KR100458137B1 - 스트레스 내성 형질전환 식물체 - Google Patents

스트레스 내성 형질전환 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감소된 수분 유용성에 대해 증가된 내성을 지닌 형질전환 식물체에 관한 것이다. 식물체는 재조합 ABF를 발현하는 것이 가능한 앱시스산 반응성 요소 결합 인자(ABF)를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 또한 감소된 수분 유용성에 대해 식물체의 내성을 증진시키는 방법이 제공된다.

Description

스트레스 내성 형질전환 식물체{Transgenic plants with enhanced stress tolerance}
본 발명은 스트레스 내성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 형질전환 식물체에 감소된 수분 유용성에 대한 증가된 내성을 부여하는데 효과적인 양으로 앱시스산 반응성 요소-결합 전사 인자(abscsic acid responsiveelement-binding transcription factors, ABFs)를 발현하는 형질전환 식물체에 관한 것이다.
식물체가 정착할 때 가뭄, 추위 및 높은 염도와 같은 환경적 조건에 대해 적응하는 능력을 지닌다. 이러한 스트레스 조건 하에서 식물 호르몬 앱시스산(ABA) 레벨은 성장 조직 내에서 증가하여 그들의 생존 및 생산력에 필수적인 적응성 반응을 일이킨다. 예를 들어 수분 결핍 조건 하에서 ABA는 기공의 폐쇄를 유도하여 증산작용을 통한 수분의 손실을 최소화한다. ABA-조절된 과정은 식물체 생존에 중대하고, ABA 결함 또는 ABA 반응 돌연변이체는 수분 스트레스를 받기 쉽다. 반대로 높은 레벨의 ABA는 전체 식물체 생장을 억제한다.
근원적인 ABA-매개된 스트레스 반응은 스트레스 반응성 유전자 발현의 전사 조절이다. 성장 조직 내에서 스트레스 조건 하에 상향-조절된 수많은 유전자가 보고되었다. 이들는 정상적인 조건 하에서 종자 발달시 풍부하게 발현되는LEA(Late Embryogenesis Abundant) 유전자로 알려진 유전자, 삼투압 오스모라이트(osmolyte) 생합성 유전자 및 일반적인 세포 대사의 유전자를 포함한다. 일반적으로 유전자 생성물은 스트레스 조건 하에서 보호적 또는 적응적 역할을 지닌다고 여겨진다. 더욱이 많은 다양한 키나제(kinase)/포스파타제(phosphatase)를 포함하는 조절적 유전자 및 전사 인자 유전자의 발현은 또한 비생물적 스트레스에 의해서도 유도된다. 모든 스트레스-유도성 유전자가 ABA에 의해 조절되는 것은 아니다. 그러나 많은 수가 외재성 ABA에 반응적이고, 많은 경우 그의 유도는 ABA 결함 돌연변이체에서 더 감소된다. 또한rbcS및CAB와 같은 일부 유전자의 발현은 ABA 및 스트레스에 의해 억제된다.
ABA 및/또는 스트레스 반응 유전자 발현을 제어하는 앱시스산 반응 요소(ABREs)는 수많은 연구에 의해 검출되었고, 그들의 추정되는 동족의 트랜스-액팅(trans-acting) 인자가 분리되었다. 시스(cis)-요소 중에서 가장 편재하는 것은 (C/T)ACGTGGC 컨센서스(consensus)를 공유하는 서열의 그룹이다. 많은 이러한 요소는 다른 환경적 요인에 의해 조절되는 많은 유전자에도 존재하는 G-박스(CACGTG) 서열을 포함한다. "커플링(coupling) 요소", hex3" 또는 "모티프Ⅲ"으로 알려진 ABREs의 다른 그룹은 CGCGTC 코어(core) 서열을 공유한다.
이들 두 가지 타입의 ABREs(이하 "ABREs"로 표기)의 상호작용에 기초하여 많은 추정되는 트랜스-액팅 인자가 분리되었다. 또한 bZIP류 단백질에 속하는 그들의 상동체 및 많은 다른 G-박스 결합 인자가 실험실 내에서 ABREs와 결합는 것이 가능하다. 그러나 이러한 생화학적으로 증명된 인자의 어떤것이 식물체 내의 ABA 또는 스트레스 시그날링(signaling)에 중요한 역할을 하는지를 나타내는 증거가 아직 부족하다.
무성 생장 동안 ABA 반응성 유전자 발현을 제어하는 전사 인자를 증명하는노력으로 우리는 최근 아라비돕시스(Arabidopsis) cDNA 발현 라이브러리(library)의 효모 단일-하이브리드(hybrid) 스크리닝(screening)에 의해 4개의 ABRE 결합 bZIP 인자를 분리하였다.
ABF1 내지 ABF4로 표현(ABRE Binding Factors 1-4)되는 인자들의 발현은 ABA- 및 스트레스-유도성이고, 효모 내의 ABRE-함유 수용체 유전자를 트랜스액티베이트(transactivate)할 수 있다. ABF2 및 ABF4는 그들을 각각 ABREB1 및 AREB2로 명명하고, 원형질체 내에서 ABA 반응성 프로모터를 활성화할 수 있다는 것을 나타낸 Uno et al.(Uno et al., 2000)에 의해 보고되었다. 생체 기능 내에서의ABFs를 연구하기 위해 우리는 그들을 구성적으로 과발현하는 형질전환 아라비돕시스를 생성하였다. 여기서 우리는 ABF3 및 ABF4 형질전환 라인이 ABA에 대해 과민하고, 강화된 가뭄 내성을 포함하는 일부 다른 ABA/스트레스-연관 표현형을 나타낸다는 것을 보여준다. ABF3은 발명자에 의해 미국특허 제6,218,527호에 공개되었고, ABF4는 미국특허 제 6,232,461호에 공개되었다. 2가지 ABFs의 발현 패턴은 그들의 과발현 표현형과 매우 연관되었다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 형질전환되지 않은 식물체 보다 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 실질적으로 더욱 내성이 있고, 이들 세포는 재조합 ABF 발현이 형질전환된 식물체에 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 대한 강화된 내성을 부여하는데 효과적인 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 앱시스산 반응성 요소-결합 인자 ABF를 인코딩하는 재조합 DNA 세그먼트(segment)로 구성된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
더욱이 형질전환 식물체는 재조합 앱시스산 반응성 요소-결합 인자 ABF3 및/또는 ABF4를 지닌다.
도 1은35S-ABF3및35S-ABF4식물체의 생장 표현형을 나타낸 것이다. (A) 토양에서의 생장.35S-ABF3(라인 A319) 및35S-ABF4(라인 A405) 형질전환 식물체는 토양에서 3주 동안 생장되었다. 삽입도는 충분히-생장한 장각(slilques), Ler,35S-ABF3및35S-ABF4식물체(좌측에서 우측으로)를 나타낸다. (B) ABF4 발현 레벨과 생장 표현형의 가혹성(severity) 사이의 관계. 좌측, Ler,35S-ABF4형질전환 라인, A402, A405 및 A406 내에서의ABF4발현 레벨의 RNA 겔 블럿 분석. 아래 패널은 RNA 겔의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색을 나타낸다. 각각의 레인은 총 25㎍의 RNA를 포함한다. 우측, ABF4 발현 정도 변화에 따른35S-ABF4형질전환 라인. 식물체의 공중(aerail) 부분만이 투명함을 나타내었다. (C) 좌측, ABA-없는 배지 상에서의35S-ABF3형질전환 종자의 발아. Ler, 라인 A333 및 라인 A319의 10주-령 종자가 4일간의 냉각 처리 후 ABA-없는 배지 상에 플레이트되었고, 발아(충분히 나타나는 어린 뿌리)는 다양한 시간에 기록되었다. 각각의 데어터 포인트는 3반복 실험의 평균을 나타낸다(각각 n = 50). 표준 오차는 심볼 보다 작다. 우측, Ler및 형질전환 라인 A33 및 A19 내에서의 ABF3의 RNA 겔 블럿 분석. 아래 패널은 에티디움 브로마이드 염색을 나타낸다. 각각의 레인은 총 25㎍의 RNA를 포함한다. A33 및 A19 라인 내에서의 ABF3 발현 레벨은 A405 및 A406 라인 내에서의 ABF4 발현 레벨과 유사하다.
