KR100443571B1 - 분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물 종자의 발아를촉진하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 분자 샤페론(molecular charperone) 유전자를 식물체에 형질전환시켜 발현시킴으로써 식물 종자의 발아율과 발아속도를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법은 분자 샤페론 유전자를 식물체에 형질전환시켜 형질전환 식물체 내에서 발현되도록 유도하여 형질전환 식물체 종자의 발아율과 발아속도를 현저하게 향상시키므로 종자의 발아에 필요한 시간을 단축시켜 영농에 소요되는 기간을 단축할 수 있는 장점이 있다.

Description

분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법{The method to promote plant seed germination using molecular chaperone}

본 발명은 분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 분자 샤페론 유전자를 식물체에 형질전환시켜 발현시킴으로써 식물 종자의 발아율과 발아속도를 촉진하는 방법에 관한 것이다.

식물의 종자는 식물의 증식 수단으로써 우리 인류에게는 중요한 식량원 중의 하나이다. 현화식물의 경우, 꽃가루의 정자세포와 암술의 난(egg)이 성공적으로 수분하게 되면 암술의 씨방에서 세포분열을 거쳐 배(embryo)를 형성하고 탈수과정과 종피의 형성과정을 거쳐 종자로 완성된다. 종자는 대개 환경 스트레스에 대해뛰어난 내성을 가지고 있어서 극한의 환경을 극복할 수 있으므로 식물체의 증식과 종족보존을 가능하게 한다. 종자는 일단 식물체의 성장에 적절한 환경을 접하게 되면 물을 흡수하고 발아하게 되며, 그 결과로 식물체는 새로운 삶을 시작하게 된다.

적어도 지난 50년 동안 사람들은 종자의 효용(seed performance)을 향상시킬 수 있는 방법, 특별히 종자의 발아를 향상시키는 것과 묘종(seedling)을 확립하는 것에 대해서 관심을 가져왔다. 종자를 뿌리기 전에 여러 가지 조건들을 조절해서 발아과정을 시작하거나 종결시키는 처리를 하는 것은 실제적인 몇 가지 이점을 가지고 있는데, 특별히 발아가 동시에 일어나고(synchronized) 촉진되는(accelerated) 상황에서 그러하다. 발아가 동시에 일어나서 동일한(uniform) 개체군의 묘종을 빨리 확립하면 작물이 잡초와 싸울 수 있는 능력이 향상되고, 작물의 동일함(uniformity)이 향상된 개체군을 포함하므로 수확할 때 추가적인 경제적 이점이 있는 등의 장점이 있다. 또한, 종자를 뿌린 후 발아가 빨리 되면 껍질이 벗겨진 상태를 빨리 안정화시키게 되므로 침식(erosion)을 줄일 수 있으며, 골프 그린(green) 같은 경기장(playing field)을 적은 양의 씨를 사용하고도 경기할 수 있는 정도의 수준(playable level)으로 단기간에 만들 수 있을 뿐만 아니라 뿌린 종자가 감염에 노출되는 것을 줄일 수 있고, 따라서 잘록병(damping off) 등과 같은 질병의 예방을 위해서 사용하는 화학약품의 양을 줄일 수 있다. 아울러, 종자의 발아를 촉진함으로써 영농에 소요되는 기간을 단축할 수 있다는 큰 장점이 있다.

발아를 촉진하기 위해서는 물리적인 또는 화학적인 처리를 할 수 있는데, 이렇게 하는 주된 이유는 종자가 만들어진 후의 휴지기(dormancy period)를 줄이기 위해서이다. 상기의 물리·화학적 처리에는 종자를 빛이나 차고 습한 상황에 노출시키는 방법, 지베렐린 산(gibberellic acid), 질산 칼륨(potassium nitrate), 치오-요소(thio-urea), 과산화수소 또는 에틸렌(ethylene) 같은 화학물질을 처리하는 방법 또는 종자를 단단하게 하고 삼투 프라이밍(osmotic priming)을 실시하며 기계적으로 밭을 고르는(scarification) 방법 등이 있다.

한편, 종자의 수화(hydration)를 조절하면 발아하는 시간과 발아의 동시성(synchronization)에 영향을 미칠 수 있는데, 지금까지 알려진 수화를 조절하는 방법들은 대개는 수화되는 동안에 종자가 이용할 수 있는(available) 물의 양을 제한하는 것이다. 예를 들면, 삼투 프라이밍 방법에서는 종자가 수화되는 동안에 이용할 수 있는 물의 양을 줄이는 역할을 하는 글리콜(glycol)이 용해된 수용액에 종자를 노출시키게 되는데, 일반적으로 수화 이후에 추가적으로 종자를 건조시키는 것은 삼투 프라이밍에 의해 획득한 촉진(advancement) 혹은 동시성(synchronization)의 정도를 줄이게 된다.

종자를 단단하게 하는 처리는 종자가 물을 흡수한 후 다시 원래 정도의 수분 양을 포함하도록 건조하는 과정을 포함하는데, 종자의 수분 섭취는 이용할 수 있는 물의 양이나 흡수 시간에 의해 제한을 받는다. 종자를 단단하게 하기 위하여, 종자는 공기나 열 혹은 동결 건조 등의 방법에 의해서 원래의 수분 양에 근접한 정도로 다시 건조되는데, 이렇게 함으로써 악화(deterioration)됨이 없이 종자를 보존할 수 있다. 종자를 단단하게 하면 여러 가지 반응이 나타나는데, 어떤 경우에는 다시 건조함으로써 발아 전에 수화처리의 효과를 얻지 못하게 되어서 수화 처리되지 않은 종자에서 볼 수 있는 것과 같은 발아가 지연되고 동기화되지 않는 상황이 발생한다. 다른 경우에는 탈수화(dehydration)가 2차 휴면기(secondary dormancy)를 일으키기도 하며, 심지어는 배(embryo)에 손상을 입히기도 한다. 종자를 단단하게 하는 것이 성공적으로 이루어지면, 대개는 발아에 필요한 시간을 며칠 정도 단축시키는 효과를 볼 수 있다.

식물체 종자의 발아에는 전술한 바와 같이 물의 존재가 필수적이고 적절한 온도, 적절한 광(光)조건, 적절한 저온처리, 종피의 부분적인 파열 등의 조건들이 식물체에 따라 요구되며, 발아조건이 충족되지 않을 때는 종자의 발아가 실패하게 된다(Bewley, J.D., Seed germination and dormancy.Plant Cell, 9, 1055-1066, 1997). 이러한 현상은 식물체가 자연계에서 생존하기 위해서 필요한 환경에 대한 적응능이라고 생각되는데, 100%에 근접한 발아율이 요구되는 영농의 경우에는 극복해야 할 현상이기도 하다. 따라서, 종묘회사는 종자의 발아율을 높이기 위해 많은 노력을 투자하고 있는 실정이다.

식물체 종자의 발아를 촉진하기 위하여 상기에서 기술한 여러 가지 방법들이 사용되고 있으나 상기 방법들은 번거롭고 효율이 떨어지는 등의 불편함이 있었다.

