KR20200008826A - 대장균을 이용한 단백질가수분해효소 k의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균으로부터 활성형의 단백질 가수분해효소 K(eProK)를 발현시켜 생산하는 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 활성이 향상된 형태의 eProK를 합성하기 위하여, 대장균의 외분비 시스템을 이용하여 상기 효소를 발현시키는 생산 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 생산 방법은, 비용적, 공정적 측면에서 기존의 합성 방법에 비하여 매우 경제적인 효과를 가지므로, 산업에서의 이용 가치가 매우 높다.

Description

대장균을 이용한 단백질가수분해효소 K의 생산 방법 {Production method of Proteinase K using E. coli}

본 발명은 대장균으로부터 활성형의 단백질 가수분해효소 K를 발현시켜 생산하는 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 단백질 가수분해효소 K의 활성이 향상된 형태의 eProK (enhanced Proteinase K)를 합성하고, 이를 대장균의 외분비 시스템을 통해 효율적으로 발현시키는 방법을 포함한다.

단백질가수분해효소 K(Proteinase K)는 진균류인 Tritirachium album으로부터 분리된 세린프로테아제로, 일반적인 효소와 달리 극한 물리, 화학적 환경(pH 4~12, 20~60℃)에서도 안정적인 특징을 가진다. 또한, 계면활성제, EDTA와 같은 chealating agent, 고농도의 염의 존재 하에서도 삼차원 구조에 크게 영향을 받지 않고 효소의 구조와 활성을 유지하여 활성이 높은 특성을 가진다. 또한 넓은 기질특이성을 가지고 있어, 다양한 단백질을 분해할 수 있기 때문에 분자 진단을 포함한 다양한 생명과학 분야에서 활용되고 있다.

Proteinase K는 Tritirachium album이라는 곰팡이로부터 유래되며, 심부배양에서 생육이 정지기에 이르러 배지 내 양분이 고갈되는 시점에 aminopeptidase와 함께 분비 된다. 이 효소는 주로 외부의 단백질원을 peptide나 아미노산으로 분해하여 질소원과 탄소원으로 사용하는 역할을 한다. Proteinase K는 아미노산 서열이나 결정입자 구조가 세균성 subtilisin과 매우 유사하다. 이 효소는 세포 내에서 생합성되는 과정 동안 불활성 상태를 유지하고 있기 때문에 이를 활성형으로 제조하여 공정의 효율성을 높이는 것이 기술적인 과제가 되고 있다.

즉, 생산 비용을 고려하여 상대적으로 경제적인 단백질 생산 시스템인 대장균(E. coli)을 활용하여 재조합 Proteinase K를 생산하고자 하는 시도가 있었으나, 일반적인 단백질의 발현 조건을 활용한 대장균 내 재조합 Proteinase K 생산 시, 불활성 형태인 Inclusion body 형태로 주로 생산되므로, 이를 다시 활성형으로 바꾸는 추가적인 공정이 필요한 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 보다 경제적이고 공정 효율성이 높은 Proteinase K의 제조 방법에 대한 다양한 조건을 실험을 통해 연구하였으며, Proteinase K를 활성화된 형태로 발현할 수 있는 대장균 형질전환 균주 및 상기 균주의 배양 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.

중국특허 공개 제 201210363700 호 대한민국 특허출원 제 1990-0002527 호 미국 특허출원 제10/467,532

본 발명의 목적은 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 코딩하는 DNA 서열을 형질전환 벡터에 클로닝하는 단계; 상기 벡터를 대장균에 도입하여 형질 전환하는 단계; 및 상기 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 생산 방법에 따라 생산된 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 형질전환벡터를 통해 형질 전환된, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK) 생산용 대장균을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 코딩하는 DNA 서열을 형질전환 벡터에 클로닝하는 단계; 상기 벡터를 대장균에 도입하여 형질 전환하는 단계; 및 상기 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)는 세포주변질(periplasm)로 이동하도록 하기 위하여, 상기 효소의 N 말단에 pelB 신호 펩타이드를 연결된 상태로 발현할 수 있도록 pET22b 벡터에 효소 발현 서열을 클로닝하였으며, 상기 효소는 세포 주변질에서 활성화된 형태로 존재하게 되므로, 합성 후 세포주변질로 이동할 수 있는 신호 서열을 포함하여야 한다. 즉, 이러한 특징으로 인하여 본 발명의 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)는, 기존의 단백질 가수분해효소 K와 달리, 활성화된 형태로 생산될 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 상기 염기 서열은 효소의 C 말단에 히스티딘 태그를 포함한 형태로 발현되도록 한다. 히스티딘 태그를 포함하도록 하는 것은, 추후 분리, 정제를 용이하게 하기 위함이다.

