KR100378325B1

KR100378325B1 - 분자 샤프론을 공동분비시켜 자연적으로 폴딩되고분비되는 단백질을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100378325B1
Application number: KR10-2000-0043241A
Authority: KR
Inventors: 암브로시우스도로테; 루돌프라이너; 샤프너외르크; 슈바르츠엘리자베쓰
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2003-03-29
Also published as: KR20010049895A; IN190327B; CA2313248A1; EP1077262A1; EP1077262B1; CN1283702A; DK1077262T3; ATE299942T1; DE60021318T2; JO2309B1; US6455279B1; ES2247990T3; DE60021318D1; MXPA00007339A; CN1231595C; EP1077263A1; JP2001061487A; CA2313248C

Abstract

본 발명은

디설파이드 가교결합에 의해 연결된 2개 또는 수개의 시스테인을 포함하고, 자연적으로 폴딩(folding)된 진핵생물 유래 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,

(a) N-말단에 원핵생물 유래의 신호 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 원핵세포를 배양하고, (b) 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘(periplasm) 또는 배지로 분비시키고, (c) 상기 신호 서열을 절단한 후 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘 또는 배지로부터 단리시키며, 또한 상기 원핵세포에서 분자 샤프론(chaperone)을 암호화하는 핵산을 추가로 발현시키고 상기 샤프론을 페리플라즘으로 분비시키는 것으로 이루어진 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 원핵생물에서 폴리펩타이드를 재조합적으로 고수율로 생산하는 경우에 적합하다.

Description

분자 샤프론을 공동분비시켜 자연적으로 폴딩되고 분비되는 단백질을 생산하는 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NATURALLY FOLDED AND SECRETED PROTEINS BY CO-SECRETION OF MOLECULAR CHAPERONES}

본 발명은 분자 샤프론(chaperone)을 공동분비시킴으로써, 원핵세포에서 발현된 후에 자연적으로 폴딩되고 분비되는 수용성 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

해독이라고도 지칭되는 원핵생물에서의 단백질 합성은 세포질내 리보솜에서 일어난다. 재조합 DNA를 원핵생물 숙주에서 발현시키는 경우, 이 과정에서 수득된 재조합 유전자 산물 또는 단백질을 세포질로부터 박테리아 내측막을 통해 내측막과 외측막 사이의 페리플라즘 공간으로 분비시키는 것이 바람직한 경우가 많다. 분비된 단백질은 그 후에 페리플라즘으로부터 삼투압 쇼크 등에 의해 영양소 배지로 방출될 수 있다. 이러한 방법의 문제점은 분비된 폴리펩타이드가 종종 생물학적으로 활성인 네이티브 구조를 형성하지 않는다는 점이다(학크니(Hockney)의 문헌[TIBTECH,12, 456-463, 1994] 참조).

최근에 펩티딜-프롤릴-시스/트랜스-이소머라제 또는 단백질 디설파이드 이소머라제(글락슈버(Glockshuber) 등의 EP-A 0 510 658 호)와 같은 분자 샤프론 및 폴딩 촉매를 사용하여 생체내에서 폴딩시 네이티브 형태로 생산되는 제조합 단백질의 수율을 증가시켜 왔다(토마스(Thomas) 등의 문헌[Appl. Biochem. Biotechnol.,66, 197-238, 1997] 참조). 몇몇 경우에, 이러한 방법은 래트(rat)에서 리뷸로스 비스포스페이트 카복실라제(RUBISCO; 골로우비노프(Goloubinoff) 등의 문헌[Nature,337, 44-47, 1989] 참조), 인간 프로콜라게나제(리(Lee) 및 올린스(Olins)의 문헌[J. Biol. Chem.,267, 2849-2852, 1992] 참조) 또는 신경원세포의 산화질소 신타제 등의 발현을 상당히 향상시켰다(로만(Roman) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8428-8432, 1995] 참조). 상기 예들에서는 이 콜라이(E. coli)로부터의 GroEL/ES 또는 DnaK 시스템을 사이토졸에서 공동발현시켰다.

샤프론의 공동발현 효과는 재조합 단백질을 이 콜라이의 페리플라즘으로 분비시키는 경우에서도 조사되었다. 그러나, 이 경우 페리플라즘으로의 분비를 최적화시키기 위해 단지 세포졸에서의 샤프론의 대량발현만이 평가되었다(페레즈-페레즈(Perez-Perez) 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Commun.,210,524-529, 1995]; 사토(Sato) 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Commun.,202, 258-264, 1994]; 버게스(Berges) 등의 문헌[Appl. Environ. Microbiol.,62, 55-60, 1996] 참조). 이 콜라이에서 공동분비시키려는 이전의 시도들은 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI; 글락슈버 등의 EP-A 0 510 658) 또는 펩티딜-프롤릴-시스/트랜스-이소머라제, Dsb 단백질(내픽(Knappik) 등의 문헌[Bio/Technology,11, 77-83, 1993], 큐(Qiu) 등의 문헌[Appl. Environm. Microbiol.,64, 4891-4896, 1998] 및 슈미트(Schmidt) 등의 문헌[Prot. Engin.,11, 601-607, 1998] 참조) 또는 Skp 단백질(하이허스트(Hayhurst) 및 해리스(Harris)의 문헌[Protein Expr. Purif.,15, 336-343, 1999] 참조)과 같은 폴딩-헬퍼(helper) 단백질에 관한 것이었다.