한편, 유전물질의 정보가 1차원적 폴리펩타이드(polypeptide)를 생성하는 기작에 대해서는 잘 알려져 있지만 그 폴리펩타이드가 기능을 가진 3차원적 구조를 형성하는 과정에 대해서는 밝혀진 바가 적다. 처음에 통용된 가설은 자가조립(self-assembly)에 의해 3차원 구조가 형성된다는 것으로 이것은 각 폴리펩타이드가 자발적으로 낮은 자유에너지의 접힘 구조로 상호 변환되므로 아미노산을 암호화하는 핵산 서열의 특이성만으로도 기능적 구조의 단백질을 만드는 것이 충분하다는 것이다. 그러나 몇몇 단백질에서 조립을 도와주는 역할을 하는 단백질, 즉 분자 샤페론이 단백질의 완전한 조립에 필요하다는 것이 1980년 말에 밝혀짐으로 해서 자가조립이 보편적 메카니즘이 아니며 많은 단백질의 3차원적 구조 형성에 분자 샤페론이 필요함이 알려졌다(Pahl, A. et al.,Cell Stress & Chaperones, 2, 78-86, 1997).

분자 샤페론은 통상 열충격 단백질(heat shock protein)이라고 알려져 있는데, 많은 경우 폴리펩타이드 내의 하부도메인(subdomain) 간 또는 폴리펩타이드와 다른 분자들 간의 상호작용에 의해 부정확한 구조를 형성하는 것을 방지하는 역할을 한다. 분자 샤페론은 폴리펩타이드의 정확한 조립을 매개하지만 기능을 갖춘 단백질로의 조립이 끝나면 더 이상 그 단백질의 하부구조(subunit)가 아니므로 조립되는 단백질과는 관련없는 성분이라고 말할 수 있다.

분자 샤페론은 비기능적인(nonfunctional) 구조를 만드는 다른 조립 경로(alternative assembly pathways)를 저해함으로써 폴리펩타이드가 자가조립하는 것을 돕는데, 새롭게 합성되는 폴리펩타이드 사슬의 접힘을 매개하여 단백질 기질이 더이상 잘못접히지(misfolding) 않는 구조(conformation)를 가지면 그들로부터 분리된다. 이러한 분자 샤페론은 단백질의 접힘과 조립 과정 동안 부분적으로 접힌 중간대사물에 일시적으로 결합하는 능력에 의해 특징지어 지는데, 일반적으로 완전하게 접히고 조립된 구조에는 결합하지 않으며 너무 이른 접힘과 중간대사물의 집합을 막아서 생산적인 접힘과 조립이 좀 더 효율적인 과정이 되도록 하는 역할을 한다.

이와 같이, 분자 샤페론은 광범위한 단백질들의 잘못 접힘을 방지하여 정상적인 구조의 단백질이 형성되는데 도움을 준다는 것이 확인되고 있다. 또한, 분자 샤페론에 의해 도움을 받는 대상 단백질이 생물체의 생리나 발생 과정에 중요한 역할을 할 경우 분자 샤페론은 결과적으로 생물체의 생리와 발생 과정에 중요한 영향을 미칠 것으로 예상되며 이러한 경우의 예들이 다수 보고되고 있다(Mayer, M.P. and Bukau, B.,Biol. Chem., 379, 261-268, 1998; Waters, E.R., Lee, G.J., and Vierling, E.,J. Exp. Bot., 47, 325-338, 1996). 그러나 분자 샤페론이 식물의 종자 발아에 관여함을 보고한 예는 없다.

이에, 본 발명자들은 식물 종자의 발아를 촉진시키기 위하여 노력한 결과 샤페론 유전자가 식물 종자의 발아를 촉진시키는 것을 처음으로 발견하고 담배로부터 얻은 샤페론 유전자가 도입된 담배와 상추에서 현저한 발아율의 증가와 발아속도의 촉진을 확인하여 상기 분자 샤페론 유전자가 식물의 발아 촉진에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 분자 샤페론 유전자를 이용한 종자 발아 촉진 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 분자 샤페론 유전자인서열번호 1로 기재되는TLHS2및서열번호 3으로 기재되는TLHS3를 포함하고 있는 플라스미드 벡터 pBluescript II SK(+)/TLHS2와 pBluescript II SK(+)/TLHS3의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의TLHS2와TLHS3유전자를 식물체에서 발현시키기 위해 사용된 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3가 도입되어 형질전환된 담배와 상추에 대한 노던 블롯(Northern blot) 결과를 나타내는 전기영동 사진이고,

A ; 형질전환 담배에서의TLHS2유전자의 전사

B ; 형질전환 담배에서의TLHS3유전자의 전사

C ; 형질전환 상추에서의TLHS2유전자의 전사

D ; 형질전환 상추에서의TLHS3유전자의 전사

레인 1 ; 일반 담배 또는 상추

레인 2 내지 레인 6 ; 형질전환 담배 또는 상추

도 4는 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3가 도입된 형질전환 담배와 상추의 종자에 대한 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 나타내는 전기영동 사진이고,

A ; 형질전환 담배에서의TLHS2유전자의 번역

B ; 형질전환 담배에서의TLHS3유전자의 번역

C ; 형질전환 상추에서의TLHS2유전자의 번역

D ; 형질전환 상추에서의TLHS3유전자의 번역

레인 1 ; 일반 담배 또는 상추

레인 2 내지 레인 4 ; 형질전환 담배 또는 상추

도 5는 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3가 도입된 형질전환 담배와 상추의 정상적인 성장을 보여주는 사진이고,

A ; 형질전환 담배

B ; 형질전환 상추

도 6은 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2가 도입된 형질전환 담배의 종자가 일반 담배의 종자보다 발아가 빨리 일어나는 것을 보여주는 사진이고,

A ; 형질전환 담배 종자

B ; 일반 담배 종자

도 7은 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS2가 도입된 형질전환 상추의 종자가 일반 상추의 종자보다 발아가 빨리 일어나는 것을 보여주는 사진이고,

A ; 형질전환 상추 종자

B ; 일반 상추 종자

도 8은 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS3가 도입된 형질전환 담배의 종자가 일반 담배의 종자보다 발아가 빨리 일어나는 것을 보여주는 사진이고,

A ; 형질전환 담배 종자

B ; 일반 담배 종자

도 9는 본 발명의 식물발현 벡터 pBKS1-1/TLHS3가 도입된 형질전환 상추의 종자가 일반 상추의 종자보다 발아가 빨리 일어나는 것을 보여주는 사진이고,

A ; 형질전환 상추 종자

B ; 일반 상추 종자

도 10은 상기도 6과도 7에서 예시된 발아율의 결과를 통계처리하여 나타낸 것이고,

A ; 형질전환 담배의 발아율

B ; 형질전환 상추의 발아율

□; 일반 식물체

■; 형질전환 식물체

도 11은 상기도 8과도 9에서 예시된 발아율의 결과를 통계처리하여 나타낸 것이고,

A ; 형질전환 담배의 발아율

B ; 형질전환 상추의 발아율

□; 일반 식물체

■; 형질전환 식물체

도 12는 TLHS2 단백질이 대장균에서 과발현됨을 보여주는 사진이다.

