KR101422188B1 - 감미 단백질 브라자인을 생성하는 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 브라자인 생성방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감미 단백질 브라자인을 생성하는 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 브라자인 생성방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 브라바인 단백질을 발현하는 단백질을 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주에 형질전환한 후, 브라자인 단백질 생산량을 최적화할 수 있는 니신 처리 농도 및 시간을 밝힘으로써, 종래 L. lactis 균주를 이용하는 것보다 현저히 증가된 브라자인 생산이 가능함하며, 락토바실러스 속 균주 중 삽입된 플라스미드의 안정성이 가장 높은 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주에서 브라자인 생산량이 가장 높음을 확인하였다.

Description

감미 단백질 브라자인을 생성하는 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 브라자인 생성방법{Novel Lactobacillus spp．strains for producing sweet―tasting protein，Brazzein and a method for producing the Brazzein using the same}
본 발명은 감미 단백질 브라자인(Brazzein)을 생성하는 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주 및 이를 이용한 브라자인 생성방법에 관련된 것이다.
당(sucrose)의 섭취는 비만, 충치, 당뇨병 등과 같은 문제와 연관되어 있다. 이러한 문제는 당의 섭취를 감소시키고, 당 대체품의 섭취를 증가시키는 것으로 이어졌다. 인공적인 감미제로는 사카린(saccharin), 시클라메이트(cyclamate), 아스파탐(aspartame), 수크랄로스(sucralose), 스테비오사이드(stevioside)가 있으며, 스테비오사이드는 당보다 훨씬 단맛을 내는 현재 가장 인기 있는 감미 대체품이다. 그러나, 다수의 인공적인 감미제가 방광암, 뇌 종양 및 정신 질환과 연관되어 있다는 연구 결과로 인하여(National Cancer Institute Fact Sheet. 2006; Soffritti et al. 2005), 안전하면서 건강에 도움이 되는, 새로운 대체 감미제에 대한 필요가 대두되었다.
감미 단백질은 다양한 아프리카 및 남아시아 과일로부터 분리되며, 당(sucrose)보다 중량기준으로 약 500 ~ 4000배 이상 더 달기 때문에, 이러한 감미 단백질들을 자연적인 감미제로 사용되어왔다(Faus 2000). 그 중 브라자인(Brazzein)은 가장 작은 감미 식물 단백질(6,473Da)로써, 54개의 아미노산으로 구성되어 있다. 이는 서양 아프리카 식물 펜타이플란드라 브라제아나 바일론(Pentadiplandra brazzeana Baillon)으로부터 분리되었으며(Ming and Hellekant 1994), 중량기준으로 수크로즈(sucrose)보다 500배 더 달며, 분자 내의 이황산 결합으로 인해서 열과 pH에 대하여 더욱 안정적이다. 이러한 이유로, 유력한 당 대체제로써, 브라자인에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Assadi-Porter et al. 2000; Berlec et al. 2006; Ming and Hellekant 1994).
E. coli(Assadi-Porter et al. 2000), 메이즈(maize)(Lamphear et al. 2005) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis (Berlec et al. 2006)에서 재조합 브라자인을 발현시킨 보고가 있다. 브라자인을 발현시키기 위하여, L. lactis에서는 니신-조절 발현 시스템(nisin-controlled expression system, NICE)을 적용하였다(de Ruyter et al. 1996). 또한, 발효(fermentation) 조건의 최적화 및 플라스미드/균주 조합의 변화에 의해서 브라자인 단백질의 발현량을 증가시켰다는 결과가 보고되었으나(Berlec et al. 2008, Berlec et al. 2009), 브라자인 단백질의 발현량은 여전히 상대적으로 낮은 수치였다.