본 발명의 목적은 간단한 방식으로 행해질 수 있으며 봉입체(inclusion body)의 용해, 환원 및 재생과 같은 수고스러운 시험관내 후처리가 필요하지 않는, 원핵생물에서 발현된 후에 자연적으로 폴딩된 수용성의 진핵생물 유래 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 페리플라즘(periplasm)내에서 그리고 사이토졸(cytosol)내에서 발현된 DnaJ의 세포내 위치 및 네이티브 폴딩(native folding) 형태를 조사하기 위해, 이들 DnaJ를 50㎍/㎖의 트립신으로 제한적으로 단백질 가수분해시킨 후, 웨스턴 블로팅(Western blotting)한 결과를 도시한 것이다. 분자량 표준물질을 좌우측에 적용하였다. 대조군으로서 정제된 DnaJ(좌측)를, 6.25㎍/㎖의 트립신을 사용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 절차에 따라 처리하였다.

도 2는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ를 개략적으로 도시한 것이다.

도 3은 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인을 개략적으로 도시한 것이다.

도 4는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25를 개략적으로 도시한 것이다.

도 5는 발현 플라스미드 pUBS520-ScFvOx를 개략적으로 도시한 것이다.

도 6은 발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA를 개략적으로 도시한 것이다.

본 발명의 목적은

디설파이드 가교결합에 의해 연결된 2개 또는 수개의 시스테인을 포함하고, 자연적으로 폴딩(folding)된 진핵생물 유래 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,(a) N-말단에 원핵생물 유래의 신호 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 원핵세포를 배양하고, (b) 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘(periplasm) 또는 배지로 분비시키고, (c) 상기 신호 서열을 절단한 후 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘 또는 배지로부터 단리시키며, 또한 상기 원핵세포에서 분자 샤프론(chaperone)을 암호화하는 핵산을 추가로 발현시키고 상기 샤프론을 페리플라즘으로 분비시키는 것으로 이루어지되, 단 상기 배양이 아르기닌 또는 하기 화학식 1의 화합물의 존재하에 수행되는 경우는 제외되는 방법에 의해 달성된다:

화학식 1R₂-CO-NRR₁

상기 식에서,

R 및 R₁은 수소 또는 포화되거나 포화되지 않은 분지 또는 비분지 C₁-C₄알킬쇄이고,

R₂는 수소, NHR₁또는 포화되거나 포화되지 않은 분지 또는 비분지 C₁-C₃알킬쇄이다.

상기 방법에서 샤프론을 대량발현시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시태양에서, SH 기를 함유하는 환원형 티올 시약을 원핵세포를 배양하는데 사용된 영양소 배지(발효 배지)에 추가로 첨가함으로써, 재조합적으로 생산되는 단백질의 수율을 더욱 증가시킬 수 있다. 0.1 내지 15mmol/ℓ의 티올 시약을 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라서, "티올 시약"이란 용어는 SH 기를 갖는 환원형(환원된) 티올 시약, 또는 SH 기를 갖는 환원형 티올 시약과 디설파이드 기를 갖는 산화형 티올 시약의 혼합물을 의미한다. 바람직한 물질은 환원된 글루타치온(GSH), 시스테인, N-아세틸시스테인, 시스테아민, β-메르캅토에탄올 및 유사한 화합물들이다. 티올 시약을 단독으로 그리고 혼합물로서 사용할 수 있다. 분자당 단일 SH 기를 갖는 글루타치온(GSH)과 같은 티올 시약이 특히 적합하다. 글루타치온과 같은 티올 시약은 원핵세포에서 재조합 DNA를 발현시키는 경우 네이티브 형태로 폴딩된 단백질의 수율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다(글락슈버 등의 EP-A 0 510 658 참조).

