图3为本发明所构建的新型通用共表达载体的构建过程简图。

图4为利用本发明所构建的新型通用融合和共表达载体在大肠杆菌中以可溶形式表达的外源蛋白的SDS-PAGE图(可溶表达的FkpA-PG和CBD-PG的SDS-PAGE图)。

图5为利用本发明所构建的新型通用融合和共表达载体在大肠杆菌中以可溶形式表达的外源蛋白的活性分析结果(ELISA分析FkpA-PG及与FkpA共表达的CBD-PG的抗原结合活性)。

发明详述

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

本文所述的“促折叠相关蛋白”是指任何与蛋白质的折叠和成熟过程相关联的蛋白质，包括各种分子伴侣蛋白、蛋白质二硫键形成蛋白、蛋白质二硫键异构酶、蛋白质肽基脯氨酰顺反异构酶等。

本文所述的“融合表达”是指外源基因序列与促折叠相关蛋白基因序列形成一个单一的转录和翻译单元，形成单一的融合大蛋白。

本文所述的“共表达”是指外源基因序列与促折叠相关蛋白基因序列可以在同一个转录启动子的控制下转录，但以不同的翻译单元分别翻译成促折叠相关蛋白和外源目的蛋白；外源基因序列与促折叠相关蛋白基因序列也可以在不同的转录启动子的控制下分别转录，并且以不同的翻译单元分别翻译成促折叠相关蛋白和外源目的蛋白。

本发明采用的促折叠相关蛋白FkpA同时具有脯氨酰顺反异构酶活性和分子伴侣的活性。FkpA蛋白是大肠杆菌组成型表达的蛋白，其成熟体位于大肠杆菌周质腔中，主要在这一部位发挥作用。但当外源蛋白大量表达时，原本以基础水平表达的FkpA的量显然不能满足如此众多的外源蛋白的折叠要求。通过将FkpA的编码基因克隆到以多拷贝形式存在于大肠杆菌中的质粒上，使得FkpA也能大量表达，从而有效缓解了促折叠相关蛋白的不足，这样就能使大量的外源蛋白得到正确折叠。

本发明的大肠杆菌通用高效可溶表达载体的构建是建立在大肠杆菌促折叠相关蛋白FkpA的基础之上的，这种蛋白具有催化蛋白新生肽链折叠过程中的酶促反应的能力，并且同时具有分子伴侣的功能，这些能力都是外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶表达所必需的。这种新型载体巧妙地将这种促折叠相关蛋白FkpA引入到大肠杆菌表达载体上，这种过量表达的促折叠相关蛋白就能有效地对高效表达的外源蛋白起到促进折叠的作用。这种载体具有以下特点：

1.大量表达的促折叠相关蛋白FkpA能有效促进与之相融合的外源蛋白的正确折叠，从而使外源蛋白以可溶的有活性的形式表达；

2.对于分子量较大的外源蛋白，可采用与促折叠相关蛋白FkpA共表达的方式表达，这种表达方式下的外源蛋白仍然是可溶的活性蛋白。因此，可根据外源蛋白的不同，灵活选择融合方式或者是共表达的方式来表达外源蛋白；

3.以这种方式表达的蛋白都是有功能的活性蛋白，不需要步骤繁琐而效率极低的变性和复性过程，只需要较为简单的纯化步骤就能得到大量的外源蛋白；

4.这种表达载体以大肠杆菌为表达宿主，可大量发酵生产，生产工艺简单，容易操作，成本低廉。

在构建本发明所描述的高效可溶表达载体系统时，我们采用了两种策略，即融合表达和共表达。融合表达是指促折叠相关蛋白FkpA和外源目的蛋白在DNA水平上形成一个单一的融合基因，经转录和翻译后形成一个大的蛋白，用合适的蛋白酶处理，就能释放出外源目的蛋白。共表达是将促折叠相关蛋白FkpA和外源目的蛋白在DNA水平上分别作为两个独立的基因，即各自都带有终止密码子，经转录和翻译后就形成两个不同的蛋白，即FkpA和外源目的蛋白。之所以采用两种方式，是为了更好的适应不同大小的目的蛋白。一般情况下，融合表达的蛋白总产量往往大于共表达的蛋白产量，但对于分子量过大的目的蛋白，融合表达会导致产物分子量太大而影响翻译效率和后续的纯化步骤，这种情况下，适宜采用共表达的方法。本发明构建的通用高效可溶表达载体的两种策略都取得了良好的结果，充分表明，这两种方式都是可行的。为使外源目的蛋白能从融合蛋白中释放出来，在FkpA和外源基因插入位点之间设计有蛋白酶Thrombin识别的位点。

下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本说明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

