KR20010090954A - 수박의 종자 발생시 종피특이적으로 유전자의 발현을조절하는 Ｃｖ２０ｏｘ유전자 프로모터 - Google Patents

수박의 종자 발생시 종피특이적으로 유전자의 발현을조절하는 Ｃｖ２０ｏｘ유전자 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수박(Citrullus lanatus)의 발생중인 종자로부터 분리한 종피특이적 Cv20oX 유전자 프로모터에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 수박의 종자 발생시 외피 조직(integumental tissue)에서는 강하게 발현되고 종자 내부 조직에서는 약하게 발현되는 조직 특이적 발현 양상을 보이는 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자 및 이의 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 종피특이적 발현을 조절하는 Cv20ox 유전자 프로모터는 GA 20-산화제의 발현을 조절하여 식물의 성장 및 발달에 중요한 역할을 하는 지베렐린의 생합성 과정에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 상기 프로모터에 식물생장 조절물질에 관련된 종자발달 저해인자를 연결하면 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해할 수 있으므로 무종자 식물체를 만드는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

수박의 종자 발생시 종피특이적으로 유전자의 발현을 조절하는 Ｃｖ２０ｏｘ 유전자 프로모터{A gibberellin 20-oxidase gene promoter Cv20oxP expressed specifically in integumental tissue of developing seeds of watermelon}
본 발명은 수박(Citrullus lanatus)의 발생중인 종자로부터 분리한 종피특이적 Cv20oX 유전자 프로모터에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 수박의 종자 발생시 외피 조직(integumental tissue)에서는 강하게 발현되고 종자 내부 조직에서는 약하게 발현되는 조직 특이적 발현 양상을 보이는 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자 및 이의 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터에 관한 것이다.
지베렐린은 종자의 발아, 줄기의 성장, 꽃의 생성 및 성장, 낙과(fruit-setting), 종자 발생 및 안토시아닌(anthocyanin) 생합성 등을 포함하는 식물의 성장 및 발달과정에 중요한 역할을 하는 호르몬이다(Hooley R.,Plant Mol Biol,26, 1529-1555, 1994). 지베렐린은 두 종류의 효소에 의해 테트라 사이클린 디터펜 엔트-카우렌(tetracyclic diterpeneent-kaurene)으로부터 생합성되는데(Hedden P. & Kamiya Y.,Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48, 431-460, 1997), 생합성 초기 단계에서 모노옥시게나아제(Monooxygenases)에 의해 GA12 및 GA53이 합성되고, 이렇게 합성된 지베렐린은 두 가지의 주요 디옥시게나아제(dioxygenases)인 GA 20-산화제(gibberellin 20-oxidase) 및 3β-수산화제(3β-hydroxylase)에 의해 생리적 활성을 갖는 C19-GAs로 전환된다. 이러한 지베렐린의 생합성 단계에 관여하는 GA 20-산화제는 GA12 및 GA53의 20번 탄소를 단계적으로 산화시켜 지베렐린에 C19 골격을 형성시키는 역할을 하고, 3β-수산화제는 GA 20-산화제에 의해 형성된 지베렐린의 C19 골격에서 3β-수산화(hydroxylation)를 촉매하여 생물학적 활성을 갖는 지베렐린을 형성시키는 역할을 한다.
이처럼 지베렐린의 생합성에 관여하는 두 가지 주요 디옥시게나아제인 GA 20-산화제 및 3β-수산화제를 코딩하는 게놈 DNA 및 cDNA 클론들은 이미 여러 종의 식물로부터 분리되었으며, 대장균(Escherichia coli) 형질전환체로부터 생산된 재조합 효소를 이용하여 효소 활성이 측정되었다(Hedden & Kamiya,Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol., 48, 431-460, 1997).
또한, 상기의 디옥시게나아제들의 발현이 지베렐린에 의한 피드백 조절(feedback regulation)에 의해 감소됨이 보고되었고(Chiang 등, Plant Cell., 7, 195-201, 1995), 아라비돕시스(Arabidopsis; Xu 등,Proc Natl Acad Sci USA., 42, 6640-6644, 1995) 및 시금치(Wu 등,Plant Physiol., 110, 547-554, 1996)에서의 GA 20-산화제의 발현은 장일조건에서 그 발현량이 증가되는 것을 확인하였다. 이외에도, 아라비돕시스, 콩, 완두 및 토마토에서의 GA 20-산화제에 대한 연구를 통해, 상기 식물들은 다중의 GA 20-산화제 유전자를 포함하고 있으며, 이들 GA 20-산화제 유전자들은 상기 식물의 발생시 조직 특이적 또는 시간적으로 조절되고, 줄기 신장, 꽃 형성 및 열매 형성 등과 같은 지베렐린의 다른 조절 과정에도 관여하고 있음이 증명되었다(Phillips 등,Plant Physiol., 108, 1049-1057, 1995).
한편, 상기와 같이 지베렐린 생합성 과정에 관여하는 GA 20-산화제 중 몇몇 식물체에서 밝혀진 GA 20-산화제는 종자 또는 열매에서 특이적으로 발현된다는 사실이 보고되었다. 예를 들면, 아라비돕시스의 YAP169는 장각과(silique)에서 특이적으로 발현되며(Phillips등,Plant Physiol., 108, 1049-1057, 1995), 콩과식물의 Pv85-26(Garcia-Martinez 등,Plant Mol Biol., 33, 1073-1084, 1997)은 발생중인 종자에서, 그리고 마라 마크로카퍼스(Marah macrocarpus)의 M3-8(MacMillan 등,Plant Physiol., 113, 1369-1377, 1997)은 발생중인 종자의 배(embryos) 및 내생 포자(endosperm)에서 특이적으로 발현됨이 확인되었다.