본 발명에 따라서, 샤프론은 다른 비-네이티브 단백질이 생체내에서 응집되지 않도록 보호하며 그의 네이티브 구조를 형성하도록 촉진시키는 단백질로서 여겨진다(Review 문헌들: 실버(Silver) 및 웨이(Way)의 문헌[Cell,74, 5-6, 1994] 및 시르(Cyr) 등의 문헌[TIBS,19,176-181, 1994] 참조). 선행 기술에서는 분자 샤프론을 사용하여 단백질을 안정화시킴으로써, 단백질이 응집되어 불활성화되지 않도록 보호하였다(부흐너(Buchner) 등의 EP-A 0 556 726 A1 참조). 열 쇼크 단백질(heat shock protein, Hsp) 40 유형(분자량 약 40kDa)의 ATP-의존성 샤프론 또는 작은 열 쇼크 단백질(sHsp)이 바람직하게 사용된다. DnaJ는 이 콜라이의 세포질에서 발견되는 40kDa의 열 쇼크 단백질로서, 소위 Hsp70 샤프론 시스템의 한 종류이다(부카우(Bukau, B.) 및 호르위치(Horwich, A.)의 문헌[Cell,92, 351-366, 1998] 참조). DnaK(Hsp70) 및 GrpE도 또한 상기 시스템에 속한다. 특정한 단백질은 ATP-의존성 공정으로 DnaK 시스템에 의해 네이티브 구조로 폴딩된다(슈뢰더(Schroder) 등의 문헌[EMBO J.,12, 4137-4144, 1993] 및 랑거(Langer) 등의 문헌[Nature,356, 683-689, 1992] 참조). 이 시스템은 변성된 단백질을 재폴딩시키는데 ATP를 추가로 요구한다. DnaJ는 DnaK 및 ATP가 존재하지 않을 때에도 또한 비-네이티브 단백질이 응집하지 않도록 보호하며, 폴딩-컴피턴트(competent) 상태를 매개한다(슈뢰더 등의 문헌[EMBO J. 12, 4137-4144, 1993] 참조). 1 내지 108개의 아미노산(이하에서 J-도메인(켈리(Kelley) 등의 문헌[TIBS,23, 222-227, 1998] 참조)으로 지칭됨)을 포함하는 DnaJ의 N-말단단편을 공동분비시키는 것이 또한 바람직하다. J-도메인, 및 DnaK와의 상호작용을 담당하는 G/F-부(rich) 도메인이 상기 N-말단 단편 영역에 위치한다(월(Wall) 등의 문헌[J. Biol. Chem.,270, 2139-2144, 1995] 참조). 사이토졸에서 DnaJ를 공동발현시킴으로써 가용성 단백질의 수율을 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다(요코야마(Yokoyama) 등의 문헌[Microbiol. Ferment. Technol.,62, 1205-1210, 1998] 참조).

Hsp25(예를 들어, 마우스로부터 유래함)는 도처에 존재하는 샤프론 계열인 작은 열 쇼크 단백질(sHsp; 개스텔(Gaestel) 등의 문헌[Eur. J. Biochem.,179, 209-213, 1989] 참조)의 대표 단백질이다. 이들 단백질의 분자량은 15 내지 30kDa이다. 열 쇼크를 받는 동안 sHsp는 세포내에 상당히 축적된다(총 세포 단백질의 1% 이하; 문헌[Arrigo Landry, In Morimoto(Ed.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373, 1994] 참조). DnaJ 단백질처럼, sHsp는 비-네이티브 단백질의 응집을 방지하고 이들을 폴딩-컴피턴트 상태로 유지시키는 특성을 갖는다(제이콥(Jakob) 등의 문헌[J. Biol. Chem.,268, 1517-1520, 1993]; 에른스퍼거(Ehrnsperger) 등의 문헌[EMBO J.,16, 221-229, 1997] 참조). 모든 sHsp는 역시 sHsp 계열의 일원인 진핵생물의 안구 수정체 단백질 αA 및 αB-결정체와 상동 영역을 갖는다(제이콥 및 부흐너의 문헌[TIBS,19,205-211, 1994] 참조).

본 발명에 따라서, "대량발현"이란 용어는 DnaJ 및 Hsp25 등과 같은 분비된 단백질의 발현 수준을 각각의 야생형의 원핵생물 숙주에서의 발현 수준에 비해 증가시킴(바람직하게는 100% 이상 증가시킴)을 의미한다. 이러한 대량발현은, 예를 들어 유전자(단백질, 샤프론 및/또는 신호 단백질을 암호화하는 유전자)가 원핵생물 유래의 강력한, 바람직하게는 유도성 발현 신호(예를 들어, lac 또는 T7 프로모터 또는 이들의 유도체)의 제어하에 발현될 때 이루어질 수 있다.

재조합 DNA상에 조절성 영역(프로모터 및 종결유전자)을 포함하는 폴리펩타이드(단백질)를 대량발현시키기 위한 분비 구성물은 바람직하게는 원핵생물에서 희귀한 아르기닌-tRNA_AGA/AGG를 추가로 암호화하는 벡터에 삽입되거나, 또는 이 tRNA를 암호화하는 벡터와 함께 공동발현시킨다(브링크만(Brinkmann) 등의 문헌[Gene,85, 109-114, 1989] 참조). 이러한 방식을 사용함으로써, 각 단백질을 박테리아 페리플라즘으로 공동-대량발현시킬 수 있을 뿐만 아니라 희귀한 tRNA^Arg _AGA/AGG를 전사시킬 수 있어서 박테리아 숙주 유기체에서 원하는 단백질의 합성을 증가시킬 수 있다. 폴리펩타이드 및 샤프론을 암호화하는 핵산은 1개의 벡터상에 또는 2개의 별도의 벡터상에 위치할 수 있다.