设计大小合适的特异性引物，以普通大肠杆菌菌株K12的基因组DNA为模板，采用聚合酶链反应(PCR)扩增出大肠杆菌促折叠相关蛋白FkpA的完整编码序列，但不含有终止密码子。将扩增产物回收、酶切并连接到载体质粒pTMF上，就得到了可用于融合表达的载体pTFA。用内切酶BglII和SacI从pTFA上切下含有FkpA的片段，并将其连接到含有抗膀胱癌单链抗体的载体上，构建得到了高效可溶表达抗膀胱癌单链抗体的融合表达载体pTFP1。为构建共表达载体，另外设计了一对FkpA的特异引物，其中上游引物带有大肠杆菌翻译识别序列-核糖体结合位点(RBS)，以利于外源目的蛋白和FkpA分别独立翻译成不同的蛋白。PCR扩增得到的编码框上游带有RBS的FkpA，经回收、酶切并连接到载体质粒pTMF上，就得到了可用于共表达的载体pTRFA。用内切酶BglII和NdeI从含有融合蛋白CBD-PG的载体上将该片段切下，并连入共表达载体pTRFA上，就得到了共表达CBD-PG的载体pTBNP1F。用构建好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)。从转化平板上挑取单克隆菌落细胞接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₅₅₀为0.8，向培养物中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG(购自宝生物工程(大连)有限公司)，诱导培养4小时。离心收集菌体细胞，超声破碎菌体，12000rpm离心10分钟，上清及沉淀分别进行收集，并用于12％SDS-PAGE检测。超声处理后的上清可同时用于ELISA活性实验。具体操作流程如下：

一、融合用表达载体pTFA的构建

本载体是由质粒pTMF构建而成的。质粒pTMF是质粒pET28a(+)的衍生质粒，其与pET28a(+)的唯一区别就是多克隆位点不一样。pTMF的构建过程如下：

人工合成包含所需酶切位点的双链DNA片段：

5’CCATGGGTAAGCTTGTCGACGGTACCGAGCTCATGTACCCGCGCGGT

3’ GGTACCCA TTCGAACAGCTGCCATGGCTCGAGTACATGGGCGCGCCA

    NcoI    HindIII  SalI  KpnI  SacI  Thrombin site

   AACCTCGAGCATATGGAATTCGGATCCG      3’

   TTG GAGCTCGTATACCTTAAGCCTAGGCAGCT  5’

       XhoI  NdeI  EcoRI BamHI XhoI^*

用NcoI消化处理该片段并回收，同时，用NcoI和XhoI酶切质粒pET28a(+)，回收载体大片段，并将其与上述人工合成的多克隆位点片段连接，筛选得到的阳性质粒命名为pTMF。

采用特异引物，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出不带终止密码子的FkpA，然后将其插入到pTMF上NcoI和SacI位点之间，就得到了pTFA载体。

1、特异引物的设计和合成

从GenBank中查到了大肠杆菌K12菌株FkpA的核酸编码序列，共有813个核苷酸碱基。然后从该编码框出发，设计出分别和编码框上、下游互补配对的两条引物FNC和FSC，其中FNC为平末端，FSC含有内切酶SacI位点。引物序列如下：

FNC：5’AAATCACTGTTTAAAGTAACG 3’

FSC：5’GC GAGCTCTTTTTTAGCAGAATCTGCGG 3’，下划线表示SacI位点，

旁边的GC为保护碱基。

2、PCR扩增FkpA基因

首先将合成的引物(DNA干粉)溶在适量的双蒸水(ddH₂O)中，使DNA浓度为10pmol/L。扩增反应管组成如下：

模板(大肠杆菌K12基因组DNA)    1μL(约100ng)

引物FNC(上海生工生物技术合成) 5μL

引物FSC(上海生工生物技术合成) 5μL

dNTPs(购自宝生物工程(大连)有限公司)

                              5μL(每种各2.0mmol/L)

10×PCR反应buffer(购自上海博亚生物技术公司)

                              5μL

pfu DNA聚合酶(购自上海博亚生物技术公司)                1μL

                              (3u/μL)大肠杆菌K12为普通大肠杆菌菌株K12。10×PCR反应buffer组分如下：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl₂。

用ddH₂O补足至总体积50μL，混匀，94℃预变性5分钟，然后进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜生物技术有限公司的小量胶回收试剂盒纯化回收所需的全长FkpA。

3、PCR扩增产物的限制性内切酶消化及消化后DNA的纯化回收

用SacI对回收的全长PCR产物进行消化处理，按以下说明进行：取约1ug DNA产物，加入3μL 10×buffer L(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下：100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl₂，10mMDithiothreitol)，1μL内切酶SacI(购自宝生物工程(大连)有限公司)，用ddH₂O补足体积至30μL，37℃水浴酶解反应4小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