락토바실러스 속(Lactobacillus spp.)에 속한 균들은 이들의 추정 건강-기여 속성(putative health-conferring properties)으로 인하여, 프로바이오틱스(probiotics)로서 최근 많은 관심을 받고 있다(Sanders 1999). 다수의 종들에 관하여 많은 연구가 선행되어 있으며, 완전한 게놈(genome) 서열 및 이미 확립된 유전적 기술들이 활용 가능하다(Kleerebezem et al. 2003; Wei et al. 1995). 널리 알려진 락토바실리(Lactobacilli)의 산업적 및 의료학적 중요성의 관점에서, 락토비실리의 특징을 잘 파악하는 것은 매우 중요한 관심의 하나이다(Wei et al., 1995).
이에, 본 발명자들은 감미제를 대체를 위한, 브라자인을 발현하는 새로운 균주를 생성하기 위하여, 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)에 브라자인을 발현하는 플라스미드를 형질전환시킨 후, 니신(nisin)을 처리하였을 때 브라자인 발현량이 증가하며, 이러한 발현량의 증가는 니신의 농도 및 처리시간과 관련될 뿐만 아니라, 사용한 락토바실러스 속 중 삽입된 플라스미드의 안정성이 가장 높은 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)에서 브라자인 생산량이 가장 높다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Assadi-Porter F M, Aceti DJ, Cheng H, Markley JL (2000) Efficient production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin. Arch Biochem Biophys 376:252-258. Berlec A, Jevnikar Z, Majhenic AC, Rogelj I, Strukelj B (2006) Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 73:158-165. Berlec A, Tompa G, Slapar N, Fonovic UP, Rogelj I, Strukelj B (2008) Optimization of fermentation conditions for the expression of sweet-tasting protein brazzein in Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol 46:227-231. Berlec A, Strukelj B (2009) Large increase in brazzein expression achieved by chaning the plasmid/strain combination of the NICE system in Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol 48:750-755. Bryan EM, Bae T, Kleerebezem M, Dunny GM (2000) Improved vectors for nisin-controlled-expression in Gram-positive bacteria. Plasmid 44:183-190. Chang CE, Pavlova SI, Tao L, Kim EK, Kim SC, Yun HS, So JS (2002) Molecular identification of vaginal Lactobacillus spp. isolated from Korean women. J Microbiol Biotechnol 12:312-317. Faus I (2000) Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins. Appl Microbiol Biotechnol 53:145-151. Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R et al (2003) Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc Natl Acad Sci USA 100:1990-1995. Lamphear BJ, Barker DK, Brooks CA et al (2005) Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. J Plant Biotechnol 3:103-114. Lee YW, Im SH, Xin CF, So JS (2009) Determination of optimal electrotransformation conditions for various Lactobacillus spp. Korean J Biotechnol Bioeng 24:182-188. Ming D, Hellekant G (1994) Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B. FEBS Lett 355:106-108. National Cancer Institute Fact Sheet (2006) Artificial sweeteners and cancer: questions and answers. http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Risk/artificial-sweeteners#ref1. Accessed 7 January 2010. Pavan S, Hols P, Delcour J, Geoffroy M, Grangette C, Kleerebezem M, Mercenier A (2000) Adaptation of the nisin-controlled expression in Lactobacillus plantarum: a tool to study in vivo biological effects. Appl Environ Microbiol 66:4427-4432. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York. Sanders TA (1999) Food production and food safety. BMJ 318:1689◎693. Soffritti M, Belpoggi F, Esposti DD, Lambertini L (2005) Aspartame induces lymphomas and leukaemias in rats. Eur J Oncol 10:107-116. Wei M, Rush CM, Norman JM, Hafner LM, Epping RJ, Timms P (1995) An improved methods for the transformation of Lactobacillus strains using electroporation. J Microbiol Meth 21:97-109.
