CN113383015A - 重组蛋白变体 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种修饰凝集素蛋白，其在SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有一种氨基酸修饰，或在该氨基酸序列具有至少60％的同源性。氨基酸修饰选自以下一种或多种情况：在碳水化合物结合位点至少有一种氨基酸修饰；在N端至少有一种氨基酸修饰；第76位至少有一种氨基酸修饰；或第44或89位至少有一种氨基酸修饰。修饰凝集素蛋白不含任一SEQ ID NO.2‑4序列的氨基酸序列。

Description

重组蛋白变体
该申请对2018年8月31日提交的第201821032765号印度临时专利申请的权益进行了声明，其全部内容通过引用包含在本文中。
【技术领域】
本发明是关于一种修饰凝集素蛋白以及包含修饰凝集素蛋白编码核酸序列的核酸分子，特别是一种包含该核酸分子的重组载体以及包含重组载体的转化宿主细胞。此外，本发明还涉及由修饰凝集素蛋白组成的药用组合物、癌细胞检测、癌症诊断以及癌症患者治疗。本发明还涉及重组齐整小核菌凝集素蛋白的生产工艺。
【背景技术】
凝集素是一种高特异性碳水化合物结合蛋白，是对其他分子的糖基具有高特异性的高分子。凝集素在细胞和分子水平上进行识别，并在涉及细胞、碳水化合物和蛋白质的生物识别现象中发挥许多不同的作用。凝集素为二价或多价碳水化合物结合蛋白，能够结合和沉淀糖蛋白并凝集红细胞。在动物体内发现的凝集素通常有助于细胞相互作用，而植物凝集素则能够抵御潜在捕食者或病原体。
纯凝集素在临床环境中很重要，因为它们可用于血型鉴定。有些存在于人类红细胞上的糖脂和糖蛋白可采用凝集素进行识别。许多凝集素可用作指示恶性生长早期检测的生物标记或用作自噬诱导剂，而其他凝集素也表现出通过细胞凋亡抑制癌细胞生长的能力。由于细胞增殖不受调节，有些碳水化合物部分在癌细胞上以抗原的形式表达。凝集素在癌症治疗中用作药物载体，因为它们能够与恶性肿瘤特异性结合。此外，由于凝集素还能够调节癌症相关通路，因此它们有可能用作癌症诊断和治疗药物。
凝集素能够与多种抗原结合，抗原已在癌细胞表面进行表征；大多数抗原都是针对特定类型的癌症，凝集素与这些抗原结合可以通过诱导癌细胞凋亡而抑制癌细胞生长。目前，大多数市场上可买到的凝集素来自植物和其他真核生物。
齐整小核菌凝集素(SRL)是从土生植物病原真菌齐整小核菌的菌核体中分离出来的凝集素。SRL对Thomsen-Friedenreich(TF)抗原和Tn抗原具有特异性。TF抗原是一种二糖(Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)，在各种不同人类癌细胞的细胞表面上过表达。Tn抗原是一种单糖(GalNAc-α-)。由于对TF和Tn抗原的特异性，SRL已经证明能够与人类结肠癌、卵巢癌和白血病细胞结合。SRL的晶体结构已经确定(Leonida等人，《分子生物学杂志》，2007年5月11日；368(4)：1145-61)，但尚未对根据晶体结构确定的碳水化合物结合位点进行实验验证。
虽然凝集素作为抗癌工具有许多优势，但它们仍然有许多局限性，如缺乏选择性、质量和性能不一致以及不易批量生产。此外，经常报道植物凝集素可与一系列不同的聚糖结构结合，因此缺乏许多应用所需的选择性。而且，在使用植物凝集素时，逐批质量差异也很常见。产品的质量取决于植物材料的分离方法，以及起始植物材料本身的质量。
从天然来源中分离凝集素是不可靠的，因为这样获得的凝集素与期望的性质不一致。进一步从天然来源中分离蛋白质的过程费用高且难度大。分离自然产生的凝集素所用的技术产量一般非常低，特别是在蛋白质浓度低时。这些技术有时还不能区分同一种凝集素的异构体。因此，所得的产物为混合物，有很大的不确定性。从这个意义上来说，通过重组DNA(rDNA)技术生产重组凝集素的优点是可提供单纯蛋白质，在极短的时间内具有更高且一致的产量，表征准确，同时易于扩展。利用rDNA技术，可以将产生相关蛋白质的基因转移到合适的宿主体内。这样，与传统方法相比，蛋白质的生产和分离需要的时间和精力更少。
WO 2010/095143公开了重组凝集素变体Rec-2和Rec-3，分别是通过替换3个或5个氨基酸的方式从天然SRL序列中获得的。这些变体的晶体结构均有报道(Peppa等人，《分子杂志》，2015年6月12日；20(6)：10848-65)。
WO 2014/203261公开了通过替换12个氨基酸的方式从天然SRL序列中获得的重组凝集素变体。
同时还需要进一步研究具有替代性质的凝集素变体。特别是对于用于癌症诊断和用作治疗药物的凝集素来说，如果具有可溶性和稳定性且不会损害其对恶性肿瘤/癌细胞的特异性亲和力，则是非常有利的。因此，需要新的重组凝集素序列和有效的方法来生产重组凝集素，使其在适当的宿主细胞中具有足够的转基因表达水平，同时具有可溶性和/或稳定性，同时保持对恶性细胞的亲和力。
本发明力图解决上述一种或多种需要。
【发明内容】
根据本发明的一方面，提供一种包含从以下序列中选择的氨基酸序列的修饰凝集素蛋白：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；
b)i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰，其中与i)的氨基酸序列相比，引发剂甲硫氨酸的切割增加；
c)与SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白二聚体形成的氨基酸修饰；或
d)与SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白氧化作用的氨基酸修饰。
在一些实施例中，修饰凝集素蛋白不含任一SEQ ID NO.2-4序列的氨基酸序列。在一些进一步的实施例中，修饰凝集素蛋白具有细胞毒性作用。
根据本发明的一方面，提供一种修饰凝集素蛋白，该修饰凝集素蛋白包含从以下任一序列中选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a.i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；或
b.i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰；
c.第76位处至少一种氨基酸修饰；或
d.第44或89位处至少一种氨基酸修饰，
其中修饰凝集素蛋白不含任一SEQ ID NO.2-4序列的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供一种修饰凝集素蛋白，该修饰凝集素蛋白包含从以下任一序列中选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；或
b)i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰，其中与i)的氨基酸序列相比，引发剂甲硫氨酸的切割增加；
c)与第76位处SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白二聚体形成的氨基酸修饰；或
d)与第44或89位处SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白氧化作用的氨基酸修饰；
其中修饰凝集素蛋白不含任一SEQ ID NO.2-4序列的氨基酸序列。
本发明的修饰凝集素蛋白具有生物活性。
在一个实施例中，修饰凝集素蛋白包含与SEQ ID NO.1具有至少70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性的氨基酸序列。
根据本发明的一方面，提供一种修饰凝集素蛋白，其包含从以下序列中选择的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO.1；或
ii.与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中氨基酸替换从下列一项或几项中选择：
a.主要碳水化合物结合位点氨基酸替换，其中替换氨基酸从下列一项或多项中选择：
i.第27位和/或第28位处的非极性、极性、酸性或碱性氨基酸；
ii.第47位处的非极性氨基酸和/或第48位处的极性氨基酸；
iii.第70位处的非极性氨基酸、第71位处的极性氨基酸和/或第72位处的非极性氨基酸；和/或
iv.第105位处的任何其他氨基酸。
b.次要碳水化合物结合位点氨基酸替换，其中替换氨基酸从下列一项或多项中选择：
i.第77位处的非极性氨基酸、第78位处的非极性氨基酸和/或第80位处的极性氨基酸；
ii.第101位处的任何其他氨基酸；
iii.第112位处的非极性氨基酸和/或第114位处的极性氨基酸。
在另一个实施例中，修饰凝集素蛋白包含i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰。
在一些实施例中，碳水化合物结合位点为主要和/或次要碳水化合物结合位点。
在一个实施例中，主要碳水化合物结合位点包含从下列一项或几项中选择的位置：SEQ ID NO.1中第27、28、47、48、70、71、72和105位，或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性序列中的相应位置。
在这样的实施例中，氨基酸修饰位置从下列一项或几项中选择：
i)第27和/或28位；
ii)第47和/或48位；
iii)第70、71和/或72位；和/或
iv)第105位。
在另一个实施例中，次要碳水化合物结合位点包含从下列一项或几项中选择的位置：SEQ ID NO.1中第77、78、80、101、112和114位，或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性序列中的相应位置。
在这样的实施例中，氨基酸修饰位置从下列一项或几项中选择：
i)第77、78和/或80位；
ii)第101位；
iii)第112和/或114位。
在另一个实施例中，氨基酸修饰属于氨基酸替换，因此替换氨基酸替换了原始氨基酸。在一个实施例中，氨基酸替换属于保守的或有利的氨基酸替换。
在一个实施例中，主要碳水化合物结合位点的氨基酸替换从下列一项或几项中选择：
i)第27位：保守的、有利的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是非极性的或酸性的；有利的氨基酸是极性的或碱性的，不利的氨基酸是非极性的；
ii)第28位：保守的、有利的、中性的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是非极性的；有利的氨基酸是极性的，中性的氨基酸是酸性或碱性的，不利的氨基酸是极性的；
iii)第47位：不利的氨基酸，是碱性或非极性的；
iv)第48位：不利的氨基酸，是非极性的；
v)第70位：不利的氨基酸，是非极性的；
vi)第71位：不利的氨基酸，是非极性的；
vii)第72位：不利的氨基酸，是非极性的；和/或
viii)第105位：保守的、有利的、中性的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是碱性或非极性的；有利的是极性的，中性的是酸性的、碱性的或极性的和/或不利的氨基酸是极性的、非极性的或酸性的。
在另一个实施例中，次要碳水化合物结合位点的氨基酸替换从下列一项或几项中选择：
i)第77位：不利的氨基酸，是非极性的；
ii)第78位：不利的氨基酸，是非极性的；
iii)第80位：不利的氨基酸，是非极性的；
iv)第101位：有利的、不利的或中性的氨基酸，其中有利的氨基酸是极性或碱性的，不利的氨基酸是非极性的，中性的氨基酸是非极性的或酸性的；
v)第112位：不利的氨基酸，是非极性的；
vi)第114位：不利的氨基酸，是极性的。