도 2는35S-ABF3및35S-ABF4식물체의 ABA 가혹성을 나타낸 것이다. (A) 0.5μM ABA을 함유한 배지 상에서의 형질전환 식물체의 생장. 종자는 발아되었고, 12일간 생장되었다. (B) 0.25μM ABA을 함유한 배지 상에서의 형질전환 식물체의 생장. 종자는 배지 상에서 3일간 발아되었고, 대표적 식물이 나타났다. (C) 발아의 ABA 투여-반응. 재배 후 6개월 되고, 4℃에서 4일간 미리-냉각시킨 종자가 다양한 농도의 ABA를 함유한 배지 상에서 발아되었고, 충분히 나타나는 어린 뿌리를 지닌 묘목이 3일 후 카운트되었다. 실험은 3반복으로 수행되었고(각각 n = 50), 바는 표준 오차를 나타낸다. (D) 뿌리 생장의 ABA 투여-반응. 종자는 ABA-없는 배지 상에서 4일간 발아되었고, 묘목(n = 6)은 다양한 농도의 ABA를 함유한 배지로 옮겨졌다. 뿌리 신장은 옮기고 5일 후 측정되었다. 실험은 4회 이상 수행되었고, 어떤 경우는 다른 형질전환 라인을 이용하였으며 결과는 일관되었다. 작은 바는 표준 오차를 나타낸다. 형질전환 라인 A319(ABF3) 및 A405(ABF4)가 이용되었다.
도 3은35S-ABF식물체의 염 및 포도당 민감도. (A) 발아 상의 염 효과.Ler,aba1-1, abi1-1, abi1-2,35S-ABF3(라인 A319) 및35S-ABF4(라인 A405)의 종자가 냉각 처리 4일 후 50, 100 또는 150mM NaCl을 함유한 배지 상에 플레이트되었고, 발아(충분히 열린 자엽)는 4일 후 기록되었다. 실험은 3반복으로 수행되었고표준 오차는 심볼 보다 작다. (B) 새롭게 발아된 묘목 생장 상의 염 효과. 동일한 형질전환 라인의 종자가 100mM의 NaCl, KCl 또는 만니톨 함유 배지 상에서 4일간 발아되었고, 대표적인 묘목을 나타냈다. (C)35S-ABF형질전환 식물체의 포도당 반응. 종자는 조절 생장 배지 또는 수직상의 위치에서 3% 포도당 또는 만니톨로 보충된 동일한 배지 상에서 14일간 발아 생장되었다. A319, A333, A405 및 A406는 형질전환 라인을 나타낸다.
도 4는35S-ABF4식물체의 상편생장 및 장애물-접촉 반응을 나타낸 것이다. (A)35S-ABF형질전환 잎의 상편생장 만곡(curvature). Ler및 형질전환 식물체는 MS 플레이트 상에서 2주간 생장되었다.ABF4발현 레벨은A406 라인에서 가장 높았고, A402 라인 내에서 가장 낮았다(도 1B). (B)35S-ABF4식물체의 장애물-접촉 반응. 식물체(라인 A405)는 수직의 위치에서 4일간 1.5% 한천 플레이트 상에서 생장되었고, 그 후 각이 있는(45°) 위치에서 5일간 생장되었다. 화살표는 기울어지는 방향으로 변화하기 전의 뿌리 끝 위치를 나타낸다.
도 5는35S-ABF3및35S-ABF4식물체의 가뭄 내성을 나타낸 것이다. (A)35S-ABF3식물체(라인 A319)의 가뭄 내성. 형질전환 및 야생형 식물체(각각 n =100)가 2주간 동일한 컨테이너 내의 토양에서 생장되었고, 11일간 물을 공급받지 않고, 그 후 재-급수되었다. 사진은 재급수된 지 3일 후에 찍었다. (B)35S-ABF4식물체(라인 A405)의 가뭄 내성. 유사한 발생상 단계의 식물체(2주령 야생형 식물체 및 3주령 ABF4 식물체)가 12일간 물을 공급받지 않았고, 그 후 재-급수되었다. 사진은 재급수된 지 3일 후에 찍었다. (C) 및 (D)는 각각35S-ABF3및35S-ABF4형질전환 식물체의 증산율을 나타낸다. 유사한 발생 단계의 잎이 분리 후 다양한 시간에서 절제되고, 무게 측정되었다. 각각의 데이터 포인트는 2반복 측정의 평균을 나타낸다(각각 n = 9). 표준 오차는 심볼 보다 작다. (E) ABF 형질전환 식물체의 기공의 구경(라인 A319 및 A405). 기공 가드 셀(guard cell)은 급수 기간 중간에 관찰되었다. 화살표는 가드 셀을 나타내고, 삽입도는 대표적인 기공을 나타낸다.
도 6은35S-ABF형질전환 라인 내에서의 ABA-조절된 유전자의 발현을 나타낸 것이다. ABA 반응성 유전자의 RNA 레벨이 MS 플레이트 상에서 2주가 생장된것으로부터 분리된 총 RNA를 이용한 RT-PCT에 의해 측정되었다. 라인 A319 및 A405는 더 높은ABF발현을 지닌 형질전환 라인을 나타내는 반면, A325 및 A402는 더 낮은ABF발현을 지닌 형질전환 라인을 나타낸다.
도 7은ABF3및ABF4의 발현 패턴을 나타낸 것이다. (A)ABF3및ABF4발현의 조직-특이성. RNA는 정상적인 조건 하에서 생장된 야생형 식물체의 다양한조직으로부터 분리되었고,ABF3및ABF4의 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. L, 3-주령 식물체로부터의 잎. R, 3-주령 식물체로부터의 뿌리. F, 꽃. Si, 미숙 장각. (B) 및 (C) 각각 ABF3 및 ABF4 프로모터 활성의 조직화학적 GUS 염색. T3 동형접합 식물체는 X-gluc로 6시간(패널 e 및 f) 또는 24시간 동안 염색되었다. a, 2-일령 묘목. 삽입도는 미성숙 장각(상부) 또는 건조 종자(하부)로부터의 배아를 나타낸다. b, 5-일령 묘목. (B)에서의 화살표는 새롭게 나타난 슈트(shoot)를 나타낸다. c, 2-주령 묘목. d, 100μM ABA(ABF3) 또는 200mM NaCl(ABF4)로 처리된 2-주령 묘??. e, 뿌리 끝. (C)에서의 패널의 좌측 반은 측면 뿌리 원시세포를 나타낸다. f, 가드 셀. g, 꽃. h, 장각. 화살표는 장각 이탈 지역을 나타낸다.
