KR100441755B1

KR100441755B1 - 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법

Info

Publication number: KR100441755B1
Application number: KR10-2001-0044421A
Authority: KR
Inventors: 홍주봉; 박수민
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2001-07-24
Filing date: 2001-07-24
Publication date: 2004-08-02
Also published as: KR20030009792A

Abstract

본 발명은 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 분자 샤페론(molecular chaperone) 유전자를 포함하는 발현벡터를 진핵세포에 형질 전환시켜 발현시키고 열 충격을 가하여 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법에 관한 것으로써, 본 발명에 따르면 세포 기능 조절의 중심인 핵의 기능을 조절하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 핵 내부로 이동시킬 필요가 있는 단백질을 분자 샤페론에 접합시켜 이동시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법{Method for targeting molecular chaperones into nucleus}

본 발명은 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 분자 샤페론(molecular charperone) 유전자를 포함하는 발현벡터를 진핵세포에 형질 전환시켜 발현시키고 열 충격을 가하여 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법에 관한 것이다.

진핵세포의 핵은 이중의 세포막으로 되어 있는 핵막(nuclear envelope)으로 쌓여있다. 그리고 핵막(nuclear envelope)에는 50개에서 100개의 단백질로 구성되어 10⁸dalton 이상의 크기를 가지는 핵공복합체(nuclear pore complex)가 위치한다. 이러한 핵공복합체의 크기 때문에 이온과, 작은 화합물질과 60 kDa 이하의 구형 단백질들은 핵공복합체를 통해 자유로이 핵 내외로 이동한다. 그러나 60 kDa 이상의 크기를 가지는 단백질들은 핵공복합체를 통해 이동이 가능하지 않으며, 핵내의 모든 단백질들이 일단 세포질에서 만들어진 후 핵 내부로 이동하여 들어옴을 고려 시 핵막을 통한 활발한 능동적 수송이 기능함을 알 수 있다(Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky, Paul Matsudaria, David Baltimore와 James Darnell 공저. 2000. Molecular Cell Biology, 4th edition. W.H. Freemand Company, New York, pp.432-436).

개구리의 난세포에서 단백질이 핵으로 이동하기 위해 필요한 아미노산 서열이 처음 보고된 이래 단백질의 핵 내부로의 이동과정은 많은 연구의 대상이 되어왔다. 이러한 노력의 첫 산물은 cAMP-의존성 단백질 키나아제(cAMP-dependent protein kinase (PKI))의 억제제 단백질에서 확인된 핵전달 신호(nuclear localization signal; 이하 "NLS"라고 함)로서 단백질의 핵 내로의 이동에 필요 충분한 아미노산 서열임이 확인되었다. 아울러 인간 면역 결핍증 바이러스 제1형(human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)) Rev 단백질로부터는 핵 내외로의 양방향 이동을 이끄는 아미노산 서열이 확인되었다. 계속된 연구결과는 이들 아미노산 서열을 가진 단백질들이 우선 전달 수용체(transport receptor)(대표적인 예, heterodimeric importin α/β transport receptor)에 의해 결합되고, 이들 복합체는 핵공에 위치한 핵공(nuclear pore) 단백질들에 의해 인지되어 핵 내부로의 이동이 이루어지게 된다. NLS의 공통적인 특징은 짧은 양전하를 띠고 있는 리신과 아르기닌의 스트레치(stretch)를 가지고 있는 다는 것이며, 핵 내외의 양방향 이동을 하는 단백질의 경우에는 글리신을 많이 가지고 있는 짧은 아미노산 서열을 가지고 있는 특징이 보인다. 상기의 구조적 특징을 가지는 단백질의 경우, 핵 내부로의 이동이 항시성을 가지는 데에 반해, 일부 단백질의 경우는 핵 내부로의 이동이 특징적인 자극에 의해 시작된다. 예로 단백질의 인산화가 단백질의 이동에 선행되어야 하는 경우와 번역 후 변형(post-translational modification)에 따른 단백질의 구조 변화가 요구되는 경우가 확인되고 있다(Jennifer Hood and Pamela Silver (2000) Diverse nuclear transport pathways regulate cell proliferation and oncogenesis. Biochimica et Biophysica Acta 1471 M31-M34).

한편, 유전물질의 정보가 1차원적 폴리펩타이드(polypeptide)를 생성하는 기작에 대해서는 잘 알려져 있지만 그 폴리펩타이드가 기능을 가진 3차원적 구조를 형성하는 과정에 대해서는 밝혀진 바가 적다. 처음에 통용된 가설은 자가조립(self-assembly)에 의해 3차원 구조가 형성된다는 것으로 이것은 각 폴리펩타이드가 자발적으로 낮은 자유에너지의 접힘 구조로 상호 변환되므로 아미노산을 암호화하는 핵산 서열의 특이성만으로도 기능적 구조의 단백질을 만드는 것이 충분하다는 것이다. 그러나 몇몇 단백질에서 조립을 도와주는 역할을 하는 단백질, 즉 분자 샤페론이 단백질의 완전한 조립에 필요하다는 것이 1980년 말에 밝혀짐으로 해서 자가조립이 보편적 메카니즘이 아니며 많은 단백질의 3차원적 구조 형성에 분자 샤페론이 필요함이 알려졌다(Pahl, A. et al.,Cell Stress & Chaperones, 2, 78-86, 1997).