在一个实施例中，修饰凝集素蛋白包含i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰，其中N端包含从下列各项中选择的位置：SEQ ID NO.1中第1和/或2位，或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性序列中的相应位置。
在一个实施例中，氨基酸修饰为第1位处的氨基酸替换，其中替换氨基酸非苏氨酸或缬氨酸。在进一步实施例中，替换氨基酸从丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸中选择。在进一步实施例中，氨基酸修饰为第2位处的氨基酸替换，其中替换氨基酸为色氨酸。
在一些实施例中，与对照组相比，引发剂甲硫氨酸的切割增加或减少。
在另一个实施例中，第76位处的氨基酸修饰为采用非极性氨基酸进行的氨基酸替换。在一些实施例中，非极性氨基酸从甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸中选择。
在一个实施例中，第44或89位处的氨基酸修饰为采用非极性氨基酸进行的氨基酸替换。在一些实施例中，最好在第89位处进行氨基酸修饰。在一些实施例中，非极性氨基酸从亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸中选择。
在另一个实施例中，修饰凝集素蛋白可溶、部分可溶或不溶，且/或具有细胞毒性。在一些实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性至少为对照组的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个替代实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性小于对照组的10％，或不具有细胞毒性。在另一个替代实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性与对照组相比至少增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在另一个实施例中，修饰凝集素蛋白长度等于或小于500、400、300、250、200或150氨基酸。
根据本发明的进一步方面，提供一种包含修饰凝集素蛋白和药学上可接受的稀释剂或赋形剂以及(视需要)进一步治疗成分的药用组合物。同时还提供一种癌症患者治疗方法，包括将修饰凝集素蛋白或修饰凝集素蛋白的药用组合物施用于患者。
根据本发明的另一方面，提供一种包含上述修饰凝集素蛋白和药学可接受的稀释剂或赋形剂以及(视需要)进一步治疗成分的药用组合物。根据本发明的进一步方面，提供一种治疗癌症患者的方法，包括将上述修饰凝集素蛋白施用于患者。在一些实施例中，该方法包括将上述药用组合物施用于患者。
根据本发明的另一方面，提供一种修饰凝集素蛋白或修饰凝集素蛋白的药用组合物用于癌症治疗。此外，还提供一种用于癌细胞检测、癌症诊断和/或癌症治疗的修饰凝集素蛋白。
根据本发明的进一步方面，提供一种上述修饰凝集素蛋白用于药品。或者提供一种上述药用组合物用于药品。在一些实施例中，上述修饰凝集素蛋白或药用组合物用于癌症治疗。根据本发明的进一步方面，提供一种用于癌细胞检测、癌症诊断和/或癌症治疗的上述修饰凝集素蛋白。
根据本发明的一方面，提供一种包含修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列的核酸分子，其中修饰凝集素蛋白包含从以下序列中选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；
b)i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰；
c)第76位处至少一种氨基酸修饰；或
d)第44或89位处至少一种氨基酸修饰。
根据本发明的另一方面，提供一种包含修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列的核酸分子，其中修饰凝集素蛋白包含从以下序列中选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；
b)i)或ii)的N端至少一种氨基酸修饰，其中与i)的氨基酸序列相比，引发剂甲硫氨酸的切割增加；
c)与SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白二聚体形成的氨基酸修饰；或
d)与SEQ ID NO.1的凝集素蛋白质相比，至少一种减少修饰凝集素蛋白氧化作用的氨基酸修饰。
根据本发明的另一方面，提供一种包含上述修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列的核酸分子。在本发明的进一步方面，提供包含该核酸分子插入片段的重组载体。
在一些实施例中，在5'端和3'端有效连接的载体包含在宿主细胞中起作用的启动子、上述修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列以及终止信号。在另一个实施例中，重组载体能够在单细胞生物体中复制、转录、转译和/或表达。
在本发明的另一方面，提供包含上述核酸分子的转化宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌或酵母细胞。
根据本发明的另一方面，提供一种包含核酸分子插入片段的重组载体，其中所述核酸分子包含修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列，该序列包含从以下序列选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)一种氨基酸序列，与i)具有至少60％的同源性；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；
b)i)或ii)N端至少一种氨基酸修饰；
c)第76位处至少一种氨基酸修饰；或
d)第44或89位处至少一种氨基酸修饰。
根据本发明的另一方面，提供一种包含核酸分子插入片段的重组载体，其中该核酸分子包含了对修饰凝集素蛋白进行编码的核苷酸序列，该修饰凝集素蛋白包含从以下序列选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)一种氨基酸序列，与i)具有至少60％的同源性；
其中，i)或ii)的氨基酸序列包含从下列(a)到(d)一项或几项中选择的至少一种氨基酸修饰：
a)i)或ii)碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；
b)在i)或ii)N端至少一种氨基酸修饰，其中与i)的氨基酸序列相比，引发剂甲硫氨酸的切割增加；
c)与SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白相比，至少一种可减少修饰凝集素蛋白二聚体形成的氨基酸修饰。
d)与SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白相比，至少一种可减少修饰凝集素蛋白氧化作用的氨基酸修饰。
本发明的最后一个方面，提供了一种生产重组体齐整小核菌凝集素蛋白的方法，包括：
i)培养含有上述重组体凝集素蛋白编码的重组载体的宿主细胞；
ii)表达重组体凝集素蛋白；
iii)从培养物中分离天然重组体凝集素蛋白。
伴生序列简要说明
SEQ ID NO.1：表示天然齐整小核菌凝集素氨基酸序列。
SEQ ID NO.2：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(WO 2010/095143中记录的Rec-2)。
SEQ ID NO.3：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(WO 2010/09514中记录的Rec-3)。
SEQ ID NO.4：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(在WO 2014/203261中记录)。
本发明所采用的具体技术，将通过以下的实施例作进一步的说明。
【具体实施方式】
本文所用术语“蛋白”系指氨基酸残基聚合物。
本文所用术语“凝集素”系指碳水化合物结合蛋白。
本文所用术语“修饰凝集素蛋白”系指具有碳水化合物结合活性且包含至少一种氨基酸修饰的氨基酸残基聚合物。
本文所用术语“氨基酸”系指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有类似于天然存在的氨基酸的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，包括蛋白氨基酸。天然存在的氨基酸也包括那些在细胞中转译后修饰的氨基酸。合成氨基酸包括非经典氨基酸，如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。通常，合成氨基酸并非蛋白氨基酸。
本文所用术语“氨基酸修饰”系指添加、删除或替换氨基酸序列中某一位置处的氨基酸。在一个实施例中，添加氨基酸系指在氨基酸序列中某一位置添加至少1、2、3、4或5个氨基酸。添加、删除或替换过程根据本发明或技术人员了解的方法来执行。在一个实施例中，本文所用术语“氨基酸修饰”系指进行乙酰化、硝化、糖基化和/或磺化等一种或多种修饰。
本文所用术语“氨基酸替换”系指替换氨基酸序列中某一位置的氨基酸。术语“氨基酸替换”包括保守性和非保守性氨基酸替换。保守性氨基酸替换提供功能相似的氨基酸。换言之，替换原氨基酸的氨基酸(即“替换”氨基酸)具有相似的生化特性。非保守性氨基酸替换提供功能不相似的氨基酸。换言之，替换原氨基酸的氨基酸(即“替换”氨基酸)具有不同的生化特性。在一个实施例中，氨基酸替换是“有利的”氨基酸取代。有利的氨基酸取代保持修饰凝集素蛋白的生物功能和/或其他性质。在另一个在一个实施例中，保守和有利的氨基酸替换均基于凝集素蛋白的成对或多重序列比对。保守取代是在最大量天然凝集素蛋白中相应位置发生的氨基酸替换，有利替换是在少数天然凝集素蛋白中相应位置发生的氨基酸替换。两种替换均预期保留或增强修饰蛋白质的细胞毒性。在一个实施例中，生物功能是如下文所定义的“细胞毒性作用”。在一个实施例中，基于凝集素蛋白(最好是真菌凝集素蛋白)的成对或多重序列比对，选择替换氨基酸作为有利氨基酸替换。
据了解，氨基酸可以按不同的生化特性进行分组。例如：极性氨基酸、非极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。在一个实施例中，用于氨基酸修饰的氨基酸选自以下分组的至少一种氨基酸，包括但不限于：极性、非极性、酸性、碱性、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸和非典型氨基酸。
本文所用术语“同源性”或“同源”系指在给定区域或部分上至少部分一致性的两个或多个参照实体。同源或一致的区域或领域系指具有同源或相同的两个或多个参照实体的一部分。因此，当两个序列在一个或多个序列区域上完全相同时，它们在这些区域中具有一致性。实质同源性系指在结构或功能上保守的分子，其具有或预计具有标准分子的一个或多个结构或功能(例如，生物功能或活性)的至少部分结构或功能，或与之同源的标准分子的相关/对应区域或部分。
例中，使用采用默认参数的BLASTP算法来确定两个序列之间的“同源性”百分比(Altschul等人，《核酸研究杂志》，1997年9月1日；25(17)：3389-402)可通过以下网址在线了解BLAST算法：
