BRPI0907472B1 - Uso de um gene RDL1 de planta ou sua proteína RDL1 codificada, vetor de expressão que contém um promotor heterólogo, célula hospedeira transgênica, bem como método para a produção de uma planta transgênica, uso da planta transgênica e método para a produção de sementes de planta - Google Patents

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(54) Título: USO DE UM GENE RDL1 DE PLANTA OU SUA PROTEÍNA RDL1 CODIFICADA, VETOR DE EXPRESSÃO QUE CONTÉM UM PROMOTOR HETERÓLOGO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, BEM COMO MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, USO DA PLANTA TRANSGÊNICA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE SEMENTES DE PLANTA (51) lnt.CI.: C12N 15/29; C12N 15/82; A01H 5/10; C12N 15/09; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 04/02/2008 CN 200810033537.2 (73) Titular(es): SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CAS (72) Inventor(es): ΧΙΑΟΥΑ CHEN; BING XU; JINYING GOU; ΧΙΑΟΧΙΑ SHANGGUAN; YINGBO MAO; ZHIPING LIN; LINGJIAN WANG (85) Data do Início da Fase Nacional: 04/08/2010

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USO DE UM GENE RDL1 DE PLANTA OU SUA PROTEÍNA RDL1 CODIFICADA, VETOR DE EXPRESSÃO QUE CONTÉM UM PROMOTOR

HETERÓLOGO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, BEM COMO MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, USO DA PLANTA

TRANSGÊNICA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE SEMENTES DE PLANTA FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada à bioengenharia de plantas e à engenharia de melhoria genética em plantas.

Especialmente, a invenção está relacionada ao isolamento de um cDNA do gene RDL1 específico para a fibra de algodão e à construção de vetores de superexpressão, e métodos para o aumento dos tamanhos das sementes e o comprimento de fibras de plantas transgênicas por transfecção do gene RDL1.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Sementes são materiais importantes na agricultura e em indústrias relacionadas à produção de óleos, algodão e alimentos. As características das sementes determinam diretamente a qualidade de sementes e produtos feitos a partir de sementes. Essas características incluem principalmente tamanho da semente, peso da semente, comprimento da fibra da semente (para utilidade de fibras da semente) e/ou resistência da fibra da semente.

O algodão é uma cultura agrícola importante na economia. As fibras de algodão são matérias-primas importantes na indústria têxtil. Em 2006, a produção de algodão no mundo foi de 25.220.000 de toneladas, das quais a China produziu 6.730.000 toneladas. A indústria têxtil demanda cada vez mais fibras de algodão com melhor qualidade. Por exemplo, deseja-se que as fibras de algodão

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2/33 sejam mais longas, mais fortes, mais finas e mais homogêneas. Portanto, é importante aumentar tanto a qualidade quanto a quantidade de produtos de algodão. Os processos de desenvolvimento de fibras de algodão são altamente regulados. Um dos objetivos principais das pesquisas sobre o cultivo do algodão inclui a busca por formas de aumentar a qualidade das fibras de algodão.

As fibras de algodão são fibras unicelulares diferenciadas e desenvolvidas a partir da célula epidérmica do óvulo. Os processos de desenvolvimento são divididos em quatro estágios: iniciação do desenvolvimento, alongamento, biossíntese da parede secundária e maturação da fibra, em que o estágio de alongamento e o estágio da biossíntese da parede secundária se superpõem parcialmente. Durante esses

4 estágios, as alterações da morfologia e estrutura das células da fibra são acompanhadas por processos fisiológico e bioquímicos importantes. Durante esses processos, muitos genes participam na regulação do desenvolvimento da fibra. Portanto, é importante estudar a expressão e regulação desses genes.

Foi verificado que muitas cepas de algodão possuem genes que são altamente homólogos ao RD22 de Arabidopsis, por exemplo, GhRDLl (Grossypium hirsutum RD22-like). GhRDLl é especificamente e altamente expresso durante o estágio de alongamento da fibra. O gene codifica uma proteína que possui 335 aminoácidos. Essa proteína é altamente homóloga à proteína RD22 de Arabidopsis. A região do terminal C da proteína GhRDLl contém um domínio kringle BURP plantaespecífico. No entanto, a função do domínio BURP não é bem estudada.

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Portanto, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de métodos que pudessem aprimorar eficazmente as características das sementes de planta, aumentando, dessa forma, a qualidade e quantidade das sementes de cultivos de alimentos, algodão e óleos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os objetivos da invenção incluem o uso de genes RDL1 de planta, particularmente gene RDL1 de algodão, para aprimorar as características de sementes de planta, aumentando, dessa forma, a qualidade das sementes dos cultivos.

O primeiro aspecto da presente invenção inclui um uso de genes RDL1 de planta ou das proteínas RDL1 codificadas para aprimorar as características da semente de planta.

De acordo com uma modalidade da invenção, os genes

RDL1 de planta são genes RDL1 de algodão.

De acordo com outra modalidade da invenção, a seqüência do gene RDL1 de planta é selecionada de:

(a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou 20 (b) uma molécula que pode hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as seqüências especificadas em (a), em que a molécula pode aprimorar as características da semente de planta.

De acordo ainda com outra modalidade da invenção, a 25 seqüência da proteína RDL1 é selecionada de:

(a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6; ou (b) uma proteína derivada de (a) e que possuem substituição, eliminação ou inserção de um ou mais aminoácidos das seqüências especificadas em (a), em que a proteína possui uma atividade para o aprimoramento das

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4/33 características da semente de planta.

De acordo ainda com outra modalidade da invenção, o aprimoramento das características da semente de planta pode incluir tamanho aumentado da semente, peso aumentado da semente, comprimento aumentado da fibra da semente e/ou resistência aumentada fibra.

De acordo ainda com outra modalidade da invenção, as plantas podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas.

De acordo com uma modalidade preferida, os cultivos ou plantas podem ser selecionados de grama marram, rosa-louca (Híbíscus mutabílís) e crucífera; mais preferivelmente, algodão, couve, arroz, trigo, cevada, milho ou sorgo (Sorghum vulgare) (kaolíang); ainda mais preferivelmente, algodão ou couve; e, mais preferivelmente ainda, algodão.

O segundo aspecto da presente invenção inclui vetores, em que os vetores contêm genes RDL1 de planta.

De acordo com uma modalidade preferida, os vetores contêm genes RDL1 de algodão.

De acordo com uma modalidade preferida, as seqüências dos genes RDL1 são selecionadas de:

(a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou (b) moléculas de DNA que podem hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as seqüências de DNA especificadas em (a) e possuem atividades para o aprimoramento das características de sementes de plantas de cultivo, em que as moléculas de DNA incluem moléculas ou fragmentos que possuem seqüências altamente homólogas às seqüências do gene ou fragmentos do gene RDL1 de algodão ou gene ou fragmentos do gene RD22 de Arabídopsís.

De acordo com uma modalidade preferida, os vetores são

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5/33 selecionados de plasmideos bacterianos, fagos bacterianos, plasmideos de levedura, vírus de plantas ou vírus de mamíferos; e, preferivelmente, pEGFP-1, pCAMBIA1300, pCAMBIA2301 ou pBI121.