레인 1 ; 아라비노즈가 배지에 첨가되지 않아 TLHS2의 과발현이 유도되지 않은 대장균에서 추출한 단백질의 SDS-PAGE 결과

레인 2 내지 레인 4 ; 아라비노즈를 배지에 첨가하여 TLHS2의 과발현이 유도된 대장균에서 추출한 단백질의 SDS-PAGE 결과

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분자 샤페론 유전자로 식물체를 형질전환시켜 종자의 발아율과 발아속도를 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 분자 샤페론 유전자를 형질전환시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 분자 샤페론 유전자로 식물체를 형질전환시켜 종자의 발아율과 발아속도를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 분자 샤페론 유전자를 식물체 종자의 발아 촉진에 사용하기 위하여, 먼저 담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클론을 확보하였다. 기존의 연구결과에 의해 분자 샤페론의 cDNA 클론으로 확인된서열번호 5로 기재되는TLHS1(Park, S.M. and Hong, C.B.,Molecules and Cells, 8, 594-599, 1998; Joe, M.K. et al.,Molecules and Cells, 10, 519-524, 2000) 유전자의 cDNA를 탐침으로 사용하여 담배의 게놈 라이브러리(genome library)를 두차례 스크리닝(screening)하였다. 이로부터 선별된 분자 샤페론의 게놈 클론으로 예상되는 클론들을 배양하여 각각의 재조합 파지(phage) DNA를 수확하였고, 수확된 파지 DNA를 제한효소로 절단하고 전기영동한 후TLHS1유전자를 탐침으로 사용하여 DNA 혼성화 반응을 수행하였다. DNA 블롯 분석을 수행하여 확인된, 분자 샤페론 단백질의 전체 기록부위를 포함할 것으로 예상되는 DNA 절편을 분리하여 플라스미드 벡터의 다중클로닝 부위(multicloning site) 내에 서브클로닝하였다.

다음으로, 플라스미드 벡터에 존재하는 다중 클로닝 부위의 염기서열을 이용하여 서브클로닝된 분자 샤페론 유전자의 염기서열을 양방향으로부터 결정하였다. 이로부터 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 완전한 ORF(open reading frame)를 포함하고 있는 것으로 판단되는 2개의 게놈 클론의 분자 샤페론 유전자를 확보하였으며, 이들을 각각TLHS2와TLHS3로 명명하였다. 상기TLHS2는서열번호 1로 기재되는 462개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있으며서열번호 2의 아미노산 서열로 번역되고,TLHS3은서열번호 3로 기재되는 477개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있으며서열번호 4의 아미노산 서열로 번역되었다.

이와같이 결정된 염기서열에 기초하여TLHS2와TLHS3의 단백질 기록 부위만을 제한효소로 처리하여 분리한 후 분리한 DNA를 플라스미드 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하여TLHS2와TLHS3분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하였으며(도 1참조), 상기 벡터가 형질감염된 형질전환 대장균을 2000년 10월 21일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0879BP 및 KCTC 0880BP).

TLHS2와TLHS3의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시키기 위하여, 상기TLHS2와TLHS3유전자의 대장균 내 발현벡터로부터 제한효소 처리에 의해 얻은 각각의TLHS2또는TLHS3유전자의 단백질 기록부위를 식물체 형질전환용 벡터에 삽입하여TLHS2및TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터를 제조하였다(도 2참조). 상기에서 식물체 형질전환용 발현벡터를 제조하기 위하여TLHS2또는TLHS3유전자와 염기서열이 24 뉴클레오타이드 범위에서 70% 이상의 상동성을 보이는 본 발명의 분자 샤페론 유전자의 유사체를 사용할 수 있다. 상기 발현벡터에TLHS2와TLHS3유전자의 단백질 기록부위가 올바로 삽입되었는지 염기서열을 분석하여 확인한 결과,TLHS2와TLHS3유전자는 발현벡터가 가지고 있는 CaMV35S 프로모터(promoter)와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위(terminator) 사이에 센스(sense) 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다.

본 발명의 분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물체의 종자 발아를 촉진하는 방법은,

1) 분자 샤페론 유전자 또는 그의 유사체를 포함하는 식물체 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1의 식물체 형질전환용 발현벡터를 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환 식물체로부터 분자 샤페론 유전자 및 그의 유사체를 발현시켜 종자의 발아율과 발아속도를 촉진시키는 단계로 구성된다.

상기에서 단계 1의 분자 샤페론 유전자 또는 그의 유사체로는 모든 종류의 분자 샤페론 유전자가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의TLHS2및TLHS3유전자와 HSP(heat shock protein) 70, HSP 60, HSP 90, HSP 100, GroEL, GroES, 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin), 샤페로닌(chaperonin), 및 저분자량 HSP(small HSP) 등이 사용될 수 있다.

본 발명자들은 분자 샤페론 유전자가 식물의 발아율과 발아속도에 미치는 영향을 확인하기 위한 바람직한 실시예로서, 본 발명의 분자 샤페론 유전자TLHS2또는TLHS3가 형질전환되었음이 확인된 담배와 상추를 자가수분시켜 형성된 종자에 대한 발아시험을 수행하였다. 그 결과,TLHS2또는TLHS3유전자가 도입되어 발현된 형질전환 담배는 정상적인 발육을 보였으며 개화과정이나 꽃의 형태도 정상적이었다(도 5참조). TLHS2 또는 TLHS3 단백질이 형성되었음이 확인된 형질전환 담배 종자의 발아율 변화를 분석한 결과, 비형질전환 담배의 경우에는 4일이 경과하여도 거의 종자의 발아가 관찰되지 않았고 1주일이 경과되어야 10% 미만의 종자에서 발아가 관찰되기 시작한 반면에,TLHS2가 도입되어 발현된 형질전환 담배의 경우에는 2일 경과 후 40% 정도의 발아율을 보였고(도 6참조)TLHS3가 도입된 형질전환 담배의 경우에는 2일 경과 후 10% 정도의 발아율이 관찰되었다(도 8참조).TLHS2또는TLHS3가 도입되어 발현된 형질전환 담배의 경우에는 3일이 경과한 후에는 50%정도의 발아율을 보였는데(도 10의A및도 11의A참조), 상기 결과는 일반적인 담배 종자의 경우 50%의 발아율을 나타내기 위하여 암상태, 22℃의 조건에서 10일 이상의 기간이 요구되는 것과 비교할 때, 본 발명의TLHS2또는TLHS3유전자의 도입으로 인하여 담배 종자의 발아율과 발아속도가 괄목할만하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

또한,TLHS2또는TLHS3유전자가 도입되어 발현된 형질전환 상추 역시 정상적인 발육을 보였으며 개화과정이나 꽃의 형태도 정상적이었다(도 5참조). TLHS2 또는 TLHS3 단백질이 형성되었음이 확인된 형질전환 상추 종자의 발아율 변화를 분석한 결과, 비형질전환 상추의 경우에는 2일 경과까지는 거의 종자의 발아가 관찰되지 않았고 4일이 경과되어야 10% 미만의 종자에서 발아가 관찰되기 시작한 반면에,TLHS2가 도입되어 발현된 형질전환 상추의 경우에는 4일 경과 후 90% 정도의 발아율을 보였다(도 7,도 9및도 10의B참조).TLHS3가 도입된 형질전환 상추의 경우에도 4일 경과 후 90% 정도의 발아율을 보였는데(도 11의B참조), 상기의 결과로부터 상추의 경우에도TLHS2또는TLHS3유전자의 도입으로 발아율과 발아속도가 괄목할만하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 분자 샤페론 유전자TLHS2및TLHS3가 식물체의 발아율과 발아속도의 향상에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 분자 샤페론 유전자를 형질전환시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로서,TLHS2또는TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 각각을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 종인 LBA4404에 직접 형질전환(direct transformation)시키고, 상기 형질전환 균주를 이용하여 담배와 상추에 형질전환 과정을 수행하였다. 담배의 형질전환을 위해서는 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacumcv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였고, 상추의 형질전환을 위해서는 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativusL. cv.) 청치마의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.