본 발명의 범주에서 원핵생물 유래의 신호 서열은 원핵생물, 바람직하게는 그람(Gram)-음성 박테리아로부터 유래한 핵산 단편으로 이해되며, 신호 펩타이드에 결합된 단백질이 박테리아 내측막을 통과할 수 있도록 보장한다. 그 결과, 단백질은 페리플라즘 또는 세포 상청액에 존재할 수 있다. 이러한 신호 서열은 통상적으로 18 내지 30개의 아미노산 길이를 가지며, 예를 들어 문헌[Murphy Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope inEscherichia coli] 및문헌[Neidhardt et al. (editors):Escherichia coliandSalmonella, Second Edition, Vol. 1, ASM Press, Washington, p. 967-978, 1996]에 기술되어 있다. 박테리아 신호 서열은, 예를 들어 Ala-X-Ala 서열 이후부터 절단될 수 있다(본 헤이진(von Heijne) 등의 문헌[J. Mol. Biol.,184, 99-105, 1985] 참조). 박테리아 신호 펩티다제의 구조는 패트첼(Paetzel) 등의 문헌[Nature,396, 186-190, 1998]에 기술되어 있다. 원핵세포의 페리플라즘에 존재하는 프로테아제에 의해 원하는 단백질로부터 또다시 절단될 수 있는 신호 서열이 바람직하게 사용된다. 또 다르게는 이러한 프로테아제를 세포 상청액 또는 단리된 단백질에 첨가하여 신호 서열을 절단할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 프로테아제, 인터페론, 단백질 호르몬, 항체 또는 이들의 단편들과 같은 다수의 진핵생물 유래의 단백질의 이종 발현을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법은 네이티브 상태에서 디설파이드 가교결합에 의해 연결된 2개 이상의 시스테인을 포함하는 단백질을 이종 생산하는 경우, 특히 이들의 N-말단에 원핵생물 유래의 신호 서열이 융합되어 있지 않아서 이들을 원핵생물에서 발현시키는 동안 봉입체가 형성되는 경우 특히 적합하다. 상기 방법은 네이티브 상태에서 5개 이상의 디설파이드 가교결합을 포함하는 단백질의 이종 생산에 특히 적합하다. 이러한 단백질은, 예를 들어 재조합 플라스미노젠 활성화제(이하에서 rPA로 지칭됨; 마틴(Martin) 등의 문헌[Cardiovasc. Drug Rev.,11, 299-311, 1993] 및 미국 특허 제 5,223,256 호 참조)이다. rPA는 이 콜라이의 환원형 사이토졸에서는 형성될 수 없는 9개의 디설파이드 가교결합을 갖는다.

단백질 및 샤프론은 박테리아 내측막을 통과할 수 있도록 신호 서열과 "작동적으로 연결"됨으로써 페리플라즘에 확실하게 위치할 수 있다.

이 콜라이에서 작용형의 분비성 rPA 단백질을 단리시키기 위해, 플라스미드 pA27fd7(코네르트(Kohnert) 등의 문헌[Protein Engineering,5, 93-100, 1992] 참조)로부터 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유전공학적 방법에 의해 그람-음성 박테리아의 원핵생물 유래의 신호 서열, 예를 들어 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 유래의 펙테이트 리아제 B(PelB)의 신호 서열에 융합시킨다. 이러한 유전자 융합체는 벡터 pET20b(+)(미국 매디슨 소재의 노바진 인코포레이디드(Novagen Inc.))로 클로닝시켜 구성되었다. 따라서, 유전자는 T7 프로모터의 제어하에 발현된다. 융합 단백질은 이에 존재하는 신호 서열에 의해 페리플라즘으로 분비된다. 신호 서열은 분비되는 동안 또는 그 후에 내측막에 존재하는 펩티다제에 의해 절단된다. 분비된 단백질은 그 후에 페리플라즘에서 폴딩된다. 페리플라즘에서의 산화형 조건에 의해 디설파이드 가교결합이 형성될 수 있다(울핑(Wulfing) 및 플렉툰(Pluckthun)의 문헌[Mol. Microbiol.,12, 685-692, 1994] 참조). 페리플라즘에서 DnaJ, J-도메인 또는 Hsp25를 동시에 공동-대량발현시킴으로써 작용형 단백질의 수율을 약 5 내지 10배 증가시킬 수 있다(하기 표 1 참조).

하기 실시예, 참조 문헌, 서열목록 및 도면은 본 발명을 더욱 자세히 설명하며, 본 발명의 보호성 범주는 하기 특허청구의 범위에 나타나 있다. 기술된 방법들은 변형된 후에도 본 발명의 주제를 여전히 기술하는 예들임을 주지하여야 한다.

서열목록에 대한 설명

서열번호: 1은 pIN III ompA3-dnaJ로부터 증폭된 조절성 서열(프로모터, 종결유전자)과 함께 OmpA 신호 서열 및 DnaJ로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ의 일부분의 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 2는 OmpA-DnaJ 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 3은 pIN III ompA3-dnaJ로부터 증폭된 조절성 서열(프로모터, 종결유전자)과 함께 OmpA 신호 서열 및 J-도메인으로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인의 일부분의 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 4는 OmpA-J-도메인 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 5는 pIN III ompA3-hsp25로부터 증폭된 조절성 서열(프로모터, 종결유전자)과 함께 OmpA 신호 서열 및 Hsp25로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25의 일부분의 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 6은 OmpA-Hsp25 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 7은 pHEN-ScFv 또는 pIN III ompA3로부터 증폭된 조절성 서열(프로모터, 종결유전자)과 함께 PelB 신호 서열 및 ScFv옥사졸론(Oxazolon)으로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pUBS520-ScFvOx의 일부분의 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 8은 PelB-scF_v옥사졸론 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 9는 PelB 신호 서열 및 rPA로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA의 일부분의 서열을 나타낸 것이다.