본 발명의 목적은 감미 단백질 브라자인(Brazzein)을 생성하는 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주 및 이를 이용한 브라자인 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 브라자인을 발현하는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 균주를 이용한 브라자인 생산방법을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주에 브라자인을 발현하는 플라스미드를 형질전환한 후, 30 ~ 40 ng/㎖ 농도의 니신을 3 ~ 4시간 처리하였을 때, 브라자인 단백질의 생산량이 가장 높으며, 이러한 효과는 종래의 L.lactis 균주에서 생성되는 브라자인 보다 현저히 높으므로, 본 발명에 따른 락토바실러스 속 균주를 브라자인을 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주에 형질전환된 브라자인(Brazzein) 단백질을 PCR을 이용하여 확인한 그림이다:
1번 레인: 1.1kb DNA 래더(ladder);
2번 레인: 100 bp DNA 래더;
3번 레인: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) KLB8;
4번 레인: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KLB 213; 및
5번 레인: 기탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주(본 균주는 이하 도면의 간단한 설명 및 도면에서 '락토바실러스 류테리 KCTC3594' 또는 'KCTC3594'로 표기함).
도 2는 니신을 처리하는 시간에 따른 락토바실러스 속의 브라자인 발현을 확인한 결과이다:
도 2의 A는 락토바실러스 속의 브라자인 발현을 웨스턴 블랏에 의해서 확인한 그림이다;
KLB8: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
KLB 21: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum);
KCTC3594: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri);
도 2의 B는 상기 웨스턴 블랏의 이미지를 상대적으로 분석한 그래프이다;
KLB8: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
KLB 21: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); 및
KCTC3594: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri);
도 3은 다양한 니신 농도에 따른 락토바실러스 속의 브라자인 발현을 확인한 결과이다:
도 3의 A는 다양한 니신 농도에서 브라자인의 발현을 웨스턴 블랏을 통해서 확인한 그림이다;
KLB8: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
KLB 21: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum);
KCTC3594: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri);
도 3의 B는 상기 웨스턴 블랏의 이미지를 상대적으로 분석한 그래프이다;
KLB8: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
KLB 21: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); 및
KCTC3594: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri).
도 4는 다른 락토바실러스(Lactobacillus spp.) 속 균주 및 L.lactis에서 브라자인의 발현을 비교한 결과이다:
도 4의 A는 다른 락토바실러스 균주에서 브라자인의 발현 나타낸 웨스턴 블랏 그림이다;
1번 레인: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) KLB8;
2번 레인: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KLB 213;
3번 레인: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) KCTC3594;
4번 레인: 락토코쿠스 락틱스(Lactococcus.lactis);
도 4의 B는 상기 웨스턴 블랏의 이미지를 상대적으로 분석한 그래프이다;
KLB8: 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
KLB 21: 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum);
KCTC3594: 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri); 및
IL1403: 락토코쿠스 락틱스(Lactococcus.lactis).
도 5는 pMSP3545::Bra-ht의 안정성을 세 종류의 락토바실러스 속에서 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 브라자인을 발현하는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) KCTC18192P 균주로 락토바실러스 류테리 KCTC3594 균주를 모균주로 사용하여, 서열번호 1을 포함하는 pMS3545::Bra-ht 플라스미드로 형질전환한 균주를 제공한다.
상기 균주는 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 브라자인을 발현하는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)는 2010년 5월 27일 한국생명공학연구원에 기탁되었다(KCTC18192P).