4、载体质粒pTMF的提取

采用碱法小量提取质粒，所用Top10菌株购自美国Invitrogen公司。具体步骤如下：从Top10/pTMF平板上挑取单菌落，接种在5ml含卡那霉素(Km，普通医用制品，华北制药厂生产)50μg/mL的LB培养基(组分为：10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl，用NaOH溶液调节pH为7.0；固体LB培养基需加入终浓度为1.5-2.5％的琼脂粉。使用前需进行灭菌处理)中，37℃培养过夜，12000rpm离心1分钟收集菌体。菌体沉淀重悬于100μl Solution I(50mmol/L Glucose，10mmol/L EDTA，25mmol/LTris-Cl，pH8.0)，充分混匀。加入200μl新配制的Solution II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，盖紧管盖，快速颠倒4-5次，将离心管置于冰浴中放置3分钟。加入150μl预冷的SolutionIII(3mol/L KAc，pH4.8)，混匀后于冰浴中放置5分钟。然后于12000rpm，4℃离心10分钟。将上清转移至另一新鲜离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟，然后于4℃，12000rpm离心20分钟，就得到DNA沉淀。DNA沉淀用70％乙醇淋洗一遍，离心管开盖放置在通风的地方，待DNA干燥后，将其溶于500μl ddH₂O中(含50μg/ml的RNase A)，37℃消化RNA约半小时。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，于室温，12000rpm离心10分钟。转移水相至另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡混匀，室温下，12000rpm离心10分钟。转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的醋酸钠(NaAc，3mol/l，pH5.2)并混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，4℃放置1小时以沉淀DNA。4℃下，12000rpm离心20分钟，弃上清，DNA沉淀用70％乙醇淋洗一遍，干燥后沉淀溶于50μlddH₂O备用。

5、载体质粒pTMF的限制性内切酶消化及消化后DNA的纯化回收

先用NcoI对载体DNA进行消化，具体如下：取约1μg质粒pTMF在30μl总反应体积中(3μ10×Buffer K(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下：200mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM MgCl₂，10mMDithiothreitol(DTT)，1000mM KCl)，2μl NcoI(购自宝生物工程(大连)有限公司)，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收酶切后的DNA。用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(购自宝生物工程(大连)有限公司)补平NcoI酶切后的两端缺口，反应如下：纯化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下：100mM Tris-HCl(pH7.5)，70mM MgCl₂，1mM Dithiothreitol)5μl，dNTPs(购自宝生物工程(大连)有限公司，每种各2.0mmol/L)5μl，Klenow片段(购自宝生物工程(大连)有限公司，3u/μl)1μl，补足体积至50μl，37℃补平反应45分钟。按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收补平后的DNA。然后用SacI对补平后的DNA进行酶切，具体反应如下：取补平后的质粒pTMF在30μl反应体系中(3μl10×Buffer L(组分及来源同上)，2μl SacI，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，回收方法参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的载体片段。

6、载体片段pTMF与FkpA片段的连接

取回收的双酶切pTMF约40ng，双酶切全长FkpA约20ng，加入2μl 10×T₄DNA连接酶缓冲液(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下：660mM Tris-HCl(pH7.6)，66mM MgCl₂，100mM DTT，1mM ATP)，1μl T₄ DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，加ddH₂O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜(约16小时)。

7、大肠杆菌感受态细胞的制备

用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：从野生大肠杆菌菌株Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。以1％的接种量转接于40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中10分钟，于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L CaCl₂中，冰浴放置30分钟，4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl₂(含20％甘油)重悬细胞，以每管200μl分装备用。不及时使用的各管于-70℃保存。

8、重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定

10ul连接产物加入到200μl的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分钟，然后加入800μl不加抗生素的液体LB培养基，轻轻混匀，37℃轻摇培养复苏45-60分钟。取200μl培养液涂布于LB(含50μg/ml Km)平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，用BglII和SacI双酶切，能切下大约980bp的质粒，即初步确定为阳性克隆；同时，用FkpA特异的引物FNC和FSC进行PCR反应，进一步鉴定插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送上海生工生物工程公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为pTFA。

二、共表达用载体pTRFA的构建

共表达载体pTRFA是由质粒pTMF在NdeI和BamHI位点之间插入用特异引物扩增的带RBS的FkpA基因而来的。扩增用的模板为已构建好的质粒pTFA，扩增用的上游引物带有一段RBS识别序列。

1、特异引物的设计和合成

从GenBank中查到了大肠杆菌K12菌株FkpA的核酸编码序列，共有813个核苷酸碱基。然后从该编码框出发，设计出分别和编码框上、下游互补配对的两条引物RFND和FBM，其中RFND的5’带有一个NdeI识别位点和一段RBS序列，FBM不含内切酶切点，为平末端引物。两条引物序列如下：

