CN112409464B - 提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用 - Google Patents

提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPE QIHRRDILKWGAMAGAAVA)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明所筛选获得的信号肽突变体，对于重组蛋白在枯草芽孢杆菌中具有高效的胞外蛋白分泌水平，重组蛋白胞外分泌水平提高了15倍以上。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。

Description

提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及 应用
技术领域
本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧产孢的革兰氏阳性菌株，细胞壁结构简单，仅含单层细胞膜，具有高效的蛋白分泌能力，常被用作生产淀粉酶、蛋白酶等工业酶制剂的理想表达宿主。信号肽(Signal Peptide，简称SP)是一段引导新合成蛋白质跨膜转移的N端氨基酸序列，长度约15～30个氨基酸残基。不同来源的信号肽虽无明显的同源性，但均由三部分组成，包括碱性氨基酸组成的N端、疏水性氨基酸组成的H区和亲水氨基酸组成的C端。带正电荷的N端，负责引导新合成的多肽链结合到带负电荷的内质网膜上；H区是信号肽的主要功能区，介导蛋白质的跨膜转运；C端提供信号肽酶(SPase)识别位点。
在枯草芽孢杆菌表达系统中，信号肽与外源基因的匹配度是影响外源蛋白分泌的重要因素之一，不同信号肽对同一外源基因的分泌表达影响不同，相同信号肽对不同外源基因的分泌表达影响也不同。因此，针对某一特定基因，筛选合适的信号肽对于实现该基因的高效表达具有重要意义。Degerin等构建了含173种枯草芽孢杆菌信号肽和220种B.licheniformis的信号肽，分别与来源于B.amyloliquefaciens的枯草菌素基因进行融合表达，最终筛选到两个最适枯草菌素分泌表达的信号肽，在这两个信号肽的引导下，其产量较野生型信号肽提高7倍。但目前已报道的信号肽及改造信号肽的方法，主要集中在信号肽的筛选及信号肽的理性设计，该方法存在一定的局限性，仍不能满足重组蛋白在枯草芽孢杆菌表达宿主的高效分泌表达，特别是普适性的高效分泌表达。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVA，SEQ ID NO.1)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。
本发明的第一个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体，所述的信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10所示。
进一步地，所述的重组蛋白为淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、磷脂酶、胶原蛋白、蛛丝蛋白、甲基对硫磷水解酶、纳豆激酶中的一种或多种。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800。
进一步地，所述的重组蛋白通过质粒pMA5、pMA0911或pWB980进行表达。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的信号肽突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述的基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种包含所述的信号肽突变体的重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第五个目的是提供所述的信号肽突变体在提供枯草芽孢杆菌中重组蛋白胞外生产水平中的应用。
进一步地，所述的应用是将重组蛋白基因连接至含有所述的信号肽突变体的表达载体上，转入枯草芽孢杆菌宿主中进行表达。
本发明的有益效果是：
本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVA)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明所筛选获得的信号肽突变体，对于重组蛋白在枯草芽孢杆菌中具有高效的胞外蛋白分泌水平，重组蛋白胞外分泌水平提高了15倍以上。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。
附图说明
图1为96孔板筛选获得正向信号肽突变体；
图2为正向信号肽突变体对枯草芽孢杆菌产酶的影响；
图3为复合突变信号肽突变体对枯草芽孢杆菌产酶的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
淀粉酶酶活力测定方法：
反应混合物含有7.4g·L-1(w/v)可溶性淀粉和30mmol·L-1甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)。将混合物在50℃下预热5min，加入100μL酶溶液，并将混合物(1.35mL)在50℃下温育5min。然后取1mL反应混合物与1mL DNS溶液混合，煮沸15min，在冰水中迅速冷却，并加入去离子水至定容至10mL。使用微孔板分光光度计(酶标仪)Epoch 2(美国伯腾仪器公司，美国)测定A540值。通过将不同浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5g·L-1)的葡萄糖(1mL)与1mL DNS溶液混合后，采用上述反应方法进行反应，并测量A540以绘制标准曲线。一个单位(U)的淀粉酶定义为：在上述测定条件下每分钟水解淀粉产生1μmol还原糖(葡萄糖)所需的酶量，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量。
甲基对硫磷酶活力测定方法：
使用BioTek Synergy酶标仪测定酶活性，反应温度为37℃，200μL反应体系中，包括20mM Tris-HCl(pH 8.0)，125μM甲基对硫磷和纯化的酶(1μg·mL-1)。将反应测定的A405对应于产物对硝基酚的标准曲线，进而计算酶活力。酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟生成1μM对硝基苯酚所需的酶量，定义为1个酶活力单位U。
纳豆激酶酶活力测定方法：
将纳豆激酶酶液稀释一定倍数与终浓度为0.5mmol/L的四肽底物(D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺)混合，在37℃水浴下反应1min，加入75μL 50％冰醋酸溶液终止反应，测定A405值。纳豆激酶活力单位(U)定义为：催化上述反应，每分钟释放1nmol对硝基苯胺的纳豆激酶含量。
实施例1：
以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，设计简并引物M1-FW(SEQ ID NO.11):ATCGCTCCCCATTTTAAAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN和M1-RS(SEQ ID NO.12):TAAAAAGGAGCGATTTACATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN)，采用简并引物对信号肽M1(MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVA)的N端区域(MSDEQKKPEQIHRRD)进行定向进化，以淀粉酶为模式蛋白，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库。采用的质粒为枯草芽孢杆菌质粒pMA5。首先采用含有可溶性淀粉的平板37℃培养，筛选具有较大透明圈的菌落，挑选具有较大透明圈的菌落，接种至96孔板，在37℃、800rpm条件下进行发酵培养。测定淀粉酶酶活力，筛选具有高酶活力的信号肽突变体M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6(图1)。