본 발명의 브라자인을 발현하는 락토바실러스 속 균주는 브라자인을 발현하는 pMSP3545::Bra-ht 플라스미드를 종래의 선행 문헌(Korean. J. Biotechnol. Bioeng 24:182-188)에 따라 락토바실러스 속에 전기천공법을 통해서 형질전환되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 형질전환된 락토바실러스 균주는 에리스로마이신 저항성인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 추가적으로 에리스로마이신을 1 ~ 20 ㎍/㎖ 첨가하는 것이 바람직하며, 3 ~ 15 ㎍/㎖ 첨가하는 것이 더욱 바람지하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 브라자인을 발현하는 락토바실러스 속 균주에서 브라자인을 발현시키기 위하여 첨가되는 니신(nisin)은 락토바실러스 속 균주에 따른 초기 지수기(early exponential phase)에 첨가되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 첨가되는 니신(nisin)은 5 ~ 70 ng/㎖인 것이 바람직하며, 10 ~ 50 ng/㎖ 첨가하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서 락토바실러스 속 균주에 브라자인을 발현하는 pMSP3545::Bra-ht 플라스미드를 전기천공법으로 도입한 후, 브라자인의 발현을 콜로니 PCR을 이용하여 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 브라자인 단백질의 상응되는 크기인 500 bp에서 관찰된 PCR 산물이 따라 pMSP3545::Bra-ht가 락토바실러스 속 균주에서 브라자인을 발현하고 있음을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 속 균주에서 브라자인 단백질의 발현량을 최적화하기 위하여, 니신 처리시간에 따른 브라자인 발현량을 비교한 결과, 니신을 처리한 후, 3 ~ 4시간 후 최고 발현량을 나타냈으며, 시간이 경과할수록 발현량이 점차 감소하는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 속 균주에서 브라자인 단백질의 발현량 최적화하기 위하여, 처리하는 니신의 농도에 변화를 주어 발현량을 비교한 결과, 25 ~ 40 ng/㎖의 농도에서 최대량을 발현하였으며, 그 이상의 농도에서 니신은 세포 성장을 심각하게 저해하여 브라자인의 생성량이 감소하는 결과를 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 락토바실러스 속의 다른 균주를 이용하여 브라자인 발현량을 측정한 결과, 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주에서 발현량이 가장 높음을 확인하였다(도 4 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 브라자인을 발현하는 플라스미드의 락토바실러스 속 균주 속에서의 안정성을 측정한 결과, 균주 속의 안정성에 따라서 브라자인의 발현량에 차이가 있으며, 브라자인의 발현량이 높은 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주에서 플라스미드의 안정성이 가장 높았다(도 5 참조).
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 락토바실러스 속 균주를 이용하여 브라자인을 생산하는 방법을 제공한다.
브라자인을 생산하는 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) 수탁번호 KCTC181921P로 기탁된 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 배양하는 단계; 및
2) 배양액으로부터 브라자인 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 브라자인 생산방법.
상기 브라자인을 생산하는 방법에 있어서, 단계 1)의 배양은 에리스로마이신(erythromycin)을 3 ~ 15 ㎍/㎖이 포함된 배지에서 배양하는 것이 바람직하며, 5 ~ 10 ㎍/㎖이 포함된 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 단계 1)의 배양은 10 ~ 70 ng/㎖의 니신(nisin)이 포함된 배지에서 배양하는 것이 바람직하며, 25 ~ 50 ng/㎖이 포함된 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 단계 1)의 배양은 2 ~ 5시간 처리하여 배양하는 것이 바람직하며, 니신을 3 ~ 4시간 처리하여 배양하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서 브라자인을 생성하는 락토바실러스 속 균주는 종래 브라자인을 생성하는 L. latcis보다 브라자인을 생성량이 높았으며, 브라자인의 발현량을 최적화하기 위하여, 브라자인의 발현을 유도하는 니신의 처리시간 및 농도를 조절하여, 니신 처리 3 ~ 4시간 후에 발현량이 가장 높으며, 이때 첨가되는 니신의 농도는 25 ~ 40 ng/㎖인 것이 효과적임을 확인하였다. 아울러, 이러한 발현량은 락토바실러스 속 균주의 종류에 따라 차이를 보였으며, 그 원인은 삽인된 플라스미드의 락토바실러스 속 균주에서의 안정성의 차이로 인하여 발생함을 밝혔다(도 1,2,3,4 및 5 참조).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 락토바실러스 속의 형질전환
감미 단백질 브라자인(Brazzein)을 발현하는 신규한 균주를 제작하기 위하여, 감미 단백질을 발현하는 pMSP3545::Bra-ht 플라스미드를 "Determination of optimal electroformation conditions for various Lacobacillus spp."(Koran. J. Biotechnol. Bioeng 24:182-188)에 기재된 방법에 따라서 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)에 전기천공법(electrotransformation)을 통해서 형질전환하였다.