서열번호: 10은 PelB-rPA 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

일반적인 절차:

DnaJ, J-도메인 및 Hsp25를 이 콜라이의 페리플라즘에서 대량발현시키기 위해서, 이들 단백질을 암호화하는 DNA를 유전공학적 방법에 의해 이 콜라이의 외측막 단백질 A의 신호 서열(OmpA)에 융합시키고, 이 융합체를 lac-lpp 프로모터의 제어하에 재조합 플라스미드상에서 이 콜라이에서 발현시켰다. 그 결과, DnaJ 및 Hsp25의 폴리펩타이드쇄는 원핵생물 숙주의 페리플라즘으로 이동되어 거기서 네이티브한 형태로 폴딩된다. DnaJ의 위치 및 그의 네이티브 폴딩 형태는 트립신으로 제한적인 단백질 가수분해를 행한 후, 웨스턴 블로팅으로 확인하였다.

실시예

실시예 1

발현 플라스미드 pIN III ompA3-dnaJ의 구성

분자 유전학적 기법은 문헌[Ausubel et al. (Ed.), J. Wiley Sons, Curr.Protocols in Molecular Biology, 1997]에 기초하였다. 올리고뉴클레오타이드는 독일 에버스베르크 소재의 MWG 바이오테크(Biotech) 또는 독일 에겐스타인 소재의 기브코 라이프 사이언시즈(GIBCO Life Sciences) 회사들로부터 구입하였다.

DnaJ를 암호화하는 유전자(진 뱅크(Gene Bank) 수탁번호 M 12565 호)를 제한 절단 부위 EcoRI 및 BamHI에 의해 발현 플라스미드 pIN III ompA3(가이렙(Ghayreb) 등의 문헌[EMBO J.,3, 2437-2442, 1984] 참조)에 클로닝시켰다. 클로닝된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 생성물 단편의 서열을 디데옥시 시퀀싱(sequencing)(독일 에버스베르크 소재의 MWG 바이오테크로부터 시판중인 LiCor DNA-시퀀서(Sequencer) 4000)으로 조사하였다. 생성된 플라스미드를 pIN III ompA3-dnaJ로 명명하였다. 페리플라즘에서 발현된 DnaJ의 서열은 폴리펩타이드 서열이 Met 대신에 Gly-Ile-Pro로 시작한다는 점에서 야생형 단백질의 서열과 다르며, 따라서 N-말단이 2개의 아미노산 만큼 더 연장되었다. 또한 DnaJ는 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)로 유도되는 lac-lpp 프로모터의 제어하에 발현된다.

실시예 2

발현 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ의 구성

플라스미드 pIN III ompA3-dnaJ로부터 lac-lpp 오페론, 신호 서열, dnaJ 유전자 및 이 오페론의 종결유전자를 암호화하는 영역을 PCR로 증폭시켰다(서열번호: 1). PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 절단하고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 선형화된 벡터 pUBS520으로 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 pUBS520-pIN-dnaJ로 명명하였다(도 2).

실시예 3

발현 플라스미드 pUBS520-pIN-J-도메인의 구성

2가지 종결 코돈을 퀵체인지(QuikChange) 돌연변이 유발 시스템(독일 만하임 소재의 프로메가(Promega))을 사용하여 플라스미드 pUBS520-pIN-dnaJ의 324번 뉴클레오타이드 이후에 삽입시켜, 단지 처음의 108개의 아미노산만이 발현되도록 하였다. 돌연변이된 영역의 서열을 디데옥시 시퀀싱(독일 에버스베르크 소재의 MWG 바이오테크로부터 시판중인 LiCor DNA-시퀀서 4000)으로 측정하고, 단축된 단백질 단편의 발현 여부를 웨스턴 블로팅 및 항-DnaJ 항체를 사용하는 검출법으로 검출하였다. 형성된 플라스미드를 pUBS520-pIN-J-도메인으로 명명하였다(도 3).

실시예 4

발현 플라스미드 pIN III ompA3-hsp25의 구성

Hsp25를 암호화하는 유전자(진 뱅크 수탁번호 L 07577 호)를 제한 절단 부위 EcoRI 및 BamHI에 의해 발현 플라스미드 pIN III ompA3(가이렙 등의 문헌[EMBO J.,3, 2437-2442, 1984] 참조)에 클로닝시켰다. 클로닝된 PCR 단편의 서열을 디데옥시 시퀀싱(독일 에버스베르크 소재의 MWG로부터 시판중인 LiCor DNA-시퀀서 4000)으로 조사하였다. 생성된 플라스미드를 pIN III ompA3-hsp25로 명명하였다. 페리플라즘에서 발현된 Hsp25의 서열은 폴리펩타이드 서열이 Met 대신에 Gly-Ile-Leu로 시작한다는 점에서 야생형 단백질의 서열과 다르며, 따라서 N-말단이 2개의 아미노산 만큼 더 연장되었다. 또한 Hsp25는 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)로 유도되는 lac-lpp 프로모터의 제어하에 발현된다.