O terceiro aspecto da invenção inclui células hospedeiras criadas geneticamente, em que as células hospedeiras abrigam vetores de acordo com modalidades da invenção.

De acordo com uma modalidade preferida, as células 10 hospedeiras podem ser selecionadas de procariotas, eucariotas inferiores ou eucariotas superiores; preferivelmente, células bacterianas, células de levedura ou células de plantas; mais preferivelmente, Escherichia coli, estreptomicetos, agrobactérias e leveduras; e, mais preferivelmente ainda, agrobactérias.

O quarto aspecto da presente invenção inclui métodos para a produção de plantas transgênicas. Os métodos podem incluir:

(1) o fornecimento de vetores que contêm genes RDL1;

(2) o fornecimento de células hospedeiras que abrigam os vetores gerados na etapa (1);

(3) o contato de células de plantas ou tecidos com as células hospedeiras da etapa (2), os vetores da etapa (1), ou o gene RDL1, permitindo, dessa forma, que o gene RDL1 seja transfectado nas células de plantas e integrado nos cromossomos das células de plantas;

(4) seleção de células de plantas, tecidos ou órgãos que possuem RDL1 nelas transfectado; e (5) geração/crescimento das células, tecidos ou órgãos 30 da planta transgênica com RDL1 obtidos na etapa (4), em que

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6/33 as sementes das plantas transgênicas podem ser características aprimoradas.

De acordo com uma modalidade preferida, os genes RDL1 são genes RDL1 de algodão.

De acordo com uma modalidade preferida, as células hospedeiras são agrobactérias.

De acordo com ainda outra modalidade preferida, as plantas de cultivo podem ser selecionadas de grama marram, rosa-louca (Hibiscus mutabilis) ou crucífera;

preferivelmente, algodão, couve, arroz, trigo, cevada, milho ou sorgo (Sorghum vulgare); mais preferivelmente, algodão ou couve; e, mais preferivelmente ainda, algodão.

O quinto aspecto da invenção inclui usos de plantas de cultivo transgênicas geradas pelos métodos da invenção. As plantas transgênicas podem ser usadas para produzir sementes de plantas de cultivo que possuem características aprimoradas.

De acordo com uma modalidade preferida, as características aprimoradas podem incluir tamanhos aumentados da semente, pesos aumentados da semente, comprimentos aumentados da fibra da semente e/ou resistências aumentadas da fibra.

De acordo com outra modalidade preferida, a planta pode ser algodão.

O sexto aspecto da presente invenção inclui métodos para a produção de sementes de plantas de cultivo que possuem características aprimoradas, em que os métodos podem incluir o aumento dos níveis de expressão do gene RDL1 nessas plantas de cultivo.

De acordo com uma modalidade preferida, gene RDL1 pode

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7/33 ser transfectado nas plantas de cultivo para aumentar os níveis de expressão do gene RDL1.

De acordo com outra modalidade preferida, os métodos podem incluir as seguintes etapas:

(i) transfecção, com o uso de métodos transgênicos, do gene RDL1 em plantas e a permissão de que gene transfectado se integre nos cromossomos da planta;

(ii) seleção de células, tecidos ou órgãos da planta transgênica com RDL1; e (iii) geração/crescimento das células, tecidos ou órgãos da planta transgênica com RDL1 obtido da etapa (ii) para a produção de sementes de plantas com características aprimoradas.

De acordo com outra modalidade preferida, as características aprimoradas podem incluir tamanhos

aumentados	da semente,	pesos	aumentados	da semente,
comprimentos	aumentados	da	fibra e/ou	resistências
aumentadas da fibra. De acordo com ainda	outra	modalidade	preferida, as

plantas podem ser selecionadas de grama marram, rosa-louca (Híbíscus mutabílís) ou crucífera; preferivelmente, algodão, couve, arroz, trigo, cevada, milho ou sorgo (Sorghum vulgare), mais preferivelmente, algodão ou couve, e, mais preferivelmente ainda, algodão.

De acordo com uma modalidade, os métodos incluem a produção de plantas transgênicas que possuem características aprimoradas de sementes e obtenção de sementes a partir delas, pela utilização dos métodos da invenção.

De acordo com outra modalidade, os métodos incluem a

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8/33 produção de plantas transgênicas que possuem características aprimoradas de sementes pela utilização dos métodos da invenção e o cruzamento dessas plantas transgênicas com plantas não transgênicas ou com outras plantas transgênicas para a produção de plantas híbridas. A seguir, selecionar as plantas híbridas que possuem características aprimoradas de sementes e obter sementes a partir dessa planta híbrida.

O sétimo aspecto da invenção inclui plantas 10 transgênicas que abrigam genes RDL1 de plantas.

De acordo com uma modalidade, a seqüência do gene RDL1 é selecionada de:

(a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou (b) moléculas que podem hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as seqüências especificadas em (a), e possuem atividades para o aprimoramento das características de sementes, em que as moléculas de DNA incluem moléculas ou seus fragmentos que possuem seqüências altamente homólogas àquelas do gene ou fragmentos do gene RDL1 de algodão ou gene ou fragmentos do gene RD22 de Arabidopsis.

De acordo com outra modalidade, as plantas transgênicas podem ser selecionadas de grama marram, rosalouca (Hibiscus mutabilis) ou crucífera; preferivelmente, rosa-louca (Hibiscus mutabilis) ou crucífera; mais preferivelmente, algodão, couve, arroz, trigo, cevada, milho ou sorgo (Sorghum vulgare) .

O oitavo aspecto da invenção inclui métodos para a geração de plantas. Os métodos podem incluir o cruzamento das plantas transgênicas, obtidas pela utilização dos

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9/33 métodos da invenção, com plantas não transgênicas ou com outras plantas transgênicas para a produção de plantas híbridas que contêm o gene RDL1 de planta.

De acordo com uma modalidade, as plantas transgênicas 5 e as plantas não transgênicas, ou outras plantas transgênicas, usadas no cruzamento, podem pertencer à mesma família ou a famílias diferentes, preferivelmente à mesma família de planta. As referidas plantas são selecionadas preferivelmente de grama marram, rosa-louca (Hibiscus mutabilis) ou crucífera; mais preferivelmente, rosa-louca (Híbíscus mutabilis) ou crucífera; mais preferivelmente, algodão, couve, arroz, trigo, cevada, milho ou sorgo (Sorghum vulgare) .

De acordo com outra modalidade, a prole híbrida possui características genéticas estáveis.

Modalidades preferidas da invenção usam o gene RDL1 de algodão ou sua proteína RDL1 codificada.

Outros aspectos da presente invenção ficariam evidentes para aqueles habilitados na técnica com base nesta descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG 1 mostra a construção do vetor GFP-GhRDL1.

A FIG 2 mostra a caracterização molecular de algodão transfectado com GFP-GhRDL1.