상기 세 가지 속의 락토바실러스(Lactobacillus) 균주는 정지기(stationary phase)의 16~18시간 배양시기에 1% 글리신(Glycine)이 첨가된 MRS 브로스(Bioworld) 5 ㎖에 접종시켰다. 상기 세포는 초기 로그기(log phase)인, OD600 수치가 0.2~0.3가 되는 접종 후 약 3시간 후에 6,000g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 모았다. 상기 세포 펠렛은 차가운 워싱 버퍼[5 mM 소디움 포스페이트(sodium phosphate), pH 7.4, 1 mM MgCl2]를 이용하여 2회 세척한 후, 전기 천공(electroporation) 버퍼[S 버퍼, 0.5 M 수크로즈(sucrose)]를 이용하여 마지막으로 세척하였다. 1 ㎕의 pMSP3545::Bra-ht는 0.1 cm의 내부 전극봉 공간이 있는 Gene PulserTM 일회용 큐벳(cuvette)에서 차가운 세포 현택액 50 ㎕과 혼합된 후, 얼음 위에 5분 동안 두었다. 상기 혼합물은 12.5 kV/cm 피크 필드 세기(peak field strength)의 전기 자극을 주었다. 전기 천공법을 수행한 이후, 200 ㎕의 정상 MRS 브로스를 즉시 상기 세포에 첨가한 뒤에, 37℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 그 뒤에, 5 ㎍/㎖의 에리스로마이신(erythromycin)이 첨가된 MRS 아가(agar) 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트는 2~3시간 동안 37℃에서 반응시켰다.
< 실험예 1> 감미 단백질을 발현하는 락토바실러스 속의 확인
pMSP3545::Bra-ht가 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.)에 형질전환된 것을 확인하기 위하여, 콜로니 PCR 방법을 통하여 브라자인을 발현하는 단백질의 에리스로마이신 저항성 유전자(resistance gene)의 증폭을 이용하여 확인하였다.
에리스로마이신 저항성 유전자를 확인하기 위하여, 단일 콜로니에 5×버퍼 10 ㎕, 10mM dNTP 1 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머(서열 번호 2: 5'-GAAATTGGAACAGGTAAAGG-3') 1 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머(서열 번호 3: 5'- ATGGGTCAATCGAGAATATC-3') 1 ㎕, Taq polymerase 2 unit 및 나머지 부피를 증류수로 채워 넣어 총 부피가 50 ㎕가 되도록 첨가하여 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 5분에서 변성시킨 후, 94℃ 1분, 47.7℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클을 반복한 뒤, 72℃에서 마지막으로 증폭시켰다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 증폭된 에리스로마이신 저항성 유전자는 예상된 길이와 상응되는 약 500 bp의 사이즈를 보였으며, 이를 통하여 감미 단백질을 발현하는 pMSP3545::Bra-ht 플라스미드가 모든 락토바실러스 속에 성공적으로 형질전환되었음을 확인할 수 있었다(도 1).
