MXPA00007339A - PROCESO PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS PLEGADAS Y SEGREGADAS DE FORMA NATURAL POR LA CO-SECRECION DE ACOMPAnANTES MOLECULARES. - Google Patents

Abstract

Un proceso para la produccion de un polipeptido eucariotico plegado de forma natural que contiene dos o varias cisteinas enlazadas por puentes de disulfuro al a ) cultivar celulas procarioticas en las cuales las celulas procarioticas contienen un vector de expresion que codifica para el polipeptido que contiene una secuencia de senal procariotica en el N- termino, b) segregar el polipeptido en el periplasma o en el medio, c) escindir la secuencia de senal y aislar el polipeptido a partir del periplasma o el medio, que se caracteriza en que un acido nucleico que codifica para un acompanante molecular se expresa adicionalmente en la celula procariotica y el acompanante se segrega en el periplasma, es adecuado para la produccion recombinante de polipeptidos en procariotas en un alto rendimiento.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS PLEGADAS Y SEGREGADAS DE FORMA NATURAL POR LA CO-SECRECIÓN DE ACOMPAÑANTES MOLECULARES La invención se refiere a un proceso para la producción de polipéptidos segregados y plegados de forma natural, solubles en agua, después de la expresión en células procarióticas mediante la co-secreción de acompañantes o chaperones moleculares. ' La síntesis de proteínas en organismos procarióticos, que también se llama traducción, toma lugar en los ribosomas en el citoplasma. Cuando el ADN recombinante se expresa en organismos hospedadores, procarióticos, frecuentemente es deseable segregar el producto génico recombinante o proteina que se obtiene en este proceso a partir del citoplasma mediante la membrana bacteriana inferior en el espacio periplasmático entre la membrana interior . y exterior. Las proteínas segregadas luego se pueden liberar del periplasma hacia el medio nutriente, por ejemplo, por un choque osmótico. Una desventaja de este proceso es que los polipéptidos segregados frecuentemente no forman la conformación biológicamente activa, nativa (Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456-463) .

REF.: 121531 Recientemente, los acompañantes moleculares y catalizadores de plegado tal como las peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas o disulfuro-isomerasas proteicas (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) se han usado para incrementar el rendimiento de la proteina recombinante, nativa cuando se pliega in vivo (Thomas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 66 (1997) 197-238). En algunos casos, esto ha conducido a mejoras considerables en la expresión de por ejemplo, ribulosa-bisfofato-carboxilasa (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature 337 (1989) 44-47), pro-colagenasa humana (Lee & Olins, J. Biol. Chem. 267 (1992) 2849-2852) u óxido de nitrógeno-sintasa neuronal a partir de ratas (Román et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428-8432) . En estos ejemplos, GroEL/ES o el sistema DnaK a partir de E . col i se co-sobre-expresó en el citosol. La co-expresión de los acompañantes o chaperones también se ha examinado cuando se segregan proteínas recombinantes en el periplasma de E . col i . Sin embargo, en este caso únicamente se evaluó una sobre-expresión citosólica de los acompañantes a fin de optimizar la secreción en el periplasma ( Perez-Perez-et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524-529; Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258-264; Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55-60) . Intentos previos en la co-secreción en E . col i se han enfocado en proteínas auxiliares del plegado tal como por ejemplo la disulfuro-isomerasa proteica (PDI; Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) o las peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas , proteínas Dsb (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77-83; Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol. 64 (1998) 4891-4896 y Schmidt et al., Prot. Engin. 11 (1998) 601-607) ó proteina . S kp (Hayhurst y Harris, Protein Expr. Purif. 15 (1999) 336-343) . El objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de polipéptidos eucarióticos, naturalmente plegados, solubles en agua, después de la expresión en procariotas que se puede llevar a cabo de una manera simple y que no requiere un tratamiento posterior in vi tro , laborioso tal como disolución de los cuerpos de inclusión, reducción y renaturalización. El objeto se logra por un proceso para la producción de un polipéptido eucariótico naturalmente plegado que contiene dos o varias cisteinas enlazadas por puentes de disulfuro al: a) cultivar células procarióticas en las cuales las células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica para este péptido que contiene una secuencia de señal procariótica en el N-término, b) segregar el polipéptido en el periplasma o el medio, c) escindir la secuencia de señal y aislar el polipéptido a partir del periplasma o el medio en donde un ácido nucleico que codifica para^ un acompañante molecular se expresa de manera adicional en la célula procariótica y el acompañante o chaperón se segrega en el periplasma con la condición de que se realice el cultivo sin la presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I R2-CO-NRR? (I), en la cual R y R± representan hidrógeno o una cadena de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ramificada o no ramificada, saturada o no saturada, y R2 representa hidrógeno, NHRl o una cadena de alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, ramificada o no ramificada, saturada o insaturada. En este proceso, se prefiere que el acompañante esté sobreexpresado . En una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención, los reactivos de tiol reductores que contienen grupos SH se adicionan, .además, al medio nutriente (medio de fermentación) usado para cultivar las células procarióticas lo que incrementa adicionalmente el rendimiento de la proteina recombinantemente producida. Se adicionan de manera preferente 0.1-15 mmol/1 de reactivo de tiol. De acuerdo con la invención, el término "reactivo de tiol" significa ya sea un reactivo de tiol reductor (reducido) con grupos SH o una mezcla de reactivos de tiol reductores con grupos SH y reactivos de tiol oxidantes con grupos de disulfuro. Las substancias preferidas son glutationa reducida (GSH), cisteina, N-acetilcisteina, cisteamina, ß-mercaptoetanol y compuestos similares. Los reactivos de tiol se pueden usar de manera individual asi como en mezclas. Los reactivos de tiol tal como glutationa (GSH) que tienen un grupo SH individual por molécula son particularmente adecuados. Los reactivos de tiol tal como glutationa se conoce que mejoran el rendimiento -de las proteínas plegadas de forma nativa cuando el ADN recombinante se expresa en células procarióticas (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) .

Los acompañantes o chaperones se entienden de acuerdo con la invención como proteínas que protegen otras proteínas no nativas de la agregación in vivo y promueven la formación de su conformación nativa (revisiones: Silver y Way, Cell 74 (1994) 5-6 y Cyr et al., TIB'S 19 (1994) 176-181) . Los acompañantes moleculares se usan en la técnica anterior para estabilizar proteínas y de esta manera para protegerlas de la agregación e inactivación (Buchner et al., EP-A 0 556 726 Al).