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。另一实施例中，通过EMBOSSNeedle算法，采用默认参数来确定两个序列之间的同源性百分比，以便开展序列全局比对。可以通过以下网址在线了解EMBOSS Needle算法：https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/。
除非另有说明，否则术语“同源性”可与本规范中的术语“序列一致性”互换使用。
本文所用术语“对应位置”系指两个或多个序列之间的类似位置。在一个实施例中，通过至少第一和第二序列的序列比对来确定相应的位置。序列对比结果对至少第一和第二序列中的对应位置进行比对，因此可以确定该位置。在一个实施例中，序列比对是成对或多重序列比对。在一个实施例中，通过算法进行序列比对。在一个实施例中，算法是如上所述的BLAST或EMBOSS Needle算法。
本文所用术语“碳水化合物结合位点”系指参与碳水化合物结构识别和结合的凝集素蛋白中的氨基酸残基。在一个实施例中，该碳水化合物结合位点参与TF抗原(双糖；Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)和/或Tn抗原(单糖；GalNAc-α-)的识别和结合。在一个实施例中，“碳水化合物结合位点”包含“主要碳水化合物结合位点”和/或“次要碳水化合物结合位点”。
本文所用术语“主要碳水化合物结合位点”系指参与特定碳水化合物结构识别和结合的一个或多个氨基酸残基。在一个实施例中，该特定碳水化合物结构是TF抗原。在一个实施例中，构成主要碳水化合物结合位点的氨基酸残基选自SEQ ID NO.1中的27、28、47、48、70、71、72和/或105中的一个或多个位置，或与其具有至少60％同源性的序列中的对应位置。在一个实施例中，通过序列比对来确定相应的位置。
本文所用术语“次级碳水化合物结合位点”系指参与识别和结合特定碳水化合物结构的一个或多个氨基酸残基。在一个实施例中，该特定的碳水化合物结构为Tn抗原。在一个实施例中，构成次级碳水化合物结合位点的氨基酸残基系从SEQ ID NO.1序列的77、78、80、101、112和/或114位中的一个或多个或从一个与该序列具有至少60％同源性的序列中的一个相应位置选取。在一个实施例中，相应位置通过序列比对确定。
本文所用术语“细胞毒性作用”系指一种可杀死癌细胞或抑制癌细胞生长(即发挥抗增殖活性)的物质。在一个实施例中，物质的细胞毒性百分率使用如示例5中所详述的硫代罗丹明B分析(SRB法)予以测定。在一个实施例中，由SRB法测定的至少为20％、30％、40％、50％或60％的细胞毒性百分率即指示细胞毒性作用。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白表现出的细胞毒性百分率是对照组的细胞毒性百分率的至少60％、70％、80％或90％。在一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白，而在另一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.2序列的凝集素蛋白。
本文所用术语“N端”系指位于朝向氨基酸序列起点(即朝向氨基末端)的氨基酸残基。在一个实施例中，N端系指位于氨基酸序列的前10％或5％的氨基酸残基。
本文所用术语“引发剂甲硫氨酸的切割”系指从氨基酸序列中除去N端(引发剂)甲硫氨酸。在一个实施例中，引发剂甲硫氨酸的切割由甲硫氨酸胺肽酶(MAP)催化。在一个实施例中，引发剂甲硫氨酸的切割通过使用本领域技术人员已知的质谱或高效液相色谱(HPLC)分析予以测定。
本文所用术语“引发剂甲硫氨酸的切割增加”系指相对于对照组，引发剂甲硫氨酸切割的程度增加。在一个实施例中，它指相对于对照组，引发剂甲硫氨酸切割的程度增加至少5％、10％、25％或50％。在一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白，而在另一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.2序列的凝集素蛋白。
本文所用术语“二聚体形成”系指含有两种相同或不同单体的一个低聚体的形成。在一个实施例中，二聚体形成系指生成含有根据本发明的两种修饰凝集素蛋白的(相同或不相同)二聚体。在一个替代实施例中，二聚体形成系指生成含有根据本发明的修饰凝集素蛋白以及替代性凝集素蛋白的二聚体(例如由SEQ ID NO.1序列组成的替代性凝集素蛋白)。在一个实施例中，二聚体形成由每个单体中半胱氨酸残基之间的二硫键介导。在一个实施例中，半胱氨酸残基位于SEQ ID NO.1序列的76位或与该序列具有至少60％同源性的氨基酸序列中的相应位置。在一个实施例中，相应位置通过序列比对确定。在一个实施例中，二聚体形成的水平通过使用质谱法、尺寸排阻色谱法和/或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中的任何一个方法测定。
本文所用术语“二聚体形成降低”系指相对于对照组，二聚体形成水平降低。在一个实施例中，“二聚体形成降低”系指相对于对照组，二聚体形成水平降低至少5％、10％、25％或50％。在一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白，而在另一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.2序列的凝集素蛋白。
本文所用术语“氧化”系指电子损失或氧化态增加。在一个实施例中，术语“氧化”系指氨基酸残基氧化，氨基酸残基的实施例包括甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或组氨酸。在一个实施例中，术语“氧化”系指甲硫氨酸残基氧化成甲硫氨酸亚砜。在一个实施例中，易于氧化的甲硫氨酸残基位于SEQ ID NO.1序列的44位或89位，或与该序列具有至少60％同源性的氨基酸序列中的相应位置。在一个实施例中，相应位置通过序列比对确定。在一个实施例中，氧化水平通过使用质谱法和/或反相高效液相色谱法(RP-HPLC)予以测定。氧化被认为会影响蛋白质的表达和活性。在一个实施例中，氧化效应系由位于SEQ ID NO.1序列第44或89位的易于氧化的氨基酸对凝集素蛋白的可溶性表达和/或活性的替换效应决定。
本文所用术语“氧化降低”系指相对于对照组，氧化水平降低。在一个实施例中，“氧化降低”系指相对于对照组，氧化水平降低至少5％、10％、25％或50％。在一个替代实施例中，“氧化降低”系指凝集素蛋白的增强可溶性表达和/或活性。在一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白，而在另一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.2序列的凝集素蛋白。
本文所用术语“可溶性”系指以可溶性或至少部分可溶性形式表达的修饰凝集素蛋白。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白的可溶性通过可表达修饰凝集素蛋白的宿主细胞的细胞裂解及随后对裂解上清液和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳予以测定。裂解上清液中若存在修饰凝集素蛋白，则表明修饰凝集素蛋白可溶。裂解上清液和沉淀中若存在修饰凝集素蛋白，则表明修饰凝集素蛋白部分可溶。在一个实施例中，本文所用术语“可溶性”系指不形成包涵体的修饰凝集素蛋白。使用上述方法，沉淀中若存在修饰凝集素蛋白，则表明修饰凝集素蛋白系以包涵体的形式表达。
本文所用术语“核酸分子”系指多种核苷酸的聚合物。核酸分子可包含天然核酸，或者可包含人工核酸。在一个实施例中，核酸分子为脱氧核糖核酸(DNA)或其衍生物。在一个替代实施例中，核酸分子为核糖核酸(RNA)或其衍生物。
本文所用术语“核苷酸”系指天然核苷酸和被细胞酶识别的合成核苷酸类似物。
为研制具有改变型和/或改进型理化性质和/或生物活性的新凝集素，本发明之发明人研制了几种凝集素变体，在活性和非活性位点对天然凝集素序列进行了修饰。
在一个实施例中，本发明提供了衍生于天然凝集素序列的重组凝集素变体，显示出改变型性质；优选的是，其还显示出对某些仅在癌细胞上发现的某些糖链的特异性和/或与天然蛋白质相比增强的可溶性和/或稳定性。这些重组凝集素系通过对天然凝集素进行有意修饰获得。在本发明的一个实施例中，一个包含但不限于真菌和植物的组衍生出了天然凝集素。通常，天然凝集素衍生于土传植物病原真菌。在本发明的一个示例性实施例中，植物病原真菌为S.rolfsii。优选的是，衍生于天然凝集素氨基酸序列的重组凝集素对Tn抗原和/或TF抗原具有特异性，因此可与人结肠癌、卵巢癌和白血病细胞结合。
总体而言，本发明所涉及的修饰凝集素蛋白含选自SEQ ID NO.1序列的或与该序列具有至少60％同源性的氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中修饰凝集素蛋白包含SEQ IDNO.1序列中或与该序列具有至少60％同源性的氨基酸序列中的至少一个氨基酸修饰。SEQID NO.1序列对应于天然齐整小核菌凝集素序列(如WO2010/095143之报告)。氨基酸修饰选自以下一个或多个修饰：SEQ ID NO.1序列中或与该序列具有至少60％同源性的序列中碳水化合物结合位点的氨基酸修饰；SEQ ID NO.1序列中或与该序列具有至少60％同源性的序列中N端的氨基酸修饰；可降低修饰凝集素蛋白的二聚体形成水平的氨基酸修饰；和/或可降低氧化水平的氨基酸修饰。
优选的是，修饰凝集素蛋白不含SEQ ID NO.2(如WO 2010/095143中报告的Rec-2重组变体)、SEQ ID NO.3(如WO 2010/095143中报告的Rec-3重组变体)或SEQ ID NO.4(如WO 2014/203261之报告)序列中任何一个序列的氨基酸序列。SEQ ID NOS.2～4序列为与SEQ ID NO.1序列具有至少60％同源性的氨基酸序列示例。具体而言，根据EMBOSS Needle测定之结果，SEQ ID NOS.2、3、4序列分别与SEQ ID NO.1序列具有97.9％、96.5％和91.5％的同源性。
碳水化合物结合位点
在本发明的第一个实施例中，碳水化合物结合位点是初级碳水化合物结合位点，其包含SEQ ID NO.1序列号中的第27、28、47、48、70、71、72和105号氨基酸位(根据Leonidas等人2007年之报告)或与SEQ ID NO.1序列具有至少60％同源性的序列中的相应位置。初级碳水化合物结合位点对在癌细胞表面表达的TF抗原(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)具有特异性。在第一个实施例中，修饰凝集素蛋白在初级结合位点的一个或多个位置含有氨基酸替换。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白在下述一个或多个位置含有氨基酸替换：27和/或28；47和/或48；70、71和/或72；和/或105。
在本发明的第二个实施例中，碳水化合物结合位点是次级碳水化合物结合位点，其包含SEQ ID NO.1序列号中的第77、78、80、101、112和114号氨基酸位(根据Leonidas等人2007年之报告)或与SEQ ID NO.1序列具有至少60％同源性的序列中的相应位置。次级碳水化合物结合位点对Tn抗原(GalNAc-α-)具有特异性。在第二个实施例中，修饰凝集素蛋白在次级结合位点的一个或多个位置含有一个氨基酸替换。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白在下述一个或多个位置含有氨基酸替换：77、78和/或80；101；和/或112和/或114。