분자 샤페론은 통상 열충격 단백질(heat shock protein)이라고 알려져 있는데, 많은 경우 폴리펩타이드 내의 하부도메인(subdomain)들 간의 또는 폴리펩타이드와 다른 분자들 간의 상호작용에 의해 부정확한 구조를 형성하는 것을 방지하는역할을 한다. 분자 샤페론은 폴리펩타이드의 정확한 조립을 매개하지만 기능을 갖춘 단백질로의 조립이 끝나면 더 이상 그 단백질의 하부구조(subunit)가 아니므로 조립되는 단백질과는 관련없는 성분이라고 말할 수 있다.

분자 샤페론은 비기능적인(nonfunctional) 구조를 만드는 다른 조립 경로(alternative assembly pathway)를 저해함으로써 폴리펩타이드가 자가조립하는 것을 돕는데, 새롭게 합성되는 폴리펩타이드 사슬의 접힘을 매개하여 단백질 기질이 더 이상 잘못 접히지(misfolding) 않는 구조(conformation)를 가지면 그들로부터 분리된다. 이러한 분자 샤페론은 단백질의 접힘과 조립 과정 동안 부분적으로 접힌 중간대사물에 일시적으로 결합하는 능력에 의해 특징지어 지는데, 일반적으로 완전하게 접히고 조립된 구조에는 결합하지 않으며 너무 이른 접힘과 중간대사물의 집합을 막아서 생산적인 접힘과 조립이 좀 더 효율적인 과정이 되도록 하는 역할을 한다.

이와 같이, 분자 샤페론은 단백질의 잘못 접힘을 방지하여 정상적인 구조의 단백질이 형성되는데 도움을 광범위한 단백질들에 줌이 확인되고 있다. 그리고 분자 샤페론에 의해 도움을 받는 대상 단백질이 생물체의 생리나 발생과정에 중요한 역할을 할 시, 분자 샤페론은 결과적으로 생물체의 생리와 발생과정에 중요한 영향을 미칠 것으로 예상되었으며, 이러한 예들이 다수 보고되고 있다(Mayer, M.P. and Bukau, B.,Biol. Chem., 379, 261-268, 1998; Waters, E.R., Lee, G.J., and Vierling, E.,J. Exp. Bot., 47, 325-338, 1996). 그러나 분자 샤페론이 단백질을 핵 내부로 이끌고 들어감에 대해 보고된 된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 진핵세포에서 단백질의 핵 내부로의 이동을 촉진시키기 위하여 노력한 결과 분자 샤페론이 다른 단백질의 핵 내부로의 이동을 촉진시킬 수 있는 가능성을 처음으로 발견하고, 담배로부터 얻은 샤페론 유전자가 도입된 담배 세포에서 현저한 분자 샤페론의 핵 내부로의 이동 증가를 확인하여 상기 분자 샤페론 유전자가 진핵세포에서 다른 단백질을 핵 내부로 이동시키는 데 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 세포 기능 조절의 중심인 핵의 기능을 조절하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 핵 내부로 이동시킬 필요가 있는 단백질을 효과적으로 이동시킬 수 있는 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 분자 샤페론 유전자인서열번호 1로 기재되는TLHS3유전자를 포함하고 있는 플라스미드 벡터 pBluescript II SK(+)/TLHS3의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의TLHS3유전자를 식물체에서 발현시키기 위해 사용된 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS3의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 폴리유비키틴(PUB) 유전자를 식물체에서 발현시키기 위해 사용된 식물발현 벡터 pBKS1-1/PUB의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS3가 도입되어 형질 전환된 담배세포에서 TLHS3 단백질의 세포 내 위치를 보여주는in situ분석 결과를 나타내는 현미경 사진이고,

A : 형질전환 담배세포에서의 열 충격 처리 전의 TLHS3의 세포 내 분포

B : 형질전환 담배세포에서의 열 충격 처리 후의 TLHS3의 세포 내 분포

도 5는 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/PUB가 도입되어 형질 전환된 담배세포에서 PUB 단백질의 세포 내 위치를 보여주는in situ분석 결과를 나타내는 현미경 사진이고,

A : 형질전환 담배세포에서의 열 충격 처리 전의 PUB의 세포 내 분포

B : 형질전환 담배세포에서의 열 충격 처리 후의 PUB의 세포 내 분포

도 6은 TLHS3의 세포 내에서의 존재 형태를 확인하기 위하여 네이티브 겔(native gel) 전기영동된 단백질에 대해 TLHS3에 대한 폴리클로날(polyclonal) 항체로 웨스턴 블럿(western blot) 분석을 수행한 결과이고,

A : 형질전환과정이 수행되지 않은 일반 담배

B :TLHS3유전자가 도입되어 발현된 형질전환된 담배

레인 1 : 25 ℃에 유지된 담배로부터 추출된 단백질

레인 2 : 고온스트레스 45 ℃가 30분 주어진 담배로부터 추출된 단백질

레인 3 : 고온스트레스 45 ℃가 1시간 주어진 담배로부터 추출된 단백질

레인 4 : 고온스트레스 45 ℃가 2시간 주어진 담배로부터 추출된 단백질

레인 5 : 고온스트레스 45 ℃가 4시간 주어진 담배로부터 추출된 단백질.

도 7은 TLHS3 단백질이 대장균에서 과발현됨을 보여주는 사진이다.