实施例2：
将筛选获得的连接有淀粉酶的具有高酶活力的信号肽突变体M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6接种至摇瓶发酵培养基中放大发酵培养，测定重组枯草芽孢杆菌产淀粉酶酶活力情况。结果显示，淀粉酶酶活力显著提高，与突变前M1信号肽相比较，M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6产重组淀粉酶的酶活力分别提高至原来的1.2、1.7、1.3、1.6、1.1、1.4倍(图2)。同时，将甲基对硫磷水解酶和纳豆激酶分别连接至含有信号肽突变体的枯草芽孢杆菌质粒pMA5，进行摇瓶发酵产酶实验验证。筛选获得的信号肽突变体对于甲基对硫磷水解酶和纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达分泌水平均有显著提高(图2)。其中，甲基对硫磷水解酶在含有M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6信号肽突变体的枯草芽孢杆菌中的表达分泌水平，较对照M1，分别提高至对照的2.1、10.1、3.1、8.6、1.6、6.6倍。纳豆激酶在含有M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6信号肽突变体的枯草芽孢杆菌中的表达分泌水平，较对照M1，分别提高至对照的1.6、5.2、2.1、4.4、1.4、2.6倍。将M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6，翻译成编码的氨基酸序列分别为MSDKQHKPEQIHRRD、MSDKQRKPEQIHRRD、MSDKQKKPKQIHRRD、MSDKQKKPEQIHRRD、MSKKQKKPKQIHRRD、MSDKQKKPERHRRD。
实施例3：
针对筛选获得的M1-mut1、M1-mut2、M1-mut3、M1-mut4、M1-mut5、M1-mut6信号肽突变体，采用排列组合复合突变的方式对M1信号肽的N端区域进行排列组合复合突变，获得720个突变体。以淀粉酶为模式蛋白，采用96孔板在37℃条件下进行发酵产酶筛选。筛选获得3个具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽突变体：M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003。利用500mL摇瓶在37℃和200rpm条件下进行放大发酵培养验证，测定突变株M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003的淀粉酶酶活力分别为对照菌株M1-mut2的1.3、1.5、1.5倍。对于信号肽突变体M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003的基因序列分别进行基因测序，翻译成蛋白序列后发现其N端区域序列分别为MSDKQHKPKRIHRRD、MSDKQRKPKQIHRRD、MSKKQHKPKQIHRRD。将甲基对硫磷水解酶和纳豆激酶基因分别连接至含有信号肽突变体的质粒上，转化枯草芽孢杆菌WB600宿主。利用500mL摇瓶在37℃和200rpm条件下进行放大发酵培养验证，测定突变株M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003的甲基对硫磷水解酶和纳豆激酶酶活力(图3)。突变株M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003的甲基对硫磷水解酶和纳豆激酶酶活力分别为对照菌株M1-mut2的1.1、1.7、1.4倍和1.4、1.8、1.4倍。这进一步验证了筛选获得的3个信号肽突变体M1-mut-001、M1-mut-002、M1-mut-003具有高效胞外蛋白胞外分泌水平能力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Ser Asp Glu Gln Lys Lys Pro Glu Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Ser Asp Lys Gln His Lys Pro Glu Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 3
Met Ser Asp Lys Gln Arg Lys Pro Glu Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Ser Asp Lys Gln Lys Lys Pro Lys Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 5
Met Ser Asp Lys Gln Lys Lys Pro Glu Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
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<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 6
Met Ser Lys Lys Gln Lys Lys Pro Lys Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
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<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 7
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1 5 10 15
Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 8
Met Ser Asp Lys Gln His Lys Pro Lys Arg Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 9
Met Ser Asp Lys Gln Arg Lys Pro Lys Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 10
Met Ser Lys Lys Gln His Lys Pro Lys Gln Ile His Arg Arg Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(43)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
atcgctcccc attttaaaat nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 43
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
taaaaaggag cgatttacat nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 42

Claims (6)

1.一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体，其特征在于，所述的信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
2.一种编码权利要求1所述的信号肽突变体的基因。
3.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。
4.一种包含权利要求1所述的信号肽突变体的重组枯草芽孢杆菌。
5.权利要求1所述的信号肽突变体在提高枯草芽孢杆菌中重组蛋白胞外生产水平中的应用，其特征在于，所述的重组蛋白为淀粉酶、甲基对硫磷水解酶、纳豆激酶中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用是将重组蛋白的编码基因连接至含有所述的信号肽突变体的表达载体上，转入枯草芽孢杆菌宿主中进行表达。
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