특히, 발생 중인 종자는 다른 어떤 식물의 기관 보다 많은 양의 지베렐린을 함유하고 있기 때문에, 식물에서의 지베렐린의 생합성 과정을 밝히기 위한 유전학적 및 생리학적 연구에 빈번히 사용되어 왔다(Graebe 등,Annu Rev Plant Physiol., 38, 419-465, 1987). 그러나 종자 발생시 지베렐린의 역할 및 정확한 합성 장소에 대해서 거의 알려진 바 없고, 단지 최근에 GAs가 몇몇 식물 종에서 종자 발생의 초기 및 후기 단계에 지베렐린이 관여한다는 사실이 보고되었으며(Euwens & Schwabe 등,J Exp Bot., 26, 1-14, 1975), 콩과 식물의 몇몇 지베렐린 결핍 돌연변이에서 종자 발생의 변화된 양상이 보고되었다. 예를 들면, lh-2 돌연변이에서는 종자 발생시 지베렐린의 발현이 현저하게 감소하였고 종자의 발생이 정지하는 것이 관찰된 바 있다(Swain 등,Plant J., 12, 1329-1338, 1993; Swain 등, 1995). 이는 지베렐린 결핍 돌연변이인 ls-1 및 lh-2의 생리학적, 생화학적 및 유전학적 분석 결과, 배 및/또는 배유에서 생합성된 지베렐린이 수분된 후 초기 몇일 이내에 종자 발생을 위해 요구되기 때문임이 밝혀졌다(Ait-Ali 등,Plant J., 11, 443-454, 1997). 더우기, 종자의 발생은 지베렐린 및 옥신(auxins) 등의 식물 호르몬(phytohormones)과 관련된 과피 발생에 매우 중요한데(Van Huizen 등,Plant Physiol., 115, 123-128, 1997), 토마토의 경우, 수정된 후 짧은 기간 동안이기는 하나 지베렐린이 열매와 종자의 발생에 반드시 필요하였다(Groot 등,Physiol Plant., 67, 315-319, 1987).
한편, 현재까지 많은 연구자들이 병충해에 대한 내성 증가 또는 수확량 증대를 위해 다양한 식물체에 유전자 조작을 가한 형질전환 식물체(transgenic plant)들을 개발하였으며, 이미 안정성이 검증된 많은 유전자 조작 식물체들이 재배되어 일반인들에게 공급되고 있다. 이러한 연구의 일환으로 무종자 식물체의 개발에도 관심이 집중되고 있는데, 대표적인 예로서 씨없는 수박이 개발되어 재배되고 있다. 현재 씨 없는 수박의 재배 방법으로는 두 가지 방법이 개발되어 사용되고 있는데, 그중 하나가 3배체 수박을 재배하는 방법이다. 이 방법은 우리나라의 우장춘 박사가 개발한 방법으로서 일반적으로 2배체인 수박 염색체를 4배체로 만든 후 이 4배체 염색체의 수박과 2배체 염색체의 수박을 교배하여 3배체 염색체를 갖는 수박을 형성하는 방법이다. 이렇게 형성된 3배체 염색체의 수박은 생식분열 때 정상적인 화분 및 난자를 발달시키지 못하기 때문에 결국 씨없는 수박을 형성하게 된다. 하지만, 3배체 수박은 생육이 불안정하여 재배중에 과피가 두꺼워지거나 갈라지며 기형과의 발생도가 높을 뿐만 아니라 당도가 낮아지는 경향이 있어 현재는 이 방법을 거의 사용하지 않는다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 현재는 주로 생장조절제를 이용하는 방법이 사용되고 있다. 이 방법은 식물생장조절제(Fulmet, 사이토카이닌류)를 수박의 자방에 처리하여 씨없는 수박을 얻는 방법으로 아직까지 식물생장조절제의 어떠한 작용기작에 의해 씨없는 수박이 생산되는지는 밝혀져 있지 않다. 또한, 생장조절제를 이용한 방법은 생장조절제의 처리시기를 잘못 조절할 경우 낙과가 발생할 수 있고 생장조절제를 1, 2번 암꽃에만 처리해야하는 어려움이 있으며 과일이 맺히는 착과 후 과피가 갈라져 열과가 발생하는 등의 문제점이 있어 대체적으로 상당한 재배기술이 요구되는 방법이다.
상기의 3배체 수박 재배방법 및 생장조절제 처리방법 이외에도 기타 유전자 조작을 이용한 씨 없는 과일의 생산방법이 발표되고 있다. 수박 이외에도 담배나 가지식물에서 무종자 식물체의 생산방법이 보고되었는데, 이들은 일반적으로 자방특이적으로 발현하는 프로모터 뒤에 식물생장조절에 관여하는 유전자(iaaM)를 연결하여 식물체에 도입한 후 자방에서 식물생장조절물질이 과발현하도록 조절하여 무종자 식물체를 생산하는 방법이다. 이와 같이 자방특이적 프로모터를 이용한 무종자 식물체 생산방법은 큰 문제점이 발견되지 않아 무종자 식물체의 생산에 유용한 방법으로 알려져 있으나, 다만 현재까지 상기 방법이 담배나 가지식물에만 적용되어 무종자 식물체를 생산하였기 때문에 다른 과일에의 적용은 더 연구되어야 할 것이다.