RFND：5’GAATGG CATATGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATC

CATGAAATCACTGTTTAAAGTAAC 3’

下划线表示NdeI识别位点，斜体部分即为RBS序列，旁边的GAATGG为酶切保护碱基。

FBM：5’TTATTTTTTAGCAGAATCTG 3’，该引物为平末端。

2、PCR扩增带RBS序列的FkpA基因(RFkpA)

首先将合成的引物(DNA干粉)溶在适量的双蒸水(ddH₂O)中，使DNA浓度为10pmol/L。扩增反应管组成如下：

质粒DNA(pTFA)                  1μL(约20ng)

RFND(上海生工生物技术公司合成)

                                      5μL

FBM(上海生工生物技术公司合成)

                                      5μL

dNTPs(购自宝生物工程(大连)有限公司)

                                      5μL(每种各2.0mmol/L)

10×PCR反应buffer(购自上海博亚生物技术公司)

                                      5μL

pfu DNA聚合酶(购自上海博亚生物技术公司)              1μL

                                      (3u/μL)

10×PCR反应buffer组分同上。用ddH₂O补足至总体积50μL，混匀，94℃预变性5分钟，然后进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜生物技术有限公司的小量胶回收试剂盒纯化回收所需的全长RFkpA。

3、PCR扩增产物的限制性内切酶消化及消化后DNA的纯化回收

用NdeI对回收的全长PCR产物进行消化处理，按以下说明进行：取约1ug DNA产物，加入3μL 10×buffer H(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下：500mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl₂，10mMDithiothreitol，1000mM NaCl)，1μL内切酶NdeI(来源同上)，用ddH₂O补足体积至30μl，37℃水浴酶解反应4小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

4、载体质粒pTMF的限制性内切酶消化及消化后DNA的纯化回收

先用BamHI对载体DNA进行消化，具体如下：取约1μg质粒pTMF在30μl反应体系中(3μl 10×Buffer K(组分及来源同上)，3μl 0.1％BSA(来源同内切酶)，2μl BamHI，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收酶切后的DNA。用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(来源同上)补平BamHI酶切后的两端缺口，反应如下：纯化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer 5μl，dNTPs(组分及来源同上，每种各2.0mmol/L)5μl，Klenow片段1μl(3u/μl)，补足体积至50μl，37℃补平反应45分钟。按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收补平后的DNA。然后用NdeI(来源同上)对补平后的DNA进行酶切，具体反应如下：取补平后的质粒pTMF在30μl反应体系中(3μl 10×BufferH(组分及来源同上)，2μl NdeI，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，回收方法参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的载体片段。

5、载体片段pTMF与RFkpA的连接

取回收的双酶切pTMF约40ng，酶切全长RFkpA约20ng，加入2μl 10×T₄ DNA连接酶缓冲液，1μl T₄ DNA连接酶，加ddH₂O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜。

6、重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定

10ul连接产物加入到200μl的大肠杆菌菌株Top10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分钟，然后加入800μl不加抗生素的液体LB培养基，轻轻混匀，37℃轻摇培养复苏45-60分钟。取200μl培养液涂布于LB(含50μg/ml Km)平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，用BglII和EcoRI(两种内切酶的来源同上)双酶切，能切下大约800bp的质粒，即初步确定为阳性克隆；同时，用FkpA特异的引物RFND和FBM进行PCR反应，进一步鉴定插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送上海生工生物工程公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为pTRFA。

三、融合表达抗膀胱癌单链抗体的载体pTFP1的构建

融合表达载体pTFP1是由单独表达抗膀胱癌单链抗体的载体pTP1在BglII和SacI之间插入同样双酶切pTFA得到的小片段(含有不带终止密码子的FkpA)构建而成的。载体pTP1为单独表达C-末端带c-myc标签序列的抗膀胱癌单链抗体的载体，其构建过程简要介绍如下。

从分泌抗膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株BDI-1(来自北京大学)提取基因组DNA，采用特异引物扩增得到抗膀胱癌单链抗体基因序列(参见文献Yu LZ等)。合成两条特异引物用于扩增c-末端带c-myc标签序列的抗膀胱癌单链抗体基因序列：

PGH：5’CC CTCGAGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3’，下划线为XhoI识别位点；

PGLC1：5’CC GAATTCTTAATTCA GA TCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC

          TTTTAGTTCCAACTTTGTCCCCG 3’，下划线为EcoRI识别位点，斜体部分为c-myc标签序列。按照与上文相同的扩增条件扩增得到C-末端带c-myc标签序列的抗膀胱癌单链抗体基因序列，其模板来自北京大学。扩增得到的抗膀胱癌单链抗体基因序列连入载体pTMF的XhoI-EcoRI位点之间，得到的阳性克隆质粒命名为pTP1。