优选的是，第一和/或第二个实施例中的氨基酸替换属于保守或有利氨基酸替换。保守氨基酸替换系指替换氨基酸(即替换原始氨基酸的氨基酸)具有与原始氨基酸相似的生化特性。在一个实施例中，极性氨基酸被不同的极性氨基酸替换；非极性氨基酸被不同的非极性氨基酸替换；酸性氨基酸被不同的酸性氨基酸替换；或，碱性氨基酸被不同的碱性氨基酸替换。它也指基于凝集素蛋白的成对或一次多序列比对，在最大天然凝集素蛋白的相应位置发生的氨基酸替换。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白包含有利氨基酸替换，从而使修饰凝集素蛋白保持了修饰凝集素蛋白的生物功能和/或其他性质。在一个优选的实施例中，修饰凝集素蛋白含有有利氨基酸替换，从而使修饰凝集素蛋白保持了细胞毒性作用和/或可溶性。在一个实施例中，基于天然凝集素蛋白、优选真菌凝集素蛋白的一次成对或一次多序列比对，为有利氨基酸替换选择了氨基酸残基。有利替换是在少数天然凝集素蛋白的相应位置发生的氨基酸替换。不希望受到理论的束缚，据认为，选择存在于一个同源序列中一个相应位置的氨基酸残基并将其包含在修饰凝集素蛋白中更有可能保持修饰凝集素蛋白的生物功能和/或其他性质(例如细胞毒性作用和/或可溶性)。
在一个替代实施例中，第一和/或第二个实施例中的氨基酸替换属于非保守或不利氨基酸替换。非保守或不利氨基酸替换系指替换氨基酸(即替换原始氨基酸的氨基酸)具有不同于原始氨基酸的生化特性。例如，极性氨基酸被非极性氨基酸替换，反之亦然。非保守或不利氨基酸替换也可指当进行成对或多序列比对时，用不存在于其它天然凝集素蛋白相应位置的氨基酸进行的替换。在一个实施例中，相对于对照组，非保守或不利氨基酸替换改变了修饰凝集素蛋白的细胞毒性作用和/或可溶性。在一个实施例中，改变型细胞毒性作用和/或可溶性由相对于SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白确定，而在另一个实施例中，细胞毒性作用和/或可溶性由相对于SEQ ID NO.2序列的凝集素蛋白确定。
在一个实施例中，初级碳水化合物结合位点中的替换氨基酸选自以下一个或多个氨基酸：
a.在第27位：保守、有利或不利氨基酸，其中保守氨基酸为非极性或酸性氨基酸；有利氨基酸为极性或碱性氨基酸，而不利氨基酸为非极性氨基酸；
b.在第28位：保守、有利、中性或不利氨基酸，其中保守氨基酸为非极性氨基酸；有利氨基酸为极性氨基酸、中性氨基酸为酸性或碱性氨基酸，而不利氨基酸为极性氨基酸；
c.在第47位：不利氨基酸，其为碱性的或非极性氨基酸；
d.在第48位：不利氨基酸，其为非极性氨基酸；
e.在第70位：不利氨基酸，其为非极性氨基酸；
f.在第71位：不利氨基酸，其为非极性氨基酸；
g.在第72位：不利氨基酸，其为非极性氨基酸；和/或
h.在第105位：保守、有利、中性或不利氨基酸，其中保守氨基酸为碱性或非极性氨基酸；有利氨基酸为极性氨基酸、中性氨基酸为酸性、碱性或极性氨基酸，和/或不利氨基酸为极性、非极性或酸性氨基酸。
具体而言，初级碳水化合物结合位点中的替换氨基酸选自以下一个或多个氨基酸：
a.位于第27位的甘氨酸(Y27G)、色氨酸(Y27W)、苯丙氨酸(Y27F)、谷氨酸(Y27E)或组氨酸(Y27H)；和/或位于28位的甘氨酸(A28G)、色氨酸(A28W)、丝氨酸(A28S)、天冬氨酸(A28D)或组氨酸(A28H)；
b.位于第47位的亮氨酸(S47L)；和/或位于48位的色氨酸(G48W)；
c.位于第70位的异亮氨酸(H70I)；位于71位的色氨酸(N71W)；和/或位于72位的甘氨酸(Y72G)；和
d.位于第105位的苯丙氨酸(R105F)、谷氨酰胺(R105Q)、谷氨酸(R105E)、亮氨酸(R105L)、赖氨酸(R105K)、丙氨酸(R105A)、丝氨酸(R105S)、缬氨酸(R105V)、异亮氨酸(R105I)、脯氨酸(R105P)、蛋氨酸(R105M)、甘氨酸(R105G)、苏氨酸(R105T)、酪氨酸(R105Y)、色氨酸(R105W)、天冬酰胺(R105N)、半胱氨酸(R105C)、天冬氨酸(R105D)或组氨酸(R105H)。
在一个实施例中，次级碳水化合物结合位点中的替换氨基酸选自以下一个或多个氨基酸：
a.在第77位：一个不利、非极性氨基酸；
b.在第78位：一个不利、非极性氨基酸；
c.在第80位：一个不利、非极性氨基酸；
d.在第101位：一个有利、一个不利或一个中性氨基酸，其中有利氨基酸为极性或碱性氨基酸、不利氨基酸为非极性氨基酸、中性氨基酸为非极性的或酸性氨基酸；
e.在第112位：一个不利、非极性氨基酸；
f.在第114位：一个不利、极性氨基酸；
具体而言，次级碳水化合物结合位点中的替换氨基酸选自以下一个或多个氨基酸：
a.位于第77位的苯丙氨酸(D77F)；位于78位的甘氨酸(I78G)和位于80位的色氨酸(T80W)；
b.苯丙氨酸(RlOlF)、谷氨酰胺(R101Q)、蛋氨酸(RlOlM)、谷氨酸(R101E)；和位于101位的赖氨酸(RlOlK)；
c.位于第112位的甘氨酸(Y112G)和/或位于114位的天冬酰胺(VI14N)。
优选的是，第一和/或第二个实施例中的且含有氨基酸替换的修饰凝集素蛋白具有细胞毒性作用。在一个实施例中，通过使用SRB法测定细胞毒性作用。在一个特别优选的实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性百分率比对照组的高(或二者相等)。在一个实施例中，对照组为SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白。在一个替代实施例中，对照组为不同于SEQID NO.1序列的凝集素蛋白。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性百分率与对照组相比增加了20％。在优选的实施例中，这一增加为45％。在多个替代实施例中，与对照组相比，修饰凝集素蛋白的细胞毒性百分率至少增加了10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或100％。优选的是，第一和/或第二个实施例中的且含有氨基酸替换的修饰凝集素蛋白具有可溶性或部分可溶性。
N端修饰
在本发明的第三个实施例中，修饰凝集素蛋白包含位于SEQ ID No.1序列的1和/或2位的或位于与该序列具有至少60％同源性的序列相应位置的氨基酸替换。优选的是，位于1位的替换氨基酸(即替换原始氨基酸的氨基酸)并非缬氨酸或苏氨酸二者之一。具体而言，优选的是，位于1位的替换氨基酸具有一个小侧链。替换氨基酸最好选取以下氨基酸之一：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。在一个进一步的实施例中，位于2位的替换氨基酸为色氨酸。在一个替代实施例中，位于2位的替换氨基酸为一个不同的非极性氨基酸。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白在SEQ ID NO.1序列的1位和2位或在一个与该序列具有至少60％同源性的序列的相应位置含有如上定义的氨基酸替换。在一个优选的实施例中，位于1位和2位的替换氨基酸分别为丙氨酸和色氨酸。
优选的是，与对照组相比，第三个实施例中的修饰凝集素蛋白的氨基酸序列增加了N端(引发剂)甲硫氨酸的切割。在一个实施例中，对照组为SEQ ID NO.1序列的氨基酸序列，而在另一个实施例中，对照组为SEQ ID NO.2序列序列的氨基酸序列。在一个实施例中，引发剂甲硫氨酸的切割由甲硫氨酸胺肽酶(MAP)催化。引发剂甲硫氨酸切割的程度通过使用本领域技术人员已知的一种方法测定；最好是使用质谱法或高效液相色谱法(HPLC)。不希望受到理论的束缚，据认为，引发剂甲硫氨酸被甲硫氨酸胺肽酶切割的程度受引发剂甲硫氨酸之后的第一和/或第二位氨基酸残基的影响(例如，SEQ ID NO.1序列的1位和/或2位)。具体而言，据认为，在引发剂甲硫氨酸之后的第一位置处，包含具有小侧链的氨基酸残基的氨基酸序列增加了引发剂甲硫氨酸切割的程度(如上所述)。
此外，优选的是，第三个实施例中的修饰凝集素蛋白具有可溶性和/或细胞毒性作用。更为优选的是，修饰凝集素蛋白具有可溶性和细胞毒性作用。在一个实施例中，通过使用SRB法测定细胞毒性作用。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白表现出的细胞毒性百分率是对照组的细胞毒性百分率的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另一个实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性百分率小于对照组的10％，或者没有细胞毒性。在一个进一步的实施例中，细胞毒性百分率是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白的至少60％、70％、80％或90％。
在第三个实施例的变体中，N端的氨基酸替换位于不同于SEQ ID NO.1序列1位和/或2位的位置，或位于与该序列具有至少60％同源性的序列中的相应位置。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白在氨基酸序列的前10％或5％(除1位和/或2位外)含有氨基酸替换。
二聚体形成降低
根据报告，在酸性条件下，天然齐整小核菌蛋白以单体形式存在，而在中性或碱性pH值条件下形成二聚体(Leonidas等人，2007年)。
不希望受到理论的束缚，据认为，位于SEQ ID NO.1序列76位的半胱氨酸残基可通过二硫键的形成介导二聚体形成。在某些实施例中，优选的是，使二聚体形成降低，从而使仅存在一个形式的蛋白质(即单体形式)。
因此，在本发明的第四个实施例中，修饰凝集素蛋白包含位于SEQ ID No.1序列76位的或位于与该序列具有至少60％同源性的序列相应位置的氨基酸替换，使得该位置的氨基酸残基不再是半胱氨酸。在一个优选的实施例中，位于76位的替换氨基酸(即替换原始氨基酸的氨基酸)为甘氨酸。在一个替代实施例中，位于76位的替换氨基酸为不同的非极性氨基酸残基。在一个实施例中，根据列Leonidas等人2007年研究报告的图6，替换氨基酸基于真菌凝集素蛋白的序列比对选取。因此，在一个实施例中，非极性替换氨基酸选取缬氨酸或亮氨酸二者之一。
与SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白相比，第四个实施例中含有氨基酸替换的修饰凝集素蛋白表现出二聚体形成降低。在一个实施例中，通过使用质谱法测定二聚体形成水平。在一个替代实施例中，通过使用尺寸排阻色谱法或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定二聚体形成水平。优选的是，第四个实施例中的修饰凝集素蛋白具有可溶性和/或细胞毒性作用。更为优选的是，修饰凝集素蛋白具有可溶性和细胞毒性作用。在一个实施例中，通过使用SRB法测定细胞毒性作用。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白表现出的细胞毒性百分率是对照组的细胞毒性百分率的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另一个实施例中，修饰凝集素蛋白的细胞毒性百分率小于对照组的10％，或者没有细胞毒性。在一个进一步的实施例中，细胞毒性百分率是对照组的至少60％、80％或90％。在一个实施例中，对照组是SEQ ID NO.1序列的凝集素蛋白，而在另一个实施例中，对照组是SEQID NO.2序列的凝集素蛋白。
在第四个实施例的变体中，使二聚体形成降低的氨基酸替换位于除76位以外的一个位置。例如，不希望受到理论的束缚，在一个实施例中，除二硫键以外的替代键有助于二聚体形成，并使用替代氨基酸替换来破坏这些键的形成，从而使二聚体形成降低。
减少氧化