Los acompañantes dependientes de ATP del tipo HSP40 (masa molecular aproximadamente 40 kDa) o una proteina de choque térmico, pequeña (sHSP) se usan de manera preferente. La DnaJ es una proteina de choque térmico de 40 kDa que se presenta en el citoplasma de E . coli y es una parte del llamado sistema acompañante Hsp70 (Bukau, B & Horwich, A., Cell 92 (1998) 351-366) . La DnaK (Hsp70) y la GrpE también corresponden a este sistema. Las proteínas particulares se pliegan en la conformación nativa por el sistema DnaK en un proceso dependiente de ATP (Schróder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144; Langer et al., Nature 356 (1992) 683-689). Este sistema requiere adicionalmente ATP para re-plegar las proteínas desnaturalizadas. La DnaJ protege a las proteínas no nativas de la agregación también en la ausencia de DnaK y ATP y media un estado competente con el plegado (Schroder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144). La co-segregación de un fragmento" N-terminal de DnaJ que comprende los aminoácidos 1-108 y en lo siguiente se refiere como el dominio J (Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227) se prefiere de manera adicional. Los dominios J y un dominio rico en G/F que son responsables de las interacciones con DnaK se localizan en esta región (Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139-2144) . Se ha mostrado que la co-expresión de DnaJ en el citosol puede conducir a un incremento en el rendimiento de la proteina soluble (Yokoyama et al,. Microbiol. Ferment . Technol. 62 (1998) 1205-1210) . La Hsp25 (por ejemplo del ratón) es un representante de las proteínas de choque térmico, pequeñas (sHsps; Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209-213) que son una clase omnipresente de los acompañantes. La masa molecular de estas proteínas está entre 15 y 30 kDa. Durante el choque térmico, existe una acumulación substancial de sHsps en la célula (hasta 1 % de la proteina celular total -Arrigo & Landry (1994), In Morimoto (Ed.) : The Biolog.y of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373) . Tal como las proteínas DnaJ, la sHsps tiene la propiedad de prevenir la agregación de las proteínas no nativas y de mantener a éstas en un estado competente para el plegado (Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517-1520; Ehrnsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221-229) . Todas las sHsps tienen regiones que son homologas a las proteínas eucarióticas de los lentes oculares, aA y aB-cristalina que, a su vez, son miembros de la familia sHsps (Jakob y Buchner, TIBS 19 (1994) 205-211) . El término "sobreexpresión" de acuerdo con la presente invención significa un incremento de la expresión de las proteínas segregadas tal como por ejemplo DnaJ y Hsp25 (de manera preferente por al menos 100 %) en comparación a la expresión en el tipo silvestre del organismo hospedador, procariótico, respectivo. Esta sobreexpresión por ejemplo se puede lograr cuando los genes (para la proteina, acompañante y/o péptido de señal) están bajo el control de una señal de expresión, procariótica, fuerte, preferentemente inducible (por ejemplo de un promotor T7 ó lac o un derivado del mismo) . La construcción de secreción para la sobreexpresión de los péptidos (proteínas) incluyendo regiones reguladoras (promotora y ter inadora) en el ADN recombinante se integra de manera preferente en un vector que codifica de manera adicional para la arginina-ARNtAGA/AGG gue es raro en procariotas o se co-expresa con un vector que codifica para este ARNt (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114) . Esto permite la co-sobreexpresión de las proteínas respectivas en el periplasma bacteriano asi como la trascripción del raro ARNtArgAGA/AGG, que da por resultado una síntesis incrementada de lá proteina deseada en el organismo hospedador, bacteriano. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido y el acompañante o chaperón se puede localizar en un vector o en dos vectores separados. Una secuencia de señal procariótica en el sentido de la invención se entiende como un fragmento de ácido nucleico que se deriva a partir de procariotas, preferentemente a partir de bacterias gram-negat ivas , y asegura que las proteínas unidas al péptido de señal puedan penetrar a través de la membrana bacteriana, inferior. Como resultado, las proteínas se localizan en el periplasma o en el sobrenadante celular. Estas secuencias de señal tienen usualmente una longitud de 18-30 aminoácidos y se describen por ejemplo en Murphy & Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli y en Neidhardt et al. (editores) : Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, vol., ASM Press, Washington, 1996, p. 967-978. La escisión de las secuencias de señal bacterianas puede presentarse por ejemplo después de una secuencia Ala-X-Ala (von Heijne et al., J. Mol. Biol. 184 (1985) 99-105) . La estructura de la peptidasa de señal bacteriana ' se describe en Paetzel et al., Nature 396 (1998) 186-190. Las secuencias de señal se usan preferentemente ya que se escinden nuevamente de la proteina deseada por proteasas localizadas en el periplasma de las células procariotas. De manera alternativa, estas proteasas se pueden adicionar al sobrenadante celular o a la proteina aislada para escindir la secuencia de señal. El proceso de acuerdo con la invención puede mejorar la expresión heteróloga de numerosas proteínas eucarióticas tal como por ejemplo proteasas; interferones, hormonas proteicas, anticuerpos o fragmentos de los mismos. El proceso es particularmente adecuado para la producción heteróloga de proteínas que contienen al menos dos cisteinas enlazadas por un puente de disulfuro en su estado nativo; especialmente cuando no tienen la secuencia de señal procariótica fusionada en el N- término y se forman cuerpos de inclusión insolubles durante su expresión procariótica. El proceso es particularmente adecuado para proteínas que contienen más de 5 puentes de disulfuro en el estado nativo. Esta proteina por ejemplo es un activador de plasminógeno, recombinante (referido como rPA en lo siguiente, Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299-311, Patente de los Estados Unidos No. 5,223,256). El rPA tiene 9 puentes de disulfuro que no se forman en el citosol reductor de E . col i . La localización periplasmática de la proteina y del acompañante se asegura por "enlace -operativo" con un péptido de señal para penetrar las membranas bacterianas, interiores. A fin de aislar la proteina rPA secretoria en una forma funcional en E . col i , el gen para esta proteina a partir del plásmido pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1993) 93-100) se fusionó por métodos de ingeniería genética a una secuencia de señal procariótica de bacterias gram-negativas, por ejemplo a la secuencia de señal de pectato-liasa B (PelB) de Erwini sa ca ro t ovora . La fusión génica se construyó por ' clonación en el vector pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, EUA). Como resultado, la expresión génica está bajo el control del promotor T7. La secuencia de señal presente en la proteina de fusión provoca secreción en el periplasma. La secuencia de señal se escinde antes o después de la secreción por una peptidasa localizada en la membrana interior. La proteina segregada puede plegarse en el periplasma. Las condiciones oxidantes en este compartimiento permiten la formación de puentes de disulfuro (Wülfing y Plückthun, Mol. Microbiol. 12 (1994) 685-692) . La co-sobreexpresión simultánea de DnaJ, del dominio J o Hsp25 en el periplasma permite que se incremente el rendimiento de la proteina funcional por cerca de 5 a 10 veces (Tabla 1) . Los siguientes ejemplos, publicaciones, el listado de secuencias y las figuras ponen en claro de manera adicional la invención, el alcance protector de la cual resulta de las reivindicaciones de la patente. Los métodos descritos se van a entender como ejemplos que aún describen la materia de la invención aún después de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-dnaJ que codifica para la proteina de fusión compuesta de' la secuencia de señal OmpA y DnaJ conjuntamente con las secuencias reguladoras (promotora, terminadora) , que se amplificó a partir de pNI III ompA3-dnaJ . La SEQ ÍD NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión OmpA-DnaJ. La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-J-dominio que codifica para la proteina de fusión compuesta de la secuencia de señal OmpA y el dominio J junto con las secuencias reguladoras (promotora, terminadora) que se amplificó a partir de pIN III ompA3-dnaJ. La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión OmpA-J-dominio .