1、表达质粒pTP1和pTFA的提取和限制性内切酶消化

用华舜小量质粒提取试剂盒提取质粒pTP1和pTFA(本发明构建，参见上文)，分别用BglII和SacI进行双酶切处理，条件如下：取约1ug DNA，加入1.5μL 10×buffer K(组分及来源同上)，内切酶NdeI和SacI各1μL，用ddH₂O补足体积至30μl，37℃水浴酶解反应4小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，即回收pTP1酶切后的大片段和pTFA酶切后的小片段，参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

2、DNA的连接反应，重组DNA的转化和阳性克隆的筛选

取回收的双酶切pTP1约40ng，FkpA约20ng，加入2μl 10×T₄ DNA连接酶缓冲液，1μl T₄ DNA连接酶，加ddH₂O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜。10ul连接产物加入到200μl的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分钟，然后加入800μl不加抗生素的液体LB培养基，轻轻混匀，37℃轻摇培养复苏45-60分钟。取200μl培养液涂布于LB(含50μg/ml Km)平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，用BglII和SacI双酶切，能切下大约980bp的质粒，即初步确定为阳性克隆；同时，用FkpA特异的引物FNC和FBM进行PCR反应，进一步鉴定插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送上海生工生物工程公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为pTFP1(参见附图1及附图2)。

四、共表达抗膀胱癌单链抗体—纤维素结合域(CBD)融合蛋白CBD-PG和FkpA蛋白的载体pTBNP1F的构建

共表达载体pTBNP1F是由用BglII和NdeI双酶切质粒pTBNP1得到的含有融合蛋白CBD-PG基因序列的片段插入到同样双酶切处理的质粒pTRFA上构建而成的。质粒pTBNP1的构建过程如下：

pTBN的构建：

提取Cellulomas fimi(粪纤维单胞菌，购自中国普通微生物菌种保藏中心)染色体DNA作为扩增纤维素结合域(CBD)的模板；从GeneBank查得Cellulomas fimi染色体上编码纤维素结合域的基因序列，全长492个碱基，设计两条特异引物，分别与该CBD序列上、下游互补，引物序列如下：

上游引物CBDNC：5’TCCACCCGCAGAACCGCC 3’(平末端)

下游引物BD3：5’TA GAGCTCCGGCGTGGGGGTGGGGG 3’，下划线所示为内切酶SacI位点。按以下条件进行PCR扩增反应：

模板(Cellulomas fimi染色体DNA) 1μL(约100ng)

引物CBDNC(上海生工生物技术合成)5μL

引物BD3(上海生工生物技术合成)  5μL

dNTPs(购自宝生物工程(大连)有限公司)

                               5μL(每种各2.0mmol/L)

10×PCR反应buffer(购自上海博亚生物技术公司)

                               50μL

pfu DNA聚合酶(购自上海博亚生物技术公司)                1μL

                               (3u/μL)

10×PCR反应buffer组分同上文。

用ddH₂O补足至总体积50μL，混匀，94℃预变性5分钟，然后进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜生物技术有限公司的小量胶回收试剂盒纯化回收所需的全长CBD。

先用NcoI对载体pTMF进行消化，具体如下：取约1μg质粒pTMF在30μl总反应体积中(3μl 10×Buffer K(来源及组分同上)，3μl 10×BSA，2μl NcoI(来源同上)，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收酶切后的DNA。用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(来源同上)补平NcoI酶切后的两端缺口，反应如下：纯化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer(来源及组分同上)5μl，dNTPs(来源及组分同上)5μl，Klenow片段(来源同上)1μl，补足体积至50μl，37℃补平反应45分钟。按照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明纯化回收补平后的DNA。然后用SacI对补平后的载体DNA和回收的CBD进行酶切，具体反应如下：取补平后的质粒pTMF或CBD在30μl反应体系中(3μl10×Buffer L(组分及来源同上)，2μl SacI，用ddH₂O补足体积至30μl)，37℃酶解反应4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，回收方法参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的载体和CBD片段。按照与上文相同的方法进行载体与CBD片段的连接及转化，筛选所得到的阳性克隆质粒命名为pTBN。

pTBNP1的构建：

为方便克隆，采用特异引物扩增C-末端含c-myc识别序列标签的抗膀胱癌单链抗体，并将其连入载体pTBN。扩增所用的引物为

PGH(与上文相同)；

PGLC2：5’CC CATATGTTAATTCAGATCCTCTTCTGAGATG 3’，下划线为NdeI识别位点。按照与上文扩增PG相同的条件扩增得到C-末端带c-myc标签序列的抗膀胱癌单链抗体基因序列，其模板为上文构建的载体pTP1。扩增得到的抗膀胱癌单链抗体基因序列连入载体pTBN的XhoI-NdeI位点之间，得到的阳性克隆质粒命名为pTBNP1。