在本发明的第五个实施例中，修饰凝集素蛋白在SEQ ID NO.1的89位处或与其具有至少60％同源性的氨基酸序列的对应位置处包含氨基酸替换。在另一实施例中，修饰凝集素蛋白在SEQ ID NO.1的44位和/或89位处或与其具有至少60％同源性的氨基酸序列的对应位置处包含氨基酸替换。在优选实施例中，89处的替换氨基酸(即替换原始氨基酸的氨基酸)为缬氨酸。在替代实施例中，89位处的替换氨基酸是不同的非极性氨基酸残基。在一个实施例中，替换氨基酸是基于Leonidas等人2007年的图6中所报告的真菌凝集素蛋白的序列比对来选择的。因此，在一个实施例中，非极性氨基酸残基选自亮氨酸或异亮氨酸之一。在另一实施例中，修饰凝集素蛋白在44位处包含如上文针对89位所定义的氨基酸替换。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白在上文定义的44位和89位处包含氨基酸替换。
在不希望受到理论约束的情况下，认为SEQ ID NO.1的44位和/或89位处的甲硫氨酸残基易被氧化，从而导致在这些位置处形成甲硫氨酸亚砜。甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜有可能损害凝集素的生物活性。因此，在某些实施例中，优选减少凝集素蛋白的氧化。因此，与SEQ ID NO.1的凝集素蛋白相比，包含如第五实施例所定义的氨基酸替换的修饰凝集素蛋白表现出减少的氧化。在一个实施例中，使用质谱分析法测定氧化水平。在替代实施例中，使用反相高效液相色谱法测定氧化水平。此外，优选根据第五实施例的修饰凝集素蛋白是可溶的和/或具有细胞毒性作用。此外，修饰凝集素蛋白最好是可溶的并且具有细胞毒性作用。在一个实施例中，使用SRB法来测定细胞毒性作用。在一个实施例中，修饰凝集素蛋白表现出至少为对照的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞毒性百分比。在另一实施例中，修饰凝集素蛋白具有小于对照的10％的细胞毒性百分比，或不具有细胞毒性。在其他实施例中，其细胞毒性百分比至少为对照的60％、70％或90％。在一个实施例中，对照是SEQ ID NO.1的凝集素蛋白，在另一实施例中，对照是SEQ ID NO.2的凝集素蛋白。
在第五个实施例的变体中，减少氧化的氨基酸替换位于44位和/或89位以外的位置。例如，在不希望受到理论约束的情况下，在一个实施例中，诸如半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸氨基酸残基等替代氨基酸残基有助于凝集素蛋白的氧化。因此，采用替代的氨基酸替换来限制这些位点的氧化，从而减少蛋白质的整体氧化。
另一些实施例
在上述第一至第五个实施例中，氨基酸修饰属于氨基酸替换。然而，在第一至第五个实施例中任一实施例的变体中，氨基酸修饰就属于修饰，而非氨基酸替换。在一个变体实施例中，氨基酸修饰是在氨基酸序列中的特定位置添加或删除氨基酸。在一个实施例中，氨基酸的添加是指在氨基酸序列中的特定位置添加至少1、2、3、4或5个氨基酸。
在上述第一至第五个实施例中，优选修饰凝集素蛋白具有细胞毒性作用。在与第一至第五个实施例中的任一实施例相关的进一步实施例中，修饰凝集素具有进一步的生物功能(除了具有细胞毒性作用之外)。在一个实施例中，生物功能涉及修饰凝集素蛋白对抗原的特异性。
在上述第一至第五个实施例中，修饰凝集素蛋白可包含与SEQ ID NO.1具有至少60％同源性的氨基酸序列中的氨基酸修饰。在与第一至第五个实施例中的任一实施例相关的进一步实施例中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％或85％的同源性。尤其优选该氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
应理解，修饰凝集素蛋白可包含上述关于第一至第五个实施例的氨基酸修饰中的任意一种的组合或多个。
在本发明的另一实施例中，提供了一种药物组合物，其包含如上所述的修饰凝集素蛋白。此外，该药物组合物包含药学上可接受的稀释剂或赋形剂。示例性稀释剂和赋形剂包括无菌水、生理盐水和磷酸盐缓冲液。在一些实施例中，药物组合物还包含进一步的治疗成分。
药物组合物的附加组分的进一步细节可在美国宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司出版的《雷明顿的制药科学》和《美国药典》(1984年)中找到。
在使用中，向需要治疗的患者施用如上所述的修饰凝集素蛋白(以下简称“药物”)。在一个实施例中，药物的适宜剂量为0.1至1mg/kg。在一个实施例中，患者患有癌症。在一个实施例中，癌症选自卵巢癌、白血病和/或结肠癌中的一种。原则上，可以使用药物的任何给药方式。在一个实施例中，通过以下模式之一施用药物：注射、喷雾或吸入。
在一个实施例中，如上所述的修饰凝集素蛋白用于检测癌细胞。
在一个实施例中，如上所述的修饰凝集素蛋白用于诊断方法中；最好用于癌症诊断方法中。
在另一实施例中，本发明涉及一种上述修饰凝集素蛋白编码核苷酸序列的核酸分子。在一个实施例中，核酸分子包括核苷酸序列中的任何变化，包括但不限于替换、删除和/或添加。
应了解，由于遗传密码的简并性，编码特定修饰凝集素变体的核酸分子可具有一系列核苷酸序列。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码氨基酸丙氨酸。
核酸分子可以是DNA或RNA或其衍生物。
在一个实施例中，本发明涉及包含载体的重组DNA分子。优选载体是质粒或病毒载体。在一个实施例中，提供了一种重组载体，其包含核酸分子的插入物，所述核酸分子包含编码如上所述的修饰凝集素的核苷酸序列。在另一实施例中，重组载体是表达载体，并且包括在5'到3'方向上可操作连接的：在宿主细胞中起作用的启动子；编码如上所述的修饰凝集素蛋白的结构核酸序列；以及终止信号。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种生产重组齐整小核菌凝集素蛋白的工艺；特别是，如上所述的修饰凝集素蛋白。在一个实施例中，克隆的核苷酸序列编码修饰凝集素蛋白，其接近天然凝集素氨基酸序列，但提供替代性质。或者，编码修饰凝集素变体的核苷酸序列可使用化学或重组手段合成并在合适的宿主中表达以获得重组蛋白。适宜的宿主细胞包括原核细胞和低等真核细胞以及高等真核细胞。可以使用本领域已知的方法将重组分子引入宿主细胞。在本发明的示例性实施例中，适宜的宿主是微生物细胞。在优选实施例中，微生物细胞选自包括但不限于酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系的组。
上述重组蛋白可作为表达产物从重组宿主中分离获得。在一个实施例中，本发明的重组蛋白通过常规技术纯化，通常是常规色谱方法。在本发明的另一示例性实施例中，通过SDS-PAGE测定的重组凝集素的分子质量约为16000道尔顿。在本发明的又一示例性实施例中，重组凝集素可具有血型特异性，通常是对人类血型的特异性。在本发明的又一示例性实施例中，重组蛋白可具有识别TF抗原及其隐蔽形式的独特能力。
因此，虽然已经参照说明性实施例描述了本发明，但该描述并非意在以限制性的方式进行解释。所属领域的技术人员在参考所述描述之后将明白说明性实施例以及本发明的其它实施例的各种修改。因此，预期本发明将涵盖落入本发明真正范围内的任何修改或实施例。
示例
示例1：定点突变
天然齐整小核菌凝集素序列(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列通过定点突变在下文表1中所述的不同特定位置进行修饰。从大肠杆菌BL21DE3细胞中提取质粒，该质粒编码克隆在pET20b载体中的天然SRL序列的氨基酸序列，并将其用作模板。将PCR反应设置为50μl，包括10μl的5X Q5反应缓冲液、1μl的10mM dNTPs、2.5μl的10μM正向引物、2.5μl的10μM反向引物、0.5μl的Q5高保真DNA聚合酶和20ng的模板，总体积用蒸馏水补足至50μl。
利用PCR扩增目的基因，在98℃下进行30秒的预变性步骤，然后进行35个扩增循环，包括在98℃下进行30秒的变性步骤、在55℃下进行30秒的退火步骤和在72℃下进行30秒的延伸步骤。最后，在72℃下进行5分钟额外的延伸步骤。所有PCR反应均用MastercyclerPro进行。在含有溴化乙锭(EtBr)的1.2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
表1：用于构建衍生自天然SRL序列的不同凝集素变体的引物列表a.用于引发剂甲硫氨酸高效切割的克隆变体
Figure BDA0002945202620000281
b.克隆变体以改变主要碳水化合物结合位点
Figure BDA0002945202620000282
c.克隆变体以改变次要碳水化合物结合位点
Figure BDA0002945202620000283
d.用于防止二聚体形成和蛋白质氧化的克隆变体
Figure BDA0002945202620000284
Figure BDA0002945202620000291
示例2：限制消化
PCR产物(从示例1获得)或质粒用NdeI和BamHI限制性内切酶消化，使用500ng的PCR产物/质粒、1μl的10x CutSmart缓冲液、1-2单位的NdeI和1-2单位的BamHI，最终体积为10μl。将反应物在37℃下培养45分钟至1小时，并在含有溴化乙锭(EtBr)的1.2％琼脂糖凝胶上观察消化结果。
然后从琼脂糖凝胶中提取并纯化DNA。
示例3：通过菌落PCR进行pET载体连接和转化体的确认
使用由100ng DNA样品(来自示例2的限制性酶消化产物)、50ng消化的pET载体、1μl 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μl T4 DNA连接酶组成的混合物进行与pET载体的连接反应，最终体积为10μl。该反应在22℃下进行1小时。
通过热休克法将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。然后将细胞接种到LA/卡那霉素平板上并在37℃过夜培养。然后在以下PCR条件下用pET正向和反向引物对转化体进行PCR以检查插入片段的完整性。PCR程序包括在95℃下进行10分钟的初始热变性步骤，然后进行35个扩增循环，包括在95℃下进行30秒的热变性步骤，在55℃下进行30秒的引物退火和在72℃下保持45秒的引物延伸步骤。最后，在72℃下进行10分钟额外的引物延伸步骤。PCR反应包括菌落(DNA模板)、10pM的pET正向引物、10μM的pET反向引物、5μl的EconoTaq PLUS GREEN 2X Master Mix(Lucigen)和蒸馏水，最终体积为10μl。在含有EtBr的1.2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
示例4：质粒DNA提取及表达分析
将阳性转化子接种于LB/卡那霉素液体培养基中，然后从大肠杆菌中提取质粒DNA。通过测序证实了在这项工作中制备的所有构建体以及pET载体中的插入片段。
将含有编码凝集素变体的每个修饰核苷酸序列的pET27b载体转化到大肠杆菌BL21DE3GOLD细胞中。通过在自诱导培养基中的表达分析选择阳性克隆。通过SDS-PAGE分析确认重组凝集素表达水平和大小。制备阳性克隆的甘油原液并保持在-80℃。
将甘油原液(40μl)接种到50mL LB液体培养基(含有20μg/ml卡那霉素)中，并在37℃，140rpm下培养16小时。将1％培养物接种到200ml生产培养基中，该培养基包含1％酵母提取物(w/v)、1.2％葡萄糖(w/v)、0.3％KH2PO4(w/v)、1.25％K2HPO4(w/v)、0.5％(NH4)2SO4(w/v)、0.05％NaCl(w/v)、0.1％MgSO4.7H2O(w/v)和0.1％(v/v)微量金属溶液。加入最终浓度为20μg/ml的卡那霉素。在37℃和140转/分钟下培养。当培养物的OD600达到1.5时，温度降至18℃，并进一步培养培养物1小时。然后用0.25mM IPTG诱导培养物，并进一步在18℃培养20小时。通过SDS-PAGE分析，对诱导前和诱导后的培养样本进行了蛋白表达和溶解度分析。将培养液在15℃以9000rpm的转速离心分离15分钟。将获得的沉淀重悬于切割缓冲液(25mM tris,1mM EDTA,pH 8.0)中。通过在18000psi(124100kPa)的高压均化切割细胞。使用用切割缓冲液预平衡的0.1微米中空纤维澄清切割物。