레인 1 : 아라비노즈가 배지에 첨가되지 않아 TLHS3의 과발현이 유도되지 않은 대장균에서 추출한 단백질의 SDS-PAGE 결과

레인 2 : 아라비노즈를 배지에 첨가하여 TLHS3의 과발현이 유도된 대장균에서 추출한 단백질의 SDS-PAGE 결과

레인 3 : 대장균에서 과발현된 TLHS3를 정제한 후의 SDS-PAGE 결과

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터를 진핵세포에 형질전환시켜 발현시키고 열 충격을 가하여 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 바람직하게는 분자 샤페론 유전자에 핵 내부로 이동시킬 필요가 있는 단백질(이하 "목표단백질"이라고 한다)의 유전자를 접합시켜 접합된 유전자를 진핵세포에 형질 전환시켜 발현시키고 열 충격을 가함으로써 그러한 목표단백질을 효과적으로 핵 내부로 이동시킬 수 있는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 분자 샤페론의 복합체 형성능을 이용하여 분자 샤페론을 목표단백질과 복합체를 형성시켜 핵 내부로 이동시는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기의 분자 샤페론으로는 모든 분자 샤페론이 사용될 수 있으나 특히 TLHS3와 HSP(heat shock protein) 70, HSP 60, HSP 90, HSP 100, GroEL, GroES, 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin), 샤페로닌(chaperonin), 및 저분자량 HSP들(small HSP들) 등이 사용되는 것이 바람직하며,서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 지닌 TLHS3이 더욱더 바람직하다. 상기 TLHS3에는서열번호 1에 기재된 염기서열로부터 발현되는 것뿐만 아니라서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 지니는 모든 TLHS3이 포함된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 진핵세포체에서 핵 내부로의 이동촉진에 사용할 분자 샤페론 유전자를 얻기 위하여, 먼저 담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클론을 확보하였다. 기존의 연구결과에 의해 분자 샤페론의 cDNA 클론으로 확인된서열번호 7로 기재되는TLHS1(Park, S.M. and Hong, C.B.,Molecules and Cells, 8, 594-599, 1998; Joe, M.K. et al.,Molecules and Cells, 10, 519-524, 2000) 유전자의 cDNA를 탐침으로 사용하여 담배의 게놈 라이브러리(genome library)를 두 차례 스크리닝(screening)하였다. 이로부터 선별된 분자 샤페론의 게놈 클론으로 예상되는 클론들을 배양하여 각각의 재조합 파지(phage) DNA를 수확하였고, 수확된 파지 DNA를 제한효소로 절단하고 전기영동한 후TLHS1유전자를 탐침으로 사용하여 DNA 혼성화 반응을 수행하였다. DNA 블롯 분석을 수행하여 확인된, 분자 샤페론 단백질의 전체 기록부위를 포함할 것으로 예상되는 DNA 절편을 분리하여 플라스미드 벡터의 다중클로닝 부위(multicloning site) 내에 서브클로닝하였다.

다음으로, 플라스미드 벡터에 존재하는 다중 클로닝 부위의 염기서열을 이용하여 서브클로닝된 분자 샤페론 유전자의 염기서열을 양방향으로부터 결정하였다. 이로부터 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 완전한 ORF(open reading frame)를 포함하고 있는 것으로 판단되는 1개의 게놈 클론의 분자 샤페론 유전자를 확보하였으며, 이를TLHS3로 명명하였다. 상기TLHS3은서열번호 1로 기재되는 477개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있으며서열번호 2의 아미노산 서열로 번역되었다.

이와 같이 결정된 염기서열에 기초하여TLHS3유전자의 단백질 기록 부위만을 제한효소로 처리하여 분리한 후 분리한 DNA를 플라스미드 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하여TLHS3분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하였으며(도 1 참조), 상기 벡터가 형질 감염된 형질전환 대장균을 2000년 10월 21일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0880BP).

TLHS3유전자의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시키기 위하여, 상기TLHS3유전자의 대장균 내 발현벡터로부터 제한효소 처리에 의해 얻은TLHS3유전자의 단백질 기록부위를 식물체 형질전환용 벡터에 삽입하여TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터를 제조하였다(도 2 참조). 상기 발현벡터에TLHS3유전자의 단백질 기록부위가 올바로 삽입되었는지 염기서열을 분석하여 확인한 결과,TLHS3유전자는 발현벡터가 가지고 있는 CaMV35S 프로모터(promoter)와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위(terminator) 사이에 센스(sense) 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 분자 샤페론 유전자가 진핵세포체에서 목표 단백질의 핵 내부로의 이동을 촉진함을 확인하기 위한 바람직한 실시예로서, 분자 샤페론 유전자TLHS3을 담배에 형질전환시켜 담배의 핵 내부로의 분자 샤페론의 이동실험을 수행하였다.

먼저 상기의TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 각각을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 종인 LBA4404에 직접 형질전환(direct transformation)시키고, 상기 형질전환 균주를 이용하여 담배에 형질전환 과정을 수행하였다. 담배의 형질전환을 위해서는 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacumcv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.