1、质粒pTRFA和pTBNP1DNA的提取以及限制性内切酶消化

用华舜小量质粒提取试剂盒提取质粒pTRFA和pTBNP1，分别用BglII和NdeI进行双酶切处理，条件如下：取约1ug DNA，加入1.5μL 10×bufferH(组分及来源同上)，内切酶BglI和INdeI各1μL，用ddH₂O补足体积至30μl，37℃水浴酶解反应4小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，即回收pTRFA酶切后的大片段和pTBNP1酶切后的小片段，参照华舜生物技术有限公司产品华舜小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

2、DNA的连接、重组DNA的转化和阳性克隆的筛选

DNA的连接反应按以下进行：取回收的双酶切pTRFA约40ng，CBD-PG片段约20ng，加入2μl 10×T₄ DNA连接酶缓冲液，1μl T₄ DNA连接酶，加ddH₂O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜。10ul连接产物加入到200μl的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分钟，然后加入800μl不加抗生素的液体LB培养基，轻轻混匀，37℃轻摇培养复苏45-60分钟。取200μl培养液涂布于LB(含50μg/mlKm)平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，用BglII和NdeI双酶切，能切下大约1.3kb的质粒，即初步确定为阳性克隆。将鉴定后的质粒送上海生工生物工程公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为pTBNP1F(参见附图1及附图3)。

五、融合蛋白FkpA-PG的可溶表达以及CBD-PG与FkpA的可溶共表达

构建好的质粒pTFP1、pTBNP1F和空载体pTMF分别转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)。从转化平板上挑取单克隆菌落细胞接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₅₅₀为0.8，向培养物中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG(购自宝生物工程(大连)有限公司)，诱导培养4小时。取1mL培养液，12000rpm离心1分钟收集菌体，去上清，菌体细胞重悬在500μl PBS(组分为：8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na₂HPO₄和0.24克KH₂PO₄，用HCl调pH至7.4，定容至1升)中，超声破碎菌体后，12000rpm离心10分钟，收集上清，沉淀重悬在500μl PBS中。并用12％SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达情况。SDS-PAGE电泳的相关步骤如下。

聚丙烯酰胺凝胶的配制：

	浓缩胶5％	分离胶12％	分离胶8％	封口胶
					30％Acr/Bis(29∶1)(ml)1.5M Tris-HCl(pH8.8)(ml)1.0M Tris-HCl(pH6.8)(ml)10％SDS(ml)10％AP(ml)TEMED(ml)ddH20(ml)	0.5-0.380.030.030.0032.1	6.03.8-0.150.150.0064.9	4.03.8-0.150.150.0096.9	0.53-0.50.020.020.00120.93

样品的处理：适量蛋白样品(一般约30μl)与等体积的2×SDS凝胶电泳加样缓冲液(100mmol/l Tris-HCl pH6.8，200mmol/l DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混合，沸水浴加热5分钟，冷却备上样。

电泳：准备电泳缓冲液(25mmol/l Tris-HCl，pH8.3，0.1％SDS)。取适量体积的样品上样，恒压90-100V，待样品进入分离胶，恒压120-150V。染色及脱色：采用考马斯亮兰R250染色(0.25g考马斯亮兰R250溶于100ml甲醇-水-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室温染色4-12小时。用甲醇-水-冰乙酸溶液脱色，室温脱色至具有明显条带，凝胶照相分析结果(参见附图4)。

六、ELISA分析FkpA-PG及与FkpA共表达的CBD-PG的抗原结合活性

超声波破碎法制备的膀胱癌细胞系BIU87(购自北京大学)的细胞膜抗原包被ElISA板4℃过夜，用含0.05％ Tween20的PBS(即PBST)洗板三次，加200μl 1％的BSA封闭2小时，分别用PBST和PBS各洗三次。含可溶FkpA-PG和可溶CBD-PG的超声上清分别进行结合反应1小时，用PBST和PBS各洗三次。加入1∶1000稀释的兔抗鼠c-myc抗体(9E10，美国Santa Cruz公司产品)，室温结合1小时，分别用PBST和PBS各洗三次。再加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体IgG(北京华美公司产品)，室温结合1小时，分别用PBST和PBS各洗三次。在底物显色液(10mg/ml OPD，1％H₂O₂)中显色后，96孔酶标仪测定OD₄₉₀读数(参见附图5)。

参考文献：

Darby NJ，Morin PE，Talbo G等.通过非天然的二硫键中间体的牛胰腺蛋白酶抑制剂的再折叠(Refolding of bovine pancreatic trypsin inhibitorvia non-native disulphide intermediates).分子生物学杂志(J Mol Biol)，1995，249：463-77；