본 발명은 형질전환되지 않은 식물체 보다 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 실질적으로 더욱 내성이 있고, 이들 세포는 재조합 ABF 발현이 형질전환된 식물체에 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 대한 강화된 내성을 부여하는데 효과적인 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 앱시스산 반응성 요소-결합 인자 ABF를 인코딩하는 재조합 DNA 세그먼트(segment)로 구성된 형질전환 식물체를 제공한다.
더욱이 형질전환 식물체는 재조합 앱시스산 반응성 요소-결합 인자 ABF3 및/또는 ABF4를 지닌다.
또한 본 발명은 형질전환 식물체에 의해 생산된 종자 및 형질전환 식물체의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 제공한다.
ABF3 및 ABF4 과발현 라인의 생장 표현형
ABF3 및 ABF4의 생체내 기능을 연구하기 위해 우리는 과발현 접근을 이용하였다.ABF3및ABF4의 코딩 구역은 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스35S프로모터에 융합되었고, 각각의 구조물은 아라비돕시스(생태형 Ler) 식물체를 형질전환하는데 이용되었다. 38 및 12 T3 동형접합체 라인이 각각35S-ABF3및35S-ABF4구조물로부터 회수되었고, 예비 분석 후, 더 높은 ABF 발현 레벨을 지닌 형질전환 라인이 더욱 상세한 분석을 위해 선택되었다.
야생형 식물체와 비교하여35S-ABF3형질전환 식물체는 공중 부분에서 약한 생장 지연을 나타내었고; 잎꼭지는 약간 더 짧았고, 잎은 더 둥글었다(도 1A). 그러나 지연의 정도는 심하지 않았고, 전체적인 생장 패턴은 장각이 다소 더 짧고 더 두꺼운 것을 제외하고는 야생형 식물체와 유사하였다(도 1A, 삽입도). 이와는 반대로35S-ABF4형질전환 식물체는ABF4발현 레벨에 의존적인(도 1B) 심한 생장 지연을 나타내었다(도 1A). 잎꼭지는 더 짧았고, 잎은 더 작았으며 개화는 지연되었고, 식물체는 더 짧았다. 또한35S-ABF3식물체의 발아는 ABA 부재시 야생형 식물체와 비교하여 몇시간 지연되었다(도 1C). 반대로35S-ABF4식물체 정상적으로 발아되었고, 따라서35S-ABF4식물체에서 관찰된 생장 지연은 후-발아 고정이었다.
35S-ABF 식물체의 ABA 반응
ABF3 및 ABF4의 과발현이 ABA 민감도에 의해 영향을 받는지 여부를 시험하기 위해35S-ABF3및35S-ABF4형질전환 식물체가 다양한 농도의 ABA를 함유한 배지 상에서 발아되었고 생장되었다. ABA 농도가 0.5μM 또는 그 이상일 경우35S-ABF식물체의 생장은 어린 뿌리 출현 후 완전히 정지되었다, 즉 자엽 녹화/확장 및 뿌리 생장이 심하게 억제되고, 어떤 형질전환 묘목도 진짜 잎을 지니도록 발달되지 않았다(도 2A). 동일한 조건에서 야생형 식물체는 ABA-없는 배지 상에서 보다는 느린 속도지만 계속하여 생장하고 발달하였다. 형질전환 묘목이 결국 진짜 잎을 지니도록 생장하였지만35S-ABF형질전환 식물체의 ABA 과민도는 또한 0.25μM ABA에서도 관찰되었다(도 2B).
ABA 반응의 단계-특이성을 알기 위해 ABA 투여-반응이 발아 동안 및 발아 후 측정되었다. 도 2C에서 나타나 바와 같이35S-ABF형질전환 식물체는 발아 단계에서 ABA에 과민하였고, 0.5μM ABA은 그들의 발아 효율을 8(ABF3) 또는 28%(ABF4)로 억제하는데 충분한 반면 야생형 식물체는 동일한 조건에서 80% 발아를 유지하였다. 이와 같이35S-ABF형질전환 라인의 뿌리 생장은 ABA에 과민하였다(도 2D).0.5μM ABA에서 야생형 뿌리 생장은 대조군 속도의 84%인 반면35S-ABF3및35S-ABF4식물체의 것은 각각 그 대조군 속도의 35% 및 51%였다. 1μM ABA에서35S-ABF4식물체의 뿌리 생장은 6%로 감소하였고,35S-ABF3은 37%로 감소하였다. 더욱이35S-ABF형질전환 식물체의 측면 뿌리 및 공중 부분 생장은 이러한 농도에서 유의적으로 억제되었다(데이터는 나타나지 않음). 야생형 식물체는 동일한 ABA 농도에서 대조군 속도의 62%로 생장하였다. ABA 농도가 5μM 이상인 경우 형질전환 뿌리 생장은 거의 완전하게 저지된 반면 야생형 식물체는 여전히 생장을 계속하였다. 결과는35S-ABF형질전환 식물체의 발아 및 후-발아 생장 모두가 ABA에 과민하다는 것을 나타낸다.
35S-ABF 식물체의 염 반응
높은 농도의 염은 아라비돕시스의 발아를 억제한다. 일부 연구는 ABA가 억제 과정에 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. 모든 염-둔감성 돌연변이체가 ABA-둔감성은 아니나 모든 ABA 결함(aba) 및 ABA 둔감(abi) 돌열변이는 발아 동안 염-둔감성을 나타낸다. 이는 아마도 높은 염에 의해 레벨이 증가하는 ABA가 억제 과정을 증진시키기 때문이다. ABF3 및 ABF4 모두의 발현이 염-유도성, 즉 이러한 경우 염-유도된 발아 억제이기 때문에 염 반응에 관여한다. 이를 시험하기 위해35S-ABF형질전환 식물체가 다양한 농도의 NaCl을 함유한 배지 상에서 발아되었다. 도 3A는 야생형 및abi1및abi2돌연변이 식물체의 발아가 100mM 이하의 NaCl에의해서는 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로35S-ABF식물체의 발아 및 생장은 100mM NaCl에 의해 유의적으로 영향을 받았고(도 3A 및 3B); 어린 뿌리의 출현, 뿌리 생장 및 자엽 개방/확장이 심하게 억제되었다. 병렬 실험에서 형질전환 식물체는 NaCl과 유사한 방식으로 KCl에 반응하였다(도 3B). 반대로 동일한 삼투압을 주는 동일한 농도 또는 2배 농도(데이터는 나타나지 않음)의 만니톨에 대한 반응은 정상이었다. 따라서 ABA 결함 또는 ABA 둔감 돌연변이체의 염-둔감성 표현형과는 반대로 ABF3 및 ABF4 과발현은 모두 발아/어린 묘목 단계에서의 염 과민성을 유발하고, 과민성은 자연 상태의 삼투성이기 보다는 이온성인 것으로 나타났다.