将澄清的蛋白质溶液进行离子交换色谱以纯化重组凝集素。
示例5：生物测定-纯化的凝集素对卵巢癌细胞系(PA-1)的抗增殖活性
使用磺酰罗丹明B(SRB)分析法测定重组、纯化凝集素变体的抗增殖活性。凝集素蛋白被认为通过结合TF/TN抗原对PA-1卵巢癌细胞系发挥细胞毒性作用；因此，该分析可以提供关于凝集素蛋白特异性的信息。抗增殖活性进一步表明凝集素蛋白的稳定性，因为认为蛋白的构象保持活性。该分析通过用SRB染色细胞蛋白来测量总生物量。SRB是一种亮粉红色的氨基呫吨染料，在弱酸性条件下可与三氯乙酸固定细胞蛋白质的碱性氨基酸残基形成静电复合物。它可以在温和的碱性条件下解离，并且可以溶解用于测量。它已被广泛用于针对不同类型的癌细胞系和非癌细胞系的药物毒性筛选。简单洗涤细胞，固定，并用染料染色。然后用Tris基液将掺入的染料从细胞中释放出来。从染色细胞释放的掺入染料与细胞生物量成正比，并且可以测量以指示由测试材料引起的细胞毒性程度。
当细胞处于生长的对数期时，监测/测量细胞的细胞毒性。在最终体积为200pl的培养基中进行检测，包括一份200μl无细胞培养基对照样本，用作对照吸光度读数。在无血清培养基中进行测试稀释以降低本底，并制备比所需浓度高10倍的稀释度。
在第一天，通过初始胰蛋白酶消化步骤接种细胞，在Neuebauer室中通过台盼蓝法计数，并以5000个细胞/孔的密度铺在平底96孔板(暗壁板)的孔中。在第二天，在过夜培养后，板中的培养基补充180μL/孔，然后用20μL每种测试物品以2.5至80μg/ml的浓度处理细胞，使得总体积为每孔200μL。孔板从第二天到第四天进行培养。然后在第五天用SRB处理细胞。然后在无菌条件下用显微镜下观察孔板。
将50μl 50％三氯乙酸(TCA)溶液(冷)轻轻铺在生长培养基上，固定细胞。在固定步骤后不得移动孔板，以避免细胞移位而导致不准确。然后将这些平板在4℃培养1小时，然后用纯净水洗涤4次以除去过量的固定剂和血清蛋白。将孔板风干。其中一些孔板在室温下储存备用。然后通过加入0.4％(50μl)SRB染料溶液将板用SRB染料染色以覆盖孔的培养表面，然后在28℃培养30分钟。
然后通过倾析除去污渍，用洗涤溶液(1％乙酸)冲洗。在5个洗涤循环中洗涤板直至除去未掺入的染料。将孔板进一步风干直至看不到水分。
为进行溶解，向孔中加入200μl的SRB溶解缓冲液(10mm Tris)，即等于孔的原始体积，然后在28℃下培养5分钟。然后轻轻搅拌孔板5至10分钟以溶解染料，并在580nm处测量吸光度。
示例6：天然rolfsii凝集素序列的氨基酸修饰
对天然凝集素序列进行了修饰，以改变理化性质，如下所述。
a)提高引发剂甲硫氨酸的切割效率：
重组蛋白在大肠杆菌中的高表达率限制了甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)酶对N端甲硫氨酸(引发剂甲硫氨酸)的切割，从而产生含有Met-凝集素和无Met-凝集素的蛋白质的混合物。影响引发剂甲硫氨酸切割的一个重要因素是甲硫氨酸残基后的氨基酸。MAP切割第二个位置的残基(即引发剂甲硫氨酸后的第一个氨基酸残基)上具有小侧链的所有蛋白质。引发剂甲硫氨酸后具有缬氨酸或苏氨酸残基的蛋白质被MAP切割的效率远低于在该位置具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸的蛋白质。构建克隆以用4种不同的氨基酸替换天然凝集素序列N端的第一(苏氨酸)和第二(酪氨酸)氨基酸(表2)以检查对引发剂甲硫氨酸切割、溶解度、特异性和生物活性的影响。凝集素变体的溶解度，特异性和生物活性不受进行改变的影响。
从天然凝集素序列的所有五个变体中纯化重组凝集素，所述天然凝集素序列设计用于摇瓶有效甲硫氨酸切割。天然凝集素序列的所有变体，其中第1位的苏氨酸被丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸和脯氨酸替换，与对照相比，显示出可溶且相似的表达。所有变体的生物学活性也与对照相似。因此观察到，与对照相比，改变凝集素序列的第一和/或第二氨基酸不影响表达或生物活性。
b)防止二聚体形成和蛋白质氧化：
存在于S.rolfsiilccUn单体中的半胱氨酸残基被认为有助于通过二硫键形成二聚体，因此可能影响凝集素的特异性和生物活性。S.rolfsii凝集素中的甲硫氨酸残基被认为在纯化过程中易于氧化。通过氨基酸替换替换了76位和89位处的半胱氨酸和甲硫氨酸残基，以分别防止二聚体形成和蛋白质氧化。与对照相比，天然凝集素序列的ULLB-0005/015变体(其中76位的半胱氨酸被甘氨酸替换以防止二聚体形成)以可溶形式表达重组凝集素而不影响生物活性。类似地，与对照相比，天然凝集素序列的ULLB-0005/016变体(其中第89位的甲硫氨酸被缬氨酸替换以防止蛋白质氧化)以可溶形式表达而不影响生物活性。因此，分别用甘氨酸和缬氨酸改变76和89位的半胱氨酸和甲硫氨酸不影响凝集素的表达、溶解度、特异性和生物活性。
表2设计用于引发剂甲硫氨酸有效切割，防止二聚体形成和蛋白质氧化的克隆汇总
i.引发剂甲硫氨酸高效切割的变化
Figure BDA0002945202620000321
ii.为防止二聚体形成和蛋白质氧化所做的改变
Figure BDA0002945202620000322
Figure BDA0002945202620000331
还对天然凝集素序列进行了修饰，以改变生物活性，如下所述。
c)主要碳水化合物结合位点修饰：
主要碳水化合物结合位点显示对癌细胞中表达的TF抗原(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)的特异性。改变主要碳水化合物结合位点中的氨基酸，并研究修饰的凝集素蛋白质的蛋白质溶解度、特异性和生物活性。关于对特异性和生物活性的影响，评估了修饰的凝集素蛋白对卵巢癌细胞系(PA-1)的细胞毒性。主要碳水化合物结合位点进行的氨基酸修饰见表3。天然凝集素序列的ULLB-0005/008(Y27G和A28W)和ULLB-0005/011(R105F)变体以可溶形式表达重组凝集素，但是，生物活性丧失。而ULLB-0005/010(H70I，N71W和Y72G)变体表达为部分可溶，并且该变体的细胞毒性比变体ULLB-0005/009(S47L和G48W)中的重组凝集素更高，表达为包涵体。因此，改变主要碳水化合物结合位点会影响凝集素的溶解度和生物活性。本示例中的数据表明，第27、28、47、48、70、71、72和105位的氨基酸残基定义了主要的碳水化合物结合位点。结论是主要的碳水化合物结合位点与癌细胞表面存在的TF抗原结合有关。
表3设计用于改变主要碳水化合物结合位点的克隆汇总
Figure BDA0002945202620000332
Figure BDA0002945202620000341
d)次要碳水化合物结合位点修饰：
参与与GalNAc-α-(Tn抗原)结合的次要碳水化合物结合位点被修饰。改变次要碳水化合物结合位点中的氨基酸，并研究修饰的凝集素蛋白质的蛋白质溶解度、特异性和生物活性。评估了对卵巢癌细胞系(PA-1)的特异性和生物活性的影响。在次要碳水化合物结合位点进行的氨基酸修饰如表4所示，并影响重组凝集素的溶解度、特异性和/或生物活性。
二级结合位点选自77、78、80、101、112或114，经修饰分别由D、I、T、R、Y和V替换为F、G、W、F、G和N，由天然凝集素序列制备出多种新变体。设计用于改变次要碳水化合物结合位点的变体ULLB-0005/012(D77F、I78G和T80W)和ULLB-0005/014(Y112G和V114N)分别以包涵体和部分可溶的形式表达重组凝集素。在ULLB-0005/012变体中进行的不利氨基酸替换可能有助于该蛋白的不溶性表达。变体ULB-0005/013显示出针对PA-1细胞系的抗增殖活性丧失，而变体ULLB-0005/014显示出与针对PA-1细胞系的对照克隆相似的抗增殖活性。本示例中的数据表明，第77、78、80、101、112和114位的氨基酸残基定义了次要的碳水化合物结合位点。结论是修饰碳水化合物的二级结合位点会影响凝集素的溶解性和生物活性。
表4设计用于改变次要碳水化合物结合位点的克隆汇总
Figure BDA0002945202620000342
示例7：新的定位突变
与示例1类似，变体凝集素序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列通过定点诱变在不同的特定位置进行修饰，如下表5中所述。
表5：用于构建衍生自变体凝集素序列SEQ ID NO.2的不同凝集素变体的引物列表。
a.克隆变体以改变主要碳水化合物结合位点
Figure BDA0002945202620000361
Figure BDA0002945202620000371
b.克隆变体以改变次要碳水化合物结合位点
Figure BDA0002945202620000372
示例8：变体凝集素序列SEQ ID NO:2的氨基酸修饰。
对天然凝集素序列进行了修饰，以改变理化性质，如下所述。
a.主要碳水化合物结合位点修饰：
主要碳水化合物结合位点显示对癌细胞中表达的TF抗原(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)的特异性。改变主要碳水化合物结合位点中的氨基酸，并研究修饰的凝集素蛋白质的蛋白质溶解度、特异性和生物活性。关于对特异性和生物活性的影响，评估了修饰的凝集素蛋白对卵巢癌细胞系(PA-1)的细胞毒性。主要碳水化合物结合位点进行的氨基酸修饰见表6。天然凝集素序列的变体，ULLB-0005/028(Y27E)、ULLB-0005/032(A28D)、ULLB-0005/018(R105Q)、ULLB-0005/035(R105S)、ULLB-0005/043(R105W))和ULLB-0005/045(R105C)，其以可溶形式表达重组凝集素；然而，生物活性丧失。变体ULLB-0005/021(R105K)ULLB-0005/047(R105H)以可溶形式表达，并且该变体的细胞毒性显着高于其他变体。这可能是由于替换氨基酸的碱性。同样，在A28处用非极性甘精胰岛素进行的保守替换(A28G-ULLB-0005/031)也以可溶性形式表达，并且该变体的细胞毒性显著高于其他变体。变体ULLB-0005/019(R105E)和ULLB-0005/046(R105D)表示为包涵体。用酸性氨基酸替换R105可能导致该蛋白的不溶表达。变体ULLB-0005/034(R105A)、ULLB-0005/037(R105I)、ULLB-0005/038(R105P)和ULLB-0005/041(R105T)以可溶形式表达，因此与对照相比不受影响。因此，改变主要碳水化合物结合位点会影响凝集素的溶解度和生物活性。该示例中的数据证明27、28和105位处的氨基酸残基限定了主要碳水化合物结合位点。结论是主要的碳水化合物结合位点与癌细胞表面存在的TL抗原结合有关。
表6设计用于改变主要碳水化合物结合位点的克隆汇总
Figure BDA0002945202620000381
Figure BDA0002945202620000391
b.次要碳水化合物结合位点修饰：