Anfinsen CB.支配蛋白链折叠的原理(Principles that govern thefolding of protein chain).科学(Science)，1973，181：223-30；

Saxena VP，Wetlaufer DB.蛋白质中三维结构的形成(Formation ofthree-dimensional structure in proteins).生物化学(Biochemistry)，1970，9：5015-22；

Gething MJ，Sambrook J.细胞中蛋白质的折叠(Protein folding in thecell).自然(Nature)，1992，355：33-45；

Ellis RJ.分子伴侣：避免拥挤(Molecular chaperones：avoiding thecrowd).当代生物学(Current Biology)，1997，7：R531-R533；

Holmgren A.硫氧还蛋白和谷氧还蛋白系统(Thioredoxin andglutaredoxin systems).生物的化学杂志(J Biol Chem)，1989，264：13963-66；

LaVallie ER，DiBlasio EA，Kovacic S等.一种克服大肠杆菌胞质中包涵体形成的硫氧还蛋白基因融合表达系统(A thioredoxin gene fusionexpression system that circumvents inclusion body formation in the E.colicytoplasm).生物技术(Biotechnology(NY))，1993，11：187-193；

Smith DB，Johnson KS.一步法从大肠杆菌纯化与谷胱甘肽巯基转移酶融合表达的多肽(Single-step purification of polypeptides expressed inEscherichia coli as fusions with glutathione S-transferase).基因(Gene)，1988，67：31-40；

Raina S，Missiakas D.建立和破坏二硫键(Making and breakingdisulfide bonds).微生物学年评(Annu Rev Microbiol)，1997，51：179-202；

Amrein KE，Takacs B，Stieger M等.从过量产生细菌分子伴侣GroES和GroEL的大肠杆菌表达系统表达产生的重组人p50csk蛋白酪氨酸激酶的纯化与鉴定(Purification and characterization of recombinant humanp50csk protein-tyrosine kinase from an Escherichia coli expression systemoverproducing the bacterial chaperones GroES and GroEL).美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)，1995，92：1048-1052；

Knappik A，Krebber C，Pluckthun A.折叠催化剂对大肠杆菌表达的不同抗体片段体内折叠过程的影响(The effect of folding catalysts on the invivo folding process of different antibody fragments expressed in Escherichiacoli).生物技术(Biotechnology)，1993，11：77-83；

Kamitami S，Akiyama Y，Ito K.一种周质腔酶碱性磷酸酶正确折叠所必需的大肠杆菌基因的发现和鉴定(Identification and characterization of anEscherichia coli gene required for correctly folded alkaline phosphatase，aperiplasmic enzyme).欧洲分子生物学杂志(EMBOJ)，1992，11：57-62；

Joly J C，Swartz J R.大肠杆菌蛋白二硫键异构酶的蛋白折叠活性(Protein folding activities of Escherichia coli protein disulfide isomerase).生物化学(Biochemistry)，1994，33：4231-6；

Humphereys DP，Weir N，Lawson A等.共表达人二硫键异构酶(PDI)增加大肠杆菌表达的抗体片段Fab的产量(Co-expression of human disulfideisomerase(PDI)can increase the yield of an antibody Fabfragmentexpressed in Escherichia coli).欧洲生物化学学会联合会通讯(FEBS Lett)，1996，380：194-197；

Eppens E F，Nouwen N，Tommassen J.一种细菌外膜蛋白在穿过周质腔过程中的折叠(Folding of a bacterial outer membrane protein duringpassage through the periplasm).欧洲分子生物学杂志(EMBO J)，1997，16：4295-301；

Yamanaka H，Kameyama M，Baba T等.大肠杆菌热稳定的肠毒素I的成熟途径：需要DsbA形成二硫键(Maturation pathway of Escherichia coliheat-stable enterotoxin I：requirement of DsbA for disulfide bond formation).细菌学杂志(J Bacteriol)，1994，176(10)：2906-13；

Jeong K J，Lee S Y. 大肠杆菌分泌产生人莱普廷(Secretory productionof human leptin in Escherichia coli).生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng)，2000，67：398-407；

Kurokawa Y. Yanagi H，Yura T.蛋白二硫键异构酶DsbC稳定大肠杆菌表达且转运至周质腔的含多二硫键的重组蛋白(Overexpression of proteindisulfide isomerase DsbC stabilizes multiple-disulfide-bonded recombinantprotein produced and transported to the periplasm in Escherichia coli).应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol)，2000，66：3960-5；