35S-ABF 식물체의 당 반응
높은 농도에서 당은 어린 묘목의 발달을 억제한다, 즉 자엽 녹화/확장 및 슈트 생장을 억제한다. 다른 사람에 의해 수행된 연구서 ABA는 포도당 또는 슈크로스 신호 트랜스덕션(transduction)에 필수적인 역할을 한다. 예를 들어 ABA-결함,aba2돌연변이는 당 둔감성,sis4돌연변이에 대립 유전성이고, 포도당 또는 당 둔감성 돌연변이,gin6, sis5및sun6은 ABA 둔감성 돌연변이 abi4에 대립 유전성이다. 또한 연구는 다른aba돌연변이체 및abi5돌연변이체가 어느 정도 포도당에 둔감하다는 것을 나타낸다. 따라서 ABF3 및 ABF4가 실제로 ABA 시그날링을 매개하면 ABF 과발현은 당 민감도에 영향을 미친다. 다른 당 보다 더욱 심한 생장 억제를 나타내는 포도당에 대한 반응을 측정함으로서 이를 처리하였다. 우리의 실험 조건 하에서 야생형 묘목은 포도당 농도가 4% 이상이었을 때 자엽 녹화 및 진짜 잎 발달의 억제와 같은 생장 결함을 나타내었다(데이터는 나타나지 않음). 반대로35S-ABF형질전환 라인의 공중 부분 생장은 야생형 식물체가 충분히 발달하는 농도인 3% 포도당에서 완전히 저지되었다(도 3C). 따라서35S-ABF형질전환 식물체는 포도당에 과민하였다. 이러한 형질전환 식물체의 강화된 반응은 야생형 식물체 및35S-ABF형질전환 식물체 모두의 생장을 유의적으로 그러나 동일하게 억제하는 동일한 농도의 만니톨에서는 관찰되지 않았다. 따라서 과민성은 삼투성이기 보다는 포도당-특이적이었다.
35S-ABF4 식물체의 상편생장 및 장애물-접촉 반응
최근의 연구는 ABA 시그날링 경로가 에틸렌(ethylene)의 것과 상호작용한다는 것을 나타낸다. 이 연구에서 ABA-매개된 발아 억제는 에틸렌에 의해 음성적으로(negative) 조절되는 반면 에틸렌 시그날링 구성성분은 뿌리 생장의 ABA 억제에 필수적이다. 또한 ABA-의존적 스트레스 반응에서 옥신(auxin)의 관련이 증명되었다. 점진적인 가뭄에 노출 시 새로운 측면 뿌리는 짧고 괴경화된(tuberized) 형태가 된다. '가뭄 가근생성(rhizogenesis)'로 알려진 과정은 ABA 결함aba-1및 ABA 둔감성abi1-1돌연변이체 뿐만 아니라 옥신 저항성axr1-3돌연변이체에도 악영향을 미친다. ABF3 또는 ABF4의 과발현이 에틸렌 또는 옥신 민감도에 영향을미치는지 여부를 시험하기 위해35S-ABF및 야생형 식물체의 생장 상에서의 에틸렌 전구체 1-아미노사이클로프로판(aminocyclopropane)-1-카르복실산(ACC) 및 인돌(indole)-3-아세트산(IAA)의 효과를 비교하였다. 우리는 그들의 반응에서 어떤 차이점도 발견하지 못했다. 그러나35S-ABF4식물체의 잎은 플레이트 상에서 생장시 상편생장 만곡을 나타내는 경향이 있었고, 이는 일반적으로 스트레스 조건 하에서 에틸렌의 작용에 의한 것이다. 또한35S-ABF4형질전환 식물체의 뿌리는 장애물-접촉 반응에 이상을 나타내었다. 도 4B에 나타난 바와 같이 야생형 식물체의 뿌리는 기울어진 위치에서 고형 한천 표면 상에서 생장할 때 파동적인 패턴으로 생장하였다. 그러나 뿌리 생장의 파동적 패턴은35S-ABF4식물체 내에서 유의적으로 감소하였다. 장애물-접촉 반응은 일부 옥신 저항성 돌연변이체에 악영향 미치고, 이는 옥신 시그날링 구성성분이 그 과정에 관련된다는 것을 나타낸다. 따라서 결과는 옥신 시그날링 경로(들)가35S-ABF4식물체 내에서 교란된다는 것을 의미한다. 이와 함께 우리의 결과는 ABF4 과발현이 에틸렌 및 옥신 반응의 일면에 영향을 미친다는 것을 제안한다.
35S-ABF4 식물체의 가뭄 내성
중요한 ABA-제어된 과정 중의 하나는 수분 스트레스 조건 하에서 증산 작용을 통한 수분 손실을 최소화하는 기공 폐쇄이다. 따라서 ABA 생합성 돌연변이체 및 일부 ABA 반응 돌연변이체는 손상된 기공 구경 조절 때문에 가뭄에 매우 민감하다. 따라서 ABF3 및 ABF4 과발현 라인은 인자가 ABA/스트레스 시그날링에 관련된 경우 수분 부족 조건에 변화된 반응을 나타내는 것으로 기대된다. 이를 알기 위해 우리는35S-ABF식물체의 가뭄 내성을 측정하였다. 도 5A에 나타난 바와 같이 11일간 급수가 중단될 때 야생형 식물체는 완전히 시들었고, 그 후 재급수 되었을 때 16%가 성숙을 위해 생존하였다. 그러나35S-ABF3식물체는 두드러지게 영향을 받지 않았고, 모두가 처리에 생존하여 종자를 뿌렸다. 유사한 실험에서35S-ABF4식물체는 또한 수분 부족 조건 하에서 높은 생존율을 나타내었다; 그들 모두는 12일 가뭄 처리에 살아남은 반면 야생형 식물체의 33%가 종자를 뿌렸다(도 5B). 따라서35S-ABF3및35S-ABF4식물체 모두 야생형 식물체 보다 가뭄 조건에 더 좋은 생존을 하였다.
형질전환 식물체의 강화된 가뭄 내성은 적어도 일부분 이상 그들의 더욱 낮은 증산율에 의한 것이 가능하다. 분리된 로제트(rosette) 잎의 프레쉬(fresh) 중량 손실에 의해 측정될 때35S-ABF3및35S-ABF4형질전환 라인의 수분 손실율은 각각 야생형 식물체의 약 50 및 70% 이하였다(도 5C 및 D). 결과와 일치하게 형질전환 식물체의 기공은 야생형 식물체 보다 더 작은 개방을 지녔다(도 5E). 정상적인 생장 조건 하에서 급수 중에 관찰될 때 야생형 기공의 ca. 85%(89/104)가 개방된 반면35S-ABF3및35S-ABF4식물체 내에서는 약 20%가 개방되었다. 따라서 ABF3 또는 ABF4의 구성적인 과발현은 부분적인 기공 폐쇄, 감소된 증산작용 및 강화된 가뭄 내성을 유발한다.