A FIG 3 mostra a localização subcelular de GhRDL1 usando a proteína de fusão GFP-GhRDL1, em que A, 35S::GFP/GhRDL1, fibra de 2 DPA; B, R 15, fibra de 2 DPA; C, 35S::GFP-GhRDL1, tricomas da folha.

A FIG 4 mostra a análise do peso (100 sementes com fibras) de sementes transgênicas de algodão GFP/GhRDL1

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10/33 (geração T2), em que A, comparação morfológica de sementes; B, comparação do peso (100 sementes) de sementes.

A FIG 5 mostra a comparação de tamanho de sementes de Arabídopsís transfectadas com GhRDLl. A FIG 5A é uma comparação morfológica de sementes; FIG 5B é uma comparação dos comprimentos da semente e larguras da semente (Barra = 500 pm).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Após um estudo de longo prazo profundo da construção, 10 função e localização do gene RDL1, os inventores construíram vetores transgênicos que contêm o gene RDL1. Com a utilização da tecnologia transgênica de plantas, os inventores obtêm novas plantas, que possuem características aprimoradas de sementes. Por exemplo, os métodos produzem algodão transgênico que possui peso aumentado da semente, comprimento aumentado da fibra da semente; e os métodos também produzem Arabídopsís transgênica com tamanho aumentado da semente. As observações acima indicam que o gene RDL1 pode afetar as características da semente. As sementes obtidas das plantas transgênicas que expressam níveis elevados de gene RDL1 exibem aprimoramentos, por exemplo, tamanho aumentado da semente, peso aumentado, comprimento aumentado da fibra, resistência aumentada fibra, e assim por diante. Com base nessas realizações, os inventores completam a invenção.

Por exemplo, os inventores usam a localização subcelular da proteína de fusão RDL1-GFP para mostrar que a proteína GhRDLl pode estar localizada em certas áreas da parede celular com distribuições polarizadas. Os resultados mostram que as bordas da parede celular, marcadas por

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11/33 sinais de fluorescência verde, são preenchidas com o polissacarídeo rico em pectina. Na medida em que os componentes principais da parede celular primária também contêm pectina durante o estágio de alongamento rápido da fibra de algodão, esses dados sugerem que a localização específica de GhRDLl pode estar ligada à pectina na parede celular. Além disso, as proteínas de fusão de BURP e GFP exibem características de localização similares.

Os inventores a seguir usaram métodos de 2 híbridos de 10 levedura para identificar a proteína GhEXPA1 (α-expansina 1 de Gossypium hirsutum) como sendo uma proteína de interação com GhRDLl, por cotransfecção das proteínas de fusão GFPGhRDLl e RFP-GhEXPA1 em Arabidopsis, seguida por exame das células da raiz de Arabidopsis usando microscopia confocal.

Os resultados confirmam essa interação proteína-proteína ao mostrar a colocalização de sinais fluorescentes concentrados na parede celular. Experimentos Co-IP subseqüentes também confirmam a interação entre essas duas proteínas.

Para estudar as funções de GhRDLl, os inventores usam métodos mediados por agrobactérias para transferir

35S::GFP-GhRDLl em algodão. Os resultados mostram que o tamanho da semente do algodão transgênico é significativamente maior do que o controle. Com o uso do eixo hipocotiledonário da muda de algodão do 6d da geração T3 para analisar as características mecânicas de tecidos antes e depois da transferência gênica, os resultados mostram que a força média necessária para quebrar o eixo hipocotiledonário é significativamente maior em plantas transgênicas do que aquela de controle. Os resultados

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12/33 estatísticos obtidos de plantas da geração T3 que crescem no campo mostram que a maioria das plantas transgênicas é mais pesada do que o controle; e possui peso aumentado (100 sementes) e comprimento aumentado da fibra, quando comparado com o controle. Os resultados acima demonstram que a superexpressão da proteína de fusão GFP-GhRDL1 no algodão pode aprimorar o desenvolvimento de fibras de algodão e óvulos e, dessa forma, é valiosa para o aprimoramento do algodão.

Gene RDL1 e sua proteína codificada

Os termos “gene RDL1 de planta” ou “gene RDL1”, que são aqui usados de forma intercambiável, significam um gene que codifica uma seqüência de proteína que é altamente homóloga às seqüências que codificam a proteína RDL1 do algodão, ou moléculas que podem hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as referidas seqüências gênicas acima, ou moléculas da família do gene que são altamente homólogas para as referidas moléculas acima. A expressão dos referidos genes acima pode aprimorar as características da semente como, por exemplo, tamanho aumentado da semente, peso aumentado da semente, comprimento aumentado da fibra da semente e/ou resistência aumentada da fibra da semente. Essa definição também inclui moléculas que podem hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as seqüências do gene RDL1 de algodão ou outras moléculas altamente homólogas da família do gene.

O termo “gene RDL1 de algodão” significa um gene que codifica uma proteína cuja seqüência é altamente homóloga à seqüência da proteína RD22 de Arabídopsís. Essa definição também inclui moléculas que podem hibridizar, sob condições

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13/33 altamente rigorosas, com a seqüência do gene RDL1 de algodão, ou com outras moléculas altamente homogêneas da família do gene. Os referidos genes acima são aqueles especificamente superexpressos no estágio de alongamento da fibra de algodão. Por exemplo, gene codificador de RDL1 de algodão do campo (GhRDL1) que codifica uma proteína que possui 355 aminoácidos, que contém um domínio BURP planta-

específico	no domínio	do terminal C.
NCBI	revela as	seqüências do gene	RDL1 e suas
10 seqüência	homólogas,	por exemplo, AY072821	[ (Li C-H, mRNA

da proteína induzida por desidratação de Grossypium hirsutum - proteína RD22-like (RDL) , cds completa; AY641990 [Wang S., mRNA da proteína induzida por desidratação de Grossypium arboreum - proteína RD22-like 1 (RDL1), alelo RDL1-1, cds completa; e AY641991 [Wang S, mRNA da proteína induzida por desidratação de Grossypium arboreum - proteína RD22-like 2 (RDL2), alelo RDL2-2, cds completa. Esses genes mencionados acima também estão incluídos na presente invenção.

O gene RDL1 de acordo com as modalidades da presente invenção pode ser selecionado de: (a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 (que correspondem a AY072821,

AY641990 e AY641991, respectivamente); ou (b) moléculas funcionalmente ativas que podem hibridizar, sob condições altamente rigorosas, com as seqüências especificadas em (a), que podem aprimorar as características de sementes.

O termo “condição altamente rigorosas” significa: (1) hibridização e lavagens sob condições de forças iônicas baixas e temperaturas elevadas como, por exemplo, 0,2X SSC,

SDS 0,1%, 60°C; ou (2) hibridização na presença de

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14/33 desnaturantes, por exemplo, formamida 50% (v/v), soro de bezerro 0,1%/Ficoll 0,1% a 42°C, e assim por diante; ou (3) a identidade de seqüência entre duas seqüências pode ser de pelo menos 50%; preferivelmente, > 55% > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% ou > 90%; mais preferivelmente, > 95%, quando ocorre a hibridização. Por exemplo, as referidas seqüências acima podem ser complementares às seqüências especificadas em (a).