상기TLHS2또는TLHS3발현벡터가 도입되어 형질전환된 담배와 상추에서 본 발명의 분자 샤페론 유전자가 전사(transcription)되는지를 확인하기 위하여, 형질전환 담배와 상추로부터 전체 RNA를 추출하여TLHS2또는TLHS3유전자를 탐침으로 노던 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, 형질전환 과정을 거쳐 재분화된 모든 담배와 상추로부터TLHS2또는TLHS3유전자의 전사체 부위에 특이적으로 나타나는 밴드가 확인되었으며, 형질전환 과정을 거치지 않은 대조군 담배와 상추로부터는TLHS2또는TLHS3유전자의 전사체에 대응하는 특이적인 밴드가 관찰되지 않았다(도 3참조). 상기의 결과로부터, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추는 목표한 유전자인TLHS2또는TLHS3가 도입되어 정상적으로 mRNA가 생성되고 있음을 확인하였다.

노던 블롯 분석을 통해 형질전환 담배와 상추로부터TLHS2및TLHS3유전자가 정상적으로 전사되고 있음을 확인한 본 발명자들은TLHS2및TLHS3유전자의 번역 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 형질전환체임이 확인된 담배와 상추를 자가수분시켜 종자를 형성하게 하고 형성된 종자로부터 단백질을 추출한 후, TLHS2 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 수행하였다. 이때, 폴리클로날 항체는 정제된 TLHS2 단백질을 항원으로 이용하여 면역화시킨 토끼의 혈청을 취하여 사용하였다. 그 결과, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추의 종자로부터는 공히 TLHS2 또는 TLHS3 단백질에 의한 것으로 판단되는 특이적인 밴드가 확인된 반면 형질전환 과정을 거치지 않은 담배와 상추의 종자로부터는 특이적인 단백질 밴드가 확인되지 않았다(도 4참조). 상기의 결과로부터, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추에는 목표한 유전자인TLHS2또는TLHS3가 도입되어 정상적으로 단백질이 발현됨을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클로닝

담배로부터 분자 샤페론 유전자의 클론을 확보하기 위하여, 기존의 연구결과에 의해 분자 샤페론 유전자로 확인된서열번호 5로 기재되는TLHS1(Park, S.M.and Hong, C.B.,Molecules and Cells, 8, 594-599, 1998; Joe, M.K. et al.,Molecules and Cells, 10, 519-524, 2000) 유전자의 cDNA를 탐침으로 사용하였다.

<1-1> 담배 게놈 라이브러리의 스크리닝

Clontech사(U.S.A)로부터 구입한 EMBL3 벡터의BamHI 부위에 삽입된 담배 게놈 라이브러리를 23 cm×23 cm LB 바텀 아가 플레이트(bottom agar plate)에 깔린 대장균(Escherichia coli) 종인 KW251 위에 도말하였다. 플레이트 위에 약 1×10⁵개의 플라크(plaque)가 형성된 후, 1 차 스크리닝을 위해 플레이트를 하이본드-N 나일론(Hybond-N nylon) 막에 블롯팅(blotting)하였다.서열번호 5로 기재되는TLHS1유전자가 들어있는 플라스미드 벡터(Joe, M.K. et al.,Molecules and Cells,10, 519-524, 2000)를 제한효소인BamHI/XbaI으로 절단하여 얻은 절편을³²P로 표지한 후, 상기 표지된 절편을 블롯팅된 막에 가하여 65℃에서 혼성화 반응을 수행하였다. 1차 스크리닝 결과 양성신호(positive signal)를 보였던 플라크를 분리하여 아가 플레이트 위에 플라크를 형성시킨 후, 1차 스크리닝과 동일한 방법으로 혼성화 반응을 수행하여 2차 스크리닝을 실시하였다(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

<1-2> 분자 샤페론 유전자의 서브클로닝(subcloning)

상기 실시예 <1-1>의 스크리닝 결과로 분리된, 분자 샤페론의 게놈 클론으로 예상되는 클론들을 배양하여 각각의 재조합 파지(phage) DNA를 수확하였다(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

수확된 파지 DNA를 제한효소SalI,BamHI,EcoRI으로 단일 절단(single digestion) 또는 이중 절단(double digestion)하고 아가로즈 겔 전기영동한 후,서열번호 5로 기재되는TLHS1유전자를 탐침으로 사용하여 게놈라이브러리의 1, 2차 스크리닝과 동일한 방법으로 DNA 혼성화 반응을 수행하였다. 서던 블롯 분석을 수행하여 확인된 분자 샤페론 유전자의 전체 기록 부위를 포함하는 DNA 절편 부위를 아가로즈 겔로부터 수확·분리하여 플라스미드 벡터 pBluescript II SK(+)(Promega, U.S.A)의 다중클로닝 부위 내의BamHI과SalI 부위에 T4 DNA 접합효소(ligase)를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 벡터에 부착시킴으로써 분자 샤페론 유전자의 전체 기록 부위를 포함하는 상기 DNA 절편을 서브클로닝하였다.

<1-3> 분자 샤페론 유전자의 염기서열 결정

플라스미드 벡터에 존재하는 다중 클로닝 부위의 염기서열을 이용하여 플라스미드 벡터 pBluescriptII SK(+)에 서브클로닝된 분자 샤페론 유전자의 염기서열을 양방향으로부터 결정하였다. 간략하게 설명하면, 엑소뉴클리아제 III(exonuclease III)를 사용하는 시퀀싱 키트(deletion kit for kilo-sequencing, Takara, Japan)를 이용하여 한쪽 방향 삭제 시리즈(deletion series)를 제작하였으며, 서열 버전 2.0(Sequenase version 2.0, United States Biochemical Cooperation, U.S.A.)을 사용하여 생거(Sanger)의 다이디옥시 사슬 종결법(dideoxy chain termination, Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)으로 한쪽 방향으로 절삭된 클론들의 염기서열을 결정하였다. 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 완전한 ORF를 포함하고 있는 것으로 판단되는 2개의 게놈 클론의 분자 샤페론 유전자를 확보하였으며, 각각TLHS2와TLHS3로 명명하였다. 상기TLHS2는서열번호 1로 기재되는 462개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있었으며서열번호 2의 아미노산 서열로 번역되었고,TLHS3은서열번호 3으로 기재되는 477개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있었으며서열번호 4의 아미노산 서열로 번역되었다.