따라서, 본 발명자들은 무종자 식물체를 생산하기 위한 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 수박(Citrullus lanatus)의 발생중인 종자로부터 종피특이적으로 발현을 조절하는 Cv20oX 유전자 프로모터를 발견하였다. 본 발명은 발생중인 종자의 외피조직(integumental tissue)에서 특이적으로 발현되는 Cv20ox 유전자 프로모터를 분리하여 이 프로모터의 종피특이적 발현을 확인하기 위하여 바람직한 실시예로서 상기 프로모터에 지베렐린(GA) 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자 및 리포터 유전자를 연결한 후 수박에 도입하여 상기 Cv20ox 유전자 프로모터에 의해 지베렐린 20-산화제 유전자의 발현이 종피특이적으로 조절됨을 확인함으로써 본 발명을완성하였다. 따라서, 본 발명의 종피특이적으로 발현을 조절하는 Cv20ox 유전자 프로모터는 상기 프로모터에 식물생장 조절물질에 관련된 종자발달 저해인자를 연결하면 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해할 수 있으므로 무종자 식물체를 만드는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 수박의 종자 발생시 조직 특이적으로 발현되는 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 종피특이적으로 발현되는 Cv20ox 유전자 프로모터를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터를 이용하는 무종자 식물체의 생산방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 Cv20ox 유전자의 아미노산 서열과 여러 다른 식물의 GA 20-산화제의 아미노산 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 수박의 발생중인 종자로부터 분리한 Cv20ox 게놈 DNA에 대한 DNA 블럿 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 3a는 수박의 성숙된 여러 조직으로부터 분리한 RNA에 대한 RNA 블럿 분석 결과를 나타낸 것이고,
I : 수분 후 8 일째의 외피 조직 S : 수분 후 8 일째의 종자 전체
IS : 수분 후 8 일째의 내부 종자 조직 F1 : 수분 후 1 일째의 열매
F2 : 수분 후 2 내지 3 일째의 열매 F8 : 수분 후 8 일째의 열매
T : 덩굴손 L : 잎
M : 웅성 꽃 O : 수분되기 전의 씨방
도 3b는 흡수(imbibition) 후 15일 동안 성장한 어린 식물의 서로 다른 조직으로부터 분리한 RNA에 대한 RNA 블럿 분석 결과를 나타낸 것이고,
C : 자엽 Hu : 상층부 배축
Sm : 배축의 상층부 대부분을 포함하는 줄기 분열조직
H1 : 배축의 하층부 R : 뿌리
도 3c는 종자 발생시 본 발명의 Cv20ox 유전자의 시간적 발현 양상을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 Cv20ox 유전자 발현 조절과정에 있어서 GA3가 미치는 영향을 나타낸 것이고,
+ : GA3를 처리한 수분 후 3 일째의 열매
- : GA3를 처리하지 않은 수분 후 3 일째의 열매
도 5는 조직 내 혼성화 실험(in situhybridization)에 의해 수박 종자 내에서 Cv20ox 유전자의 조직 특이적 발현 양상을 나타낸 결과이고,
A, B, 및 C : 수분 후 5 일째의 종자
D 및 E : 수분 후 6 일째의 종자
F 및 G : 수분 후 4 일째의 종자
nu : 핵 ii : 외피의 내층
oi : 외피의 외층 e : 구형의 배
도 6a는 정상적으로 수분된 후에 수확된 종자와 CPPU 처리 후에 수확된 종자간의 Cv20ox 유전자 발현 양상을 비교한 것이고,
레인 1 : 수분 후 2 일째 레인 2 : 수분 후 3 일째
레인 3 : 수분 후 4 일째 레인 4 : CPPU 처리 후 2 일째
레인 5 : CPPU 처리 후 3 일째 레인 6 : CPPU 처리 후 4 일째
도 6b는 본 발명의 Cv20ox 유전자의 발현 양상을 CPPU 처리후 10 일째의 외피와 내부 종자 조직에서 비교한 것이고,
레인 1 : 외피 레인 2 : 내부 종자 조직
도 7은 본 발명의 Cv20ox 유전자의 발현벡터 pGA2118의 개열 지도를 나타낸 것이고,
도 8은 GUS 리포터 유전자의 발현을 조직화학적으로 검출한 결과이다.
A : 수분 후 8 일째의 발생 중인 종자
B : 평행으로 자른 수분 후 8 일째의 종자 내부
C : 잎 D : 뿌리
F : 배축 G : 자엽
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
수박으로부터 분리한 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자는 종자 발생시 조직 특이적으로 발현된다.
1) Cv20ox 유전자의 분류학적 특성
수박의 발생중인 종자로부터 분리한 지베렐린 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox유전자 클론의 염기 서열을 분석한 결과, 상기 유전자의 cDNA는 1420개의 뉴클레오타이드로 이루어지며(서열번호3 참조) 379개의 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코딩하고(서열번호4 참조), His-239, Asp-241, 및 His-295 로 구성되는 Fe2+결합 부위(Fe2+binding motif)와 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 결합 부위를 포함하는 2-옥소글루타레이트-의존성 디옥시게나아제(2-oxoglutarate-dependent dioxygenases)에 전형적인 보존적 지역을 갖는다. 또한, 상기 유전자의 cDNA는 기존에 밝혀진 다른 식물의 GA 20-산화제의 염기 서열과 매우 유사한 염기 서열을 가지고 있는데, 구체적으로, 마라 마크로카르프스(Marah macrocarpus)의 GA 20-산화제와는 76%, 호박의 GA 20-산화제와는 63%의 상동성을 나타내고, 완두콩, 콩, 아라비돕시스, 시금치 및 양상추의 GA 20-산화제들과도 50% 이상의 상동성을 나타낸다(도 1참조).