A seqüência de nucleotídeos de comprimento total do 10 gene RDL1 ou seus fragmentos podem ser facilmente obtidos com o uso de técnicas de amplificação por PCR, técnicas de DNA recombinante ou síntese artificial. Com relação às técnicas de amplificação por PCR, as seqüências relacionadas podem ser obtidas por design de iniciadores apropriados com base nas seqüências reveladas na presente invenção, especialmente as seqüências do quadro de leitura aberta. Além disso, as seqüências relacionadas podem ser adquiridas de bancos de cDNA comerciais, ou pela utilização de métodos convencionais conhecidos por aqueles habilitados na técnica para amplificar as seqüências usando seqüências do banco de cDNA como modelos. Quando as seqüências são longas, duas ou mais reações de amplificação por PCR podem ser realizadas, seguidas por ligação desses fragmentos amplificados na ordem correta.

O gene RDL1 de acordo com a presente invenção pode ser selecionado de algodão ou de outras plantas que possam conter genes que possuem homologia de seqüência elevada com o gene RDL1 de algodão (por exemplo, pelo menos 50%; ou preferivelmente, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%;

mais preferivelmente, > 85%, > 90%, > 95%; ou até mesmo 98%

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15/33 de identidade de seqüência). Esses genes mencionados acima também são considerados dentro do escopo da presente invenção. As ferramentas e os métodos para a realização de alinhamentos de seqüências são bem conhecidos na técnica como, por exemplo, BLAST.

O termo “proteína RDL1” refere-se a um polipeptídeo codificado pelo gene RDL1 de acordo com modalidades da presente invenção. Essa definição também pode incluir polipeptídeos mutantes que também podem aprimorar as características da semente. As presentes proteínas podem ser purificadas de fontes naturais, ou obtidas como produtos de síntese química, ou obtidas como produtos de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insetos ou mamíferos) com o uso de técnicas de DNA recombinante. As presentes proteínas podem ser codificadas por genes selecionados de gene RDL1 de algodão ou outros genes ou famílias gênicas homólogas. As seqüências da proteína de RDL1 podem ser selecionadas de: (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID

NO: 4 ou SEQ ID NO: 6; ou (b) seqüências de proteína derivadas das seqüências de aminoácidos especificadas em (a) com substituição, eliminação ou inserção de um ou mais aminoácidos, que se mantêm funcionalmente ativas para aprimorar as características da semente.

As referidas mutações incluem (sem limitação): uma ou mais (normalmente, 1-50; bom, 1-30; melhor, 1-20; principalmente, 1-10; por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 10) eliminações, inserções e/ou substituições de aminoácidos; e inserção nos domínios do terminal C e/ou do terminal N de um ou mais (normalmente, < 20; melhor, < 10;

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16/33 principalmente, < 5) aminoácidos. Por exemplo, sabe-se na técnica que uma substituição com aminoácidos funcionalmente similares pode normalmente não alterar a função das proteínas mutantes. Além disso, a inserção de um ou mais aminoácidos nos domínios do terminal C e/ou do terminal N pode normalmente não alterar a função das proteínas mutantes. Por exemplo, proteínas RDL1, com ou sem a metionina do terminal N, ainda mantêm a atividade de aprimoramento das características da semente de planta.

Para se obter as referidas proteínas acima (b), radiação ou mutágenos podem ser usados para induzir mutações aleatórias. Alternativamente, as proteínas mutantes podem ser obtidas por realização de mutagênese sítio-dirigida ou outras técnicas conhecidas de biologia molecular. As seqüências de proteína podem ser usadas para a construção das plantas transgênicas. A seguir, é feito o monitoramento das características da semente para se verificar se foram ou não aprimoradas para que seja feita a seleção e identificação das proteínas (por exemplo, em referência aos métodos descritos na presente invenção).

Dependendo das células hospedeiras usadas no processo de produção de DNA recombinante, as presentes proteínas podem ser glicosiladas ou não glicosiladas. Esse termo também pode incluir os domínios ativos e os derivados funcionalmente ativos das proteínas RDL1.

As mutações de polipeptídeos incluem: seqüências homólogas, variantes conservadoras, variantes alélicas, mutantes naturais, mutantes induzidos, seqüências capazes de hibridização, sob condições de alto ou baixo rigor, com as seqüências que codificam proteínas RDL1, as proteínas ou

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17/33 polipeptídeos obtidos pela utilização de antissoro contra proteínas RDL1. Além disso, também podem ser usados outros polipeptídeos, por exemplo, proteínas de fusão que contêm proteína RDL1 ou outros fragmentos da proteína RDL1. Exceto os polipeptídeos de comprimento quase total, as modalidades da presente invenção podem incluir fragmentos solúveis de proteínas RDL1. Em geral, os fragmentos de proteína normalmente contêm pelo menos 10 aminoácidos contínuos das seqüências da proteína RDL1; normalmente, pelo menos 30 aminoácidos contínuos; bom, pelo menos 50 aminoácidos contínuos; melhor, pelo menos 80 aminoácidos contínuos; principalmente, pelo menos 100 aminoácidos contínuos.

Sementes de plantas e suas características:

O termo planta refere-se às plantas que possuem valores econômicos essenciais nas indústrias de alimentos, algodão e óleos. Os valores econômicos são baseados principalmente em suas sementes. As plantas incluem, sem limitação, dicotiledôneas ou monocotiledôneas. A monocotiledônea preferida é grama marram; mais preferivelmente, arroz, trigo, cevada, milho e sorgo (Sorghum vulgare). As dicotiledôneas preferidas incluem, sem limitação, plantas de Malvaceae gossypíum e

Brassicaceae brassica etc.; mais preferivelmente, algodão ou couve etc.; mais preferivelmente ainda, algodão.

As características da semente de acordo com modalidades da presente invenção incluem, sem limitação, tamanho da semente, peso da semente, comprimento da fibra da semente e/ou resistência da fibra da semente. Aprimoramentos das características das sementes referem-se, quando comparadas com as sementes antes dos aprimoramentos,

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18/33 ao fato de que as sementes após aprimoramento possuem tamanho aumentado, peso aumentado, comprimento aumentado da fibra e/ou resistência aumentada fibra. Os termos “índice de semente” e “peso de 100 sementes” são aqui usados de forma intercambiável, e se referem ao peso por 100 sementes. Esses dados indicam o tamanho do grão e o grau de plenitude de sementes.

Modalidades da presente invenção também fornecem métodos de produção de sementes de planta que possuem características aprimoradas de sementes. Os métodos podem incluir o aumento dos níveis de expressão do referido gene RDL1 (preferivelmente, gene RDL1 de algodão). Os aprimoramentos podem ser obtidos pelo aumento dos níveis de expressão do gene RDL1 de planta ou pelo aumento da quantidade das proteínas RDL1. Aqueles habilitados na técnica podem, com base em finalidades particulares, selecionar métodos de aprimoramento apropriado, por exemplo, métodos de transfecção. Esses métodos normalmente incluem etapas de construção de vetores de transfecção que contêm o gene RDL1 e sua transfecção em plantas e clones de plantas etc.