본 발명의 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)는 일반적인 Proteinase K에 비하여 활성이 5 내지 8배 뛰어난 것으로 알려진 돌연변이로서, Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N 돌연변이를 코딩하는 DNA 서열에 의해 합성된 것이다. Proteinase K는 signal peptide, pro peptide와 mature form의 형태로 단백질이 생합성되며, 생합성된 단백질이 균체 외로 분비되고 분해과정을 거쳐 활성을 보이는 Proteinase K로 전환된다. 본 발명의 eProK는 활성을 가지는 형태로서, pET22b 클로닝 벡터에 의해 함께 발현된 N 말단의 pelB 신호에 의해 세포주변질로 분비되며, 여기에서 활성을 가지는 형태로 변형된다.

즉, 본 발명은 대장균의 외분비 시스템을 이용한 것이며, 활성된 형태로 발현시키고, 이를 세포주변질로 외분비되도록 하는 방법을 제공하는 것이 목적이다.

본 발명의 생산 방법은, eProK를 최적화된 조건에서 발현하기 위하여 배양 조건을 한정하고 있다. 상기 배양 조건은 배양 시간 및 온도, 그리고 진탕 배양 시 속도를 한정할 경우, 가장 활성이 높은 형태의 eProK가 합성됨을 실험적으로 확인하여 확립한 것이다.

본 발명에서 pET22b-eProK-His가 도입된 형질전환 대장균은 이에 제한되는 것은 아니나, BL21(DE3) pLysS를 사용하였다. 이는 T7 RNA polymerase에 의해 전사를 촉진시키기 위한 것으로서, 상기 균주의 경우, T7 프로모터를 통하여 eProK-His 효소를 발현할 수 있는 특징을 가진다. 상기 형질 전환된 대장균은, 기본적으로 LB 배지에서 1차 배양되며, 본 발명에서 이용된 모든 LB 배지는 암피실린, MgCl₂, 및 글리세롤을 포함한다.

상기 1차 배양은 3, 5, 10, 20시간동안 진행하여 단백질의 발현량과 활성 여부를 측정하였다. 또한, 1차 배양 시, 진탕 속도도 단백질의 발현량 및 활성에 영향을 주는 것을 확인하였다. 이에 제한되는 것은 아니나, 3시간 이상 10시간 이하로 배양 시, 단백질 발현량이 비교적 높은 것으로 확인되었고, 보다 바람직하게는 3시간 내지 5시간 배양 시, eProK의 발현량이 가장 높음을 확인하였다. (도 1) 또한, SDS 및 CaCl₂ 를 통한 활성 형태를 확인한 결과, 3시간 내지 5시간 동안 배양한 경우, 활성도가 높은 eProK가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

배양 시간 뿐만 아니라, 진탕 배양 속도도 단백질의 발현량에 영향을 주는 것을 확인하였으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 100 내지 200 rpm으로 진탕 배양 시, 단백질의 발현량이 비교적 높은 것으로 나타났으며, 보다 바람직하게는 200rpm으로 배양 시, 발현되는 효소의 양이 더 높은 것을 확인하였다. (도 2)

또한, 본 발명의 배양 방법은, 상기 1차 배양 후, 대장균이 배양 정지기에 이르는 대장균 OD₆₀₀ > 8 인 조건에서 IPTG를 추가하여 단백질을 과발현시키는 2차 배양 단계를 포함한다. IPTG는 Isopropyl-β-D-thio-galactoside로서, lac operon에 의해 조절되는 단백질의 발현을 위해 락토오스 대신 넣어주는 물질이다. 락토오스는 lacZ에 의해 발현되는 β-갈락토시다아제에 의해 분해되지만, IPTG는 분해되지 않아, lac operon을 이용한 단백질 과발현에 이용된다. 본 발명에서 사용한 BL21(DE3) pLysS는 대장균의 lac operon으로 하여금 T7 phage RNA polymerase를 발현시키게 하고, 이는 pET22b-eProK-His가 지니고 있는 T7 promoter를 통해 결과적으로 eProK-His를 발현하게 된다. 또한 BL21(DE3) pLysS 균주는 BL21(DE3)에 pLysS plasmid가 포함된 것으로, 이것은 T7 리소자임이 인코딩된 것이다. T7 리소자임은 IPTG의 유도에 의해서 단백질 발현이 유도될 수 있도록 해 준다. 작용하는 원리는 어느 정도의 수준까지 자라기 전까지 T7 RNA Polymerase가 작동하지 못하도록 pLysS 유전자가 이를 억제시키고, 그 후 IPTG 등의 발현 물질을 넣어 주면 pLysS가 억제되어 T7 RNA Polymerase를 작동시키게 된다.