2) Cv20ox 유전자의 발현양상
수박 종자의 DNA 및 RNA 블럿 분석 결과, 상기 Cv20ox 유전자는 수박 게놈 DNA 내 하나 또는 두 개의 카피 넘버로 존재하며 발생중인 종자에서만 특이적으로 발현되는데, 특히 상기 유전자는 종자의 다양한 여러 조직중 외피 조직에서는 매우 강하게 발현되는 반면, 종자의 내부 조직에서는 약하게 발현되는 공간적 발현 양상을 나타낸다(도 3a참조). 또한, GA 20-산화제 유전자의 시간적 발현 양상을 보면, 수분 후 3 일째의 종자에서부터 발현되기 시작하여 수분 후 15 일째까지 매우강하게 발현된다(도 3b참조).
이외에도 상기 Cv20ox 유전자의 전사체는 수박종자의 발생시 종자 외피의 외부 조직 내층에 대부분이 존재하는 분포양상을 나타낸다(도 5의B, E및G참조).
N-(2-클로로-4-피리딜)-N'-페닐우레아(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea, 이하 "CPPU"로 약칭함) 처리에 의해 유도된 단위결실 열매(Parthenocarpic)에서의 Cv20ox 유전자의 발현 양상을 살펴보면, 상기 유전자는 CPPU 처리에 의해 조기에 발현되는데(도 6a참조), 이는 CPPU 처리에 의해 촉진된 종자 및 열매의 발생에 기인하는 것으로 판단된다. 한편, 상기 유전자의 전사체는 외피에서 강하게 발현되고 종자 내부에서는 약하게 발현되는 발현양상을 나타내는데(도 6b참조), CPPU가 처리된 종자는 배나 배유로 발달하지 못하므로 상기와 같이 종자 내부에서 관찰되는 GA 20-산화제의 전사체는 모세포 조직 예를 들면, 핵 또는 전이 세포 등에서 발현되는 것임을 암시한다.
수박의 발생중인 종자로부터 분리한 Cv20ox 유전자 프로모터는 식물체 내에서 종피특이적으로 발현을 조절한다.
Cv20ox 프로모터 부위는서열번호 5로 기재되는 염기 서열로 구성되며, 번역(translation) 시작 코돈(start codon)으로부터 132 뉴클레오타이드 상류 부위에 잠정적 TATA 박스(TATAAATC box)가 존재하고, A/T 풍부 서열 부위로서 19 bp 이상의 A/T 뉴클레오타이드를 세부분 포함한다. 이러한 염기 서열의 분포는 이미 A/T 함량이 높으며, 여러개의 긴 A/T 풍부 서열을 포함한다는 것이 알려진 카나발리아(Canavalia)의 주요 종자 저장 단백질 유전자 중 하나인 ConA 유전자의 5' 상류 부위의 염기 서열 분포와 유사하다. 또한, 상기 유전자의 5' 상류 부위의 A/T 풍부 서열은 전사 촉진에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으므로(Yamamoto 등, 1995) Cv20ox 유전자의 프로모터 부위는 Cv20ox 유전자의 발현을 조절하는 매개 신호를 밝히기 위해 유용할 뿐만 아니라 상기 프로모터에 식물생장 조절물질에 관련된 종자발달 저해인자를 연결하면 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해할 수 있으므로 무종자 식물체를 만드는데 유용하게 이용될 수 있다. 이와 같이 무종자 식물체를 생산하기 위해 종피특이적으로 발현을 조절하는 프로모터에 연결할 수 있는 종자발달 저해인자로는 식물 호르몬인 옥신의 생합성에 관여하는 iaaM 및 iaaH 유전자, 싸이토카이닌의 생합성에 관여하는 ipt 유전자 또는 GA 20-산화제 안티센스 등이 사용될 수 있다. 본 발명자들은 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터에 상기 유전자들을 연결하여 제조한 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 대표적으로, 발현벡터 pGA2257은 Cv20ox 유전자 프로모터에 연결된 종자발달 저해인자로 GA 20-산화제 안티센스를 포함하는 벡터로서 상기 벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환체를 2000 년 4 월 6 일자로 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC 11160)
본 발명자들은 Cv20ox 유전자 프로모터의 종피특이적 활성을 조사하기 위하여, 상기 프로모터를 발현이 용이하고 식물체내에서 복잡한 관계를 거치지 않아도 그 발현 양상을 쉽게 확인할 수 있는 리포터 유전자에 연결하여 일시적 발현 시스템을 구축한다. 그 바람직한 예로서, 상기 Cv20ox 유전자 프로모터 부위에 리포터 유전자로서 GUS 코딩 부위를 융합시킨 발현 벡터를 제조하여 이를 수박의 다양한 기관으로 삽입시킨 후 GUS 염색에 의한 발현양상을 확인한 결과, Cv20ox 유전자 프로모터의 활성은 발생 중인 종자의 외피 조직에서만 검출되고, 특히 핵에 인접한 층에서 매우 강하게 검출된 반면, 잎, 뿌리, 배축 및 자엽과 같은 비생식 기관에서는 전혀 검출되지 않는다(도 8참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 수박의 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자
<1-1> GA 20-산화제 유전자 Cv20ox의 cDNA 분리
본 발명은 수박에서 지베렐린의 생합성에 관여하는 GA 20-산화제 유전자를 분리하기 위하여, 발생중인 수박 종자로부터 cDNA를 분리하였다. 구체적으로, 수박(Citrullus lanatus(Thunb.) var COUNTRY HOME)의 F1 잡종을 사용하여 온실에서 낮에는 30 내지 35℃로, 밤에는 15 내지 20℃의 온도를 유지하면서 배양하였다. 상기와 같이 배양하여 수분시킨 후 6 내지 10 일째의 수박 종자로부터 cDNA 합성 키트(ZAP cDNA kit, Stratagene) 및 시험관 내 패키징 혼합물(gigapack III Gold, Stratagene)을 이용하여 추출한 폴리 (A)+ RNA를 λZAPⅡ 벡터(Stratagene)에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기의 cDNA 라이브러리는 초기 플라크 형성수(plaque forming units)가 4 × 106인 독립 재조합물로서 저빈도 클론을 포함하기에 충분하며, 이를 대장균(E. coliXL1-Blue, Stratagene) 내에서 증폭시켰다. 4 × 105플라크로 플라크 혼성화 실험(plaque hybridization)을 수행한 후 니트로셀룰로오즈 막으로 플라크를 옮기고, cDNA 삽입부를 포함하는 pBlue-script 플라스미드를 f1 헬퍼 파지 R408(f1 helper phage R408, Stratagene)을 사용하여 박테리오파지 λ로부터 얻었다.