35S-ABF 식물체 내의 ABA 반응성 유전자의 발현
식물체에서의 ABF3 및 ABF4의 전사 조절적 역할을 연구하기 위해35S-ABF내에서의 ABA/스트레스 반응성 유전자의 다양한 발현이 측정되었다. 도 6에 나타난 바와 같이 많은 ABA-조절된 유전자(그룹Ⅰ)의 전사체 레벨은35S-ABF3및35S-ABF4형질전환 라인에서 강화되었다. 이들은 발현이 ABA 및 비생물적 스트레스에 의해 유도되는LEA류 유전자rd29B및rab18을 포함한다. ABA-유도성 발현, 세포 사이클 조절자 유전자ICKI(사이클린(cyclin)-의존적 키나제 억제자)도 또한35S-ABF형질전환 라인 내에 포함되었다.ICKI유전자는 ABA에 의해 세포 분열 저지를 매개한다고 알려졌다.35S-ABF3형질전환 라인에서ABI1RNA 레벨의 강화가 관찰되었고,ABI2전사체 레벨이 증가의 정도가 더 낮기는 하나 증가되었다.ABI1RNA 레벨의 증가는 또한 더 높은ABF4발현을 지닌35S-ABF4라인(A405) 내에서 관찰되었다. 상동성 단백질 포스파타제 2Cs를 인코드하고, 그의 돌연변이는 결함있는 기공 폐쇄 및 시든 표현형을 유발하는ABI1및ABI2의 발현이 ABA 및 수분 스트레스에 의해 강화된다. 반면에 ABA-억제성 유전자 SKOR은 RNA 레벨35S-ABF4형질전환 라인(그룹Ⅱ) 내 유의적으로 감소하거나 검출되지 않았다. 유전자는 뿌리-특이적 K+외부 정류 채널을 인코드하고, 그의 발현의 ABA 억제는 적응적 수분 스트레스 반응의 일부분이 된다고 알려졌다. 유사하게 가드 셀 이온 채널 유전자KAT1 및 KAT2는 높은ABF3발현을 지닌35S-ABF3라인(A319) 내 음성적으로 조절되었다. 2개의 이온 채널은 K+유입을 정상적으로 매개하여 기공 개방을 가능하게 하였으나 그들의 활성은 ABA에 의해 억제된다. 또한 스트레스 반응성 생합성 유전자(그룹Ⅲ), 칼콘(chalcone) 신타제(synthase) 유전자CHS및 알코올 탈수효소 유전자ADH1이 하향-조절되었다. 그러나 두 유전자의 전사체 레벨은 식물체가 높은 염으로 처리될 때35S-ABF형질전환 라인 내에서 더 높았으며 이는 ABF3 및 ABF4의 스트레스-유도된 후-번역적 변형이 이러한 유전자의 조절에 필요하다는 것을 나타낸다. 따라서 ABF3 또는 ABF4의 과발현은 ABA/스트레스 반응성 유전자의 조절을 유발하였고, 두 인자는 특별한 유전자 및 환경적 조건에 따라 양성적인 또는 음성적인 역할을 하였다.
ABF3 및 ABF4의 발현 패턴
지금까지 기술된 표현형은 ABF3 또는 ABF4의 과발현이 ABA 반응의 다양한 면을 강화한다는 것을 나타내었다. 결과의 생리적 관련성을 평가하고 그들의 기능에 대한 더 많은 단서를 수득하기 위해 우리는 그들의 시간적 및 공간적 발현 패턴을 연구하였다. 우리는 먼저 그들의 유도되지 않은 기초 발현의 조직-특이성을 연구하였다. ABF3 및 ABF4의 기초 발현 레벨이 매우 낮기 때문에 우리는 분석을 위해 역전사가 결부된 중합효소 연쇄 반응(RT-PCT)을 사용하였다. 도 7A에 나타난 바와 같이ABF3및ABF4모두의 상대적으로 더 높은 발현이 뿌리에서 검출되었다. 또한 더 낮은 ABF3 발현이 꽃에서 발견되었으나 동일한 조건 하에서의 잎 및 장각 내에서 관찰되지 않았다. 반대로 약한ABF4발현이 잎, 꽃 및 장각 내에서 검출가능하였다.
ABF3및ABF4의 더욱 상세한 시간적 및 공간적 발현 패턴이ABF 프로모터-GUS수용체 구조물을 잠복시킨 형질전환 식물체의 조직화학적 GUS 염색에 의해 측정되었다.ABF3프로모터(2.1kb) 구조물과 함께 GUS 활성이 배아 내에서 검출될 수 없었으나 발아 단계에서 출현한 어린 뿌리(도 7B, a) 및 더 후반 단계에서의 발육 조직의 대부분(도 7B, b 및 c) 내에서 관찰되었다. 뿌리는 끝 부분을 제외하고는 대부분 강하게 염색되었고, 잎꼭지, 잎 도관 조직 및 가드 셀은 상대적으로 강한 GUS 활성을 나타내었다(도 7B, b∼f). 반대로 출현한 슈트 및 어린 잎(도 7B, b 및 c)은 ABA, 염 또는 만니톨 처리 후에만 GUS 염색을 나타내었다. 성숙한 식물에서 GUS 염색은 꽃밥, 주두 및 장각(이탈 구역, 리플럼(replum) 및 푸니쿨리(funiculi) 내에서도 검출되었다(도 7B, g 및 h).
ABF4프로모터는 녹색 장각으로부터의 배아 내에서 활성이었으나 그의 활성은 배아가 성숙됨에 따라 감소하였고, 일부 제한된 구역(어린 뿌리 끝, 슈트 분열조직 구역 및 자엽 끝)을 제외하고는 새롭게 발아된 묘목 내에서 검출되지 않았다(도 7C, b). 더 후반 단계에서 충분히-확장된 자엽의 단계로부터 시작하여(도 7C,b)ABF4프로모터 활성은 모든 발육 조직 내(도 7C, c∼f) 및 또한 꽃 기관 및 장각(이탈 구역, 리플럼 및 푸니쿨리) 내(도 7C, e)에서 관찰되었고, 이는 생장 조절에서의 역할을 나타낸다. 또한 이는 잎꼭지 및 가드 셀 내에서 강한 활성을 나타내었다(도 7C, c 및 f). 묘목의 염 처리는ABF4프로모터 활성을 다소 강화하였다(도 7C, d).
토론
ABA-조절된 유전자 발현은 ABA 시그날링에 중심적인 역할을 하고, 많은 ABA/스트레스 반응성 유전자는 (C/T)ACGTGGC- 또는 CGCGTG-함유 ABREs에 의해 조절된다. 따라서 관련된 전사 인자의 확인은 ABA 시그날 트랜스덕션(transduction) 케스케이드(cascade)에 중요하다. 많은 연구는 ABA 시그날링 경로가 조직-특이적이라는 것을 나타내고, 일부 종자-특이적 ABA 시그날링 구성성분(ABI3, ABI4및ABI5)이 유전적 스크린에 의해 증명되었다.ABI3, ABI4는 그의 결합 사이트 및 중간 타겟 유전자가 아직 알려져 있지 않은 전사 인자를 인코드한다. 최근ABI5이 ABF-관련 인자의 종자-특이적 서브패밀리(subfamily)에 속하는 bZIP 인자를 암호화한다는 것을 나타내었고, 후발아 발달 저지에서의 그의 역할도 논의되었다. 그러나 많은 bZIP 인자가 실험실 내에서 ABREs와 상호작용을 한다고 알려졌으나 주요 기능이 발육 생장 동안의 ABA 시그날링을 중재하는 것인 ABRE 결합 인자는 보고되지 않았다.
ABF는 대부분의 다른 식물 bZIP 인자와는 달리 G-박스 타입 및 CGCGTG-함유 ABREs 모두와 상호작용이 가능하다는 점에서 ABRE 결합 bZIP 중에서 유일하다. 그들의 ABRE-함유 수용체 유전자의 트랜스액티베이션 능력 및 그들 발현의 스트레스-유도성과 함께 넓은 결합 특이성은 ABFs가 많은 ABA/스트레스 반응성 유전자를 조절하는 잠재성을 지니고, 따라서 스트레스 반응성 ABA 시그날링에 관여하기 용이하다는 것을 나타낸다. 이러한 의문을 제기하기 위해 우리는 과발현 접근을 사용하였다. ABREs와 상호작용하는 ABF 및 많은 다른 bZIP 인자의 잠재적 기능적 과잉을 고려할 때 그 접근은 안티센스(antisense), 넉아웃(knockout) 및 RNA 방해와 같은 기능 접근의 손실 보다 더 좋은 방법이 될 것이다. 그러나 ABF의 과발현(우리는 연구에서 사용된35S-ABF형질전환 라인 내의ABF3및ABF4레벨이 그들의 ABA-유도된 레벨의 약 2∼10배의 범위에 있음을 측정한다)은 비-자연적 조건을 유발할 수 있었다. 예를 들어 ABF에 의해 정상적으로 조절된 유전자는 켜지거나 꺼졌을 것이다. 또한 비-자연적 헤테르다이머리제이션(heterdimerization)을 통해 그들을 적정함으로서 다른 ABF 멤버 또는 잠재적으로 다른 bZIP 인자의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 표현형의 과발현은 경고에 의해 중단될 필요가 있고, 그들의 역할은 다른 실험 수단에 의해 더욱 확인될 수 있다. 그럼에도 불구하고 우리의 결과는 ABF3 또는 ABF4 과발현은 ABA 과민성, 당 과민성 및 강화된 가뭄 내성과 같은 일부 ABA-관련된 표현형에 ABA/스트레스 반응성 유전자의 변화된 발현을 부여한다는 것을 나타낸다.