상기TLHS3발현벡터가 도입되어 형질 전환된 담배세포에 대한in situ분석 실험은 형질 전환된 담배의 종자를 사용하였다. 침윤(Imbibition) 후 3 일 된 담배종자에 열 충격을 가한 다음 파라핀으로 종자를 고정시키고 5 uM의 두께로 박편을 만들어 슬라이드 글래스(slide glass) 상에 고정시켰다. 형질 전환된 담배종자 내에 분포하는 TLHS3 단백질의 확인은 TLHS3 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 수행하였다. 이때, 폴리클로날 항체는 정제된 TLHS3 단백질을 항원으로 이용하여 면역화시킨 토끼의 혈청을 취하여 사용하였다. 그 결과, 형질전환 과정을 거친 담배의 세포로부터는 TLHS3 단백질의 분포가 핵을 제외한 세포질에서 강하게 확인되었다(도 4A 참조). 그리고 이 담배 세포가 열 충격 처리되었을 시, 1시간만에 거의 모든 TLHS3 단백질이 핵 내부로 이동했음이 확인되었다(도 4B 참조). 이러한 결과는 매우 특이한 것으로서 TLHS3는 전술한 핵 내부로의 이동에 필요한 아미노산 서열이 존재하지 않으며 또한 속도와 강도면에서 매우 빠르고 강한 특징을 보인다. 아울러 열충격 처리에 의한 다른 단백질의 대대적인 핵 내부로의 이동에 관한 결과도 보고된 바가 없다. 이러한 사실은 폴리유비키틴(PUB)을 대상으로 검정되었다.PUB유전자가 도입된 담배 세포에서는 PUB에 대한 in situ 분석 결과, 약하나마 PUB의 분포가 핵을 포함하여 세포 전체에서 확인되었다(도 5A 참조). 이 담배 세포에 열 충격을 가하였을 시, 1 시간 후에 PUB에 대한 in situ 반응이 강해지기는 하였으나 핵 내부로의 강한 집적은 관찰되지 않았다(도 5B 참조). 또한 TLHS3의 분자량은 18.3 kDa으로써 핵공을 통한 이동이 비교적 자유로운 작은 크기이나 TLHS3는 식물세포 내에서 복합체로 존재하여 적어도 200,000 Da 이상의 크기로 확인되었다(도 6A와 B 참조). 아울러 TLHS3 복합체는 많은 종류의 식물세포의 단백질과 복합체를 이루어 존재함이 단백질 네이티브 겔(native gel) 전기영동에 이은 웨스턴 블럿(western blot)분석으로 확인되었다(도 6B 참조).

상기의 결과로부터 특징적으로 TLHS3가 발현된 담배세포에서 열 충격에 의해TLHS3가 강력하고 급속히 세포질에서 핵 내부로 이동함을 확인할 수 있다. 그리고 TLHS3의 핵 내부로의 이동 형태는 커다란 복합체임을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참고예 1> 담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클로닝

<1-1> 담배 게놈 라이브러리의 스크리닝

담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클론을 확보하기 위하여, 기존의 연구결과에 의해 분자 샤페론 유전자로 확인된서열번호 7로 기재되는TLHS1(Park, S.M. and Hong, C.B.,Molecules and Cells, 8, 594-599, 1998; Joe, M.K. et al.,Molecules and Cells, 10, 519-524, 2000) 유전자의 cDNA를 탐침으로 사용하였다. 클론텍사(Clontech. Co.)(U.S.A)로부터 구입한 EMBL3 벡터의BamHI 부위에 삽입된 담배 게놈 라이브러리를 23 cm ×23 cm LB 바텀 아가 플레이트(bottom agar plate)에 깔린 대장균(Escherichia coli) 종인 KW251 위에 도말하였다. 플레이트 위에 약 1×10⁵개의 플라크(plaque)가 형성된 후, 1 차 스크리닝을 위해 플레이트를 하이본드-N 나일론(Hybond-N nylon) 막에 블롯팅(blotting)하였다.TLHS1이 들어있는 플라스미드 벡터(Joe, M.K. et al.,Moleucles and Cells,10, 519-524, 2000)를 제한효소인BamHI/XbaI으로 절단하여 얻은 절편을³²P로 표지한 후, 상기 표지된 절편을 블롯팅된 막에 가하여 65℃에서 혼성화 반응을 수행하였다. 1차 스크리닝 결과 양성신호(positive signal)를 보였던 플라크를 분리하여 아가 플레이트 위에 플라크를 형성시킨 후, 1차 스크리닝과 동일한 방법으로 혼성화 반응을 수행하여 2차 스크리닝을 실시하였다(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

<1-2> 분자 샤페론 유전자의 서브클로닝(subcloning)

상기 참고예 <1-1>의 스크리닝 결과로 분리된, 분자 샤페론의 게놈 클론으로 예상되는 클론들을 배양하여 각각의 재조합 파지(phage) DNA를 수확하였다(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

수확된 파지 DNA를 제한효소SalI,BamHI,EcoRI으로 단일 절단(single digestion) 또는 이중 절단(double digestion)하고 아가로즈 겔 전기영동한 후,TLHS1유전자를 탐침으로 사용하여 게놈라이브러리의 1, 2차 스크리닝과 동일한 방법으로 DNA 혼성화 반응을 수행하였다. 서던 블롯 분석을 수행하여 확인된 분자 샤페론 유전자의 전체 기록 부위를 포함하는 DNA 절편 부위를 아가로즈 겔로부터 수확·분리하여 플라스미드 벡터 pBluescript II SK(+)(Promega, U.S.A)의 다중클로닝 부위 내의BamHI과SalI 부위에 T4 DNA 접합효소(ligase)를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 벡터에 부착시킴으로써 분자 샤페론 유전자의 전체 기록 부위를 포함하는 상기 DNA 절편을 서브클로닝하였다.

<1-3> 분자 샤페론 유전자의 염기서열 결정

플라스미드 벡터에 존재하는 다중 클로닝 부위의 염기서열을 이용하여 플라스미드 벡터 pBluescriptII SK(+)에 서브클로닝된 분자 샤페론 유전자의 염기서열을 양방향으로부터 결정하였다. 간략하게 설명하면, 엑소뉴클리아제 III(exonuclease III)를 사용하는 시퀀싱 키트(deletion kit for kilo-sequencing, Takara, Japan)를 이용하여 한쪽 방향 삭제 시리즈(deletion series)를 제작하였으며, 서열 버전 2.0(Sequenase version 2.0, United States Biochemical Cooperation, U.S.A.)을 사용하여 샹거(Sanger)의 다이디옥시 사슬 종결법(dideoxy chain termination, Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)으로 한쪽 방향으로 절삭된 클론들의 염기서열을 결정하였다. 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 완전한 ORF를 포함하고 있는 것으로 판단되는 1개의 게놈 클론의 분자 샤페론 유전자를 확보하였으며,TLHS3로 명명하였다. 상기TLHS3은서열번호 1로 기재되는 477개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있었으며서열번호 2의 아미노산 서열로 번역되었다.