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25 que codifica para la proteina de fusión compuesta de la secuencia de señal OmpA y Hsp25 junto con las secuencias reguladoras (promotora, terminadora) que se amplificó a partir de pIN III ompA3-hsp25. La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión OmpA-Hsp25. La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-ScFvOx que codifica para la proteina de fusión compuesta de la secuencia de señal PelB y ScFvOxazolon junto con las secuencias reguladoras (promotora, terminadora) que se amplificó a partir de pHEN-ScFv o pIN III ompA3. La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión PelB-scFvoxazolon . La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de la parte del plásmido de expresión pET20b ( + ) -rPA que codifica para la proteina de fusión compuesta de la secuencia de señal PelB y rPA. La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión PelB-rPa.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una transferencia Western de la proteólisis limitada de la DnaJ expresada de manera periplasmática y citosólica con 50 µg/ml de tripsina para detectar la ubicación celular y el pliegue nativo de la proteina. Las normas de peso molecular se aplicaron a la izquierda y derecha. Como un control, se sometió la DnaJ purificada (izquierda) al mismo procedimiento pero usando 6.25 µg/ml de tripsina. La Figura 2 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-dnaJ. La Figura 3 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-J-Dominio . La Figura 4 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25. La Figura 5 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-ScFvOx. La Figura 6 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pET20b(+)-rPA.

General : Para la sobreexpresión periplasmát ica de DnaJ, el dominio J y Hsp25 e E . col i , el ADN que codifica para estas proteínas se fusionó por ingeniería genética a la secuencia de señal de la proteina A de membrana exterior (OmpA) de E . col i y la fusión se expresó en E . col i en un plásmido recombinante bajo el control del promotor lac-lpp. Como resultado, la cadena polipeptidica de DnaJ y Hsp25 se transportaron hacia el periplasma del organismo hospedador procariótico y se plegaron nativamente ahi. Su ubicación y pliegue nativo del DNAJ se demostró por proteólisis limitada con tripsina y por transferencia Western.

Ej emplo 1 : Construcción del plásmido de expresión pIN III ompA3-dnaJ Las técnicas genéticas moleculares se basaron en Ausubel et al., (ed.), J. Wiley & Sons, 1997, Curr. Protocols of Molecular Biology. Los oligonucleótidos se obtuvieron a partir de las compañías MWG Biotech, Ebersberg o GIBCO Life Sciences, Eggenstein, GER. El gen que codifica para DnaJ, Número de Acceso del Gene Bank M 12565, se clonó por medio de los sitios de restricción EcoRI y BamHI en el plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442) . La secuencia del fragmento de PCR clonado se verificó por secuenciación con didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) . El plásmido resultante se nombró pIN III ompA3-dnaJ. La secuencia de la DnaJ expresada en el periplasma difiere de aquella de la proteina tipo silvestre ya que la secuencia polipeptidica empieza con Gly-Ile- Pro en lugar dé Met, por lo tanto hubo una extensión N-terminal de 2 aminoácidos. Aqui, DnaJ, está bajo el control del promotor lac-lpp que se induce con IPTG ( isopropil-ß-D-tiogalactósido ) .

Ej emplo 2 : Construcción del plásmido de expresión pUBS520-pIN--dnaJ La región del plásmido pIN III ompA3-dnaJ que codifica para el operón lac-lpp, la secuencia de señal, el gen dnaJ y la región terminadora del operón se amplificó por medio de PCR (SEQ ID NO: 1) . El producto de PCR se escindió con la endonucleasa de restricción Bglll y se clonó en el vector pUBS520 linealizado con la endonucleasa de restricción BamHI . El plásmido resultante se nombró pUBS520-pIN-dnaJ (Figura 2) .

Ej emplo 3 : Construcción del plásmido de expresión pUBS520-pIN-J-Dominio Se insertaron dos codones finali zadores en el plásmido pUBS520-pIN-dnaJ después del nucleótido 324 por medio del sistema de mutagénesis QuikChange (Promega, Mannheim, DE) de modo que sólo se expresan los 108 aminoácidos. La secuencia de la región mutagenizada se determinó por secuenciación con didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) y la expresión del fragmento de proteina cortado se detectó por transferencia Western y la detección con un anticuerpo anti-DnaJ. El plásmido que se formó se nombró pUBS520-pIN-J-dominio (Figura 3) .

Ej emplo 4 : Construcción del plásmido de expresión pIN III ompA3-hsp25 El gen que codifica para Hsp25, Número de Acceso del Gene Bank: L 07577, se clonó por medio de los sitios de incisión por restricción EcoRI y BamHI en el plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442) . La secuencia del fragmento de PCR clonado se verificó por secuenciación con didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) . El plásmido resultante se nombró pIN III ompA3-hasp25. La secuencia de la Hsp25 expresada en el periplasma difiere de aquella de la proteina tipo silvestre ya que la secuencia polipeptidica empieza con Gly-Ile-Leu en lugar de Met, por lo tanto hubo una extensión N-terminal de 2 aminoácidos. Por lo tanto, Hsp25 está bajo el control del promotor lac-lpp que se indujo con IPTG ( isopropil-ß-D-t iogalactósido ) .

Ej emplo 5 : Construcción del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25 La región del plásmido pIN III ompA-hsp25 que codifica para el operón lac-lpp, la secuencia de señal, el gen hsp25 y la región terminadora del operón se amplificó por medio de PCR (SEQ ID NO: 5) . El producto de PCR se escindió con la endonucleasa de restricción Bglll y se clonó en el vector pUBS520 linealizado con la endonucleasa de restricción Ba HI . El plásmido resultante se nombró pUBS520-pIN-hsp25 (Figura 4) .