실시예 5

발현 플라스미드 pUBS520-pIN-hsp25의 구성

플라스미드 pIN III ompA3-hsp25로부터 lac-lpp 오페론, 신호 서열, hsp25 유전자 및 이 오페론의 종결유전자를 암호화하는 영역을 PCR로 증폭시켰다(서열번호: 5). PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 절단하고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 선형화된 벡터 pUBS520로 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 pUBS520-pIN-hsp25로 명명하였다(도 4).

실시예 6

발현 플라스미드 pUBS520-ScFvOx의 구성

샤프론 특성이 없는, 헵텐 옥사졸론과 관련한 단일쇄 Fv 단편(ScFv옥사졸론; 피들러(Fiedler) 및 콘라드(Conrad)의 문헌[Bio/Technology,13,1090-1093, 1995] 참조)과의 공동-발현을 음성 대조군으로서 조사하였다.

플라스미드 pHEN-ScFvOx로부터 lac 프로모터, 신호 서열 pelB 및 scfvox 유전자를 암호화하는 영역을 PCR로 증폭시켰다. 플라스미드 pIN III ompA3로부터 lpp 종결유전자를 암호화하는 영역을 2차 PCR로 증폭시켰다. 상기 2개의 단편을 이후의 PCR에서 융합시켰다. 이러한 방식으로 형성된 PCR 생성물(서열번호: 7)을 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 BamHI으로 절단하고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 선형화된 벡터 pUBS520에 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 PUBS520-ScFvOx로 명명하였다(도 5).

실시예 7

발현 플라스미드 pET20b(+)-rPA의 구성

플라스미드 벡터 pA27fd7(코네르트 등의 문헌[Protein Engineering,5, 93-100, 1992] 참조)로부터 플라스미노젠 활성화제(rPA)의 유전자를 PCR 방법의 보조하에 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BamHI으로 절단하고, 플라스미드 벡터 pET20b(+)(미국 매디슨 소재의 노바진 인코포레이티드)로 클로닝시켰다. 상기 플라스미드는 PelB의 신호 서열(에르위니아 카로토보라로부터 유래한 펙테이트 리아제) 및 rPA로 구성된 융합 단백질을 암호화한다. 페리플라즘으로 분비된 rPA를 디데옥시 시퀀싱(독일 에버스베르크 소재의 MWG 바이오테크로부터 시판중인 LiCor DNA-시퀀서 4000)으로 조사하였다. 상기 구성물을 pET20b(+)-rPA(서열번호: 10)(도 6)로 명명하였다. rPA는 이 콜라이 BL21(DE3) 균주에서 lacUV5 프로모터의 제어하에 발현되는 T7-RNA-폴리머라제에 의해 T7 프로모터의 제어하에 전사되어 발현된다. 발현은 IPTG를 첨가하여 유도시켰다. 페리플라즘에서 발현된 rPA는 코네르트 등이 기술한 플라스미노젠 활성화제와는 달리, 두 번째 아미노산(Ser)이 Ala로 대체되었다.

실시예 8

이 콜라이의 페리플라즘에서 작용형 rPA의 발현

pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-dnaJ를 포함하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포(스투디어(Studier) 및 모패트(Moffat)의 문헌[J. Mol. Biol.,189, 113-130, 1986] 참조)를 하룻밤 동안 배양한 정지기 배양물(DnaJ의 공동발현), pET20b(+)-rPA 및pUBS520-pIN-J-도메인을 포함하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포의 하룻밤 배양물(J-도메인의 공동발현), pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-pIN-hsp25를 포함하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포의 하룻밤 배양물(Hsp25의 공동발현), pET20b(+)-rPA 및 pUBS520-ScFvOx를 포함하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포의 하룻밤 배양물(ScFvOx의 공동발현), pET20b(+)-rPA 및 pUBS520을 포함하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포의 하룻밤 배양물 또는 pET20b(+) 및 pUBS520을 함유하는 이 콜라이 BL21(DE3) 세포의 하룻밤 배양물(대조군 배양물)을, 각각 암피실린(100㎍/㎖) 및 카나마이신(50㎍/㎖; 독일 뉴-울름 소재의 플루카 케미카(Fluka Chemica))을 함유하는 LB 배지 100㎖에 1:50의 비로 희석하고 170rpm 및 24℃에서 진탕시켰다. 3시간 동안 생육시킨 후에, 이들 배양물의 5㎖ 분취량을 전술한 양의 암피실린과 카나마이신, 및 5mM의 GSH(독일 소재의 풀루카)를 함유하는 LB 배지 10㎖에 각각 첨가하고, 각각을 1mM IPTG(이소프로필-β-갈락토사이드; 독일 다름스타트 소재의 어플리켐(AppliChem))로 유도시켰다. 세포들을 24℃ 및 170rpm에서 추가로 21시간 동안 더 진탕시키고, 600nm에서의 광학밀도(OD_600nm)를 측정한 후에 1㎖의 샘플을 채취하였다. 이들 1㎖의 세포 샘플을 제이코비(Jacobi) 등에 따른 변형된 프로토콜(문헌[J. Biol. Chem.,272, 21692-21699, 1997] 참조)에 의해 2㎖들이 에펜도르프(Eppendorf) 반응 용기에서 분획시켰다. 자세하게는, 500㎕의 분획용 완충액(150mM의 NaCl(로트 게엠베하(Roth GmbH), 50mM의 Trix/HCl(로트 게엠베하), 5mM의 EDTA(바이오몰(Biomol)) 및 1㎎/㎖의 폴리믹신 B 설페이트(시그마(Sigma)), pH7.5)을 세포 펠렛(pellet)에 첨가하고, 에펜도르프 써모쉐이커(thermoshaker)상에서 1400rpm으로 10℃에서 1시간 동안 진탕시킨 후, 10℃로 냉각시킨 에펜도르프 마이크로원심분리기에서 14,000rmp으로 15분간 원심분리하여 가용성 페리플라즘 단백질을 함유하는 분획(상청액) 및 그외 나머지를 함유하는 분획(펠렛)으로 분리하였다.