ABF3 또는 ABF4 과발현에 의해 부여된 ABA 과민성이 매우 뚜렷하고, 발아 및 후반 생장 단계 모두에서 관찰되는 반면(도 2), 외생적 ABA의 부재시의 생장 상의 과발현 효과는 중간 또는 발달 단계-의존적(ABF4)이었다(도 1). ABF3는 발아 및 묘목 생장 모두에 억제적 효과를 미친다. 그러나 외생적 ABA의 존재시의 것과 비교한 낮은 정도의 억제는 ABF3 단독이 억제적 기능에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로 ABF4 과발현은 발아에는 적은 효과를 나타내나 묘목 생장에서는 강한 효과를 나타내어, 묘목 생장의 ABF4 활성이 발달적으로 조절된다는 것을 의미한다. 또한 결과는 묘목 생장의 ABA 억제가 발아 억제 메카니즘과는 다른 메카니즘에 의해 중재된다는 것을 나타낸다. 또한 ABF4 효과의 발달 단계-의존성은 아마도35S-ABF4식물체의 생장 지연이 ABF4 과발현의 플레이오트로픽(pleitropic) 효과 보다는 ABA 시그날 트랜스덕션 케스케이드의 일부분의 구성적 작동으로부터 초래된다는 것을 나타낸다. 다양한 생장 지연 정도를 제외하고는35S-ABF3또는35S-ABF4식물체 어떤것도 일반적인 발달에서의 비정상을 나타내지 않았다. 따라서 그들의 과발현은 생장율에 영향을 미쳤으나 발달 과정에는 그렇지 않았다.
35S-ABF3및35S-ABF4형질전환 식물체의 다른 ABA- 또는 스트레스-관련 표현형은 염 및 포도당에 대한 과민성을 포함하고,35S-ABF4식물체는 변화된 에틸렌 또는 옥신 반응에 관련되는 것이 가능한 부가적인 표현형(즉, 잎의 상편생장 및 비정상적인 장애물-접촉 반응)을 나타내었다. 높은 염 및 높은 당의 동반 모두는삼투성을 증가시키기 때문에 염 및 포도당 과민성은 높은 삼투성에 대한 증가된 감도를 반영한다. 그러나35S-ABF식물체는 만니톨에 정상적으로 반응하였고, 이는 삼투 감도가 영향을 받지 않았음을 나타내었다. 따라서 ABF3 및 ABF4는 염 및 포도당 시그날링 경로의 비-삼투적 가지 내에서만 포함되는 것으로 나타난다. 당-중재된 발달 저지는 발달단계의 좁은 시일, 약 2일 후발아에 한정되고, ABI4-의존적 발달 시그날링 케스케이드를 통해 증가된 ABA 레벨에 의해 중재된다. 또한 ABA가 유사한 단계에서 발달 저지를 중재하고, 억제 과정이 돌연변이가 약한 당 둔감성을 유발하는 ABI5를 필요로 한다는 것이 보고되었다. 따라서 우리의 결과는 ABF3 및 ABF4가 당- 및 ABA-유도된 발달 저지를 중재함에 있어서 ABI4 및 ABI5와 기능이 겹친다는 것을 나타낸다. 이는 그 발현의 징후가 초기 발달 단계와 일치하기 때문에 ABF3의 경우에 특별하다(도 7B, a).
기공 폐쇄는 수분 결핍 조건에 대한 중요한 ABA-제어된 과정이다. 우리의 데이터는 ABF3 및 ABF4가 이러한 과정에 관련된다는 것을 나타낸다. 그들이 과발현은 ABA 과민성 돌연변이체era1표현형을 암시하는 낮은 증산작용 및 강화된 가뭄 내성을 초래하였다(도 5). 더욱이35S-ABF형질전환 식물체의 기공 개방은 야생형 식물체 보다 더 작았고, 기공 구경 조절에 관련된 일부 유전자의 변화된 발현이 형질전환 식물체 내에서 관찰되었다(도 6). 조사한 유전자 중에서ABI1이 특히 ABF3 과발현 라인 내에 가장 강하게 영향을 받았다. ABI1은 그의 발현이aba1및abi1돌여변이체에서는 감소되는 반면 ABA 및 높은 삼투성에 의해 강화되기는하나 ABA 시그날링의 음성적 조절자로 알려져 있다. 따라서 증가된 ABI1 레벨이 기공 폐쇄에서 양성적인 또는 음성적인 역할을 하는지 여부가 명확하지 않다. ABI1의 역할이 어떤 것이든지 우리의 결과는ABI1발현이 ABF3 조절을 하고, ABF3 및 ABF4 과발현이 기공 운동 및/또는 가드 셀 ABA 시그날링에 관련된 유전자 발현에 영향을 미쳐서 결과적으로 기공 폐쇄를 강화시킨다는 것을 나타낸다.
35S-ABF형질전환 라인 내의 ABA 반응성 유전자의 전사체 레벨의 변화는 ABF3 및 ABF4가 식물 내에서 전사 조절자로서 기능한다는 것을 나타낸다. 도 6에서 나타난 바와 같이 양성적 및 음성적 변화 모두는 특정한 유전자에 따라 관찰되었다. 그 결과는 ABF3 및 ABF4 타겟 유전자의 다른 서브세트(subset)가 다른 메카니즘을 통해 조절된다는 것을 나타낸다. 또한 정상적인 생장 조건 하에서의 일부 유전자의 음성적 조절과 염 처리 후의 동일한 유전자의 양성적 조절(도 6, 그룹Ⅲ)은 ABF 활성의 스트레스-유도된 변형이 이러한 유전자의 조절에 필수적이라는 것을 나타낸다. 변형 활성은 정상적인 조건 하에 한정된다. 따라서 예를 들어 동일한 유전자의 음성적 조절은 더 높은 ABF 레벨과 함께 그의 부분이 증가한 전사적으로 불활성적이고, 변형되지 않은 ABF의 결합에 의해 설명될 수 있다. 변형은 ABF의 인산화를 포함한다. ABA/스트레스 시그날링에의 키나제/포스포타제의 관련은 잘 알려져 있고, 일부 인산화 사이트가 ABF 중에 높게 보존되어 있다. 더욱 최근에는 Uno가 ABREB1(ABF2) 및 ABREB2(ABF4)를 인산화하는 배양된 세포 내에서의 ABA-활성된 키나제 활성을 보고하였다. 또한 다른 조절적 단백질과의 상호작용을포함한다.