Ejemplo 6: Construcción del plásmido de expresión pUBS520- ScFvOx La co-expresión de un fragmento Fv de cadena individual que se dirige contra el hapteno oxazolon ( ScFvOxazolon; Fiedler y Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090-1093) que no tiene propiedades de acompañantes se examinó como un control negativo. La región del plásmido pHEN-ScFvOx que codifica para el promotor lac, la secuencia de señal pelB y el gen scfvox se amplificó por medio de PCR. La región del plásmido pIN III ompA3 que codifica para el terminador lpp se amplificó en una segunda PCR. Los dos fragmentos se fusionaron en una PCR subsecuente. El producto de PCR (SEQ ID NO: 7) que se formó de esta manera se escindió con la endonucleasa de restricción Bglll y se clonó en el vector pUBS520 que se linealizó con la endonucleasa de restricción BamHI. El plásmido resultante se nombró pUBS520-ScFvOx (Figura 5) .

Ej emplo 7 : Construcción del plásmido de expresión pET20b(+)-rPA El gen de un activador de plasminógeno (rPA) del vector de plásmido (pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) se amplificó con la ayuda de un método de PCR. El producto de PCR se escindió con las endonucleasas de restricción Ncol y BamHI y se clonó en el vector de plásmido pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, EUA).

El plásmido codifica para una proteina de fusión que está compuesta de la secuencia de señal de PelB (pectato-liasa a partir de Erwini a ca ro t ova ) y rPa y la secreción de rPA en el periplasma se verificó por secuenciación con didesoxi (LiCor Dna-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE) . La construcción se nombró pET20b ( + ) -rPa (SEQ ID NO: 10) (Figura 6) . El rPA se expresa en el plásmido bajo el control del promotor T7, la T7-ARN-polimerasa en la cepa de E . col i BL21(DE3) que está bajo el control del promotor lacUV5. La inducción se llevó a cabo al adicionar IPTG. El rPA expresado en el periplasma difiere del activador de plasminógeno descrito por Kohnert et al. ya que el segundo aminoácido (Ser) está substituido por Ala.

Ej emplo 8 : Expresión funcional de rPA en el periplasma de E , coli Un cultivo estacionario, nocturno de células BL21(DE3) de E . col i (Studier & Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130) que contuvo pET20b (+) -rPA y pUBS520-pIN-dna J ( co-expresión de DnaJ), un cultivo nocturno de células BL21(DE3) de E . col i que contuvo pET20b ( + ) -rPA y pUBS520-pIN-J-dominio (co-expresión del dominio J) , un cultivo nocturno de células BL21(DE3) de E . col i que contuvo pET20b (+) -rPA y pUBS520-pIN-hsp25 (coexpresión de Hsp 25), un cultivo nocturno de células BL21(DE3) de E . col i que contuvo pET20b(+)-rPA y pUBS520-ScFvOx (co-expresión de ScFvOx) , un cultivo nocturno de células BL21(DE3) de E . col i que contuvo pET20b ( + ) -rPA y pUBS520 (cultivo de control), se dividió en una relación de 1:50 en 100 ml del medio LB que contiene ampicilina (100 µg/ml) y canamicina (50 µg/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, GER) y se agitó a 24°C y 170 rpm. Después de 3 horas de crecimiento, se adicionaron alícuotas de 5 ml de cultivo a 10 ml del medio LB que contiene las cantidades de ampicilina y canamicina mencionadas con anterioridad y GSH 5 mM (Fluka, GER) y cada una se indujo con IPTG 1 mM ( isoporpil-ß-D-tiogalactósido, AppliChem, Darmstadt, GER). Las células se agitaron durante 21 horas adicionales a 24°C y 170 rpm y se tomó una muestra de 1 ml después de determinar la OD60o- Estas muestras celulares de 1 ml se fraccionaron en recipientes de reacción Eppendorf de 2 ml por un protocolo modificado de acuerdo a Jacobi et al, (J. Biol. -Chem. 272 (1997) 21692-21699) . En detalle, se adicionaron 500 µl de amortiguador de fraccionamiento (NaCl 150 mM (Roth GmbH) , Tris/HCl 50 mM (Roth GmbH, EDTA 5 mM (Biomol) y 1 mg/ml de sulfato de polimixina B (Sigma), pH 7.5) al sedimento celular, se agitó durante 1 hora a 10°C en un termoagitador Eppendorf a 1400 rpm y luego se centrifugó 15 minutos a 14,000 rpm en una microcentrifuga Eppendorf enfriada a 10°C para formar una fracción que contiene las proteínas poliplasmáticas solubles (sobrenadante) y una fracción residual (sedimento) . La actividad de rPA se determinó esencialmente de acuerdo con el método de Verheijen et al., Thromb. Haemostasis 48 (1982) 266-269) . Todas las concentraciones determinadas de rPA en los extractos celulares se estandarizaron a suspensiones celulares de ODTOO = 1 a fin de corregir el error que se presenta cuando se mide en diferentes amortiguadores. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Efecto de la co-secreción de acompañantes o chaperones moleculares en la formación de rPA nativo en el. periplasma de E . col i en la presencia de GSH 5 mM en el medio de fermentación El cultivo se llevó a cabo en la presencia de GSH 5 mM .

Ej emplo 9 : Detección de la ubicación periplasmática de DnaJ que se expresó por medio de pIN III ompA3 Se prepararon esferoplastos a fin de probar la ubicación periplasmática y el correcto plegado de DnaJ que se segregó en el periplasma por medio de pIN III ompA3-dnaJ. Para esto, células XLI-blue de E . col i que contienen pIN III ompA3-dnaJ se diluyeron en 1:50 a partir de un pre-cultivo estacionario del medio LB (1 litro del medio LB contiene 10 g de Bacto-triptona (Difco Factories, Detroit, Michigan, EUA), 5 g de levadura (Difco Factories) y 5 g de NaCl (Roth GmbH, Karlsruhe) que contiene 100 µg/ml de ampicilina (Sigma, Deisenhofen) , cultivadas a 37°C y 200 rpm e inducida después de 2.75 h (ODeoo aproximadamente 0.5) con IPTG. Después de 3 horas de crecimiento en la presencia del inductor, las células se recolectaron por centrifugación (microcentrifuga Eppendorf, 5000 rpm, 5 min) . Una cepa de E . col i que contiene un plásmido para la sobreexpresión intracelular de DnaJ se cultivó como un control e indujo durante 3 horas. Los esferoplas tos se prepararon como sigue a partir de los sedimentos celulares obtenidos después de la centrifugación: El equivalente de 2 ml de bacterias que corresponde a una OD6oo de 1 se fraccionaron de acuerdo con Thorstenson et al, J. Bacteriol. 179 (1997) 5333-5339. Los esferoplas tos que se acumulan como un sedimento se toman en 30 µl de Tris/HCl 50 mM, pH 8.0 que contiene NaCl 100 mM .