Kurokawa Y，Yanagi H，Yura T. 细菌蛋白二硫键异构酶(DsbC)及其调节蛋白(DsbD)的表达显著增强大肠杆菌周质腔产生人神经生长因子(Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase(DsbC)and itsmodulator(DsbD)markedly enhances periplasmic production of human nervegr owth factor in Escherichia coli).生物的化学杂志(J Biol Chem)，2001，276：14393-99；

Zhang Z，Li ZH，Wang F等.DsbC和DsbG显著改善大肠杆菌可溶性表达功能性单链抗体(Overexpression of DsbC and DsbG Markedly ImprovesSoluble and Functional Expression of Single-Chain Fv Antibodies inEscherichia coli).蛋白表达与纯化(Protein Expr Purif)，2002，in press；

Ramm K，Pluckthun A.大肠杆菌二聚体肽酰脯氨酸顺反异构酶FkpA的高酶活性与分子伴侣功能机理上是相关的特征(High enzymatic activityand chaperone function are mechanistically related features of the dimeric E.coli peptidyl-prolyl-isomerase FkpA).分子生物学杂志(J Mol Biol)，2001，310：485-498；

Bothmann H，Pluckthun A.大肠杆菌周质腔肽酰脯氨酸顺反异构酶FkpA。I.增加含有或不含有脯氨酸残基的抗体片段周质腔的功能性表达(The periplasmic Escherichia coli peptidylprolyl cis，trans-isomerase FkpA.I.Increased functional expression of antibody fragments with and without cis-prolines).生物的化学杂志(J Biol Chem)，2000，275：17100-17105；

Ramm K，Pluckthun A.大肠杆菌周质腔肽酰脯氨酸顺反异构酶FkpA。II.独立于异构酶活性的体外分子伴侣功能(The periplasmicEscherichia coli peptidylprolyl cis，trans-isomerase FkpA.II.Isomerase-independent chaperone activity in vitro).生物的化学杂志(J Biol Chem)，2000，275：17106-17113；

Arie J-P，Sassoon N，Betton J-M.大肠杆菌周质腔热休克脯氨酸顺反异构酶FkpA的分子伴侣功能(Chaperone function of FkpA，a heat shock prolylisomerase，in the periplasm of Escherichia coli).分子微生物学(MolMicrobiol)，2001，39：199-210；

Zhong Zhang，Li-ping Song，Min Fang等.细菌肽酰脯氨酸异构酶FkpA显著增加大肠杆菌可溶性表达功能性工程抗体(Overexpression ofBacterial Peptidyl-prolyl-isomerase FkpA Markedly Improves Soluble andFunctional Production of Engineering Antibodies in Escherichia coli).2002，已投稿(Submitted)。

Yu LZ，Xiao S，Huang HL等。抗人膀胱癌单链抗体的构建与表达(Construction and expression of single-chain Fv antibody against humanbladder carcinoma)。泌尿学研究(Urol Res)，1996，24(5)：273-7。

                        序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

     北京安波特基因工程技术有限公司

<120>一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体系统

<130>I020261

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

aaatcactgt ttaaagtaac g                                               21

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<400>2

gcgagctctt ttttagcaga atctgcgg                                        28

<210>3

<211>71

<212>DNA

<213>Artificial

<400>3

gaatggcata tgaataattt tgtttaactt taagaaggag atatatccat gaaatcactg     60

tttaaagtaa c                                                          71

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<400>4

ttatttttta gcagaatctg                                                 20

Claims (9)

1.一种高效可溶表达功能性外源蛋白的表达载体，其特征在于促折叠相关蛋白FkpA基因与所述功能性外源蛋白基因形成单一的融合基因，表达单一的融合蛋白，或促折叠相关蛋白FkpA基因与所述功能性外源蛋白基因在同一个启动子控制下转录且分别进行翻译。

2.权利要求1的表达载体，其是大肠杆菌通用的高效可溶表达载体。

3.权利要求1的表达载体，其是pTFA。

4.权利要求1的表达载体，其是pTRFA。

5.权利要求1的表达载体，其中所述功能性外源蛋白基因是抗膀胱癌单链抗体的基因，该载体命名为pTFP1。

6.权利要求1的表达载体，其中所述功能性外源蛋白基因是纤维素结合域和抗膀胱癌单链抗体构成的融合蛋白的基因，该载体命名为pTBNP1F。

7.一种含有权利要求1-6中任何一项所述的载体的宿主细胞，它是大肠杆菌。

8.一种构建权利要求1-6中任何一项所述的载体的方法，包括将促折叠相关蛋白FkpA基因与功能性外源蛋白基因融合或将促折叠相关蛋白FkpA基因与功能性外源蛋白基因置于同一启动子控制下转录且分别进行翻译的步骤。

9.一种以可溶形式高效表达外源蛋白的方法，包括表达权利要求7的宿主细胞的步骤。

Images