<1-4> TLHS2 및 TLHS3 유전자의 재 서브클로닝

상기 실시예 <1-3>에서 결정된 염기서열에 기초하여TLHS2와TLHS3의 단백질 기록부위 양쪽 끝에 프라이머와 PCR을 이용하여XbaI 제한효소 위치를 만들었다. 좀 더 자세히 설명하면,TLHS2와TLHS3의 단백질 기록부위 바로 바깥의 염기서열을 일부 변형하여XbaI 제한효소 위치가 형성되게끔 프라이머를 제조하고 PCR을 수행하여TLHS2와TLHS3의 단백질 기록부위가XbaI 제한효소 위치로 쌓이게 제조하였다. 여기에 사용된 프라이머는TLHS2유전자의 경우에는 정방형 프라이머와 역방향 프라이머로 각각서열번호 6과서열번호 7로 기재되는 프라이머를 사용했으며,TLHS3유전자의 경우에는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 각각서열번호 8과서열번호 9로 기재되는 프라이머를 사용하였다.

이렇게 제조된TLHS2와TLHS3의 단백질 기록부위가XbaI 위치로 쌓인 재조합 DNA들을 제한효소XbaI으로 처리하여 아가로즈 겔에 전기영동하였고 각각의 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean II 키트(Bio 101, U.S.A.)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수분리하였다. 분리한 DNA를 pBluescript II SK(+)의XbaI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 부착시킴으로써 pBluescript II SK(+)/TLHS2와 pBluescript II SK(+)/TLHS3벡터를 제조하였으며(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)(도 1), 상기 벡터가 형질감염된 형질전환 대장균을 2000년 10월 21일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0879BP 및 KCTC 0880BP)

<1-5> TLHS2 및 TLHS3 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현 벡터의 제조

TLHS2및TLHS3유전자의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시키기 위하여, 상기 실시예 <1-4>에서 제조된 pBluescript II SK(+)/TLHS2와 pBluescript II SK(+)/TLHS3벡터에XbaI 제한효소를 처리하여 아가로즈 겔에 전기영동하였고 각각의 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean II 키트(Bio 101, U.S.A.)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수분리하였다. 순수분리한 DNA 절편을 식물체 형질전환용 벡터인 pBKS1-1(Suh M.C. et al.,Molecules and Cells,4, 211-219, 1994)의XbaI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 반응시켜 부착시킴으로써TLHS2및TLHS3유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3를 제조하였다(도 2)(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

상기 발현벡터 내에TLHS2및TLHS3유전자의 단백질 기록부위가 pBKS1-1이 가지고 있는 CaMV35S 프로모터와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위 사이에 올바르게 삽입된 것을 확인하기 위하여, pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3를 각각 DNA 시료로 준비하고 CaMV35S 프로모터의 3'말단 부위를 프라이머로 이용하여 Sanger 등의 다이디옥시 사슬 종결법을 이용하는 DNA 서열 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit)를 사용하였다. 정제한 DNA에 2 ㎕의 시쿼나제(sequenase) 완충액(200 mM Tris·HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl)과 0.5 pmol의 프라이머를 넣어 65℃에서 2분간 반응한 뒤 상온에 30분간 방치하였다. 여기에 1 ㎕의 0.1 M DTT, 2 ㎕의 1/5로 희석한 표지 혼합액(labeling mix), 0.5 ㎕의 [α-³⁵S]dATP, 2 ㎕의 1/8로 희석한 시쿼나제를 순서대로 넣어 혼합한 뒤 상온에서 2 내지 3분간 반응시켰다. 4 개의 튜브에 ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP를 각각 2.5 ㎕씩 분주하여 37℃에 두고 여기에 3.5 ㎕의 표지 혼합액을 넣고 원심분리하여 반응액을 섞은 뒤 다시 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 4 ㎕의반응 종료액을 각 튜브에 넣어 반응을 종료시킨 후 75 내지 80℃에서 2분 동안 가열한 다음 전기영동 겔에 2 내지 3 ㎕씩 로딩(loading)하여 전기영동후 X-레이 필름에 감광시켜 염기서열을 분석한 결과, 각각의TLHS2및TLHS3유전자가 센스 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다(도 2).

<실시예 2> TLHS2 및 TLHS3 유전자가 형질전환된 형질전환 식물체의 제조

본 발명의TLHS2및TLHS3유전자가 형질전환된 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 담배와 상추를 숙주 식물체로 사용하였다. 담배의 형질전환을 위해서는 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacumcv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였고, 상추의 형질전환을 위해서는 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativusL. cv.) 청치마의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.

<2-1> pBKS1-1/ TLHS2 와 pBKS1-1/ TLHS3 발현벡터의 식물체로의 형질전환

pBKS1-1/TLHS2와 pBKS1-1/TLHS3발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 종인 LBA4404에 도입하였다. 20 mM CaCl₂를 처리하여 만든 형질전환 수용 세포(transformation competent cell)에 DNA를 첨가하여 얼음에서 30분간 반응시킨 후 액체 질소에 1분간 방치하였다. 이것을 37℃ 수조에서 5분간 처리하여 녹인후 1 ㎖의 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 200 rpm으로 5시간 배양한 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시켰다. 침전된 아그로박테리움을 0.1 ㎖의 YEP배지에 재현탁하여 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB 고체 배지에 도말하여 28℃에서 배양하였다(An G., Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis,Methods in Enzymology,153, 292-305, 1987). 카나마이신 배지에서 콜로니를 형성한 형질전환 균주를 이용하여 담배와 상추에 형질전환 과정을 수행하였다.

pBKS1-1/TLHS2또는 pBKS1-1/TLHS3발현벡터가 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 현탁액에 담배와 상추의 잎 절편을 암상태에서 48시간 혼합시켜 배양한 후(Suh M.C., Hong C.B., et al.,Molecules and Cells, 4, 211-219. 1994), 담배는 BAP 2.0 ㎎/ℓ, NAA 0.1 ㎎/ℓ, 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ및 세포탁심(cefotaxim) 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 줄기 유도배지(Murashige T. and Skoog F.,Physiol. Plant.,15, 473-497, 1962)에서, 상추는 BAP 0.5 ㎎/ℓ, NAA 0.1 ㎎/ℓ, 카나마이신 100 ㎎/ℓ및 세포탁심 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 줄기 유도배지에서 각각 4 내지 6주 또는 2 내지 4주 동안 기내배양하였다. 상기 기내배양에 의해 줄기가 유도되면 이를 다시 카나마이신이 200 ㎎/ℓ 함유된 MS 뿌리 유도배지(Murashige T. and Skoog F.,Physiolia Plantarum,15, 473-497, 1962)로 옮겨 기내배양하였다. 뿌리가 유도된 식물체를 토양으로 옮겨 심었으며, 자연광 하에서 온도가 25 ±2℃로 유지되고 외부와 이중창에 의해서 차단된 온실에서 재배하여 성장과 개화 및 종자의 발달 과정을 분석하였다. 종자가 성숙되면 이를 수확하여 실온에서 2주일간 건조시킨 후 4℃에 보관하였다.