다른 양태로서 본 발명은 상기 생산 방법에 의해 생산된, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 제공한다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기 활성형 단백질 가수분해 효소(eProK) 생산능을 가지는 대장균을 제공한다.

본 발명의 활성형 단백질 가수분해효소 K(eProK)의 생산 방법은, 추가적인 처리 없이도 활성이 향상된 형태의 eProK를 늦은 재조합 단백질 발현 유도 방법을 통해 합성하고, 이를 대장균의 외분비 시스템을 통해 효율적으로 발현시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 생산 방법은, 비용적, 공정적 측면에서 기존의 합성 방법에 비하여 매우 경제적인 효과를 가지므로, 산업에서의 이용 가치가 매우 높다.

도 1은 배양 시간별 eProK의 발현 상태 및 활성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 진탕배양 시, 진탕 속도에 따른 외분비 효소의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 배양 정지기에 IPTG를 처리하여 단백질 과발현을 유도하였을 때, 배지로 단백질의 외분비 시스템이 작동하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 배지로 외분비된 eProK의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 eProK를 발현시키기 위해 재조합된 형질전환벡터 pET22b의 개열지도를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

Proteinase K 발현을 위한 DNA cloning 및 재조합 균주 제작

1-1. DNA 클로닝

대장균에서 재조합 단백질의 발현을 위하여 Proteinase K을 코딩하는 DNA를 합성 후 대장균 단백질 발현용 벡터에 클로닝하였다. 먼저, 대장균에서 효율적인 단백질 발현을 위하여 Proteinase K 아미노산 서열을 기준으로 하여 대장균 codon usage를 고려한 DNA 서열을 역으로 디자인하고, 이를 인공적으로 합성하였다.

합성한 Proteinase K는 야생형보다 활성이 5-8배가량 뛰어난 것으로 알려진 Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N 돌연변이를 코딩하는 DNA 서열로서, 이를 야생형 Proteinase K (ProK)와 구분하기 위하여 enhanced Proteinase K (eProK)라고 명칭하였다. [BMC Biotechnol. 2007 Mar 26;7:16]

Disulfide bond를 지니고 있는 Proteinase K 효소를 활성화시키기 위하여 대장균 내 발현된 효소를 세포주변질(Periplasm)으로 이동시켰다. 이에 따라 효소와 연결된 형태로 함께 pelB 신호 펩타이드를 발현할 수 있도록 N말단에 pelB 신호 펩타이드 서열을 함께 pET22b (Novagen) 벡터에 클로닝하였다. 또한, 발현된 Proteinase K 효소의 정제를 위하여 C말단에 6x 히스티딘 표지 (6x-His tag)가 연결된 형태로 함께 발현할 수 있도록 pET22b (Novagen) 벡터에 클로닝하여 pET22b-eProK-His 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 벡터는 도 5의 개열지도로 표시된다.

1-2. 재조합 대장균 제작

상기 클로닝된 pET22b-eProK-His 벡터를 BL21(DE3) pLysS (Novagen) 대장균주에 형질 전환하여 해당 대장균주에서 발현되는 T7 RNA polymerase로 하여금 T7 promoter를 통한 eProK-His 효소를 발현할 수 있도록 한 대장균 형질전환 균주를 개발하였다.

상기 형질전환 균주에서 실제 발현되는 효소에 해당하는 단백질 서열을 서열번호 1, 해당 단백질을 코딩하는 DNA 염기 서열을 서열번호 2로 각각 표기하였다.

<실시예 2>

최적화된 eProK의 대장균 내 발현 조건 확립

2-1. Proteinase K 발현을 위한 조건

상기 실시예 1에서 제작한 pET22b-eProK-His 벡터로 형질전환된 BL21(DE3) pLysS (Novagen) 대장균 형질전환 균주의 단일 콜로니를 이용하여 LB 배지에서 37℃ 12시간 진탕 배양하였다. 이를 새로운 LB 배지에 1/100 비율로 접종하여 37℃ 3시간 배양한다.