상기의 cDNA 라이브러리로부터 GA 20-산화제 유전자의 cDNA만을 분리하기 위하여 GA-20 산화제 내 보존적 서열에 대한 프라이머(degenerate primer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로,서열번호 1로 기재되는 순방향 프라이머와서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머를 사용하여 상기에서 얻은 수분후 6 내지 10 일째의 종자 cDNA 라이브러리로부터 분리된 DNA들을 주형으로 PCR을 수행하였고, PCR 반응은 94℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음, 94℃에서 1분, 40℃ 또는 50℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 40회를 반복 수행한 후 72℃에서 10분간 증폭시켜 반응을 종결하였다. 상기 PCR 반응으로 얻은 300 bp의 DNA 절편을 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분리하여 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 상기 클론을 DNA 서열 분석 키트(Big DyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction, PE Applied Biosystems)로 처리한 후 서열 분석기 (model ABI 373 DNA Sequencer, Applied Biosystems)를 이용하여 염기 서열을 분석하였다.
<1-2> Cv20ox 유전자의 염기 서열 분석
상기의 서열 분석 결과를 일본 DNA 정보 은행(DNA Data Bank of Japan)의 블라스트(BLAST) 프로그램을 사용하여 기존에 이미 밝혀진 GA 20-산화제의 염기 서열과 비교하였다.
그 결과, 상기 GA 20-산화제 유전자로부터 추정되는 아미노산 서열은 다양한 식물 종의 GA 20-산화제의 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타내었다. 그러나, 상기 클론은 GA 20-산화제 유전자의 일부분만을 포함하기 때문에, 수박 종자의 cDNA 라리브러리를 탐색하여 추정되는 GA 20-산화제의 전장 ORF를 포함하는 cDNA 클론을 확보하였다. 상기 클론은서열번호 3으로 기재되는 1420개의 염기 서열로 이루어지며 379의 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코딩하였다(Accession No. AF074709). 또한, 상기 펩타이드는 His-239, Asp-241, 및 His-295로 구성되는 Fe2+결합 부위와 2-옥소글루타레이트 결합 부위를 포함하는 2-옥소글루타레이트-의존성 디옥시게나아제에 전형적인 보존적 부위을 가지고 있었다.
상기 펩타이드의 서열 분석 결과,서열번호 4로 기재되는 Cv20ox 펩타이드 서열은 공지의 GA 20-산화제 유전자의 아미노산 서열과 매우 유사하였다(도 1). 구체적으로, 상기의 수박 종자로부터 분리한 Cv20ox 단백질은 마라 마크로카르프스(Marah macrocarpus)의 GA 20-산화제와는 76%, 호박의 GA 20-산화제와는 63%의 상동성을 나타내었다. 또한, 상기 단백질은 완두콩, 콩, 아라비돕시스, 시금치 및 양상추의 GA 20-산화제들과도 50% 이상의 상동성을 나타내었다.
<1-3> 게놈 DNA상 Cv20ox 유전자의 분포 양상
수박 게놈 DNA 내 Cv20ox 유전자의 카피 넘버(copy number)를 확인하기 위하여 게놈 DNA 블럿 분석을 수행하였다. 구체적으로, 2주령인 수박의 잎으로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide, Rogers SO & Bendich AJ,Extraction of DNA from plant tissue, A6, 1-10, 1988) 방법을 이용하여 전체 게놈 DNA(total genomic DNA)를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 HindⅢ 또는 EcoR1 제한효소로 절단하여 0.8% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동으로 분리한 후, 상기 겔로부터 DNA를 나일론 막으로 옮겼다. 랜덤 프라이밍 방법(random priming method; Sambrook J, et al.,Molecular Cloning,1989)을 통해 실시예 1에서 얻은 300bp cDNA 클론을 32P로 표지한 후 이를 탐침으로 이용하여 상기 막에 혼성화를 실시하였다.
그 결과,32P로 표지된 cDNA 클론은 하나 또는 두 개의 주요 밴드에 혼성화되었는데(도 2), 이는 상기 유전자가 수박 게놈 DNA 내 하나 또는 두 개의 카피 넘버로 존재함을 나타낸다. 또한, 약하게 혼성화된 밴드가 나타나는 것은 Cv20ox와 관련된 부가적인 유전자가 존재함을 의미한다.