그 결과, 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 pBKS1-1/TLHS2또는 pBKS1-1/TLHS3발현벡터가 도입된 담배와 상추의 잎 절편에서 먼저 줄기가 유도되었고 이어서 뿌리가 유도되었다. 담배의 경우에는 줄기가 유도되는데 약 3∼4주, 이로부터 뿌리가 유도되는데 약 4∼6주가 경과되었으며, 상추의 경우에는 줄기가 유도되는데 약 2∼3주, 이로부터 뿌리가 유도되는데 약 2∼4주가 경과되었다.

<2-2> 형질전환 담배와 상추에 대한 노던 블롯 분석

상기 실시예 <2-1>의 과정을 통해 pBKS1-1/TLHS2또는 pBKS1-1/TLHS3발현벡터가 도입된 담배와 상추에서 본 발명의 분자 샤페론 유전자가 전사되는지를 확인하기 위하여, 형질전환 담배와 상추로부터 전체 RNA를 추출하였다(Hong C.B. and Jeon J.H., 한국식물학회지, 30, 201-203). 형질전환 담배와 상추를 막자사발을 이용해 액체질소와 함께 넣어 곱게 간 후 페놀:클로로포름(1:1)과 균질화(homogenization) 용액(50mM LiCl, 25mM Tris-HCl, 35mM EGTA, 0.5% SDS, pH 8.0)을 1:1로 넣어 잘 섞은 후 4℃에서 5000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮겨 동량의 클로로포름을 넣고 혼합한 후 4℃, 12000 rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액만 취해 동량의 4 M LiCl과 혼합한 뒤 -20℃에서 약 8시간 동안 방치하여 RNA를 침전시킨 후 4℃ 12000 rpm으로 15분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 여기에 DEPC가 처리된 멸균수를 넣어 펠렛을 용해시킨 후 동량의 페놀:클로로포름(1:1)을 넣고 추출한 후 클로로포름으로 다시 한 번 추출하여 상층액을 동량의 4 M LiCl에 옮겼다. 이를 다시 -20℃에 6시간 이상 넣어 둔 후 4℃에서 15000 rpm으로 15분간 원심분리하여 용액을 제거한 후 2 M LiCl과 70% 에탄올로 세척한 후 건조된 펠렛을 DEPC가 처리된 멸균수에 용해 시켰다. 분리한 전체 RNA는 분광광도계(spectrophotometer, Spectronic Instrument, U.S.A.)를 이용하여 200 nm에서 380 nm까지 흡광도를 측정한 후 260 nm에서 얻은 흡광도를 농도로 환산하여 정량 하였다. 추출된 RNA의 노던블롯 분석을 수행하기 위하여 1.2 g의 아가로즈에 증류수 70 ㎖을 넣고 가열해 녹인 후 5× 겔 러닝 완충액(gel runnung buffer, 0.2 M MOPS, 50 mM sodium acetate, 5 mM EDTA, pH 8.0)과 17.5% 포름알데히드(formaldehyde)를 넣고 겔을 만들어 2시간 동안 굳혔다. 10 ㎍의 전체 RNA 4.5 ㎕, 5× 겔 러닝 완충액 2 ㎕, 포름알데히드 3.5 ㎕ 및 탈 이온화된 포름아마이드 10 ㎕를 넣고 혼합하여 55℃에서 15분 동안 처리한 후, 10× 로딩 완충액(50% glycerol, 1 mM EDTA, 0.4% bromophenol blue, 0.4% xylene cyanol) 2 ㎕를 넣어 겔에 로딩한 후 80 V로 전기영동을 실시하였다. 그 후 겔을 증류수로 세척하고 20× SSPE로 20분 동안 처리한 다음 모세관 현상을 이용하여 RNA를 Hybond-N 막으로 옮긴 후 UV를 조사해 고정·건조시켰다. 상기 막을 6× SSPE(1.08 M NaCl, 60 mM NaH₂PO₄,6 mM EDTA, pH 7.4)에 적신 다음 50% 포름아마이드, 5× SSPE, 0.1% SDS, 5× Denhardt's 용액(1 g/ℓ ficoll, 1 g/ℓ BSA)과 100 ㎍/㎖의 단일 가닥 연어 정충(salmon sperm) DNA가 포함된 전혼성화 용액에 넣어 42℃에서 3시간 동안 20 rpm으로 교반시켰다. 전혼성화가 끝나면서열번호 1로 기재되는TLHS2유전자또는서열번호 3으로 기재되는TLHS3유전자 탐침을 넣어 동일 조건에서 16 내지 20 시간 동안 혼성화 반응을 시킨 후 0.2× SSPE와 0.1% SDS가 포함된 용액으로 3시간 이상, 용액을 3회 이상 교체하여 세척한 후 -70℃에서 두 장의 증폭막(Amersham, U.S.A.)을 이용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과, 형질전환 과정을 거쳐 재분화된 모든 담배와 상추로부터TLHS2또는TLHS3유전자의 부위에 특이적으로 나타나는 전사체 밴드가 확인이 되었으며, 형질전환 과정을 거치지 않은 대조군 담배와 상추로부터는TLHS2또는TLHS3유전자에 대응하는 특이적인 전사체 밴드가 관찰되지 않았다(도 3). 상기의 결과로부터, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추는 목표한 유전자인TLHS2또는TLHS3가 도입되어 이들의 mRNA가 정상적으로 발현되고 있음을 확인하였다.

<2-3> 형질전환 담배와 상추에 대한 웨스턴 블롯 분석

상기 실시예 <2-2>의 노던블롯 분석을 통해 형질전환 담배와 상추로부터TLHS2및TLHS3유전자가 정상적으로 발현되고 있음을 확인한 본 발명자들은TLHS2및TLHS3유전자의 번역 여부를 확인하기 위하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 노던 블롯 분석으로 형질전환체임이 확인된 담배와 상추를 자가수분시켜 종자를 형성하게 하고 형성된 종자로부터 단백질을 추출한 후, TLHS2단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 수행하였다.

우선 TLHS2 단백질에 대한 폴리클로날 항체의 제조 방법은,서열번호 1로 기재되는TLHS2의 ORF를 대장균 발현벡터인 pBAD-His(Invitrogen, U.S.A)의SacI-SphI 위치에 삽입하여 대장균 균주 MC1061에 형질감염시키고 LB-amp 고체배지에서 콜로니를 형성한 형질감염된 대장균을 37℃에서 2시간 동안 200 rpm으로 진탕배양한 후 0.2%(w/v)의 농도로 아라비노즈(arabinose)가 첨가된 LB 배지에서 배양하여 히스티딘이 표지(tagging)된 TLHS2 단백질의 과발현을 유도하였고, 배양한 대장균의 일부를 취하여 TLHS2 단백질의 대장균 내의 과발현을 Hoefer Scientific Instruments사의 SE600 키트를 사용하여 SDS-PAGE로 확인하였다. 12개의 웰이 있는 두께 0.5 mm의 18×16 cm 겔을 만들고 각각의 시료를 시료 완충액(50 mM Tris·HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.005% bromophenol blue)과 혼합하여 3분 동안 끓인 후 얼음에 1분 동안 방치하였다. 각 웰당 20 ㎍에 해당하는 시료를 전기영동한 후 염색약(0.125%(w/v) Coomassie brillant blue R-250, 50%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 빙초산)을 이용하여 30분 동안 염색하고, 10% 메탄올과 10% 빙초산을 포함하는 탈색액으로 탈색시켜 결과를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 TLHS2-His 단백질이 대장균 내에서 과발현됨을 확인하였고(도 12), 상기의 과정을 거쳐 TLHS2-His 단백질의 과발현이 확인된 대장균을 수확하고 파쇄하여 얻은 세포파쇄물을 황산암모늄 분별침강법, Ni²⁺친화 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 TLHS2 단백질을 정제하였다. 상기 정제된 단백질을 다시 SDS-PAGE를 수행하여 히스티딘이 표지된 TLHS2 단백질에 해당하는 겔의 부위를 자른 다음 전기용출법(electro-elution)으로 단백질을 분리하였으며, 상기 분리된 단백질을 항원으로 사용하였다. 항원 100 ㎍을 동일한 부피의 프룬드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 섞은 후 토끼에 주사하였고 이 후로 3주 간격으로 항원 100 ㎍에 동일한 부피의 프룬드 완전 보조제와 섞어서 3회 더 주사하였으며 마지막으로 주사한지 5일 후 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 상온에서 30분간 방치한 후 4℃에서 10시간 동안 다시 방치하였다. 상기 혈액을 4℃에서 5,500 g로 15분간 원심분리하여 상층액인 혈청을 취하였고 상기 혈청을 TLHS2 단백질에 대한 폴리클로날 항체로 이용하였다(Harlow E. and Lane D.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