대장균 OD₆₀₀ > 4 이상에서 0.1mM IPTG를 첨가하여 16℃ 24시간 이상 배양하는 경우, 단백질의 과발현을 시작하였다. 모든 LB 배지에는 100ug/ml ampicillin, 1mM MgCl₂, 0.5% glycerol을 첨가했다.

2-2. 배양 조건에 따른 단백질 발현 확인

단백질 발현을 위한 대장균 배양 방식은 LB 배지를 사용한 진탕 배양 방식을 선택하였다. 단백질 발현 온도는 16℃로 고정한 뒤 배양시간을 각각 3, 5, 10, 20시간으로 다양화하여 단백질 발현 유무를 확인하였다. Periplasm에서의 효소의 활성 여부를 확인하기 위하여 2% SDS 및 2mM CaCl₂를 첨가하여 기질 단백질로 활용한 BSA 단백질이 분해됨을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 1에서 보듯이, 16℃에서 3내지 10시간동안 배양하였을 때, eProK가 발현되었음을 확인할 수 있었으며, 특히 3시간 및 5시간 배양 시, 활성이 더 높은 eProK가 발현됨을 확인할 수 있었다.

또한, 진탕 배양의 속도에 따른 단백질 발현양 차이를 확인하기 위하여, 진탕 속도를 각각 100rpm 및 200rpm으로 설정하여 배양한 후, eProK의 발현양을 비교하였다, 그 결과, 도 2에서 보듯이, 진탕 속도가 200rpm인 경우, 더 많은 eProK가 발현됨을 확인하였다.

2-3. 대장균 배양 정지기(stationary phase)에서의 단백질 발현을 통한 배지로의 외분비 유도

재조합 Proteinase K 효소 발현용 형질전환 균주를 활용하여 늦은 재조합 단백질 발현 유도 (Late recombinant protein expression induction) 방법을 통해 단백질 발현을 유도하였으며, 또한 대장균 periplasm 외분비 시스템을 적용하여 침전되지 않고 활성을 지닌 형태의 Proteinase K 효소를 생산하기 위한 조건으로 배양하였다.

효소가 periplasm로 외분비 되도록 의도하여 디자인한 pET22b-eProK-His는 대장균 배양 정지기 (OD₆₀₀ > 8)에서 단백질 과발현을 유도하면 periplasm 외분비뿐만 아니라 배양 용액으로의 단백질 외분비까지 유도됨을 확인하였다. (도 3) 이 때, 과발현 유도를 위해 0.2 mM IPTG를 사용했으며 과발현시 배양 조건은 20℃, 40시간 이상 배양하였다. 기본 배양액은 LB media와 0.5 % (w/v) 글리세롤을 사용하였으며, fed-batch culture를 위해 300ml의 20% w/v 글루코오스를 40시간 동안 지속적으로 첨가해주었다. eProK-His 발현은 글루코오스 지속첨가를 진행하지 않은 batch culture에서만 발현되었고 글루코오스를 지속 첨가한 fed-batch culture에서는 단백질 과발현이 유도되지 않았다.