ABF3 및 ABF4의 발현 패턴은 그들의 과발현 표현형에 의해 나타난 기능과 일치하엿다. 공간적으로 두 프로모터 모두는 뿌리 및 가드 셀 내에서 가장 활성적이있고, 수분 스트레스 반응 동안 그들의 역할과 일치하였다. 또한 단지 적은 생장 억제를 미치는 ABF3는 생장하는 조직(뿌리 끝, 새로운 슈트 및 새로운 잎) 내에서 약하게 발현하는 반면, ABF4는 뿌리의 생장하는 구역(분열조직, 신장 영역 및 측면 초생 뿌리) 내에서 강하게 발현하였다. 시간적으로는 강한 ABF3 프로모터 활성이 새롭게 발아된 묘목 내에서 관찰되었고, 발아 상의 더욱 명백해진 그의 효과와 일치하였다(도 1C 및 2C). 반대로 ABF4 프로모터는 묘목 생장의 징후에서 주요한 활성을 나타내었고, 묘목 생장 상의 강한 효과와 일치하였다. 또한 우리의 결과는 ABF3 및 ABF4 모두 재생 단계 및 종자 이탈 동안 기능을 한다는 것을 나타낸다. 두 프로모터 모두는 이탈 영역, 리플럼 및 장각의 배주병(funicle) 내에서 강한 활성을 나타내었고, 또한 상대적으로 강한 활성이 주두 및 꽃밥 내에서 검출되었다.
유사한 결합 활성 및 다른 발현 패턴을 지닌 다중 인자의 분리는 ABRE를 포함하는 ABA/스트레스 시그날링이 다중 인자에 의해 중재되기 용이하다는 것을 나타내었다. 우리의 최근 결과는 관찰을 더욱 뒷받침하였다. 그들의 과발현 표현형 및 발현 패턴이 유사하더라도 ABF3 및 ABF4가 여러 면에서 서로 달랐다. 시간적및 공간적 발현 패턴의 세부적인 것은 달랐다(도 7). 생장 지연, 뿌리 생장 억제 및 손상된 자극-접촉 반응은 ABF4 형질전환 라인에서 더욱 현저하였다. 또한 작은 차이점이 분자 레벨에서 관찰되었다.ABI1및ABI2발현 레벨은35S-ABF3형질전환 라인 내에서 더 높은 반면,SKOR발현의 하향-조절은 단지35S-ABF3식물체 내에서 관찰되었다. 다른 ABFs, ABF1 및 ABF2의 기능은 측정되어야 하나 그들의 역할은 서로 매우 다르고, 또한 우리의 예비 데이터에 따라 ABF3 및 ABF4와도 매우 다른 것으로 보인다. 따라서 발육 조직 내에서의 ABRE-의존적 ABA/스트레스 시그날링은 겹치지만 뚜렷한 기능을 하는 다중 인자에 의해 매개되는 것으로 보인다.
상기에 제시되고 기술된 우리의 데이터는 ABF3 및 ABF4가 스트레스-반응성 ABA 시그날링에 관련된다는 것을 나타낸다. 특히 ABF3 및 ABF4의 과발현은 가뭄 조건 하에서 아라비돕시스 식물체의 생존율을 뚜렷이 증가시켰다. 우리의 실험에서 구성적 프로모터(즉, 35S 프로모터)를 사용하였다. 그러나 조직-특이적 또는 유도성인 다른 프로모터는 또한 형질전환 라인 내의 ABF 유전자의 발현을 이끄는데 사용될 수 있다. 스트레스 조건 하에서만 활성적인 유도성 프로모터는 그의 구성적 과발현이 생장 지연을 초래하는 ABF4의 경우에 특별히 효과적일 것이다. 또한 ABF의 발현 레벨 또는 안티센스, RNA 간섭 및 넉다운과 같은 성립된 기술을 이용한 그의 상동성을 감소시킴으로서 식물체의 스트레스 내성을 변화시키는 것이 가능할 것이다.
ABA는 가뭄 반응뿐만 아니라 높은 염, 추위/결빙, 열 및 상처와 같은 다른 환경적 스트레스에 대한 반응을 제어한다. 따라서 ABF는 형질전환되지 않은 식물체 보다 더 이러한 다수의 스트레스에 대해 내성적인 형질전환 식물체를 발달시키느데 사용될 수 있다. 더욱이 스트레스-반응성 유전자 발현을 제어하고, ABF에 결합하는 시스-조절적 요소는 다양한 식물체 중에 높게 보존된다. 따라서 아라비돕시스 외의 식물체 내의 ABF 과발현도 그들의 가뭄 및 다른 스트레스 내성을 강화시킬 것이고, 그들 내의 ABF 유전자를 발현함으로서 강화된 스트레스 내성을 지닌 형질전환 채소류 또는 곡류 식물체를 발달시키는 것이 가능하다.
실시예
아라비돕시스 생장
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 생태형 랜스버그 에렉타(Landsbergerecta(Ler))가 이번 연구에 사용되었다.aba1-1, abi1-1및abi2-1종자는 오하이오 주립대학에 소재하는 아라비돕시스 생물 자원 센터에서 수득되었고, 그들의 표현형은 사용되기 전에 확인되었다.
식물체는 22℃에서 장일 조건(16시간 광/8시간 암 사이클) 하의 무균상으로 또는 토양에서 생장되었다. 토양 생장에서 종자는 질석, 펄라이트(perlite) 및0.1%의 Hyponex로 관개된 이탄지(peat moss)를 1 : 1 : 1 비율의 혼합물에 파종되었고, 잔여 휴지상태를 깨기위해 4℃의 암조건에서 4일간 방치되었으며 정성적인 생장 조건으로 옮겨졌다. 그렇지 않은 상태가 아니면 식물체는 1주일에 한번 급수되었다. 무균 생장에 있어서 종자는 70% 에탄올로 5분간 처리되었고, 그 후 5분간 30% 가정용 표백제로 처리되었으며 증류수로 5회 세척되었고, 0.8% 파이토아가(Phytoagar)로 응고된 MS 배지 상으로 플레이트되었다. MS 배지는 본문에 기술된 바와 같이 1% 슈크로스로 보충되었고, 필요에 따라 ABA, 염, 포도당 또는 만니톨로 보충되었다. 발아 시험을 위해 종자는 사용되는 동일한 또는 유사한 시간에 수집되었다. 뿌리 생장 측정을 위해 식물체는 다양한 위치에서 발아되었고, 생장되었다.
구조물 및 아라비돕시스 형질전환
35S프로모터-ABF코딩 구역 구조물(35S-ABF3및35S-ABF4)이 pBI121의 β-글루쿠로니다제(glucuronidase (GUS)) 코딩 구역을ABF3또는ABF4의 코딩 구역으로 대치시킴으로서 준비되었다. GUS 서열은 BamHI-SacI 분해 후 제거되었고, 3'돌출을 제거하는 T4 DNA 중합효소 처리 후 pBI121의 잔여 부분은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 BamHI 분해에 의해 준비된ABF3또는ABF4의 코딩 구역으로 결찰되었다. 정지 코돈 및 BamHI 링커(linker) 서열을 지닌 전체 코딩 구역에 포함된ABF의 코딩 구역은 클로닝 목적을 위한 개시 코돈 앞에 부착되었다.ABF프로모터-GUS리포터 융합은 pBI101.2의 GUS 리포터 유전자의 앞에 개시 코돈으로부터의 5' 측면 서열의 2.1kb(BF3) 또는 1.2kb(ABF4)를 삽입함으로서 준비되었다. 프로모터 단편은 주형으로서의 아라비돕시스(생태형, 콜롬비아(Colombia) 게모믹 DNA 및ABF3의 경우 5'-caaacttaccctgttgttgcaact-3'(서열번호: 1)과 5'-ctagtctagaaggat
caagcttctggatatttac-3'(서열번호: 2),ABF4의 경우 5'-gatcaatttgaatttttgatatac
atc-3'(서열번호: 3)과 5'-ctagtctagattcaatgaaaacaaagcatccaag-3'(서열번호: 4)의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해 준비되었다. PCR 단편은 XbaⅠ으로 분해되었고, HindⅢ 분해 및 Klenow 처리 및 XbaⅠ 분해에 의해 준비된 pBI101.2로 결찰되었다. DNA 조작은 표준 절차를 따랐고, ABF 코딩 구역 및 정션(junction) 서열의의 완전성은 DNA 서열화에 의해 확인되었다.