Vetores, células hospedeiras e plantas transgênicas.

A presente invenção também está relacionada aos vetores que contêm gene RDL1 e células hospedeiras geradas por acolhimento dos referidos vetores acima produzidos por engenharia genética, e plantas transgênicas que superexpressam RDL1 obtidas com o uso de tecnologia transgênica.

Com a utilização das técnicas convencionais de DNA recombinante (Science, 1984; 224: 1.431) e das seqüências

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19/33 reveladas na presente invenção, podem ser obtidas proteínas RDL1 recombinantes. O método pode geralmente incluir as seguintes etapas:

(1) transformação ou transfecção das células 5 hospedeiras apropriadas com os polinucleotídeos (ou variantes) que codificam as proteínas RDL1 de acordo com a

presente	invenção	ou com os	vetores de	expressão
recombinantes;
(2)	incubação	das células	hospedeiras em	meios de
10 cultura	adequados; e
(3)	isolamento	e purificação	das proteínas	dos meios

ou das células hospedeiras.

Os termos vetor e “vetor de expressão recombinante” podem ser usados de forma intercambiável, e se referem aos plasmídeos bacterianos, fagos bacterianos, plasmídeos de levedura, vírus de células de plantas, vírus de células de mamíferos ou outros vetores bem conhecidos na técnica.

Resumidamente, quaisquer plasmideos ou vetores podem ser usados, desde que possam replicar e sejam estáveis nas células hospedeiras. Características importantes de vetores de expressão incluem a presença de origens de replicação, promotores, genes marcadores de seleção e elementos de controle da tradução.

Aqueles habilitados na técnica saberão como construir vetores de expressão que contêm a seqüência do gene RDL1 e elementos de controle da transcrição/da tradução adequados. Esses métodos incluem tecnologia de recombinação de DNA in vitro, técnicas de síntese de DNA e tecnologia de recombinação in vivo. As referidas seqüências de DNA podem ser ligadas eficientemente a um promotor no vetor de

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20/33 expressão para dirigir a síntese de mRNA. O vetor também pode incluir elementos que contêm sítios de ligação de ribossomo e terminadores da transcrição. Os vetores preferidos para uso na presente invenção podem incluir pEGFP-1, pCAMBIA 1300, pCAMBIA 2301 ou pBI121 etc.

Além disso, os

vetores	de	expressão	podem
um ou	mais	genes marcadores
a seleção	do	fenótipo da	célula
, por	exemplo, diidrofolato

redutase, usada no cultivo de células eucarióticas, resistência à neomicina, e proteína de fluorescência verde (GFP) ou resistência tetraciclina ou ampicilina, usadas em

E. coli.

Os vetores que contêm as referidas seqüências de DNA acima, um promotor adequado e/ou elementos de controle podem ser usados para transformar seletivamente as células hospedeiras para que expressem proteínas. As células hospedeiras podem ser procariotas, por exemplo, células bacterianas; ou células eucarióticas inferiores como, por exemplo, células de levedura; ou células eucarióticas superiores como, por exemplo, células de plantas. Exemplos representativos incluem E. coli, estreptomicetos, agrobactérias; células fúngicas, por exemplo, leveduras, células de plantas etc. As células hospedeiras preferidas para uso nas modalidades da presente invenção podem ser agrobactérias.

Quando os polinucleotídeos são expressos nas células eucarióticas superiores, podem ser inseridas seqüências intensificadoras no vetor para aumentar a transcrição. O intensificador é um elemento de DNA de atuação cis, que

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21/33 normalmente possui 10-30 pares de bases que atuam nos promotores para aumentar a transcrição gênica. Aqueles habilitados na técnica saberão como selecionar vetores, promotores, intensificadores e células hospedeiras adequadas.

Os termos “plantas transgênicas”, “transfectantes” e “plantas transfectantes” são aqui usados de forma intercambiável, e se referem às células, órgãos ou plantas que contêm genes RDL1, que expressam estavelmente proteínas

RDL1, obtidos pela utilização de técnicas convencionais de transferência gênica.

As plantas transgênicas podem ser obtidas pela utilização de transfecção de agrobactérias ou métodos de bombardeamento com arma gênica, por exemplo, o método do disco de folha. As plantas, tecidos ou órgãos transgênicos podem ser clonados com o uso e métodos convencionais para a obtenção de plantas que possuem resistência à doença elevada. Os transfectantes podem ser cultivados com o uso de métodos convencionais e expressar polipeptídeos de acordo com as modalidades da presente invenção. Dependendo das células hospedeiras usadas, vários meios de cultura, selecionados dos meios convencionais, podem ser usados para incubar as células sob as condições adequadas ao crescimento. Quando o crescimento das células hospedeiras alcança uma densidade celular apropriada, os promotores podem ser seletivamente ativados por métodos adequados (por exemplo, alterações de temperatura ou indução química), seguido por incubação das células por um período de tempo.

Os polipeptídeos recombinantes acima podem ser expressos dentro das células, ou na membrana celular, ou

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22/33 secretados para fora das células. Se necessário, dependendo das características físicas, químicas e de outras características específicas, as proteínas recombinantes podem ser isoladas e purificadas com o uso de diferentes métodos de separação. Esses métodos de separação são bem conhecidos para aqueles habilitados na técnica. Esses métodos podem incluir, sem limitação: tratamento convencional de renaturação, tratamento por precipitação de proteína (método saling-out), centrifugação, lise osmótica de bactérias, super-processo, ultracentrifugação, cromatografia (filtração em gel), cromatografia por adsorção, cromatografia por troca iônica, cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC), outras técnicas de cromatografia líquida, e a combinação destes.

VANTAGENS DA INVENÇÃO (1) fornecimento de um novo uso de gene RDL1 e de suas proteínas para aumentar eficazmente a qualidade da semente;

(2) fornecimento de plantas transgênicas com características aprimoradas, que incluem o aumento do tamanho da semente, peso, comprimento da fibra, resistência da fibra etc., fornecendo, dessa forma, matérias-primas excelentes para as indústrias de alimentos, algodão e óleos; e (3) fornecimento de novos métodos para o aprimoramento das características das sementes, que podem ter uma ampla aplicação.

EXEMPLOS

As modalidades seguintes são fornecidas para ilustrar ainda mais a presente invenção. Entende-se que essas modalidades só são usadas para ilustrar a presente

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23/33 invenção, e não devem ser considerados como limitantes do escopo desta invenção. Métodos experimentais não observados nas modalidades seguintes podem ser realizados de acordo

	com as	condições	convencionais,	como descrito	em “Molecular
5	Cloning	Laboratory Manual” por	Sambrook e cols	. (Nova York:
	Cold Spring Harbor Laboratory	Press, 1989),	ou de acordo
	com as	condições	sugeridas pelos fabricantes.	A menos que
	indicado de forma diferente,	percentagens e	frações são
	medidas	por peso.
10	A	menos que	definido de	forma diferente, todos os
	termos	usados	na presente	invenção e	nos campos

relacionados, e terminologias científicas, são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Além disso, quaisquer métodos ou materiais, que são similares ou idênticos àqueles mostrados na presente invenção, podem ser usados para a prática da presente invenção. Os métodos e materiais preferidos aqui mostrados têm finalidade apenas ilustrativa.