< 실험예 2> 니신 처리시간에 따른 브라자인 발현량 변화 측정
상기 <실시예 1>에서 형질전환된 락토바실러스 속에서 생성된 브라자인 발현량을 니신(nisin) 처리시간 변화에 따라서 측정하였다. 상기 <실시예 1>에서 형질전환된 pMSP3545::Bra-ht를 포함하는 락토바실러스 속을 1:50의 비율로 새로운 배지에 희석하였으며, 1시간 30분 동안 배양되면서 초기 지수기(exponential phase)에 도달하도록 배양하였다. 상기 배양에 종래 발표된 보고에 기재된 NICE system의 적응에 필요한 시간을 참조하여, 1시간 30분 이후 초기 지수기(exponential phase)에 니신 25 ng/㎖을 첨가하였다(Pavan et al. 2000). 또한, 니신을 첨가하지 않은 배양을 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 배양된 세포는 6,000 g에서 5분 동안 원심분리를 통하여 수득되었으며, 수득된 세포 펠렛은 0.1 M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)(pH 7.0)로 2회 세척된 후, 마지막으로 400 ㎕의 포스페이트 버퍼로 현탁되었다. 그 뒤, 세포는 30% 증폭, 30-s 정지, 30-s 중간 정지(intermediated pause)를 3분 동안 얼음 위에서 초음파분해(sonication)되었다.
상기 초음파 분해된 세포에서 브라자인 단백질의 발현량을 비교하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 웨스턴 블랏은 Sambrook et al(1989) 및 Berlec et al(2006)에 기재된 방법에 따라서 수행되었다. 구체적으로 단백질 시료는 5×SDS-PAGE 로딩 버퍼와 혼합 된 후, 100℃에서 5분 동안 끓여서 변성과정을 거쳤다. 각각의 단백질은 16% SDS-PAGE 젤에 로딩 된 후, 0.2 uM PVDF membrane(Bio-Rad)으로 이동(transfer)시켰다. 단백질이 이동된 PVDF membrane은 비특이적 결합을 막기 위하여, 상온에서 1시간 동안 블로킹하였으며, 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 항-Brazzein 항체와 반응시켰다(Berlec et al, 2006). PVDF membrane을 TBST 버퍼[20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20, pH 7.6]로 세척한 후, HRP가 결합된 염소 항-토끼 IgG(Santacruz)를 1:10,000으로 희석시킨 용액과 상온에서 반응하였다. 반응 후, 상기 PVDF membrane을 세척한 뒤, 웨스턴 블랏 검출 용액(Neronex)을 이용하여 필름(AGFA)에 현상하였다.
니신 처리 시간에 따른 브라자인 발현량을 비교한 결과, 니신을 처리한 후 3 ~ 4시간 후 최고 발현량을 확인할 수 있었으며, 그 후 점진적으로 발현량이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 니신을 처리하지 않은 시기의 브라자인의 양을 음성대조군으로하여, 웨스턴 블랏 결과를 수량화하여 비교한 결과, 도 2의 B에 나타난 바와 같이, 브라자인 발현량이 니신 처리후 점진적으로 증가하여 3 ~ 4시간에서 최고량을 발현하며, 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 이는 균주의 가수분해 능력 또는 생성 세포의 흡착에 의한 니신의 활성 감소에 기인한 것으로 추정되었다(Berlec et al, 2006)(도 2).
< 실험예 3> 니신 농도에 따른 브라자인 발현량 차이 측정
니신 농도가 락토바실러스 속에서 브라자인의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 다양한 농도(10, 25, 40 및 50 ng/㎖)의 니신을 처리한 후, 브라자인의 발현량을 비교하였다.
상기 <실시예 1>에서 형질전환된 pMSP3545::Bra-ht를 포함한 락토바실러스 속을 1:50의 비율로 새로운 배지에 희석되었으며, 1시간 30분 동안 배양되면서 초기 지수기(exponential phase)까지 배양하였다. 니신을 처리한 후, 브라자인이 가장 많이 발현되는 시간은, 상기 결과를 참조하여 결정하였으며, 이에 따른 브라자인 발현 유도시간은 L.paracasei KLB 58의 경우 4시간, Lb. plantarum KLB213 및 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주는 3시간 니신을 처리한 후, 반응시켰다. 또한, 니신을 첨가하지 않은 배양을 음성 대조군으로 사용하였으며, 10, 25, 40 및 50 ng/㎖의 니신을 처리한 군을 실험군으로써 사용하였다. 상기 배양에서 세포는 6,000 g에서 5분 동안 원심분리를 통하여 수득되었으며, 수득된 세포 펠렛은 0.1 M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 2회 세척된 후, 마지막으로 400 ㎕의 포스페이트 버퍼로 현탁되었다. 그 뒤, 세포는 30% 증폭, 30-s 정지, 30-s 중간 정지(intermediated pause)를 3분 동안 얼음 위에서 초음파분해되었다.