rPA의 활성은 본질적으로 베르헤이젠(Verheijen) 등의 문헌[Thromb. Haemostasis,48, 266-269, 1982]의 방법에 따라 측정하였다.

세포 추출액에서 측정한 모든 rPA의 농도는 상이한 완충액에서 측정하는 경우에 발생할 수 있는 오차를 보정하기 위해 OD₆₀₀=1의 세포 현탁액으로 표준화시켰다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

발효 배지에 5mM GSH의 존재하에 이 콜라이의 페리플라즘에서의네이티브 rPA의 형성에 대해 분자 샤프론의 공동분비가 미치는 효과
공동분비된 단백질	rPA(ng/㎖)×OD₆₀₀	촉진율
-	0.030±0.001	29
DnaJ	0.197±0.019	29
J-도메인	0.339±0.007	16
Hsp25	0.053±0.002	27
ScFv옥사졸론(대조군)	0.041±0.003	13

5mM GSH의 존재하에 배양하였다.

실시예 9

pIN III ompA3-dnaJ에 의해 발현된 DnaJ의 페리플라즘내 위치 검출

pIN III ompA3-dnaJ에 의해 발현되어 페리플라즘으로 분비된 DnaJ가 페리플라즘내에 위치하며 완전히 폴딩된 상태로 존재함을 입증하기 위해, 스페로플라스트(Spheroplast)를 제조하였다. 이를 위해, pIN III ompA3-dnaJ를 포함하는 이 콜라이 XLI 블루(blue) 세포를 정지기까지 예비배양한 후, 이 예비배양물을 100㎍/㎖의 암피실린(디센호펜 소재의 시그마)을 함유하는 LB 배지(1ℓ의 LB 배지당 10g의 박토(Bacto)-트립톤(미국 미시간주 디트로이트 소재의 디프코 팩토리즈(Difco Factories)), 5g의 효모(디프코 팩토리즈) 및 5g의 NaCl(칼스루헤 소재의 로트 게엠베하)을 함유함)로 1:50의 비로 희석하고, 200rpm 및 37℃에서 2.75 시간 동안 배양한 후(OD_600nm=약 0.5), 1mM의 IPTG로 유도시켰다. 유도제의 존재하에 3시간 동안 생육시킨 후에, 세포를 원심분리하여 수확하였다(에펜도르프 마이크로원심분리기, 5000rpm, 5분). DnaJ를 세포내로 대량발현시키는 플라스미드를 함유하는 이 콜라이 균주를 대조군으로서 배양하고 3시간 동안 유도시켰다. 원심분리한 후에 수득한 세포 펠렛으로부터 하기 절차에 따라 스페로플라스트를 제조하였다.