Exemplo 1: Isolamento de cDNA de RDL1

0 Preparação de RNA de algodão com o uso de extração de fenol:

Triturar 2 g de fibras da superfície ovular (obtidas 9 dias após a floração do algodão do campo) em pós em nitrogênio líquido. Transferir os pós para um tubo de centrifugação de 50 ml. Adicionar 8 ml de tampão de extração (1 M de Tris-HCl, 50 mM de EDTA, SDS 1%, pH 9,0) e volumes iguais de água-fenol saturado:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Misturar e colocar no gelo por 1 hora (misturar a cada 10 minutos). Centrifugar a mistura (13.000

g) a 4°C por 20 minutos. Repetir a etapa de extração com

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24/33 fenol:clorofórmio:álcool isoamílico 2 a 4 vezes, seguido por extração com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) uma vez. Coletar o sobrenadante. Adicionar 1/2 volume de solução rica em sal (0,8 M de citrato de sódio, 1,2 M de 5 NaCl) e 1/2 volume de isopropanol ao sobrenadante, misturar e colocá-lo em -70°C por 1 hora. Centrifugar a mistura (13.000 g) a 4°C por 20 minutos. Descartar o sobrenadante e dissolver os precipitados em 1 ml de água tratada com DEPC. Centrifugar a solução (13.000 g) a 4°C por 10 minutos.

Transferir o sobrenadante para um tubo de Enppendorf de 1,5 ml. Adicionar 1/3 volume de 8 M de LiCl e um volume igual de NaAC e colocá-lo a -20°C de um dia para o outro. Centrifugar a solução (13.000 g) a 4°C por 20 minutos. Descartar o sobrenadante e lavar os precipitados duas vezes com 1 ml de etanol 70%. Secar ao ar os precipitados em temperatura ambiente. Dissolver os precipitados em 100-200 pl de água tratada com DEPC.

Com base na seqüência de AY641990, sintetizar um par de iniciadores (que podem conter sítios de corte de enzima de restrição e aminas protetoras) e usar os iniciadores para realizar reações de PCR com o uso de cDNA de RDL1 como modelos:

RDL1-S-BamHI :

5'-CGGGATCCATGAAGGTTCTCTCCCCAATTCTTGCT-3' (SEQ ID NO:

7);

RDL1-A-SacI:

5'-CCGGAGCTCTTACTTAGGGACCCAAACAATGTG-3' (SEQ ID NO:

8).

Condições para reações de PCR: pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 94°C por 30 segundos,

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25/33 renaturação a 56°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto, para um total de 35 círculos, seguido por uma extensão final a 72°C por 10 minutos. DNAs dos subclones são então seqüenciados para determinar se os subclones estão corretos. Os resultados mostram que as seqüências obtidas são idênticas à seqüência de AY641990.

Exemplo 2: Construção de vetores de fusão de RDL1 e GFP e transformação de agrobactérias.

O gene de GFP pode ser obtido por pEGFP-1 (Clontech,

Palo Alto, EUA) . Inserir sítios de enzima de restrição apropriados usando métodos de PCR adequados. Remover códons de parada da seqüência do gene de GFP e inserir um fragmento que possui uma seqüência não superposta de 6 aminoácidos (GPGGGG).

Usar GS1: 5'-CTAGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3' (SEQ

ID NO: 9) e GA1: 5'GTCCCCCGGGCGTCCTCCTCCTCCTGGTCCCTGGTACAGCTCGTCCATGCC-3' (SEQ

ID NO: 10) como iniciadores, vetor pEGFP-1 como um modelo e DNA polimerase Pyrobest (adquirida da empresa TAKARA) para amplificar a região codificadora do gene de GFP. Ligar os fragmentos amplificados de GFP em pET32c entre os sítios Eco RV e Nco I para gerar um vetor intermediário, GFP-32c.

Usar DNA polimerase Pyrobest para amplificar as seqüências-alvo contendo sítios de enzima de restrição apropriados, por exemplo, Bam HI e Sac I (veja o Exemplo 1). Após confirmação dos quadros de leitura, usar digestão com enzima dupla e ligar os fragmentos aos sítios de corte correspondentes no vetor intermediário GFP-32c. Usar DNA polimerase Pyrobest para amplificar os fragmentos de fusão que contêm os sítios de enzima Xba I e Kpn I. Após digestão

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26/33 com enzima dupla, os fragmentos são ligados abaixo do promotor 35S de pCAMBIA2301 para gerar o vetor transgênico 35S:GFP-RDL1 (abreviação: RG, para o mapa de vetor veja a FIG. 1). A seqüência correta é confirmada.

Transformar agrobactérias usando o método de congelamento-descongelamento.

Selecionar uma colônia única LBA4404 ou GV3101 (Invitrogen) em 3 ml em meio de cultura LB (25 pg/ml de rifampicina e 50 pg/ml de canamicina (Kan) ou gentamicina (Gen), e incubar a 28°C, 220 rpm, de um dia para o outro.

Adicionar 2 ml de líquido de bactérias a 50 ml de meio de cultura LB (25 pg/ml de Rif e 50 pg/ml de Gen) , incubar a 28°C, 220 rpm, até alcançar OEPüü = 0,5 (cerca de 6 horas) . Colocar a cultura no gelo por 30 minutos, e depois centrifugá-la (5.000 g) a 4°C por 5 minutos. Ressuspender o pélete bacteriano em 10 ml de 0,15 M de NaCl e centrifugar (5000 g) a 4°C por 5 minutos. Suspender o pélete bacteriano em 1 ml de 20 mM de CaCl2. Retirar alíquotas da mistura bacteriana em tubos e 50 pl, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e manter as células competentes a -70°C. Mistura os vetores que contêm genes-alvo com 50 pl/tubo de células competentes e colocá-los o gelo por 30 minutos, seguido por congelamento rápido em nitrogênio líquido por 1 minuto. Dissolver as bactérias em banho-maria a 37°C por 5 minutos. Adicionar 1 ml meio de cultura LB e incubar a 4°C, 220 rpm, por 2-4 horas. Usar 50-100 pl e solução bacteriana para plaquear em placas de meio de cultura LB (que contêm 25 pg/ml de Rif, 50 pg/ml de Gen e 50 pg/ml de Kan ou higromicina (Hyg)). Após dois dias, selecionar uma colônia única para identificação por PCR.

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Exemplo 3. Transfecção de plantas e avaliação da prole transgênica.

a. Transgenes em algodão

Cultivar agrobactérias que abrigam o plasmídeo de 5 vetor em placas de cultura bacteriana YEB contendo 50 mg/l de canamicina, 100 mg/l de rifampicina e 300 mg/l de estreptomicina por 2 a 3 dias. Selecionar uma colônia única e inoculá-la em meio nutriente líquido YEB contendo os mesmos antibióticos, incubar em cultura em suspensão em uma agitadora de bancada a 28°C, 200 rpm/min, de um dia para o outro. Centrifugar as bactérias a 4.000 rpm/min por 10 minutos. Ressuspender o pélete de bactérias no meio nutriente líquido 1/2MS (contendo 30 g/l de glicose e 100 pmol/l de acetosiringona) e permitir que ele cresça até que a OD600 alcance 0,4-0,6, que pode então ser usada como inoculantes.