<1-4> TLHS3 유전자의 재 서브클로닝

상기 참고예 <1-3>에서 결정된 염기서열에 기초하여TLHS3의 단백질 기록부위 양쪽 끝에 프라이머와 PCR을 이용하여XbaI 제한효소 위치를 만들었다. 좀 더 자세히 설명하면,TLHS3의 단백질 기록부위 바로 바깥의 염기서열을 일부 변형하여XbaI 제한효소 위치가 형성되게끔 프라이머를 제조하고 PCR을 수행하여TLHS3의 단백질 기록부위가XbaI 제한효소 위치로 쌓이게 제조하였다. 여기에 사용된 프라이머는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 각각서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하였다.

이렇게 제조된TLHS3의 단백질 기록부위가XbaI 위치로 쌓인 재조합 DNA를 제한효소XbaI으로 처리하여 아가로즈 겔에 전기영동하였고 각각의 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean II 키트(Bio 101, U.S.A.)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수분리하였다. 분리한 DNA를 pBluescript II SK(+)의XbaI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 부착시킴으로써 pBluescript II SK(+)/TLHS3벡터를 제조하였으며(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)(도 1), 상기 벡터가 형질 감염된 형질전환 대장균을 2000년 10월 21일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0880BP)

<실시예 1> TLHS3 유전자로 형질 전환된 형질전환 식물체에서의 TLHS3의 핵 내부의 이동실험

본 발명의TLHS3유전자가 형질 전환된 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 담배를 숙주 식물체로 사용하였다. 담배의 형질전환을 위해서는 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacumcv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.PUB의 유전자가 형질전환된 담배의 제조도 동일하게 이루어졌다.

<1-1> TLHS3 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현 벡터의 제조와 PUB 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현 벡터의 제조

TLHS3유전자의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시키기 위하여, 상기 참고예 <1-4>에서 제조된 pBluescript II SK(+)/TLHS3벡터에XbaI 제한효소를 처리하여 아가로즈 겔에 전기영동하였고 각각의 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean II 키트(Bio 101, U.S.A.)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수분리하였다. 순수 분리한 DNA 절편을 식물체 형질전환용 벡터인 pBKS1-1(Suh M.C. et al.,Molecules and Cells,4, 211-219, 1994)의XbaI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 반응시켜 부착시킴으로써TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/TLHS3를 제조하였다(도 2)(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

상기 발현벡터 내에TLHS3유전자의 단백질 기록부위가 pBKS1-1이 가지고 있는 CaMV35S 프로모터와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위 사이에 올바르게 삽입된 것을 확인하기 위하여, pBKS1-1/TLHS3를 DNA 시료로 준비하고 CaMV35S 프로모터의 3'말단 부위를 프라이머로 이용하여 샹거(Sanger) 등의 다이디옥시 사슬 종결법을 이용하는 DNA 서열 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit)를 사용하였다. 정제한 DNA에 2 ㎕의 시쿼나제(sequenase) 완충액(200 mM Tris·HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl)과 0.5 pmol의 프라이머를 넣어 65℃에서 2분간 반응한 뒤 상온에 30분간 방치하였다. 여기에 1 ㎕의 0.1 M DTT, 2 ㎕의 1/5로 희석한 표지 혼합액(labeling mix), 0.5 ㎕의 [α-³⁵S]dATP, 2 ㎕의 1/8로 희석한 시쿼나제를 순서대로 넣어 혼합한 뒤 상온에서 2 내지 3분간 반응시켰다. 4 개의 튜브에 ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP를 각각 2.5 ㎕씩 분주하여 37℃에 두고 여기에 3.5 ㎕의 표지 혼합액을 넣고 원심분리하여 반응액을 섞은 뒤 다시 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 4 ㎕의 반응 종료액을 각 튜브에 넣어 반응을 종료시킨 후 75 내지 80℃에서 2분 동안 가열한 다음 전기영동 겔에 2 내지 3 ㎕씩 로딩(loading)하여 전기영동후 X-레이 필름에 감광시켜 염기서열을 분석한 결과,TLHS3유전자가 센스 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다(도 2).

폴리유비키틴 유전자(PUB)(Kim, J.H., Park, S.M., Lee, H.L., Pyee, J.H., Hong, C.B., and Lee, K.W.,J. Plant Biol.41, 227-232, 1998)의폴리유비키틴유전자(PUB)의 pBKS1-1에 삽입은 위에 기술된 내용과 동일하게 수행되었다. 단,PUB의 단백질 기록부위는 기록부위의 양쪽 말단에 해당하는 프라이머와 PCR을 이용하여 재 서브클로닝 하였다. 좀 더 자세히 설명하면,PUB의 단백질 기록부위 아미노 말단 바로 바깥의 염기서열을 일부 변형하여BamHI 제한효소 위치가 형성되게끔 프라이머를 제조하고PUB의 단백질 기록부위 카르복시 말단 바로 바깥의 염기서열을 일부 변형하여BglII 제한효소 위치가 형성되게끔 프라이머를 제조하고 PCR을 수행하여PUB의 단백질 기록부위가BamHI과BglII 제한효소로 절단 및 분리 할 수 있게 제조하였다. 여기에 사용된 프라이머는서열번호 5의 정방향 프라이머와서열번호 6의 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR 반응물에BamHI과BglII 제한효소를 처리하여 아가로즈 겔에 전기영동하였고 각각의 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean II 키트(Bio 101, U.S.A.)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수분리하였다. 순수 분리한 DNA 절편을 식물체 형질전환용 벡터인 pBKS1-1(Suh M.C. et al.,Molecules and Cells,4, 211-219, 1994)의BamHI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 반응시켜 부착시킴으로써PUB유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/PUB를 제조하였다(도 3)(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