<1-4> Cv20ox 유전자의 조직 특이적 발현 양상
본 발명은 GA 20-산화제 유전자 Cv20ox의 조직 특이적 발현 양상을 조사하기위하여, 전체 종자, 종자 외피(integument), 종자 내부 조직, 수분 후 1 일째의 열매, 수분 후 2 내지 3 일째의 열매, 덩굴손(tendril), 어린 잎, 웅성 꽃 및 수분되기 전의 씨방을 포함하는 다양한 생식 및 생장 기관으로부터 RNA를 분리하여 RNA 블럿 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기와 같은 다양한 기관으로부터 전체 RNA를 TRI 시약(Molecular Research Center)을 이용하여 추출하였다. 잎과 뿌리의 시료는 2주령의 식물로부터 체취하였고, 생식 기관(floral organ) 시료는 해부 현미경을 사용하여 성숙된 꽃을 절단하여 얻었다. 추출된 전체 RNA의 10 내지 25 ㎍ 정도를 RNA 블럿 분석에 사용하였다.
그 결과, Cv20ox 전사체는 약 1.4 kb의 밴드 위치에서 검출되었는데(도 3a), 상기 밴드는 종자 특히, 종자의 외피 조직으로부터 추출한 RNA에서 강하게 검출되었으며, 종자의 내부 조직에서도 약하게 검출된 반면, 종자를 제외한 다른 생식 기관에서는 전혀 검출되지 않았다. 한편, 파종 후 7일 동안 성장한 실생의 자엽(cotyledon), 배축(hypocotyl), 줄기 분열조직(shoot meristem) 및 뿌리로부터 분리한 mRNA를 사용한 RNA 블럿 분석에서는 Cv20ox 전사체가 상기 발생 단계의 어떠한 기관에서도 검출되지 않았다(도 3b).
또한, 본 발명자들은 발생중인 종자내에서 Cv20ox 유전자의 발현 분포를 확인하기 위하여 조직 내 혼성화(In situ hybridation) 실험을 수행하였다. 구체적으로, 수박 종자를 FAA 고정 용액(50% ethanol, 0.9 M glacial acetic acid, 및 3.7% formaldehyde)으로 처리하여 4℃에서 15 시간 동안 고정시키고, 에탄올로 탈수시킨 다음 자일렌(xylene)으로 여과한 후 파라핀(paraffin, paraplast x-tra, OXFORD labware)으로 고정시켜 몸체를 만들었다. 상기 파라핀 몸체로부터 8 내지 10 ㎛ 크기의 절편(section)을 잘라 벡타본드(Vectabond, Vector Laboratories)가 코팅된 슬라이드로 옮겨 45℃에서 12시간 동안 건조시켰다. 한편, DIG 핵산 라벨링 키트(DIG nucleic acid labeling kit, Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 리보 탐침(riboprobe)을 제조하였는데, cDNA의 안티센스 및 센스 탐침을 T7 및 T3 RNA 중합효소를 이용하여 합성한 후 가수분해시켰다. 상기 슬라이드상의 절편을 단백질 분해효소 K(proteinase K, Roche Molecular Biochemicals)가 20 ㎍/㎖ 포함된 용액으로 37℃에서 30분 동안 처리한 후, 50% 포름아미드(formamide), 0.3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 5 mM Na2HPO4, 10% 덱스트란 설페이트(dextran sulphate), 1 덴하르츠 용액(1 Denhardt's solution), 0.5 mg/㎖ 효모 tRNA, 80 g/㎖ 연어 정자(salmon sperm) DNA 및 300 ng/㎖ 상기 리보 탐침을 포함하는 용액으로 50℃에서 18 시간 동안 아세틸화시키고 혼성화시켰다. 혼성화 반응이 종결된 후 남아있는 리보 탐침을 제거하기 위하여 , 상기 슬라이드를 RNA 분해효소(RNAse, Roche Molecular Biochemicals) 20 ㎍/㎖을 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 1×SSC(sodum citrate, sodium chloride) 및 0.1×SSC의 용액으로 55℃에서 각각 1 시간 동안 세척하였다. 상기 슬라이드 상에 혼성화된 탐침은 항-딕옥시제닌-알카라인 인산화제(anti-digoxigeninalkaline phosphatase; Roche Molecular Biochemicals) 접합체와 니트로 블루 테트라졸리움 (nitro bluetetrazolium, Roche Molecular Biochemicals) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌-인산(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, Roche Molecular Biochemicals)의 발색시약을 사용하여 염색시켜 식별하였다.
그 결과, Cv20ox 전사체는 외피 조직의 내층에 풍부하게 존재하였는데(도 5의B, E및G), 이는 상기의 RNA 블럿 분석 결과와 일치하였다. 하지만, 수박 종자의 내부 조직에서는 Cv20ox 유전자를 발현하는 조직 유형을 검출하지 못하였는데, 이는 아마도 종자의 내부조직에서는 Cv20ox 유전자가 매우 낮은 수준으로 발현하기 때문으로 판단된다.
<1-5> Cv20ox 유전자의 시간적 발현 양상
수박의 종자 발생동안 Cv20ox 유전자의 시간적 발현 양상을 연구하기 위하여, 수분 후 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 15 일째의 7 가지 종자로부터 RNA를 분리하여 실시예 1의 <1-4>와 동일한 방법으로 RNA 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과, Cv20ox 전사체는 수분 후 3 일째의 종자에서부터 검출되기 시작하여 4 일째에 현저하게 증가하였으며, 15 일째까지 높은 수준으로 유지되었다(도 3c).