브라자인 단백질의 발현을 비교하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행하였다(Sambrook et al(1989) 및 Berlec et al(2006)). 구체적으로 단백질 시료는 5×SDS-PAGE 로딩 버퍼와 혼합 된 후, 100℃에서 5분 동안 끓여서 변성과정 후, 단백질을 16% SDS-PAGE 젤에서 분리된 후, 0.2 uM PVDF membrane(Bio-Rad)로 이동시켰다. 단백질이 이동된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 블로킹하였으며, 4℃에서 오버나잇으로 항-Brazzein 항체와 반응시켰다(Berlec et al, 2006). TBST 버퍼[20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20(Tween20), pH 7.6]로 PVDF membrane을 세척한 후, HRP가 결합된 염소 항-토끼 IgG(Santacruz)를 1:10,000으로 희석시킨 용액과 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 상기 PVDF membrane을 세척한 뒤, 웨스턴 블랏 검출 용액(Neronex)을 이용하여 필름(AGFA)에 현상하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 니신이 첨가되지 않았을 때, 브라자인의 발현이 관찰되지 않았으며, 니신을 25 ng/㎖ 및 40 ng/㎖ 농도로 처리하였을 때, 브라자인이 가장 많이 발현되었으나, 40 ng/㎖ 농도 이상을 처리하였을 때에는 니신은 세포의 성장을 심각하게 저해하는 효과를 보였으며, 이러한 효과는 종래 발표된 L. lactis에서 보인 결과와 유사하였다(Berlec et al. 2006)(도 3).
< 실험예 4> 락토바실러스 속 균주 종류에 따른 브라자인 발현량 변화 측정
브라자인 발현량을 다른 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주 및 L. lactis IL1403에서 비교하였다. Lb. paracasei KLB58는 25 ng/㎖의 니신을 처리한 후, 4시간 동안 반응시켰으며, Lb. plantarum KLB213 및 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주는 40 ng/㎖의 니신을 처리한 후, 3시간 동안 반응시켰다. 상기 각각의 배양에서 세포는 6,000 g에서 5분 동안 원심분리를 통하여 수득되었으며, 수득된 세포 펠렛은 0.1 M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 2회 세척된 후, 마지막으로 400 ㎕의 포스페이트 버퍼로 현탁되었다. 그 뒤, 세포는 30% 증폭, 30-s 정지, 30-s 중간 정지(intermediated pause)를 3분 동안 얼음 위에서 초음파분해되었다.
상기 시료에서 브라자인 단백질의 발현을 비교하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행하였다(Sambrook et al(1989) 및 Berlec et al(2006)). 구체적으로 단백질 시료는 5×SDS-PAGE 로딩 버퍼와 혼합 된 후, 100℃에서 5분 동안 끓여서 변성과정 후, 단백질을 16% SDS-PAGE 젤에서 분리된 후, 0.2 uM PVDF membrane(Bio-Rad)로 이동시켰다. 단백질이 이동된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 블로킹하였으며, 4℃에서 오버나잇으로 항-Brazzein 항체와 반응시켰다(Berlec et al, 2006). TBST 버퍼[20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20, pH 7.6]로 PVDF membrane을 세척한 후, HRP가 결합된 염소 항-토끼 IgG(Santacruz)를 1:10,000으로 희석시킨 용액과 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 세척된 후, 웨스턴 블랏 검출 용액(Neronex)을 이용하여 필름(AGFA)에 현상하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주에서 브라자인 발현 수준은 다른 균주보다 약 1.6배 높았으며, 이러한 결과는 락토바실리(Lactobacilli) 속의 종에 따라 발현량이 상이할 수 있다는 것을 의미한다. 아울러, 세 가지 락토바실러스 속에서 브라자인 발현량은 종래 브라자인을 성공적으로 발현한 L. lactis에서 보다 높았음을 확인할 수 있었다(Berlec et al., 2006)(도 4).