Como un control, se tomaron los esferoplastos en el mismo amortiguador pero con la adición de TritonR-X-100 al 0.1 % (Amresco, Solón, Ohio, EUA) . Para una proteólisis limitada, subsecuente con tripsina, se mezclaron 15 µl de la preparación de esferoplasto, respectiva (con o sin TritonR-X-100 ) con 2 µl de tripsina 1 mg/ml (Roche Diagnostics, GmbH, GER) y 23 µl de Tris/HCl 50 mM, pH 8.0 que contiene NaCl 100 mM y se incubó a 20°C. Después de 0, 5 y 30 minutos, se tomaron muestras de 8 µl, se mezclaron con 2 µl de inhibidor de tripsina de soya 4 mg/ml y 3 µl de amortiguador de aplicación SDS-PAGE (glicerol al 4 % (Sigma, Deisenhofen) , SDS al 0.05 % (ICN), mercaptoetanol al 2 % (Sigma), Tris/HCl, 0.0625, pH 6.8 y azul de bromofenol (Sigma)) y se hirvió durante 5 minutos . En un experimento de control, se mezclaron 2 µg de DnaJ purificada (2 µg/µl) con 1 µl de tripsina 100 µg/ml y 14 µl de Tris/HCl 50 mM, pH 8.0, que contiene NaCl 100 mM, se incubó a 20°C y la proteólisis se terminó en los tiempos señalados. Los productos de proteólisis se separaron por SDS-PAGE de acuerdo a Lammli et al., Nature 227 (1970) 680-685) . Las proteínas separadas se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (RioRad Laboratories, Munich) (Khyse-Anderson, J. Biochem. Biophys. Methods 10 (1984) 203-207; To bin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1979) 267-271) . Las membranas se bloquearon durante la noche con TBS-polvo de leche al 5 % (Glücksklee, Nestlé Frankfurt) y se cubrieron subsecuentemente durante 2 horas con anticuerpos anti-DnaJ en TBS-polvo de leche al 5 %. Después de tres pasos de lavado, 5 minutos cada vez en TBS, se incubaron con un anticuerpo adicional (peroxidasa de IgG anti-conejo, Amersham Life Sciences, Braunschweig) en TBS-polvo de leche al 5 % durante 1.5 horas y nuevamente se lavaron 5x con amortiguador de TBS. El equipo de detección de transferencia Western ECL de la Amersham Company se usó para la detección. El resultado se muestra en la Figura 1. Puesto que el acompañante segregado es positivo a la proteasa después de la preparación del esferoplasto esto demuestra que se localiza en el lado periplas ático de la membrana interior. En contraste, la DnaJ intracelular está aún protegida por la proteasa después de la preparación del esferoplasto. La permeabilización de los esferoplastos por Tritón-X-100 conduce a la digestión de la DnaJ intracelular por tripsina. El patrón de escisión de la DnaJ expresada en el periplasma es idéntico a aquel de la DnaJ nativa, purificada. Por lo tanto, esto demuestra que el producto de expresión periplasmático está en una forma nativa en este compartimiento.