OD₆₀₀=1에 상응하는 2㎖의 박테리아 등가물을 토르스텐슨(Thorstenson) 등의 문헌[J. Bacteriol.,179,5333-5339, 1997]에 따라 분획화시켰다. 펠렛으로 축적된 스페로플라스트를 100mM의 NaCl을 함유하는 50mM Tris/HCl(pH 8.0) 30㎕에 녹였다. 대조군으로서, 상기 스페로플라스트를 0.1% 트리톤(Triton, 등록상표)-X-100(미국 오하이오주 솔론 소재의 암레스코(Amresco))이 첨가된 것을 제외하고는 상기와 동일한 완충액에 녹였다. 이후에 각각의 스페로플라스트 제조물(트리톤-X-100이 존재하거나 존재하지 않음) 15㎕를 1㎎/㎖ 트립신(독일 소재의 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)) 2㎕, 및 100mM NaCl을 함유하는 50mM Tris/HCl(pH 8.0) 23㎕와 혼합하고 20℃에서 항온처리하여 트립신으로 제한적으로 단백질 가수분해시켰다. 0, 5 및 30분 후에, 8㎕의 샘플을 취하여 4㎎/㎖ 대두-트립신 저해제 2㎕ 및 SDS-PAGE 적용 완충액(4% 글리세롤(디센로펜 소재의 시그마), 0.5% SDS(ICN), 2% 메르캅토에탄올(시그마), 0.0625M Tris/HCl(pH 8.0) 및 브로모페놀 블루(시그마)) 3㎕와 혼합하고 5분간 비등시켰다. 대조 실험으로서, 2㎍의 정제된 DnaJ(2㎍/㎕)를 100㎍/㎖ 트립신 1㎕, 및 100mM NaCl을 함유하는 50mM Tris/HCl(pH 6.8) 14㎕와 혼합하고 20℃에서 항온처리한 후, 상기 시간 때에 단백질 가수분해를 종결시켰다. 단백질 가수분해 생성물은 래믈리(Lammli) 등의 문헌[Nature,227, 680-685, 1970]에 따라 SDS-PAGE하여 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막(무니히 소재의 바이오라드 래버러토리즈(BioRad Laboratories))(카이스-앤더슨(Khyse-Anderson)의 문헌[J. Biochem. Biophys. Methods,10, 203-207, 1984]; 토우빈(Towbin) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 267-271, 1979] 참조)상으로 옮겼다. 이 막을 하룻밤 동안 TBS-5% 우유 분말(글뤽스클리(Glucksklee), 독일 프랑크푸르트 소재의 네슬레(Nestle))로 블로킹시킨 후, 이어서 2시간 동안 TBS-5% 우유 분말내 항-DnaJ 항체로 피복시켰다. TBS에서 매회 5분간 3회 세척한 후에, 상기 막을 TBS-5% 우유 분말내 또다른 항체(항-토끼-IgG 퍼옥시다제, 브라운슈바이크(Braunschweig) 소재의 아머샴 라이프 사이언시즈(Amersham Life Sciences))로 1.5시간 동안 항온처리하고, 다시 TBS 완충액으로 5회 세척하였다. 아머샴 회사로부터 구입한 ECL 웨스턴 블로팅 검출 키트를 사용하여 검출하였다. 그 결과를 도 1에 도시하였다. 분비된 샤프론이 스페로플라스트를 제조한 후에 프로테아제에 민감해진 것으로 보아, 샤프론이 내측막의 페리플라즘 쪽에 위치함을 알 수 있다. 대조적으로, 세포내 DnaJ는 스페로플라스트 제조 후에도 여전히 프로테아제로부터 보호된다. 트리톤-X-100에 의해 트립신이 스페로플라스트를 투과할 수 있게 하면, 트립신에 의한 세포내 DnaJ의 분해가 일어난다. 페리플라즘에서 발현된 DnaJ의 절단 패턴은 정제된 네이티브 DnaJ의 절단 패턴과 동일하다. 따라서, 이는 페리플라즘에서 발현된 DnaJ가 페리플라즘내에서 그의 네이티브 형태로 존재함을 입증하는 것이다.

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본 발명에 의해, 원핵생물에서 진핵생물 유래의 단백질을 샤프론과 함께 공동발현시킴으로써, 봉입체의 용해, 환원 및 재생과 같은 수고스러운 후처리를 행하지 않고도 간단한 방식으로 상기 단백질을 원핵생물의 페리플라즘내에서 자연적으로 폴딩된 수용성 단백질로서 생산할 수 있다.

Claims

디설파이드 가교결합에 의해 연결된 2개 또는 수개의 시스테인을 포함하고, 자연적으로 폴딩(folding)된 진핵생물 유래 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,

(a) N-말단에 원핵생물 유래의 신호 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 원핵세포를 배양하고, (b) 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘(periplasm) 또는 배지로 분비시키고, (c) 상기 신호 서열을 절단한 후 상기 폴리펩타이드를 페리플라즘 또는 배지로부터 단리시키며, 또한 상기 원핵세포에서 분자 샤프론(chaperone)을 암호화하는 핵산을 추가로 발현시키고 상기 샤프론을 페리플라즘으로 분비시키는 것으로 이루어지되, 단 상기 배양이 아르기닌 또는 하기 화학식 1의 화합물의 존재하에 수행되는 경우는 제외되는 방법:

화학식 1

R₂-CO-NRR₁

상기 식에서,

R 및 R₁은 수소 또는 포화되거나 포화되지 않은 분지 또는 비분지 C₁-C₄알킬쇄이고,

R₂는 수소, NHR₁또는 포화되거나 포화되지 않은 분지 또는 비분지 C₁-C₃알킬쇄이다.
제 1 항에 있어서,

작은 열 쇼크 단백질(small heat shock protein; sHsp 유형) 또는 약 40kDa의 분자량을 갖는 열 쇼크 단백질(Hsp40 유형)을 사용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

영양소 배지에 환원형 티올 시약을 첨가하는 방법.
제 3 항에 있어서,

환원형 티올 시약으로서 글루타치온(GSH)을 사용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

신호 서열이 그람(Gram)-음성 박테리아로부터 유래하는 방법.
제 1 항에 있어서,

분자 샤프론을 암호화하는 핵산 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 2개의 별도 벡터상에 위치하는 방법.
제 1 항에 있어서,

분자 샤프론을 암호화하는 핵산이 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 동일 발현 벡터상에 위치하는 방법.
제 7 항에 있어서,

분자 샤프론을 암호화하는 재조합 DNA가, 박테리아 내측막을 통과할 수 있도록 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편과 작동적으로 연결되어 있는 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,

분비된 분자 샤프론 및/또는 분비된 단백질을 암호화하는 DNA가 유도성 발현 신호의 제어하에 있는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

폴리펩타이드가 항체, 항체 단편, 인터페론, 단백질 호르몬 또는 프로테아제인 방법.