아라비돕시스의 형질전환은 아라비돕시스 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주 GV3101을 이용한 진공 침윤법에 따랐다. 표현형 조사를 위해 T3 또는 T4 동형접합성 라인이 사용되었다. GUS 염색 패턴은 적어도 5개의 다른 형질전환 라인 이상을 관찰함으로서 확인되었고, T3 동형접합성 라인이 상세한 분석에 사용되었다.
RNA 분리, RT-PCR 및 RNA 겔 블럿 분석
RNA는 적게 변형된 Chomczynski and Mackey(1995)의 방법에 분리되었다.RNA 겔 블럿 분석 및 RT-PCR은 하기의 변형으로 기술된 바와 같이 수행되었다. RNA 겔 블럿 분석을 위해 하이브리디제이션은 Amersham Pharmacia Biotech사의 Rapid-hyb 완충액 내 65℃에서 수행되었다. 노출시간은 6시간(ABF3) 또는 20시간(ABF4)이었다. RT-PCR은 Promega사의 Access RT-PCR System 또는 GIBCO BRL사의 SUPERSCRIPTTMOne-Step RT-PCR System을 이용하여 수행되었다. 각각의 RT-PCR 결과는 몇 개의 독립적 반응에 의해 확인되었고, RNA 제조에서의 DNA 오염의 부재는 가능한 언제나 프라이머 세트 스패닝(spannig) 인트론을 이용함으로서 확인되었다. RT-PCR 반응에 사용된 프라이머는 표 1에 나타나 있다.
RT-PCR 프라이머
유전자명 서열 (5' ∼ 3')
액틴 F : cat cag gaa gga ctt gta cggR : gat gga cct gac tcg tca tac
ABF3 F: aga acc tca acc ggt gga gag tgR: gga gtc aga tca ggt gac atc tgg
ABF4 F: aac tgt gtt caa cag atg ggt cagR: ggt tcc tcc gta act agc taa tcc
rd29B F: gtg aag atg act atc tcg gtg gtcR: gcc taa ctc tcc ggt gta acc tag
rab18 F: atg acg agt acg gaa atc cga tggR: tat gta tac acg att gtt cga agc
ICK1 F: acg cac acg taa cct aaa tcgR: gca tct ccg tca tca att tcg
ABⅡ F: tca aga ttc cga gaa cgg aga tcR: gag gat caa acc gac cat cta ac
ABⅠ2 F: gtt ctt gtt ctg gcg acg gag cR: cca tta gtg act cga cca tca ag
rd29A F: gat aac gtt gga gga aga gtc ggcR: cag ctc agc tcc tga ttc act acc
SKOR F: atg gga ggt agt agc ggc ggcR: gat tct ctg gta atc ccc tga ag
KAT1 F: ttc tgc gtc gag gaa tac aat ata gR: ctt agg gtc aac tag aag ata g
KAT2 F: aca caa gac caa tgt caa tct ctt gR: gtc gac tag aag ata tga gtg gc
ADH1 F: tcc acg tat ctt cgg cca tgR: tag cac ctt ctg cag cgc c
CHS F: tca cca aca gtg aac aca tga ccR: gag tca agg tgg gtg tca gag g
F : 전방 프라이머, R : 역 프라이머
조직화학적 GUS 염색
GUS 활성의 in situ 에세이는 Jefferson et al.(1987)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 전체 식물체를 100mM 인산나트륨, pH 7.0, 0.1mM EDTA, 0.5mM 페리시아나이드(ferricyanide), 0.5mM 페로시아나이드(ferrocyanide) 및 0.1% 트리톤 X-100 내의 X-gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-글루쿠론산) 용액 내에 담그고, 5분간의 진공을 부여한 후 지시된 시간 동안 37℃에서 인큐베이트되었다. 엽록소는 70% 에탄올 내에 담금으로서 식물체로부터 제거되었다.
가뭄 처리 및 증산율의 측정
가뭄 처리를 위해 3주령, 토양내 생장된 식물체가 특정한 시간 동안 수분으로부터 완전히 제거되었다. 실험적 변이를 최소화하기 위해 동일한 수의 식물체가 동일한 트레이 상에서 생장되었다. 생장 지연을 나타내는 2 배취(batch)의 35S-ABF4 식물체로 동일한 연령 하나와 유사한 발생 단계의 다른 하나(즉, 야생형이 7일 후에 파종되어 치료의 종결에서 유사한 발생 단계에 있게됨)가 시험되었고, 유사한 결고가 수득되었다. 전체 시험은 적어도 4 반복되었고, 종종 식물체의 다른 배열을 이용하였으며(즉, 다른 컨테이너 상에서의 시험 식물체) 결과는 일관되었다. 분리된 잎의 증산율이 실험 배체 상의 개방된 페트리 디쉬 상에서 배축 사이드 업(side up)되게 놓인 신선한 수확된 잎의 중량을 측정함으로서 측정되었다. 3주령의 토양에서 생장된 식물체로부터의 유사한 발달 단계의 잎(세 번째 내지 다섯 번째 트루(true) 로제트(rosette) 잎)이 이용되었다.
가드 셀
가드 셀을 측정하기 위해 잎은 3주령의 급수 중간(급수 후 3일) 및 광 기간에 토양에서 생장된 식물체로부터 절단되었다. 각각 야생형 및 형질전환 라인의20개의 다른 식물체로부터의 유사한 발달 단계의 잎(세 번째 내지 여섯 번째 트루(true) 로제트(rosette) 잎)이 절단 후 바로 배축 사이드 업되게 놓여졌고, 사진을 찍었다. 그 후 일반적으로 6∼7개의 무작위의 선택될 필드 내에서 가드 셀의 수가 카운트되었다.
본 발명의 효과는 형질전환되지 않은 식물체 보다 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 실질적으로 더욱 내성이 있고, 이들 세포는 재조합 ABF 발현이 형질전환된 식물체에 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 대한 강화된 내성을 부여하는데 효과적인 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 앱시스산 반응성 요소-결합 인자 ABF를 인코딩하는 재조합 DNA 세그먼트(segment)로 구성된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
<110> Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. <120> TRANSGENIC PLANTS WITH ENHANCED STRESS TOLERANCE <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 caaacttacc ctgttgttgc aact 24 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctagtctaga aggatcaagc ttctggatat ttac 34 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gatcaatttg aatttttgat atacatc 27 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ctagtctaga ttcaatgaaa acaaagcatc caag 34

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. ⅰ) ABF의 오버- 또는 언더- 발현을 위한 조절 서열 및 센스 또는 안티센스 방향으로의 ABF 코딩 서열로 구성된 발현 벡터를 구조하고;
    ⅱ) 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환 또는다른 수립된 식물체 형질전환 방법에 의해 발현 벡터를 식물 세포 내로 트랜스퍼하고;
    ⅲ) 재조합 ABF를 발현하는 형질전환 개체를 선택하고, 유지하는 :
    단계로 구성된, 감소된 수분 유용성 및 다른 환경적 스트레스에 대해 식물체의 내성을 증가시키는 방법
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