Lista de Referencias Arrigo & Landry (1994) In Morimoto (publ.) : The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373 Ausubel et al. (publ.) Current Protocols . in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, 1997 Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55-60 Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109 - 114 Bukau, B. & Horwich, A., Cell 92 (1998) 351-366 Cyr et al., TIBS 19 (1994) 176-181) Ehrnsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221-229 EP-A 0 510 658 EP-A 0 556 726 "Fiedler y Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090 - 1093 Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209-213 Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442 Goloubinoffet al., Nature 337 (1989) 44-47 Hayhurst y Harris, Protein Expr. Purif. 15 (1999) 336-343 Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456 - 463 Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692- 21699 Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517-1520 Jakob y Buchner, TIBS 19 (1994) 205-211 Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227 Khyse-Anderson, J. Biochem. Biophys. Methods 10 (1984) 203-207 Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77-83 Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100 Lammli et al., Nature 227 (1970) 680-685 Langer et al., Nature 356 (1992) 683 - 689 Lee & Olins, J. Biol. Chem.267 (1992) 2849-2852 Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299- 311 Murphy & Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli Neidhardt et al. (publ.): Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Vol. 1, ASM Press, Washington, 1996, S. 967-978 Paetzel et al., Nature 396 (1998) 186 - 190 Perez-Perez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524-529 Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol.64 (1998) 4891 - 4896 Román et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428-8432 Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258-264 Schmidt et al ., Prot . Engin . 11 (1998)601-607 Schroder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144 Silver and Way, Cell 74 (1994) 5-6 Stüdier & Moffat, J. Mol. 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(1591) <400> 1 taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60 ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaact 120 tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataagtgcct 180 tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240 gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360 tcactggaac tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag acá gct ate gcg 412 Ket Lys Lys Thr Ala lie Ala 1 5 att gca gtg gca ctg gct ggc ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att 460 lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Glr. Ala Gly lie 10 15 20 cea gct aag caá gat tat tac gag att tta ggc gtt tcc aaa acá gcg 508 Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu lie Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala gaa gag cgt gaa ate aga aag gcc tac aaa cgc ctg gcc atg aaa tac 556 Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr 40 45 50 55 cac ceg gac cgt aac cag ggt gac aaa gag gcc gag gcg aaa ttt aaa 604 His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys 60 65 70 gag ate aag gaa gct tat gaa gtt ctg acc gac teg caá aaa cgt gcg 652 Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala 75 80 85 gca tac gat cag tat ggt cat gct gcg ttt gag caá ggt ggc atg ggc 700 Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly 90 95 100 ggc ggc ggt ttt ggc ggc ggc gca gac ttc age gat att ttt ggt gac 748 Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp lie Phe Gly Asp 105 110 115 gtt ttc ggc gat att ttt ggc ggc gga cgt ggt cgt caá cgt gcg gcg 796 Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala 120 125 130 135 cgc ggt gct gat tta cgc tat aac atg gag ctc acc ctc gaa gaa gct 844 Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala 140 145 150 gta cgt ggc gtg acc aaa gag ate cgc att ceg act ctg gaa gag tgt 892 Val Arg Gly Val Thr Lys Glu He Arg He Pro Thr Leu Glu Glu Cys 155 160 165 gac gtt tgc cac ggt age ggt gca aaa cea ggt acá cag ceg cag act 940 Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr.Gln Pro Gln Thr 170 175 180 tgt ceg acc tgt cat ggt tet ggt cag gtg cag atg cgc cag gga ttc 988 Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Met Arg Gln Gly Phe 185 190 195 ttc gct gta cag cag acc tgt cea cac tgt cag ggc cgc ggt acg ctg 1036 Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu 200 205 210 215 ate aaa gat ceg tgc aac aaa tgt cat ggt cat ggt cgt gtt gag cgc 1084 He Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His Gly Kis Gly Arg Val Glu Arg 220 225 230 age aaa acg ctg tcc gtt aaa ate ceg gca cgg gtg gac act gga gac 1132 Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys He Pro Ala Giy Val Asp Thr Gly Asp 235 240 245 cgc ate cgt ctt gcg ggc gaa ggt gaa gcg ggc gag cat ggc gca ceg 1180 Arg He Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro 250 255 260 gca ggc gat ctg tac gtt cag gtt cag gtt aaa cag cac ceg att ttc 1228 Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro He Phe 265 270 275 gag cgt gaa ggc aac aac ctg tat tgc gaa gtc ceg ate aac ttc gct 1276 Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro He Asn Phe Ala 280 285 290 295 atg gcg gcg ctg ggt ggc gaa ate gaa gta ceg acc ctt gat ggt cgc 1324 Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu He Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg 300. 305 310 gtc aaa ctg aaa gtg cct ggc gaa acc cag acc ggt aag cta ttc cgt 1372 Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg 315 320 325 atg cgc ggt aaa ggc gtc aag tet gtc cgc ggt ggc gca cag ggt gat 1420 Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp 330 335 340 ttg ctg tgc cgc gtt gtc gtc gaa acá ceg gta ggc ctg aac gaa agg 1468 Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg 345 350 355 cag aaa cag ctg ctg caá gag ctg caá gaa age ttc ggt ggc cea acc 1516 Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr 360 365 370 375 ggc gag cac aac age ceg cgc tea aag age ttc ttt gat ggt gtg aag 1564 Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys 380 385 390 aag ttt ttt gac gac ctg acc cgc taa ggatccggct gagcaacgac 1611 Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg 395 400 gtgaaegeaa tgcgttccga cgttcaggct gctaaagatg acgcagctcg tgctaaccag 1671 cgtctggaca acatggctac taaataccgc aagtaatagt acctgtgaag tgaaaaatgg 1731 cgcacattgt gcgacatttt ttttgtctgc cgtttaccgc tactgcgtca cgcgtaacat 1791 attcccttgc tctggttcac cattctgcgc tgactctact gaaggcgcat tgctggctgc 1851 gggagttgct ccactgctca ccgaaaccgg 1881 <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Pro Ala Lys Gin Asp Tyr Tyr Glu He 20 25 ' 30 Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr 35 40 45 Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu 65 70 75 80 Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala 85 90 95 Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp 100 . 105 110 Phe Ser Asp He Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met 130 135 140 Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Arg Gly Val Thr Lys Glu He Arg 145 150 155 160 He Pro Thr Leu Glu Glu Cys Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys 165 170 175 Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln 180 185 190 Val Gln Met Arg Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His 195 200 205 Cys Gln Gly Arg Gly' Thr Leu He Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cye His 210 215 220 Gly His Gly Arg Val Glu Arg Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys He Pro 225 230 235 240 Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp Arg He Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu 245 250 255 Ala Gly Glu His Gly Ala Pro Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln 260 265 270 Val Lys Gln His Pro He Phe Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys 275 280 285 Glu Val Pro He Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu He Glu 290 295 . 300 Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr 305 310 315 • 320 ' Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val 325 330 335 Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr 340 345 350 Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg Gln Lys Glr. Leu Leu Gln Glu Leu Gln 355 360 365 Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys 370 375 380 Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg 385 390 - 395 <210> 3 <211> 1881 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (392) (790) <400> 3 taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60 ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaatt 120 tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataagtgcct 180 tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240 gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360 tcactggaac tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag acá gct ate gcg 412 Met Lys Lys Thr Ala He Ala 1 5 att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att 460 He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly He 10 15 20 cea gct aag caá gat tat tac gag att tta ggc gtt tcc aaa acá gcg 508 Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu He Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala 25 30 35 gaa gag cgt gaa ate aga aag gcc tac aaa cgc ctg gcc atg aaa tac 556 Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr 40 • 45 50 55 cac ceg gac cgt aac cag ggt gac aaa gag gcc gag gcg aaa ttt aaa 604 His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys 60 65 70 gag ate aag gaa gct tat gaa gtt ctg acc gac teg caá aaa cgt gcg 652 Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala 75 80 ' 85 gca tac gat cag tat ggt cat gct gcg ttt gag caá ggt ggc atg ggc 700 Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly 90 95 100 ggc ggc ggt ttt ggc ggc ggc gca gac ttc age gat att ttt ggt gac 748 Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp He Phe Gly Asp 105 110 115 gtt ttc ggc gat att ttt ggc ggc gga cgt ggt cgt taa tag 790 Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg 120 125 130 gcggcgcgcg gtgctgattt aegetataac atggagctca ccctcgaaga agctgtacgt 850 ggcgtgacca aagagatccg cattccgact ctggaagagt gtgacgtttg ccacggtagc 910 ggtgcaaaac caggtacaca gccgcagact tgtccgacct gtcatggttc tggtcaggtg 970 cagatgcgcc agggattctt cgctgtacag cagacctgtc cacactgtca gggccgcggt 1030 acgctgatca aagatccgtg caacaaatgt catggtcatg gtcgtgttga gcgcagcaaa 1090 acgctgtccg ttaaaatccc ggcaggggtg gacactggag accgcatccg tcttgcgggc 1150 gaaggtgaag cgggcgagca tggcgcaccg gcaggcgatc tgtacgttca ggttcaggtt 1210 aaacagcacc cgattttcga gcgtgaaggc aacaacctgt attgcgaagt cccgatcaac 1270 ttcgctatgg cggcgctggg tggcgaaatc gaagtaccga cccttgatgg tcgcgtcaaa 1330 ctgaaagtgc ctggcgaaac ccagaccggt aagetattec gtatgcgcgg taaaggcgtc 1390 aagtctgtcc gcggtggcgc acagggtgat ttgctgtgcc gcgttgtcgt cgaaacaccg 1450 gtaggectga acgaaaggca gaaacagctg ctgcaagagc tgcaagaaag cttcggtggc 1510 ccaaccggcg ageacaacag cccgcgctca aagagcttct ttgatggtgt gaagaagttt 1570 tttgacgacc tgacccgcta aggatccggc tgagcaacga cgtgaacgca atgcgttccg 1530 acgttcaggc tgctaaagat gacgcagctc gtgetaacca gcgtctggac aacatggcta 1690 ctaaataccg caagtaatag tacctgtgaa gtgaaaaatg gcgcacattg tgcgacattt 1750 tttttgtctg ccgtttaccg ctactgcgtc acgcgtaaca tattecettg ctctggttca 1810 ccattctgcg ctgactctac tgaaggcgca ttgctggctg cgggagttgc tccactgctc 1870 accgaaaccg g 1881 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu lie 20 25 30 Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu He Arg Lys Ala Tyr 35 40 45 Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu He Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu 65 70 75 80 Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ais 85 90 95 Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Phe Ser Asp He Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp He Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Arg Gly Arg 130 <210> 5 <211> 1379 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (392) .. (1090) <400> 5 taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60 ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaatt 120 tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataagtgcct 180 tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240 gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360 tcactggaac tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag acá gct ate gcg 412 Met Lys Lys Thr Ala He Ala 1 5 att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att 460 He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly He 10 15 20 ctc acc gag cgc cgc gtg ecc ttc teg ctg ctg cgg age ceg age tgg 508 Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp 25 30 35 gaa cea ttc cgg gac tgg tac cct gca cac age cgc ctc ttc gat ca 556 Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala His Ser Arg Leu Phe Asp Gln 40 45 - 50 55 gct ttc ggg gtg ecc cgg ttg ecc gat gag tgg teg eag tgg ttc age 604 Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser 60 65 70 gcc gct ggg tgg ecc gga tac gtg cgc ceg ctg ecc gcc gcg acc gcc 652 Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala 75 80 85 gag ggc ecc gcg gcg gtg acc ctg gcc gca cea gcc ttc age cga gcg 700 Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala 90 ' 95 100 