웨스턴 블롯 분석은 상기와 같이 제조된 폴리클로날 항체와 화학발광(chemiluminescence)을 이용한 ECL 웨스턴 블롯 키트(Amersham, U.S.A.)를 사용하여 수행하였다. 형질전환 담배와 상추의 종자를 액체질소 내에서 막자사발로 갈고 생체 1 g 당 추출 완충액(50 mM sodium phosphate pH 7.0, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.1% lauroyl sarcosine, 0.1% triton-X 100) 1 ㎖을 첨가하여 현탁하였다. 상기 현탁액을 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 단백질 시료로 사용하였다. 추출된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, 분리 겔(seperating gel) 부분만을 따로 떼어내어 니트로셀룰로스 막으로 전이시켰다. 단백질 전이는 4℃가 유지되는 저온실에서 미니 트랜스-블롯 전기영동 전이 셀(Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad, U.S.A.)을 이용하여 완충액(0.05% SDS, 25 mM Tris·Cl pH 7.5, 192 mM 글리신(glycine))을 자석교반기로 섞어주면서 90 V로 1시간 동안 수행하였다. 5% 비지방 건조 우유(non-fat dry milk)가 포함된 TBS(Tris-buffered saline; 10 mM Tris·Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5) 용액에 단백질 전이가 끝난 상기 니트로셀룰로스 막을 넣고 레드-로터(Hoefer Co., U.S.A.)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 흔들어 주었다. TBS 용액에 0.1% 트윈(tween) 20이 첨가된 TBS-T 용액으로 30분간 니트로셀룰로스 막을 세척하고, TLHS2 단백질에 대한 폴리클로날 일차항체를 TBS-T 용액에 1:5000으로 희석하여 니트로셀룰로스 막 단위면적(cm²) 당 0.1 ㎖의 비율로 첨가한 후 상기에서 세척된 니트로셀룰로스 막과 함께 상온에서 레드-로터로 1시간 동안 흔들어주면서 반응시켰다. 일차 항체와 반응 후 니트로셀룰로스 막을 상온에서 15분 간격으로 2회, 다시 10분 간격으로 2회에 걸쳐 TBS-T 용액으로 세척하였다. ECL 웨스턴 블롯 키트의 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 이차항체를 TBS-T 용액에 1:3000으로 희석하여 상기에서 세척된 니트로셀룰로스 막과 함께 상온에서 레드-로터로 1시간 동안 흔들어 주면서 반응시킨 후, 상기 니트로셀룰로스 막을 TBS-T 용액으로 15분 간격으로 2회, 다시 10분 간격으로 4회 세척하였다. ECL 탐지 시약 1과 2를 동일한 비율로 섞어(0.125 ㎖/cm²막) 니트로셀룰로스 막과 1분 동안 반응시킨 후 상온에서 X-레이 필름에 15초 동안감광시켰다(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T.,Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추의 종자로부터는 공히 TLHS2 또는 TLHS3 단백질에 의한 것으로 판단되는 특이적인 밴드가 확인된 반면, 형질전환 과정을 거치지 않은 담배와 상추의 종자로부터는 특이적인 단백질 밴드가 확인되지 않았다(도 4). 상기의 결과로부터, 형질전환 과정을 거친 담배와 상추는 목표한 유전자인TLHS2또는TLHS3가 도입되어 정상적으로 단백질이 발현됨을 확인하였다.

<실시예 3> 형질전환 담배와 상추의 종자 발아 시험

본 발명의 분자 샤페론 유전자TLHS2또는TLHS3가 식물의 발아율과 발아속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 노던블롯 분석과 웨스턴블롯 분석을 통해 확인된 형질전환 담배와 상추를 자가수분시켜 형성된 종자에 대한 발아시험을 수행하였다.

이들 종자를 증류수로 적신 와트만 여과지(Whatman filter paper) 위에 놓고 암상태, 22℃에서 발아를 유도하면서 24시간마다 발아율을 측정하였다. 대조구로는 비형질전환 담배와 상추의 종자를 사용하였고, 동일한 처리를 하여 발아율을 비교하였다.

그 결과,TLHS2또는TLHS3유전자가 도입되어 발현된 형질전환 담배는 정상적인 발육을 보였으며 개화과정이나 꽃의 형태도 정상적이었다(도 5). TLHS2 또는TLHS3 단백질이 형성되었음이 확인된 형질전환 담배 종자의 발아율 변화를 분석한 결과, 비형질전환 담배의 경우에는 암상태, 22℃ 조건에서 4일이 경과하여도 거의 종자의 발아가 관찰되지 않았고 1주일이 경과되어야 10% 미만의 종자에서 발아가 관찰되기 시작한 반면에,TLHS2가 도입되어 발현된 형질전환 담배의 경우에는 2일 경과 후 40% 정도의 발아율을 보였고(도 6)TLHS3가 도입된 형질전환 담배의 경우에는 2일 경과 후 10% 정도의 발아율이 관찰되었다(도 8).TLHS2또는TLHS3가 도입되어 발현된 형질전환 담배의 경우에는 3일이 경과한 후에 50% 정도의 발아율을 보였는데(도 10의A및도 11의A), 상기 결과는 일반적인 담배 종자의 경우 50%의 발아율을 나타내기 위하여 암상태, 22℃의 조건에서 10일 이상의 기간이 요구되는 것과 비교할 때, 본 발명의TLHS2또는TLHS3유전자의 도입으로 인하여 담배 종자의 발아율과 발아속도가 괄목할만하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