< 실험예 5> 플라스미드 안정성 측정
플라스미드 안정성은 "Adaptation of the nisin-controlled expression in Lactobacillus plantarum: a tool to study in vivo biological effects"(Appl. Environ Microbiol. 66:4427~4432)에 기재된 방법에 약간의 변형을 가하여 수행하였다. pMSP3545::Bra-ht을 포함한 세 가지 종류의 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주를 37℃에서 MRS 브로스에서 배양하였다. 서브컬쳐(subculture)는 50 ㎕의 이전 컬쳐를 새로운 MRS 브로스 5 ㎖에 첨가함으로써 수행되었으며, 5번의 서브컬쳐동안 에리스로마이신 저항성 CFU(colony forming unit)의 비율은 정상 MRS 아가 플레이트 및 5 ㎍/㎖의 에리스로마이신이 포함된 MRS 아가 플레이트에 박테리아 희석한 것을 동일한 수로 심은 뒤에, 생성된 전체 CFU를 통해서 측정되었다.
플라스미드 안정성은 삽입된 플라스미드가 락토바실러스 속에서의 안정성 여부를 통하여 측정하였다. 5회 서브 컬쳐 후, 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주는 약 60%의 안정성을 유지하였으나, 다른 두 균주에서는 안정성이 거의 유지되지 않았다. 따라서, pMSP3545::Bra-ht는 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주에서 다른 두 균주에 비하여 상대적으로 더욱 안정하였으며, 이는 상기 수탁번호 KCTC18192P로 기탁된 락토바실러스 류테리 균주에서 브라자인의 발현량이 다른 두 균주에 비하여 더욱 높다는 상기 <실험예 4>의 결과와 동일하였다. 따라서, 이는 플라스미드 안정성이 브라자인의 발현량에 영향을 끼치는 중요한 요소인 것을 알 수 있었다(도 5).
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 브라자인(Brazzein)을 생성하는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주는 감미 단백질인 브라자인을 대량으로 생산할 수 있는 균주로서, 이를 이용하여 당 대체제인 브라자인을 대량으로 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC18192P 20100527
<110> INHA Industry Partenrship Institute <120> Novel Lactobacillus spp. strains for producing sweet-tasting protein, Brazzein and a method for producing the Brazzein using the same <130> 10p-04-04 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brazzein <400> 1 atggcgcagg acaaatgtaa aaaagtatac gaaaactacc cggtatccaa atgtcagctg 60 gcaaaccagt gtaactacga ctgtaaactg gacaaacacg ctcgttccgg agaatgcttc 120 tacgacgaaa aacgtaacct gcagtgcatc tgcgactac 159

Claims (6)

  1. 수탁번호 KCTC18192P로 기탁되고, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화되는 브라자인 단백질을 발현하는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주.
  2. 삭제
  3. 1) 제 1항의 균주를 배양하는 단계;
    2) 배양액으로부터 브라자인 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 브라자인 생산방법.
  4. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 배양은 3 ~ 15 ㎍/㎖의 에리스로마이신(erythromycin)이 포함된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 브라자인 생산방법.
  5. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 배양은 10 ~ 50 ng/㎖의 니신(nisin)이 포함된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 브라자인 생산방법.
  6. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 배양은 니신을 3 ~ 4시간 처리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 브라자인 생산방법.
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