Desinfetar, usando métodos tradicionais, sementes de R15 algodão (plantas parentes, um tipo selvagem de algodão do campo tetraplóide). Colocar as sementes em placas de cultura 1/2MS0 [sal 1/2MS (adquirido de DUCHEFA M0221) + 5 g/l de glicose + 7 g/l de pó de agarose, pH 6,0] no escuro. Após 5-7 dias, fatiar o eixo hipocotiledonário de brotos assépticos e segmentos de 1 cm de cerca de 1 cm (explantes) para transfecção subseqüente.

Submergir os explantes no líquido de agrobactérias por

15-20 minutos, e depois transferí-los para placas de cocultura MSB1 (sal MS + compostos orgânicos B5 (que contém inositol, ácido nicotínico, VB1 e VB6) + 30 g/l de glicose + 0,1 mg/l de KT (quinetina celular) + 0,1 mg/l de 2,4-D-( ácido 2,4-diclorofenoxiacético) + 2,2 g/l de Gelrite (um

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28/33 agente de solidificação), pH 6,0). Cultivar os explantes no escuro a 22°C por 2 dias. Transferir os explantes para as placas de cultura MSB2 (MSB1 + 500 mg/l de cefalosporina + 80 mg/l de canamicina) para a indução de calo. Os explantes se regeneram em plântulas em tubo de ensaio por meio da resistência à indução de calo, proliferação de calo, indução de calo embrionário (meio de cultura MSB3: sal MS + compostos orgânicos B5 + 30 g/l de glicose + 2,5 g/l de

Gelrite, pH 6,0), e desenvolvimento de célula embrionária (meio de cultura MSB4: sal MS + compostos orgânicos B5 + 30 g/l de glicose + 1,0 g/l de asparaginas + 2,0 g/l de glutamina + 3,0 g/l de Gelrite, pH 6,0; quantidade dupla de KNO3 no sal MS e remoção de NH4NO3) . Aguardar até que as plântulas no tubo de ensaio desenvolvam 3 a 4 folhas, transplantá-las para um pote e crescer em uma sala com controle de clima.

b. Transgenes em Arabidopsis

Transfectar Arabidopsis usando métodos de imersão floral (Clough e Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743). Os métodos de cultivo de agrobactérias são similares àqueles mencionados acima. Centrifugar (4.000 rpm/min) a solução de bactérias por 10 minutos. Ressuspender o pélete de bactérias nos 500 ml de solução de sacarose 5% contendo Silwet L-77 0,02%. Submergir as partes acima do solo das plantas no líquido de bactérias por 5 segundos. Colocá-las deitadas em um receptor plástico, mantê-las úmidas e evitar a luz por 16-24 horas. Vernalizar as sementes de geração T0 a 4°C por 2-4 dias. Tratá-las com água sanitária 20% por 15 minutos. Lavá-las com água estéril 3-4 vezes. Suspendê-las em agarose 0,5% (55°C), colocá-las em placas de cultura LB

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29/33 com ágar 0,6% (50 pg/ml de Kan ou Hyg), a 22°C, sob luz contínua por uma semana. Transplantar os brotos verdes resistentes ao antibiótico para um solo nutritivo (turfa:vermiculita:perlita = 1:1:1) para crescimento.

Exemplo 4. Análise de plantas transgênicas usando técnicas de biologia molecular

a. PCR

Isolamento de DNA por métodos de fenol gelado. Pegar 2 g de folhas jovens obtidas de algodão transgênico (algodão transgênico que usa R15 como receptores) . Triturar as folhas em pós em nitrogênio líquido. Transferir os pós para um tubo de centrifugação de 50 ml. Adicionar 8 ml de tampão de extração (1 M de Tris-HCl, 50 mM de EDTA, SDS 1%, pH 9,0) e volumes iguais de água-fenol saturado:clorofórmio:

isoamilol (25:24:1) no tubo. A seguir, misturar o líquido e colocá-lo no gelo por 1 hora. Misturar a cada 10 minutos e centrifugar a 13.000 g a 4°C por 20 minutos. Repetir a etapa de extração com fenol:clorofórmio:isoamilol por 2-4 vezes, seguido por uma extração final com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Coletar o sobrenadante. Adicionar volume de solução rica em sal (0,8 M de citrato de sódio, 1,2 M de NaCl) e volume de álcool isoamílico, misturar e colocar a -70°C por uma hora. Centrifugar 13.000 g a 4°C por 20 minutos e descartar o sobrenadante. Lavar os precipitados duas vezes com 1 ml de etanol 70%, secar os precipitados em temperatura ambiente, e dissolvê-los em 1 ml de água estéril. Centrifugar a 13.000 g a 4°C por 10 minutos. Coletar o sobrenadante e adicionar 5-10 pl de RNase (10 mg/ml), seguido por incubação a 37°C por 30 minutos.

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As reações de PCR podem ser realizadas usando iniciadores de GFP (que podem ser os mesmos mostrados no Exemplo 2). Os modelos podem ser plasmídeos pEGFP-1. As condições de reação da PCR podem ser: pré-desnaturação a

94°C por 5 minutos; desnaturação a 94°C por 30 segundos;

renaturação a 56°C por 30 segundos; extensão a 72°C por 1 minuto; e 35 ciclos no total, seguidos por uma extensão final a 72°C por 10 minutos.

b. Análise da coloração por GUS

Submergir os materiais das plantas em solução de corante GUS (100 mM de tampão fosfato, pH 7,0, 50 mM de

K3[Fe(CN)6], 50 mM de K4[Fe(CN)e], 10 mM de EDTA, 1 mM de Xgluc e Triton X-100 0,1%) a 37°C por 12-24 horas. Descorar as amostras em etanol 70%. Preservar as amostras em etanol

70%.

Exemplo 5. Análise das características de plantas transgênicas.

a. Análise das características do algodão transgênico

Algodão transgênico RDL1 e o R15 parental em diferentes localizações: clone de planta N° 105 e clone de planta N° 117 são plantados em Shanghai. O clone de planta N° 115 e clone de planta N° 119 são plantados em Hainan. Coletar bolas de algodão maduro de cada uma das plantas transgênicas de geração T2. As posições nas quais as bolas de algodão são coletadas são mantidas constantes o máximo possível. Cem sementes são coletadas aleatoriamente de cada uma das bolas de algodão maduro de plantas individuais. Mais de 10 sementes são obtidas e suas fibras são penteadas para medir o comprimento de cada fibra. Pesar 100 sementes (que podem ou não conter fibras). Os resultados estão

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31/33 resumidos em uma tabela.