<1-6> Cv20ox 유전자의 발현 조절 양상
본 발명자들은 수박 종자로부터 분리한 Cv20ox 유전자의 발현에 영향을 미치는 요인들을 조사하기 위하여, GA3및 CPPU를 처리하여 발현양상을 확인하였다.
먼저, GA3가 Cv20ox 전사체의 발현 수준에 어떠한 영양을 미치는 지를 확인하기 위하여, 수분 후 3 일째의 열매에 0.1 % 트윈 20(Tween 20)에 용해시킨 GA3300㎕를 처리하고 24시간 경과 후에 종자를 수확하여 RNA를 추출한 후 GA3를 처리하지 않은 종자에서 추출한 RNA와 함께 RNA 블럿 분석을 수행하였다. 이때, 대조구로서 수크로오즈 합성효소(sucrose synthase)의 전사체 발현 수준을 함께 측정하였다. 그 결과, Cv20ox의 발현은 GA3를 처리하지 않은 종자에 비해 GA3를 처리한 종자에서 억제되었고 수크로오즈 합성효소의 발현에는 아무런 변화가 나타내지 않았다(도 4). 이는 이미 여러 식물에서 보고된 바와 같이, 수박 종자의 GA 20-산화제 유전자의 발현 또한 활성형 지베렐린에 의해 피드백 조절을 받는다는 것을 의미한다.
또한, Cv20ox 유전자의 발현에 CPPU가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 CPPU 처리에 의해 유도된 단위결실 열매(Parthenocarpic)에서의 Cv20ox 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 단위결실 열매의 발생을 유도하기 위하여 0.1% 트윈 20 수용액에 용해시킨 CPPU 100 ㎎/ℓ을 개화시기의 씨방에 처리하였다.
그 결과, CPPU를 처리한 종자에서는 수분된 상태의 대조구에 비하여 Cv20ox 유전자가 조기 발현되었는데(도 6A), 이러한 Cv20ox 유전자의 조기 발현은 아마도 CPPU의 처리에 의해 촉진된 종자 및 열매의 조기 발생에 기인한 것으로 판단된다. 또한, CPPU 처리 10 일 후에 Cv20ox 유전자의 발현 양상을 보면, Cv20ox 유전자의전사체는 주로 외피에 축적되고 종자의 내부에는 약하게 축적되었는데(도 6B), 이는 CPPU 처리 종자는 배 또는 배유(endosperm)로 발달하지 못하므로 상기와 같이 종자의 내부에서 관찰되는 GA 20-산화제의 전사체는 아마도 핵(nucellar) 또는 전이 세포(transfer cell)에서 발현되는 것임을 암시한다.
<실시예 2> Cv20ox 유전자 프로모터 분리 및 활성 측정
<2-1> Cv20ox 유전자 프로모터 분리
본 발명자들은 종피특이적으로 발현을 조절하는 Cv20ox 유전자 프로모터를 분리하기 위하여, Cv20ox 프로모터 5' 상류 부위의 약 700 bp를 PCR 클로닝 키트(PCR cloning kit, TaKaRa)를 이용하여 수박의 전체 게놈 DNA로부터 분리하였다. 상기로부터 분리된 수박 게놈 DNA 10 ㎍을 HindⅢ 제한효소로 절단한 다음, HindⅢ 카세트(cassette)에 삽입하여 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 클로닝하여 재조합 벡터 pGA2044를 완성하였다.
상기 재조합 벡터의 염기 서열을 분석한 결과, Cv20ox 프로모터 5' 상류 부위는서열번호 5로 기재되는 염기 서열로 구성되며 번역(translation) 시작 코돈(start codon)으로부터 132 뉴클레오타이드 상류 부위에 잠정적 TATA 박스(TATAAATC box)가 존재하였다. 또한, 상기 유전자의 5' 상류 부위는 72%의 A/T 함량을 보이는 A/T 풍부 서열을 가지며, 19 bp 이상의 A/T 뉴클레오타이드를 세부분 포함하고 있었다. 이러한 5' 상류 부위의 A/T 풍부 서열은 전사촉진에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
<2-2> Cv20ox 유전자 프로모터의 활성 측정
상기와 같이 분리된 Cv20ox 유전자 프로모터의 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 Cv20ox 프로모터 부위에 리포터 유전자인 GUS 코딩 부위를 융합시킨 발현벡터를 제작하였다. 먼저, 높은 카피 넘버를 가지며 GUS 리포터 유전자를 포함하는 벡터 유도체인 pGA1230(Clontech)의 HindⅢ 및 PstI의 절단부분에 상기 <2-1>에서 제작한 재조합 벡터 pGA2044로부터 얻은 Cv20ox 유전자의 0.7 kb 프로모터 절편 부분을 삽입하여 발현벡터 pGA2118을 제조하였다(도 7). 발현벡터가 삽입될 수박 식물체의 다양한 기관들은 바이오라드 입자 충격기(BioRad Biolistic PDS-1000/He, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 입자 충격을 가하는 한편, 상기 발현벡터 DNA는 텅스텐(tungsten) 입자(M-10, BioRad)에 흡착시켰다. 발현벡터 DNA가 흡착된 텅스텐 입자를 상기의 입자 충격이 가해진 수박 식물체의 다양한 기관들로 입자 충격기를 이용하여 삽입시킨 후 암흑 상태에서 27℃, 30 시간 동안 배양하고 GUS 리포터 유전자의 활성을 조직 화학적 검출(histochemical detection) 방법을 통해 조사함으로써 융합 유전자의 일시적 발현을 측정하였다.