参与与GalNAc-α-(Tn抗原)结合的次要碳水化合物结合位点被修饰。改变次要碳水化合物结合位点中的氨基酸，并研究修饰的凝集素蛋白质的蛋白质溶解度、特异性和生物活性。评估了对卵巢癌细胞系(PA-1)的特异性和生物活性的影响。在次要碳水化合物结合位点进行的氨基酸修饰如表7所示，并影响重组凝集素的溶解度、特异性和/或生物活性。修饰第二结合位点101以用Q、M、E和K从R替换以从天然凝集素序列制备几种新变体。101位的有利和中性替换导致了变体ULLB-0005/022(R101Q)、ULLB-0005/023(R101M)、ULLB-0005/024(R101E)和ULLB-0005/025(R101K)的可溶性表达，并显示出与对照克隆抗PA-1细胞系相似的抗增殖活性。该示例中的数据证明101位的氨基酸残基定义了次要碳水化合物结合位点。结论是，修饰次要碳水化合物结合位点导致重组凝集素的可溶性表达，并表现出与对照相当的生物活性。
表7设计用于改变次要碳水化合物结合位点的克隆汇总
Figure BDA0002945202620000392
Figure BDA0002945202620000401
序列总汇
SEQ ID NO.1:
TYKITVRVYQTNPNAFFHPVEKTVWKYANGGTWTITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFTATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQLSNYEVKNAKGRNFEIVYTEAEGNDLHANLIIG
SEQ ID NO.2:
TYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYANGGTWTITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFTATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQLSNYQVKNAKGRNFQIVYTEAEGNDLHANLIIG
SEQ ID NO.3:
VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYANGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTFRFHADNGESFTATFGVHNYKRWCDIVTNFAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQFSNYQVKNAKGRNFQIVYTEAEGNDFHANFIIG
SEQ ID NO.4:
VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYADGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFTATFGVHDYKRWCDIVTDLAADETGMVINQEYYSEKDREEARERQNSNYEVKDAKGRNFEIVYTEAEGNDLHADLIIG
在本部分说明中，已经参考了构成该独特的、集成的发明的过程、设备和系统的多种方法，并且应当理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对所描述的实施例进行许多改变和修改。附例以举例说明的方式示出了本发明的具体示例性方法。对这些方法进行了足够详细的描述，以使本领域技术人员能够实施本发明，并且应当理解，技术人员可以对各种公开的方法进行修改。
在上述方法和步骤指示以特定顺序发生的特定事件的情况下，本领域普通技术人员将认识到，可以修改特定步骤的顺序，并且这种修改符合本发明的原理。此外，如果可能，某些步骤可以在并行过程中同时执行，也可以顺序执行。
虽然本发明的实施例揭露如上所述，然并非用以限定本发明，任何熟习相关技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，举凡依本发明权利要求所述的形状、构造、特征、方法及数量当可做些许的变更，因此本发明的专利保护范围须视本说明书所附的权利要求范围所界定者为准。
SEQUENCE LISTING
<110> UNICHEM LABORATORIES LTD
<120> RECOMBINANT PROEIN VARIANTS
<130> IN201821032765
<150> IN 201821032765
<151> 2018-08-31
<160> 136
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified Sequence
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<223> Modified Sequence
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
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65 70 75 80
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<212> DNA
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65 70 75 80
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<212> DNA
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65 70 75 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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65 70 75 80
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<212> DNA
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<223> ULLB-0005/008 Reverse Primer
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gtaccgccat tccagccttt ccacac 26
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<213> Artificial Sequence
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Glu Ile Val Tyr Thr Glu
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ccgctggtcc acagaccacc catc 24
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<213> Artificial Sequence
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85 90 95
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100 105 110
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ULLB-0005/010 Reverse Primer
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<212> PRT
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caggttccac acgccaaaac accagcgttt ataattatgc 40
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Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
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<400> 36
gtcagaaaaa ctttgaagaa gcgc 24
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/013 Reverse Primer
<400> 37
gcgcttcttc aaagtttttc tgac 24
<210> 38
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/014
<400> 38
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asn Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Asn Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Glu Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/014 Forward Primer
<400> 39
ggccagaaca aaaatgcgaa aggccgtaac 30
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/014 Reverse Primer
<400> 40
gttctggccg ttactcagct ggcgttc 27
<210> 41
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/015
<400> 41
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asn Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Gly Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Glu Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Glu Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/015 Forward Primer
<400> 42
cgctggggcg atattgtgac c 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/015 Reverse Primer
<400> 43
ggtcacaata tcgccccagc g 21
<210> 44
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/016
<400> 44
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asn Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Val Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Glu Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Glu Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/016 Forward Primer
<400> 45
gaaaccggcg tggttattaa tcag 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/016 Reverse Primer