Os resultados da geração T3 do clone de planta N° 115 e do clone de planta N° 119 em Hainan são obtidos de 5 plantas. Como mostrado na FIG. 4, o clone de planta N° 115 e o clone de planta N° 117 da geração T2 em Hainan possuem um peso (100 sementes) (contendo fibras) de 19 g, e o peso (100 sementes) do R15 parental é de 16 g. A diferença de peso entre eles é estatisticamente significante (p<0,01). Além disso, como mostrado na Tabela 1, o clone de planta N°

115 e o clone de planta N° 119 de gerações T2 e T3 possuem fibras mais longas e índice de semente maior do que o R15 parental. Essas diferenças são estatisticamente significantes.

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Tabela 1. Análise de comprimento da fibra e índice de semente de algodão transgênico

GFP-GhRDL1

06 Número da fileira de plantio de Hainan	Fonte de materiais	Desempenho da geração T2	Desempenho da geração T3	Origem do algodão transgênico
Comprimento da fibra (mm)	Índice de semente	Comprimento da fibra (mm)	Índice de semente
H238	06-1219-3	27,6	14,2	29,16	12,72	Clone de planta N° 115
H237	06-1218-4	29,5	15, 3	30,92	12,74
H236	06-1218-3	30,8	15, 2	29,74	12,78
H235	06-1218-2	29,8	14, 6	29,64	12,46
H234	06-1217-5	29,1	14, 1	28,78	11,62	Clone de planta N° 119
H233	06-1217-6	27,6	15, 6	29,14	12,64
H232	06-1216-3	29,0	16,6	29,78	13,64
CK (Referência)		27,2	11,2	27,4	11,0	R15

Notes

06-1219 representa materiais de geração T2, 06 = ano 2006, 1219 = número da fileira de plantio, 3 = número do clone; materiais de geração T2 são característicos obtidos de clones individuais; os materiais de geração T3 são os resultados estatísticos obtidos de 5 clones.

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b. Análise das características de Arabidopsis transgênica

Transfectar vetores GhRDLl (sem genes GUS) em Arabidopsis usando agrobactérias, como descrito acima. Obter clones de plantas transgene-positivos por meio de seleção por antibiótico a resistência e RT-PCR. Coletar sementes da geração seguinte e as sementes do tipo selvagem. Medir o comprimento e a largura das sementes (n >50) sob um microscópio de dissecção com aumentos de 20X. Como mostrado na FIG. 5, há uma diferença estatisticamente significante (p<0,01) no comprimento e na largura entre as sementes de Arabidopsis transgênica GhRDLl e as sementes do tipo selvagem.

Todos os documentos mencionados nessa invenção são usados como referências de forma que cada referência seja usada como uma referência isolada. Também está subentendido que aqueles habilitados na técnica, após leitura da revelação da presente invenção, poderão modificar e alterar a presente invenção. Essas modificações e alterações serão incluídas no escopo da presente invenção, a qual é limitada pelas reivindicações em anexo.

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de um gene RDL1 de planta ou sua proteína RDL1 codificada caracterizado pelo fato de ser para aumento no tamanho da semente, peso da semente, comprimento da fibra

   5 da semente e/ou resistência da fibra da semente de uma planta;

   em que o gene RDL 1 ou a proteína RDL 1 é superexpressado na planta, e em que a sequência do gene RDL 1 é SEQ ID NO: 3.

   10 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência da proteína RDL1 é selecionada de SEQ ID NO: 4.

   3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea ou uma

   15 monocotiledônea.

   4. Vetor de expressão que contém um promotor heterólogo que leva a superexpressão gênicapara aumento no tamanho da semente, peso da semente, comprimento da fibra da semente e/ou resistência da fibra da semente de uma

   20 planta, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um gene RDL1 de planta, em que a sequência do gene RDL1 é SEQ ID NO: 3, em que o gene RDL1 está ligado operacionalmente ao promotor heterólogo do vetor de superexpressão.

   25 5. Célula hospedeira transgênica, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira abriga o vetor como definido na reivindicação 4, em que a célula hospedeira é uma bactéria ou uma levedura.

   6. Método para a produção de uma planta transgênica,

   30 caracterizado pelo fato de que o método compreende:

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   2/3 (1) fornecimento de um vetor de expressão que contém um promotor heterólogo que leva a superexpressão gênicaque contém um gene RDL1, em que o gene RDL1 está ligado operacionalmente ao promotor heterólogo do vetor de

   5 superexpressão, em que a sequência do gene RDL1 é SEQ ID

   NO: 3;
2. (2) fornecimento de uma célula hospedeira que abriga o vetor descrito na etapa (1);
3. (3) contato de uma célula ou um tecido de planta com a 10 célula hospedeira da etapa (2) ou com o vetor da etapa (1) ou o cassete de expressão contendo o gene RDL1 operacionalmente ligado a um promotor heterólogonele contido, causando com que o cassete de expressão contendo o gene RDL1 operacionalmente ligado a um promotor

   15 heterólogoseja transferido para a célula de planta e permitindo que o cassete de expressão contendo o gene RDL1 operacionalmente ligado a um promotor heterólogose integre nos cromossomos da célula de planta;
4. (4) seleção de uma célula, tecido ou órgão de

   20 planta transgênica superexpressando o gene RDL1; e (5) regeneração ou crescimento de uma planta transgênica a partir da célula, tecido ou órgão de planta obtida na etapa (4), em que as sementes produzidas pela planta transgênica possuem tamanho da semente aumentado,

   25 peso da semente aumentado, comprimento da fibra da semente aumentado e/ou resistência da fibra da semente aumentado.

   7. Uso da planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é usada para a produção de

   30 sementes de planta que possuem tamanho da semente

   Petição 870180055689, de 28/06/2018, pág. 41/45

   3/3 aumentado, peso da semente aumentado, comprimento da fibra da semente aumentado e/ou resistência da fibra da semente aumentado.

   8. Método para a produção de sementes de planta que 5 possuem tamanho da semente aumentado, peso da semente aumentado, comprimento da fibra da semente aumentado e/ou resistência da fibra da semente aumentado, caracterizado

   por compreender o aumento do nível de expressão do gene RDL1 em uma planta, em que a sequência do gene RDL1 é SEQ 10 ID NO: 3. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender : a produção de uma planta transgênica com o uso do método como definido na reivindicação 6; e obtenção de sementes da planta 15 transgênica. 10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender: - a geração de uma planta transgênica com o uso do

   método como definido na reivindicação 6;

   20 - cruzamento da planta transgênica com uma planta não transgênica ou com outra planta transgênica para obter a prole híbrida;

   - seleção de uma prole híbrida que possui tamanho da semente aumentado, peso da semente aumentado, comprimento

   25 da fibra da semente aumentado e/ou resistência da fibra da semente aumentado; e

   - obtenção de sementes da prole híbrida selecionadas.

   Petição 870180055689, de 28/06/2018, pág. 42/45

   1/3

   NOS ROL1

   GFP Promotor CaMV 35S

   Promotor CallV 35S

   GllS ORF

   Promotor CaM/ 35S Margem T (esquerda)

   Canamicina (R)