그 결과, Cv20ox 프로모터의 활성은 발생 중인 종자의 외피 조직에서만 검출되었고, 특히 핵에 인접한 층에서 매우 강하게 검출된(도 8의B) 반면, 잎(도 8의C), 뿌리(도 8의D), 배축(도 8의E) 및 자엽(도 8의F)과 같은 비생식 기관에서는 검출되지 않았다. 상기의 Cv20ox 프로모터 융합 유전자의 발현 양상은 실시예 1의 <1-4>에 나타난 조직 내 분포 실험(in situ localizaiton)의 결과와 일치하였다.
상기와 같이, 본 발명자들은 Cv20ox 유전자 프로모터가 종피특이적으로 유전자의 발현을 조절함을 확인하였다. 이와 같이 종피특이적으로 발현을 조절하는 Cv20ox 유전자 프로모터에 종자발달 저해인자인 식물 호르몬인 옥신의 생합성에 관여하는 유전자 iaaM 및 iaaH, 싸이토카이닌의 생합성에 관여하는 유전자 ipt 또는 GA 20-산화제 안티센스 등을 연결하여 이들이 발생중인 종자의 종피에서 특이적으로 발현되도록 조절하면 무종자 식물체를 생산할 수 있다. 본 발명자들은 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터에 상기 종자발달 저해인자들을 연결하여 재조합 발현벡터 pGA2257(GA 20-산화제 안티센스 + Cv20ox 유전자 프로모터), pGA2281(iaaM + Cv20ox 유전자 프로모터), pGA2282(iaaH + Cv20ox 유전자 프로모터) 및 pGA2289(ipt + Cv20ox 유전자 프로모터)를 제조한 후 이들을 대장균에 형질전환시켜 재조합 형질전환체를 얻었다. 대표적으로, 발현벡터 pGA2257은 Cv20ox 유전자 프로모터에 연결된 종자발달 저해인자로 GA 20-산화제 안티센스를 포함하는 벡터로서 상기 벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환체를 2000 년 4 월 6 일자로 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 : KFCC 11160). 이러한 형질감염체들을 식물체에 감염시키면 식물체의 종자 발달시 Cv20ox 유전자 프로모터에 의해 종자발달 저해인자가 종피특이적으로 발현되어 종자 형성을 저해하므로 무종자 식물체가 생산된다.
따라서, 상기 프로모터 부위는 Cv20ox 유전자의 발현을 조절하는 매개 신호를 밝히기 위해 유용할 뿐만 아니라 상기 프로모터에 식물생장 조절물질에 관련된 종자발달 저해인자를 연결하면 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해할 수 있으므로 무종자 식물체를 만드는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 수박의 종자 발생시 외피 조직(integumental tissue)에서는 강하게 발현되고 종자 내부 조직에서는 약하게 발현되는 조직 특이적 발현 양상을 보이는 GA 20-산화제를 코딩하는 Cv20ox 유전자 및 이의 종피특이적 Cv20ox 유전자 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 Cv20ox 유전자 프로모터에 리포터 유전자를 결합시킨 후 식물체에 도입하여 상기 Cv20ox 유전자 프로모터가 종피특이적으로 발현함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Cv20ox 유전자 프로모터 부위는 Cv20ox 유전자의 발현을 조절하는 매개 신호를 밝히는데 유용하게 사용될 뿐만 아니라 상기 프로모터에 식물생장 조절물질에 관련된 종자발달 저해인자를 연결하면 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해할 수 있으므로 무종자 식물체를 만드는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 수박 종자의 종피특이적 유전자 발현을 조절하는 프로모터.
  2. 제 1항에 있어서, 종피특이적 유전자는 지베렐린 20-산화제(Cv20ox) 유전자인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제 1항에 있어서, 프로모터는 종피특이적 발현을 조절하는 조절인자를 가지는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제 1항에 있어서,서열번호 5로 기재되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  5. 제 4항의서열번호 5로 기재되는 프로모터의 염기서열에서 연속한 23 개 이상의 염기서열이 상동성을 보이는 프로모터.
  6. 제 2항의 지베렐린 20-산화제 유전자는서열번호 3으로 기재되는 것을 특징으로 하는 Cv20ox 유전자.
  7. 제 1항의 프로모터에 종자발달 저해인자를 연결하여 식물체 종자의 종피에서 종자 발달을 저해하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 종자발달 저해인자는 식물생장 조절물질에 관련된 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 9항에 있어서, 종자발달 저해인자는 iaaM, iaaH, ipt 또는 GA 20-산화제 안티센스(antisense) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 식물체는 박과식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항의 종피특이적 프로모터 및 제 9항의 종자발달 저해인자를 포함하는 pGA2257(GA 20-산화제 안티센스 유전자), pGA2281(iaaM), pGA2282(iaaH) 및 pGA2289(ipt) 발현 벡터.
  13. 제 12항에 있어서, 발현 벡터 pGA2257는 종자발달 저해인자로 GA 20-산화제 안티센스 유전자를 포함하며 수탁번호가 KFCC 11160인것을 특징으로 하는 발현 벡터.
KR1020000018483A 2000-04-08 2000-04-08 수박의 종자 발생시 종피특이적으로 유전자의 발현을조절하는 Ｃｖ２０ｏｘ유전자 프로모터 KR20010090954A (ko)

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