또한,TLHS2또는TLHS3유전자가 도입되어 발현된 형질전환 상추는 정상적인 발육을 보였으며 개화과정이나 꽃의 형태도 정상적이었다(도 5). TLHS2 또는 TLHS3 단백질이 형성되었음이 확인된 형질전환 상추 종자의 발아율 변화를 분석한 결과, 비형질전환 상추의 경우에는 암상태, 22℃ 조건에서 2일 경과까지는 거의 종자의 발아가 관찰되지 않았고 4일이 경과되어야 10% 미만의 종자에서 발아가 관찰되기 시작한 반면에,TLHS2가 도입되어 발현된 형질전환 상추의 경우에는 4일 경과 후 90% 정도의 발아율을 보였다(도 7,도 9및도 10의B).TLHS3가 도입된 형질전환 상추의 경우에도 4일 경과 후 90% 정도의 발아율을 보였는데(도 11의B), 상기의 결과로부터 상추의 경우에도TLHS2또는TLHS3유전자의 도입으로 발아율과 발아속도가 괄목할만하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 분자 샤페론 유전자TLHS2및TLHS3가 식물체의 발아율과 발아속도의 향상에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 종자의 발아율과 발아속도를 촉진하는 방법은 분자 샤페론 유전자를 식물체에 형질전환시켜 형질전환 식물체 내에서 발현되도록 유도하여 형질전환된 식물체 종자의 발아율과 발아속도를 향상시키므로, 종자의 발아를 촉진하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> HONG, Choo Bong <120> The method to promote plant seed germination using molecular chaperone <130> 0P-11-08 <160> 9 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 465 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 atgtctctga ttccgagctt ctttggtggc cgcaggagca acgtgttcga tccattctcc 60 ctcgacatat gggatccttt tgagggcttc cctttctccg gcacagtcgc caaccttcca 120 acctctgctt tcgccaacgc tcgaattgat tggaaagaga ccccagaagc tcatgtcttc 180 aaggtggatc ttcctggaat taagaaagag gaggtgaagg ttgaggtaga agaaggaaga 240 gttctacaaa ttagtgggga gagaagcaga gaggaagagg agaagaacga caaatggcac 300 cgtatggaga ggagcagcgg caagttcctt aggaggttta ggctgccgga gaataccaag 360 atggaggaga ttaaagcagc aatggagaat ggagtgctca ctgtgactgt cccaaaaatg 420 gaggaaaaga aacctgacgt gaaggccatt gacatctctg cttaa 465 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Ser Leu Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Val Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Ile Trp Asp Pro Phe Glu Gly Phe Pro Phe 20 25 30 Ser Gly Thr Val Ala Asn Leu Pro Thr Ser Ala Phe Ala Asn Ala Arg 35 40 45 Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Glu Ala His Val Phe Lys Val Asp Leu 50 55 60 Pro Gly Ile Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Arg 65 70 75 80 Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Ser Arg Glu Glu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Asp Lys Trp His Arg Met Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe Leu Arg Arg 100 105 110 Phe Arg Leu Pro Glu Asn Thr Lys Met Glu Glu Ile Lys Ala Ala Met 115 120 125 Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Met Glu Glu Lys Lys 130 135 140 Pro Asp Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Ala 145 150 <210> 3 <211> 480 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 atgtctttga ttccaagctt ctttggtggc cgcaggagca acatctttga tccattctcc 60 ctcgacctat gggatccttt cgagggcttc cctttctccc gcacagtcgc caacactcca 120 acctctgctc gtgaaaccgc tgctttcgcc agcgctcgaa ttgattggaa agagacccca 180 gaatcccact tcttcaaggt ggatcttcct ggaattaaga aagaagaggt gaaggttgag 240 gtagaagaag gaagagttct acaaattagt ggggagagaa gcagagagga agaggagaat 300 aacgacaaat ggcaccgtat ggagaggagc agcggcaagt tccttaggag gtttaggctg 360 ccggaaaata ccaagatgga ggagattaaa gcagcaatgg agaatggagt gctcactgtg 420 actgtaccaa aaatggagga aaagaaacct gaggtgaagg ccattgacat ctcttgttaa 480 480 <210> 4 <211> 159 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 4 Met Ser Leu Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Ile Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Leu Trp Asp Pro Phe Glu Gly Phe Pro Phe 20 25 30 Ser Arg Thr Val Ala Asn Thr Pro Thr Ser Ala Arg Glu Thr Ala Ala 35 40 45 Phe Ala Ser Ala Arg Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Glu Ser His Val 50 55 60 Phe Lys Val Asp Leu Pro Gly Ile Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu 65 70 75 80 Val Glu Glu Gly Arg Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Ser Arg Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Asn Asn Asp Lys Trp His Arg Met Glu Arg Ser Ser Gly 100 105 110 Lys Phe Leu Arg Arg Phe Arg Leu Pro Glu Asn Thr Lys Met Glu Glu 115 120 125 Ile Lys Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys 130 135 140 Met Glu Glu Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Cys 145 150 155 <210> 5 <211> 480 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 5 atgtctctga ttccaagctt ctttgatggc cgcaggagca acatcttcga tccattctcc 60 ctcaacatat gggatccttt cgagggcttc cctttctccg gcacggtcgc caacattcca 120 acctctactc gtgaaaccgc tgctttctcg agtgctcgaa ttgattggaa agagacccca 180 gaatcccatg tctttaaggt ggatcttcct ggaattaaga aagaggaggt gaaggtggag 240 gtagaagaag gaagagttct acaaattagt ggcgagagaa gcagagagca agaggagaag 300 aacgataaat ggcacagcat ggagaggagc agcggaaagt tccttaggag gtttaggttg 360 ccggagaata tcaaaatgga agagattaag gcaactatgg agaatggggt gctcactgtg 420 actgtcccaa aaatggagga aaagaaacct gaggtgaagg ccattgacat ctctggttaa 480 480 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TLHS2 gene <400> 6 gctctagagt cttgttccaa ttcagat 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TLHS2 gene <400> 7 gctctagatt aagcagagat gtcaatg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TLHS3 gene <400> 8 gctctagagt caaagtcctc attcaga 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TLHS3 gene <400> 9 gctctagatt aacaagagat gtcaatg 27

Claims (13)

1) 분자 샤페론 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1의 식물체 형질전환용 발현벡터를 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환 식물체로부터 상기 분자 샤페론 유전자를 발현시켜 종자의 발아율과 발아속도를 촉진시키는 단계로 구성되는 분자 샤페론 유전자를 이용하여 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법.

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제 1항에 있어서, 분자샤페론 유전자는TLHS2,TLHS3, HSP(heat shock protein) 70, HSP 60, HSP 90, HSP 100, GroEL, GroES, 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin), 샤페로닌(chaperonin), 및 저분자량 HSP들(small HSP들)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법.

제 3항에 있어서,TLHS2는 식물 종자의 발아를 촉진하는, 담배에서 분리한서열번호 1로 기재되는 분자 샤페론 유전자인 것을 특징으로 하는 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법.

제 3항에 있어서,TLHS3은 식물 종자의 발아를 촉진하는, 담배에서 분리한서열번호 3으로 기재되는 분자 샤페론 유전자인 것을 특징으로 하는 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법.

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제 1항의 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법에 의하여 제조된TLHS2분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터 pBluescript II SK(+)/TLHS2.

제 1항의 식물체 종자의 발아를 촉진하는 방법에 의하여 제조된TLHS3분자 샤페론 유전자를 포함하는 발현벡터 pBluescript II SK(+)/TLHS3.

제 9항의 발현벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 0879BP).

제 10항의 발현벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 0880BP).

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