<1-2> pBKS1-1/ TLHS3 발현벡터의 식물체로의 형질전환

pBKS1-1/TLHS3발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens) 종인 LBA4404에 도입하였다. 20 mM CaCl₂를 처리하여 만든 형질전환 수용 세포(transformation competent cell)에 DNA를 첨가하여 얼음에서 30분간 반응시킨 후 액체 질소에 1분간 방치하였다. 이것을 37℃ 수조에서 5분간 처리하여 녹인후 1 ㎖의 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 200 rpm으로 5시간 배양한 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시켰다. 침전된 아그로박테리움을 0.1 ㎖의 YEP배지에 재현탁하여 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB 고체 배지에 도말하여 28℃에서 배양하였다(An G., Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis,Methods in Enzymology,153, 292-305, 1987). 카나마이신 배지에서 콜로니를 형성한 형질전환 균주를 이용하여 담배에 형질전환 과정을 수행하였다.

pBKS1-1/TLHS3발현벡터가 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 현탁액에 담배의 잎 절편을 암상태에서 48시간 혼합시켜 배양한 후(Suh M.C., Hong C.B., et al.,Molecules and Cells, 4, 211-219. 1994), BAP 2.0 ㎎/ℓ, NAA 0.1 ㎎/ℓ, 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ및 세포탁심(cefotaxim) 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 줄기 유도배지(Murashige T. and Skoog F.,Physiol. Plant.,15, 473-497, 1962)에서 4 내지 6주 동안 기내배양하였다. 상기 기내배양에 의해 줄기가 유도되면 이를 다시 카나마이신이 200 ㎎/ℓ 함유된 MS 뿌리 유도배지(Murashige T. and Skoog F.,Physiolia Plantarum .,15, 473-497, 1962)로 옮겨 기내배양하였다. 뿌리가 유도된 식물체를 토양으로 옮겨 심었으며, 자연광 하에서 온도가 25 ±2℃로 유지되고 외부와 이중창에 의해서 차단된 온실에서 재배하여 성장과 개화 및 종자의 발달 과정을 분석하였다. 종자가 성숙되면 이를 수확하여 실온에서 2주일간 건조시킨 후 4℃에 보관하였다.

그 결과, 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 pBKS1-1/TLHS3발현벡터가 도입된 담배의 잎 절편에서 먼저 줄기가 유도되었고 이어서 뿌리가 유도되었다. 줄기가 유도되는데 약 3∼4주, 이로부터 뿌리가 유도되는데 약 4∼6주가 경과되었다.

한편, 발현벡터 pBKS1-1/PUB로 형질 전환된 담배의 제조도 상기와 꼭같은 방식으로 이루어졌다.

<1-3> 형질전환 담배에 대한 열충격처리와 in situ 분석

침윤(Imbibition) 후 3 일 된 형질전환 담배의 종자를 45 ℃에서 1 시간 조건으로 열 충격을 가하였다. 열 충격은 90% 이상의 상대습도가 유지되는 항온기에서 수행되었으며 열 충격 후 조직들은 고정액(10% formalin, 5% glicial acetic acid, 50% ethanol)에 곧바로 고정시킨 후 50%, 70%, 80%, 90% 100% ethanol로 각각 10 분 씩 탈수과정을 거치고 65 ℃에서 파라핀을 조직내로 침투시켜 조직을 고정하였다. 파라핀 고정된 조직은 5 uM 두께로 박절하여 slide glass 위에 고정시켰다. 조직내에 존재하는 TLHS3 단백질을 확인하기 위하여 3% H₂O₂로 10 분 동안 전처리를 하고 조직과 일차항체를 1 시간동안 혼성화반응을 수행한 후 0.05 M tris-buffer (pH 7.4)로 10 분동안 씻어줌으로써 반응을 정지시키고 DAKO LSAB 키트(DAKO, U.S.A)를 이용하여 일차항체의 위치를 발색반응으로 확인하였다. 이 때 사용된 일차항체는 TLHS3 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 수행하였다.