또한 pET22b-eProK-His 벡터를 포함한 대장균 형질전환 균주는 해당 효소의 발현 후 위치를 대장균 periplasm으로 할 수 있도록 디자인 되었으나, 위의 방법을 사용하여 배양 용액으로의 추가적인 외분비가 유도된 효소는 기질 단백질을 인식하여 자르는 효소 특유의 성질을 지니는 활성화 형태임을 확인하기 위하여, 배지로 외분비된 eProK의 활성을 확인하였다. 정제된 eProK 0.1 mg/ml과 기질 단백질로 사용된 0.5 mg/ml BSA를 버퍼 20mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM CaCl₂에 첨가하여 상온에서 5분간 반응시켜 단백질분해효소의 활성을 정성적으로 평가하였다. 첨가물에 따른 효소 활성 증대 여부를 파악하기 위하여 0.5% (w/v) SDS를 별도 첨가하였다. 그 결과, 도 4에서 보듯이, 대장균을 활용한 배지 외분비 효소는 활성을 갖고 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Sungkyunkwan University Foundation for Corporate Collaboration <120> Production method of Proteinase K using E. coli <130> PN1805-160 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhanced proteinase K sequence <400> 1 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu 20 25 30 Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr 35 40 45 Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala 50 55 60 Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe 65 70 75 80 Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg 85 90 95 Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile 100 105 110 Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser 115 120 125 Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln 130 135 140 Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro 145 150 155 160 Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met Val Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser 165 170 175 Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser 180 185 190 Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val 195 200 205 Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met 210 215 220 Asp Phe Val Ala Ser Asp His Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val 225 230 235 240 Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser 245 250 255 Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala 260 265 270 Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro 275 280 285 Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser 290 295 300 Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Ser 305 310 315 320 Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr 325 330 335 Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr 340 345 350 Leu Gly Arg Thr Thr Ala Ala Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr 355 360 365 Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu 370 375 380 Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala Leu Glu His His His His His His 385 390 395 400 <210> 2 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhanced proteinase K coding DNA sequence <400> 2 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggccatgg caccagccgt cgaacagcgc agcgaggctg ccccactgat cgaggcccgt 120 ggtgaaatgg tggccaataa atacattgtc aaatttaaag aaggctccgc cctttccgct 180 cttgatgctg cgatggagaa gatttctggc aagccggacc atgtctataa gaacgttttc 240 tcgggctttg cagccacact tgacgaaaat atggtccgtg ttcttcgcgc ccatcccgat 300 gtagagtaca tcgaacaaga tgcagttgtc acgattaatg cggcacaaac aaacgcacct 360 tggggccttg ctcgcatctc gtcgactagt ccgggtacgt ccacctatta ttatgatgaa 420 tcagcgggac aaggtagttg cgtatacgtg attgatacgg gtattgaggc ttcccatcct 480 gagtttgagg gacgcgctca aatggtgaaa acgtactacg cctcctctcg tgatggaaat 540 ggacacggaa ctcattgcgc tggcacggtt ggttcacgta cctacggtgt ggctaaaaaa 600 acacagttgt ttggagtcaa agtgttggac gataatggta gtggacagta ctcaaccatt 660 attgcaggta tggactttgt cgcatcagac cacaataatc gcaactgccc caaaggggta 720 gtcgcttcat tgagcttggg cggtggttac agttccagtg tgaactcggc ggctgcacgt 780 ctgcaatctt ccggcgtcat ggtggccgtt gccgccggaa acaataacgc ggacgcacgc 840 aattattcgc cagcttctga accatccgta tgcacagtcg gcgctacaga tcgttacgac 900 cgccgttcca gcttcagcaa ctatggcagc gtgttggata ttttcgctcc aggcacatca 960 atcctttcga cgtggattgg gggttcaaca cgcagtatca gcggcacatc gatggctaca 1020 cctcacgttg cagggttagc agcgtacctg atgacattgg gccgcacgac agcagcaaac 1080 gcgtgccgtt atattgccga caccgccaat aagggtgatc tgagcaatat ccctttcggg 1140 acagtaaatt tattggcgta caataactac caggcactcg agcaccacca ccaccaccac 1200 tga 1203

Claims (11)

1. 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK) 을 코딩하는 DNA를 포함하는 염기서열을 형질전환 벡터에 클로닝하는 단계;
   상기 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환하는 단계; 및
   상기 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 활성형 단백질가수분해효소 K의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 코딩하는 DNA　서열은, 상기 활성형 단백질 가수분해효소 K의 C 말단에 히스티딘 표지를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 형질전환 벡터는 pET22b 벡터인, 생산 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 형질전환 벡터에 삽입되는 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)를 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 것인, 생산 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 대장균은 BL21(DE3)pLysS 균주인, 생산 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 대장균을 배양하는 단계는,
   형질 전환된 대장균의 단일 콜로니를 배지에서 15 내지 20℃로, 3시간 내지 20시간 동안 진탕 배양하는 단계를 포함하는 1차 배양 단계; 및
   대장균 OD₆₀₀ > 8 인 조건에서 IPTG를 배양액 중에 처리하여 15 내지 20 ℃에서 24시간 이상 배양하여 단백질을 과발현 하는 2차 배양 단계를 포함하는 것인, 생산 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 1차 배양 시, 진탕 속도는 100 내지 200rpm인 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
9. 제1항의 생산 방법으로 생산된, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK).
10. 제9항에 있어서,
    상기 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK)는 N 말단에 pelB 신호 펩타이드를 포함하며, C 말단에 히스티딘 표지를 포함하는 것인, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK).
11. 제4항의 형질전환 벡터로 형질전환된, 활성형 단백질가수분해효소 K(eProK) 생산능을 가지는 대장균.

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