ctc aac cga cag ctc .age age ggg gtc teg gag ate cga cag acg gct 748 Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val Ser Glu He Arg Gln Thr Ala 105 110 115 gat cgc tgg cgc gtg tcc ctg gac gtc aac cac ttc gct ceg gag gag 796 Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Glu Gi 120 125 130 135 ctc acá gtg aag acc aag gaa ggc gtg gtg gag ate act ggc aag cac 844 Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val Val Glu He Thr Gly Lys His 140 145 150 35 gaa gaa agg cag gac gaa cat ggc tac ate tet cgg tgc ttc acc cgg 892 Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr He Ser Arg Cys Phe Thr Arg 155 160 165 aaa tac acg ctc cct cea ggt gtg gac ecc acc cta gtg tcc tet tcc 940 Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser 170 175 180 cta tcc cct gag ggc ac ctt acc gtg gag gct ceg ttg ecc aaa gca 988 Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala 185 190 195 gtc acg cag tea gcg gag ate acc att ceg gtt act ttc gag gcc cgc 1036 Val Thr Gln Ser Ala Glu He Thr He Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg 200 205 210 215 gcc caá att ggg ggc cea gaa gct ggg aag tet gaa cag tet gga gcc 1084 Ala Gln He Gly Gly Pro Glu Ala Gly Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala 220 225 230 aag tag gatccggctg agcaacgacg tgaacgcaat gcgttccgac gttcaggctg 1140 Lys ctaaagatga cgcagctcgt gctaaccagc gtctggacaa catggctact aaataccgca 1200 agtaatagta cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg cgacattttt tttgtctgcc 1260 gtttaccgct actgcgtcac gcgtaacata ttcccttgct ctggttcacc attctgcgct 1320 gactctactg aaggcgcatt gctggctgcg ggagttgctc cactgctcac cgaaaccgg 1379 <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gly He Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser 20 25 30 Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala 35 40 45 His Ser Arg Leu Phe Asp Gl'n Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp 50 55 60 Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg 65 70 75 80 Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala 85 90 95 Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val 100 105 110 Ser Glu He Arg Gln Thr Ala Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val 115 120 " 125 Asn His Phe Ala Pro Glu Glu Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val 130 135 140 Val Glu He Thr Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr 145 150 155 160 He Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp 165 170 175 Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val 180 185 190 Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala Val Thr Gln Ser Ala Glu He Thr He 195 200 205 Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg Ala Gln He Gly Gly Pro Glu Ala Gly 210 . 215 220 Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala Lys 225 230 <210> 7 <211> 1256 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (199) (969) <400> 7 gatctggctt tacactttat gcttceggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 60 caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg caaattetat 120 ttcaaggaga cagtcataat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta 180 ctcgcggccc agccggcc atg gcc gag gtc aag ctg cag gag tet ggg gga 231 Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly 1 5 10 ggc tta gtg cag cct gga ggg tcc cgg aaa ctc tcc tgt gca gcc tet 279 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser' Cys Ala Ala Ser 15 20 25 gga ttc act ttc agt age ttt gga atg cac tgg gtt cgt cag gct cea 327 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 gag aag ggg ctg gag tgg gtc gca tat att agt agt ggc agt agt acc 375 Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr He Ser Ser Gly Ser Ser Thr 45 50 55 ate tac tat gca gac acá gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac 423 He Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp 60 65 70 75 aat ecc aag aac acc ctg ttc ctg caá atg acc agt cta agg tet gag 471 Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu 80 85 90 gac acg gcc atg tat tac tgc gca aga gat tac ggg gct tat tgg ggc 519 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly 95 100 105 caá ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea ggt gga ggc ggt tea ggc gga 567 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 110 115 120 ggt ggc tet ggc ggt ggc gga teg gac att gag ctc acc cag tet cea 615 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu Leu Thr Gln Ser Pro 125 130 135 gca ate atg tet gca tet cea ggg gag aag gtc acc atg acc tgc agt 663 Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser 140 145 150 155 gcc agt tea agt gta agg tac atg aac tgg ttc caá tag aag tea ggc 711 Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly 160 165 170 acc tcc ecc aaa aga tgg att tat gac acá tcc aaa ctg tet tet gga 759 Thr Ser Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly 175 180 185 gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tet ggg acc tet tac tet ctc 807 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 190 195 200 acá ate age age atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag 855 Thr He Ser Ser Met Giu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 205 210 215 cag tgg agt agt aat cea ctc act ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag 903 Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 220 225 230 235 ctg aaa cgg gcg gcc gca gaa caá aaa ctc ate tea gaa gag gat ctg 951 Leu Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu 240 245 ' 250 aat ggg gcc gca tag taa ctgagcaacg acgtgaacgc aatgcgttcc 999 Asn Gly Ala Ala 255 gacgttcagg ctgctaaaga tgaegeaget cgtgctaacc agcgtctgga caacatggct 1059 actaaatacc gcaagtaata gtacctgtga agtgaaaaat ggcgcacatt gtgcgacatt 1119 ttttttgtct gccgtttacc gcta'ctgcgt cacgcgtaac atattccctt gctctggttc 1179 accattctgc gctgactcta ctgaaggcgc attgctggct gcgggagttg ctccactgct 1239 caccgaaacc ggagatc 1256 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Escherichia coli <4?0> 8 Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala Tyr He Ser Ser Gly Ser Ser Thr He Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120% 125 Gly Gly Ser Asp He Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala He Met Ser Ala 130 135 140 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 145 150 155 160 Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 165 170 175 Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Ser Met 195 200 205 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn 210 215 220 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala 225 230 235 240 Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 245 250 255 <210> 9 <211> 1137 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1) .. (1137) <400> 9 atg aaa tac ctg ctg ceg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ceg gcg atg gcc atg gct tac caá gga aac agt gac tgc tac 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr 20 25 30 ttt ggg aat ggg tea gcc tac cgt ggc acg cac age ctc acc gag teg 144 Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg G?y Thr His Ser Leu Thr Glu Ser 35 • 40 45 ggt gcc tcc tgc ctc ceg tgg aat tcc atg ate ctg ata ggc aag gtt 192 Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met He Leu He Gly Lys Val 50 55 60 tac acá gca cag aac ecc agt gcc cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat 240 Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His 65 70 75 80 aat tac tgc cgg aat cct gat ggg gat gcc aag ecc tgg tgc cac gtg 288 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val 85 90 95 ctg acg aac cgc agg ctg acg tgg gag tac tgt gat gtg ecc tcc tgc 336 Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys 100 105 110 tcc acc tgc ggc ctg aga cag tac age cag cct cag ttt cgc ate aaa 384 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg He Lys 115 120 125 gga ggg ctc ttc gcc gac ate gcc tcc cac ecc tgg cag gct gcc ate 432 Gly Gly Leu Phe Ala Asp He Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala He 130 135 140 ttt gcc aag cac agg agg teg ecc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc 480 Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly 145 150 155 160 ata ctc ate age tcc tgc tgg att ctc tet gcc gcc cac tgc ttc cag 528 He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln 165 170 175 gag agg ttt ceg ecc cac cac ctg acg gtg ate ttg ggc aga acá tac 576 Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val He Leu. Gly Arg Thr Tyr 180 185 ' 190 cgg gtg gtc cct ggc gag gag gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac 624 Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr 195 200 205 att gtc cat aag gaa ttc gat gat gac act tac gac aat gac att gcg 672 He Val His Lys Glu Phe Asp Asp Aep Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala 210 215 220 ctg ctg cag ctg aaa teg ga't teg tcc cgc tgt gcc cag gag age age 720 Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser 225 230 235 240 gtg gtc cgc act gtg tgc ctt ecc ceg gcg gac ctg cag ctg ceg gac 768 Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp 245 250 255 tgg acg gag tgt gag ctc tcc ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tet 816 Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys Hi's Glu Ala Leu Ser 260 265 270 cct ttc tat teg gag cgg ctg aag gag gc cat gtc aga ctg tac cea 864 Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro 275 280 285 tcc age cgc tgc ac tea caá cat tta ctt aac aga acá gtc acc gac 912 Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp 290 295 300 aac atg ctg tgt gct gga gac act cgg age ggc ggg ecc cag gca aac 960 Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn 305 310 315 320 ttg cac gac gcc tgc cag ggc gat teg gga ggc ecc ctg gtg tgt ctg 1008 Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu 325 330 335 aac gat ggc cgc atg act ttg gtg ggc ate ate age tgg ggc ctg ggc 1056 Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly He He Ser Trp Gly Leu Gly 340 345 350 tgt gga cag aag gat gtc ceg ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac 1104 Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr 355 360 365 cta gac tgg att cgt gac aac atg cga ceg tga 1137 Leu Asp Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro 370 375 <210> 10 <211 378 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 - 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr 20 25 30 Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser 35 40 45 Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met He Leu He Gly Lys Val 50 55 60 Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His 65 70 75 80 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Aep Ala Lye Pro Trp Cys His Val 85 • 90 95 Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys 100 105 110 Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg He Lys 115 120 125 Gly Gly Leu Phe Ala Asp He Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala He 130 f 135 140 Phe Ala ys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly 145 150 155 160 He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln 165 _ 170 - 175 Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr" Val lie Leu Gly Arg Thr Tyr 180 185 190 Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr 195 200 205 He Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala 210 215 220 Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser 225 230 235 240 Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp 245 250 255 Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser 260 265 270 Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Hie Val Arg Leu Tyr Pro 275 280 285 Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp 290 295 300 Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn 305 310 315 320 Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu 325 330 335 Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly He He Ser Trp Gly Leu Gly 340 345 350 Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr 355 360 365 Leu Asp Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro 370 375 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la producción de un polipéptido eucariótico plegado de forma natural que contiene dos o varias cisteinas enlazadas por puentes de disulfuro, caracterizado por: a) cultivo de células procarióticas en el cual las células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica para el polipéptido que contiene una secuencia de señal procariótica en el N-término, b) secreción del polipéptido en el periplasma o en el medio, c) escisión de la secuencia de señal y aislamiento del polipéptido a partir del periplasma o el medio, en donde un ácido nucleico que codifica para un acompañante o chaperón molecular se expresa de manera adicional en la célula procariótica y el acompañante se segrega en el periplasma con la condición de que el ' cultivo se realice sin la presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I R2-CO-NRR1 (I) en la cual R y Ri representan hidrógeno o una cadena de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ramificada o no ramificada, saturada o no saturada, y R2 representa hidrógeno, NHR_ ó una cadena de alquilo de 1 a 3 átomos de carbono ramificada o no ramificada, saturada o insaturada.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa una proteina de choque térmico, pequeña (tipo sHsp) o una proteina de choque térmico con una masa molecular de 40 kDa (tipo Hsp40) .

3. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se adicionó a un reactivo de tiol reductor al medio nutriente .

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se usa glutationa (GSH) como el reactivo de tiol reductor.

5. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia de señal se deriva de las bacterias gram-negativas .

6. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para el acompañante molecular y el ácido nucleico que lo codifica para el polipéptido se localizan en dos vectores separados .

7. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para el acompañante molecular se localiza en el vector de expresión que también contiene el ácido nucleico que codifica para el polipéptido.

8. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 6 -ó 7, caracterizado porque el ADN recombinante que codifica para el acompañante celular es un enlace operativo con un fragmento de ADN que codifica para un péptido de señal para penetrar la membrana bacteriana, interior.

9. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el ADN que codifica para el acompañante celular, segregado, y/o para la proteina segregada está bajo control de una señal de expresión inducible.

10. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, interferón, hormona proteica o una proteasa. PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS PLEGADAS Y SEGREGADAS DE FORMA NATURAL POR LA CO-SECRECIÓN DE ACOMPAÑANTES MOLECULARES RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un proceso ,para la producción de un polipéptido eucariótico plegado de forma .natural que contiene dos o varias cisteinas enlazadas por puentes de disulfuro al a) cultivar células procarióticas en las cuales las células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica para el polipéptido que contiene una secuencia de señal procariótica en el N-término, b) segregar el polipéptido en el periplasma o en el medio, c) escindir la secuencia de señal y aislar el polipéptido a partir del periplasma o el medio, que se caracteriza en que un ácido nucleico que codifica para un acompañante molecular se expresa adicionalmente en la célula procariótica y el acompañante se segrega en el periplasma, es adecuado para la producción recombinante de polipéptidos en procariotas en un alto rendimiento. oo }33 <¡