우선 TLHS3 단백질에 대한 폴리클로날 항체의 제조 방법은,서열번호 1로 기재되는TLHS3의 ORF를 대장균 발현벡터인 pBAD-His(Invitrogen, U.S.A)의SacI-SphI 위치에 삽입하여 대장균 균주 MC1061에 형질감염시키고 LB-amp 고체배지에서 콜로니를 형성한 형질 감염된 대장균을 37℃에서 2시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양한 후 0.2%(w/v)의 농도로 아라비노즈(arabinose)가 첨가된 LB 배지에서 배양하여 히스티딘이 표지(tagging)된 TLHS3 단백질의 과발현을 유도하였고, 배양한 대장균의 일부를 취하여 TLHS3 단백질의 대장균 내의 과발현을 호퍼 사이언티픽 인스트루먼트(Hoefer Scientific Instruments)사의 SE600 키트를 사용하여 SDS-PAGE로 확인하였다. 12개의 웰이 있는 두께 0.5 mm의 18×16 cm 겔을 만들고 각각의 시료를 시료 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.005% bromophenol blue)과 혼합하여 3분 동안 끓인 후 얼음에 1분 동안 방치하였다. 각 웰당 20 ㎍에 해당하는 시료를 전기영동한 후 염색약(0.125%(w/v) Coomassie brillant blue R-250, 50%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 빙초산)을 이용하여 30분 동안 염색하고, 10% 메탄올과 10% 빙초산을 포함하는 탈색액으로 탈색시켜 결과를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 TLHS3-His 단백질이 대장균 내에서 과발현됨을 확인하였고(도 6), 상기의 과정을 거쳐 TLHS3-His 단백질의 과발현이 확인된 대장균을 수확하고 파쇄하여 얻은 세포파쇄물을 황산암모늄 분별침강법, Ni²⁺친화 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 TLHS3 단백질을 정제하였다. 상기 정제된 단백질을 다시 SDS-PAGE를 수행하여 히스티딘이 표지된 TLHS3 단백질에 해당하는 겔의 부위를 자른 다음 전기용출법(electro-elution)으로 단백질을 분리하였으며, 상기 분리된 단백질을 항원으로 사용하였다. 항원 100 ㎍을 동일한 부피의 프룬드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 섞은 후 토끼에 주사하였고 이 후로 3주 간격으로 항원 100 ㎍에 동일한 부피의 프룬드 완전 보조제와 섞어서 3회 더 주사하였으며 마지막으로 주사한지 5일 후 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 상온에서 30분간 방치한 후 4℃에서 10시간 동안 다시 방치하였다. 상기 혈액을 4℃에서 5,500 g로 15분간 원심분리하여 상층액인 혈청을 취하였고 상기 혈청을 TLHS3 단백질에 대한 폴리클로날 항체로 이용하였다(Harlow E. and Lane D.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

PUB의 세포 내 분포를 확인하기 위하여서는 일차항체로서 유비퀴틴 단량체(ubiquitin monomer)에 대한 폴리클로날 항체(Sigma #U5379, U.S.A)를 사용하였으며, 실험 조건은 TLHS3와 동일하게 수행되었다.

그 결과, 형질전환 과정을 거친 담배의 세포로부터는 TLHS3 단백질의 분포가핵을 제외한 세포질에서 강하게 확인되었다(도 4A 참조). 그리고 이 담배 세포가 열 충격 처리되었을 시, 1시간만에 거의 모든 TLHS3 단백질이 핵 내부로 이동했음이 확인되었다(도 4B 참조). 이러한 결과는 매우 특이한 것으로서 TLHS3는 전술한 핵 내부로의 이동에 필요한 아미노산 서열이 존재하지 않으며 또한 속도와 강도면에서 매우 빠르고 강한 특징을 보인다. 아울러 열 충격 처리에 의한 단백질의 대대적인 핵 내부로의 이동에 관한 결과도 보고된 바가 없다. 이러한 사실은 폴리유비키틴(PUB)을 대상으로 검정되었다.PUB유전자가 도입된 담배 세포에서는 PUB에 대한 in situ 분석 결과, 약하나마 PUB의 분포가 핵을 포함하여 세포 전체에서 확인되었다(도 5A 참조). 이 담배 세포에 열 충격을 가하였을 시, 1 시간 후에 PUB에 대한 in situ 반응이 강해지기는 하였으나 핵 내부로의 강한 집적은 관찰되지 않았다(도 5B 참조).

<1-4> 형질전환 담배에서 TLHS3에 대한 네이티브 겔(native gel) 전기영동 및 웨스턴(western) 분석

핵 내부로 이동하는 TLHS3의 형태를 확인하기 위해 담배세포의 단백질에 대한 네이티브 겔(native gel) 전기영동과 웨스턴(western) 분석을 수행하였다. 액체질소로 냉각한 막자사발에 담배조직을 넣고 곱게 마쇄한 후 단백질 균질화 버퍼(homogenization buffer) (50 mM Tris·HCl pH 6.8)가 담긴 튜브(tube)에 분말을 넣고 잘 섞었다. 12000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후 상등액만을 취하여 네이티브 겔(native gel) 분석에 이용하였다. 각각 50 ug의 단백질 시료를 SDS-PAGE 겔의 조성에서 SDS만을 제하고 만든 네이티브 겔(native gel)에 전기영동 후 Tris-glycine 버퍼(15.6 mM Tris, 120 mM glycine) 하에 단백질을 니트로셀룰로오스(nitrocellulose)막에 전이시켜 웨스턴(western) 분석에 이용하였다. TLHS3에 대한 웨스턴(western) 분석은 화학발광(chemiluminescence)를 이용한 ECL 웨스턴 블럿 키트(ECL western blot kit) (Amersham, U.S.A)를 사용하였다. 단백질이 전이된 니트로셀룰로오스(nitrocellulose 막을 5% 비지방 건조 밀크(non-fat dry milk)가 포함된 TBS (10 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) 용액에 넣고 상온에서 1 시간동안 흔들어 주었다. 니트로셀룰로오tm(Nitrocellulose) 막에 TLHS3에 대한 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 TBS에 1:3,000으로 희석하여 넣어주고 상온에서 1 시간동안 혼성화반응을 수행하였다. 니트로셀룰로오서(Nitrocellulose) 막을 0.1% 트윈 20(Tween 20)이 첨가된 TBS-T로 15 분 간격으로 4 회 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 K(Horseradish peroxidase K)가 결합된 이차 항체(secondary antibody)를 TBS에 1: 3,000으로 희석하여 넣어주고 1 시간 동안 상온에서 혼성화반응을 수행하였다. 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)막을 TBS-T로 15 분 간격으로 4 회 세척한 후 ECL 검출시약(ECL detection reagent) 1과 2를 동일한 비율로 섞어 막과 1 분 동안 반응시킨 후 상온에서 X-ray 필름에 30 초 동안 감광시켰다.

