JP2021101733A - 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
(a)配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号1に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
配列番号12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号11に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号1に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号3に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号9に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号11に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
配列番号12に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、に関する。
ATCC76273株において配列番号4で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA38267)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号3で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号6で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA37956)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号5で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号8で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA37582)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号7で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号10で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA39503)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号9で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ATCC76273株において配列番号12で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA38927)で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号11で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている:Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片(配列番号95)を全合成し、これをpUC19(タカラバイオ社製、Code No. 3219)のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を構築した。
各遺伝子の上流配列(プロモーター)をコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターID、不活性化させるポリペプチドのACCESSION No.、ポリペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする塩基配列、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表1に示す。
実施例2で構築した抗リゾチウム一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxT38473G418またはpUC-PgapscFvTaoxT38473G418、BGL1発現ベクターpUC-PaoxBGL1TaoxT38473G418、mUkG1発現ベクターpUC-PaoxmUkG1TaoxT38473G418を用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
実施例4で取得した形質転換酵母の染色体DNAをカネカ簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて調製した。調製した染色体DNA混合物をテンプレートにして遺伝子不活性化の確認をPCRで行った。形質転換に用いた遺伝子の不活性化用ベクターのID、核酸断片の増幅に用いたプライマー(Fw及びRe)の番号及び配列を表6に示す。
実施例4で得られた抗リゾチウム一本鎖抗体発現酵母(AOXscFv_1〜7)を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に接種し、これを30℃、170rpm、24時間振盪培養後、前培養液を得た。続いて前培養液の菌体濃度をOD600にて測定し、初期OD600が0.5となるように25mlのBMMY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Methanol)に接種し、これを30℃、170rpm、48時間振盪培養後、遠心分離(12000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。
実施例6で得られた培養上清への抗リゾチウム一本鎖抗体分泌発現量は、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法により以下に示す方法で行った。
実施例6で得られた培養上清へのBGL1分泌発現量は、pNitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)を発色基質とした比色分析法により以下に示す方法で行った。
実施例6で得られた培養上清へのmUkG1分泌発現量は、培養上清の蛍光分析法により以下に示す方法で行った。
黒色96ウェルプレート(マイクロフルオロ1ブラック(IWAKI社製))の各ウェルに実施例6で得られた培養上清150μlを添加し、マイクロプレートリーダー(Envision;パーキンエルマー社製)で蛍光強度(励起波長485nm 蛍光波長510nm)を測定した。この方法により得られた相対蛍光強度と各々の菌体濃度(OD660)を表11に示した。相対蛍光強度は、mUkG1遺伝子を持たない野生型株の蛍光強度で補正し、mUkG1発現酵母株(AOXmUkG1_1)の蛍光強度を1として算出した。
Claims (10)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞:
(a)配列番号3に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号5に示す塩基配列を含む遺伝子、配列番号7に示す塩基配列を含む遺伝子、及び/又は配列番号9に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号3に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号5に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
配列番号7に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、及び/又は
配列番号9に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号6に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、
配列番号8に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
配列番号10に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。 - 前記(a)〜(d)のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)〜(d)のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び/又は前記(a)〜(d)のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を含有するベクターで形質転換して得られる請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記ベクターが、前記塩基配列の上流または下流に目的タンパク質をコードする塩基配列を含有する、請求項2に記載の宿主細胞。
- さらに、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを含む、請求項2に記載の宿主細胞。
- 酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、又は植物細胞である、請求項3又は4に記載の宿主細胞。
- 酵母が、メタノール資化性酵母、分裂酵母、又は出芽酵母である、請求項5に記載の宿主細胞。
- メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、及び培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
- 目的タンパク質が異種タンパク質である、請求項8に記載の方法。
- 培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いる、請求項8又は9に記載の方法。
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