상기의 결과로부터 특징적으로 TLHS3가 발현된 담배세포에서 열 충격에 의해 TLHS3가 강력하고 급속히 세포질에서 핵 내부로 이동함을 확인하였다. 아울러 TLHS3는 200,000 Da 이상의 크기의 복합체를 형성하며, 복합체 형성은 TLHS3의 동종중합체(homopolymer) 형성 뿐만 아니라 세포 내의 다양한 단백질과의 복합체 형성이 일어남을 확인하였다. 따라서 본 발명의 분자 샤페론 유전자TLHS3가 진핵세포에서 단백질의 핵 내부로의 이동을 촉진하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 분자 샤페론을 효과적으로 핵 내부로 이동시킬 수 있을 뿐만 아니라 분자 샤페론 유전자를 목표단백질의 유전자를 접합시켜 진핵세포에 도입하여 발현을 유도하고 여기에 열 충격을 가함으로써 그러한 목표단백질을 분자 샤페론과 함께 핵 내부로 이동시킬 수 있는 효과가 있다. 또한 분자 샤페론의 다른 단백질과의 복합체 형성능을 이용하여 목표단백질을 분자 샤페론과 함께 핵 내부로 이동시킬 수 있는 효과가 있다.

<110> HONG, Choo Bong <120> Method for targeting molecular chaperones into nucleus <130> 1p-07-13B <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 480 <212> DNA <213> tobacco <400> 1 atgtctttga ttccaagctt ctttggtggc cgcaggagca acatctttga tccattctcc 60 ctcgacctat gggatccttt cgagggcttc cctttctccc gcacagtcgc caacactcca 120 acctctgctc gtgaaaccgc tgctttcgcc agcgctcgaa ttgattggaa agagacccca 180 gaatcccact tcttcaaggt ggatcttcct ggaattaaga aagaagaggt gaaggttgag 240 gtagaagaag gaagagttct acaaattagt ggggagagaa gcagagagga agaggagaat 300 aacgacaaat ggcaccgtat ggagaggagc agcggcaagt tccttaggag gtttaggctg 360 ccggaaaata ccaagatgga ggagattaaa gcagcaatgg agaatggagt gctcactgtg 420 actgtaccaa aaatggagga aaagaaacct gaggtgaagg ccattgacat ctcttgttaa 480 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> tobbaco <400> 2 Met Ser Leu Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Ile Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Leu Trp Asp Pro Phe Glu Gly Phe Pro Phe 20 25 30 Ser Arg Thr Val Ala Asn Thr Pro Thr Ser Ala Arg Glu Thr Ala Ala 35 40 45 Phe Ala Ser Ala Arg Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Glu Ser His Val 50 55 60 Phe Lys Val Asp Leu Pro Gly Ile Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu 65 70 75 80 Val Glu Glu Gly Arg Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Ser Arg Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Asn Asn Asp Lys Trp His Arg Met Glu Arg Ser Ser Gly 100 105 110 Lys Phe Leu Arg Arg Phe Arg Leu Pro Glu Asn Thr Lys Met Glu Glu 115 120 125 Ile Lys Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys 130 135 140 Met Glu Glu Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Cys 145 150 155 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 3 gctctagagt caaagtcctc attcaga 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer <400> 4 gctctagatt aacaagagat gtcaatg 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 5 ccaggatccg caaatcttcg tca 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer <400> 6 gaagatctac cacgaagtct aag 23 <210> 7 <211> 480 <212> DNA <213> tobacco <400> 7 atgtctctga ttccaagctt ctttgatggc cgcaggagca acatcttcga tccattctcc 60 ctcaacatat gggatccttt cgagggcttc cctttctccg gcacggtcgc caacattcca 120 acctctactc gtgaaaccgc tgctttctcg agtgctcgaa ttgattggaa agagacccca 180 gaatcccatg tctttaaggt ggatcttcct ggaattaaga aagaggaggt gaaggtggag 240 gtagaagaag gaagagttct acaaattagt ggcgagagaa gcagagagca agaggagaag 300 aacgataaat ggcacagcat ggagaggagc agcggaaagt tccttaggag gtttaggttg 360 ccggagaata tcaaaatgga agagattaag gcaactatgg agaatggggt gctcactgtg 420 actgtcccaa aaatggagga aaagaaacct gaggtgaagg ccattgacat ctctggttaa 480

Claims

TLHS3 및 저분자량 HSP들(small heat shock proteins)로 구성된 군에서 선택된 분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터를 진핵세포에 형질전환시켜 발현시키고 열 충격을 가하여 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 분자 샤페론 유전자에 결합된 목표단백질의 유전자를 추가로 포함함으로써 분자 샤페론을 목표단백질과 함께 핵 내부로 이동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환체에서 발현된 분자 샤페론의 다른 단백질과의 복합체 형성능을 이용하여 목표단백질을 분자 샤페론에 결합시켜 핵 내부로 이동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 목표단백질은 전사인자(transcription factor)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 진핵세포는 식물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 발현벡터는 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/TLHS3인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 진핵세포는 동물세포인 것인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 분자 샤페론은서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 지니는 TLHS3인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 TLHS3는서열번호 1에 기재된 염기서열로 구성된TLHS3유전자에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
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