<400> 46
ctgattaata accacgccgg tttc 24
<210> 47
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/018
<400> 47
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Gln Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/018 Forward Primer
<400> 48
gaagaagcgc aggaacgcca g 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/018 Reverse Primer
<400> 49
ctggcgttcc tgcgcttctt c 21
<210> 50
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/019
<400> 50
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Glu Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/019 Forward Primer
<400> 51
gaagaagcgg aagaacgcca g 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/019 Reverse Primer
<400> 52
ctggcgttct tccgcttctt c 21
<210> 53
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/020
<400> 53
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Leu Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/020 Forward Primer
<400> 54
gaagaagcgc tggaacgcca g 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/020 Reverse Primer
<400> 55
ctggcgttcc agcgcttctt c 21
<210> 56
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/021
<400> 56
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Lys Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/021 Forward Primer
<400> 57
gaagaagcga aagaacgcca g 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/021 Reverse Primer
<400> 58
ctggcgttct ttcgcttctt c 21
<210> 59
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/022
<400> 59
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Gln Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/022 Forward Primer
<400> 60
cagaaaaacc aggaagaagc gc 22
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/022 Reverse Primer
<400> 61
gcgcttcttc ctggtttttc tg 22
<210> 62
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/023
<400> 62
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Met Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/023 Forward Primer
<400> 63
cagaaaaaca tggaagaagc gc 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/023 Reverse Primer
<400> 64
gcgcttcttc catgtttttc tg 22
<210> 65
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/024
<400> 65
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Glu Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/024 Forward Primer
<400> 66
cagaaaaacg aagaagaagc gc 22
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/024 Reverse Primer
<400> 67
gcgcttcttc ttcgtttttc tg 22
<210> 68
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/025
<400> 68
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Lys Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/025 Forward Primer
<400> 69
cagaaaaaca aagaagaagc gc 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/025 Reverse Primer
<400> 70
gcgcttcttc tttgtttttc tg 22
<210> 71
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/026
<400> 71
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Trp Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/026 Forward Primer
<400> 72
gtgtggaaat gggcgaatgg c 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/026 Reverse Primer
<400> 73
gccattcgcc catttccaca c 21
<210> 74
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/027
<400> 74
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Phe Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/027 Forward Primer
<400> 75
gtgtggaaat ttgcgaatgg c 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/027 Reverse Primer
<400> 76
gccattcgca aatttccaca c 21
<210> 77
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/028
<400> 77
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Glu Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/028 Forward Primer
<400> 78
gtgtggaaag aagcgaatgg c 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/028 Reverse Primer
<400> 79
gccattcgct tctttccaca c 21
<210> 80
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/029
<400> 80
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys His Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/029 Forward Primer
<400> 81
gtgtggaaac atgcgaatgg c 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/029 Reverse Primer
<400> 82
gccattcgca tgtttccaca c 21
<210> 83
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/030
<400> 83
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ser Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/030 Forward Primer
<400> 84
ggaaatatag caatggcggt acc 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/030 Reverse Primer
<400> 85
ggtaccgcca ttgctatatt tcc 23
<210> 86
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/031
<400> 86
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Gly Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/031 Forward Primer
<400> 87
ggaaatatgg caatggcggt acc 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/031 Reverse Primer
<400> 88
ggtaccgcca ttgccatatt tcc 23
<210> 89
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/032
<400> 89
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Asp Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/032 Forward Primer
<400> 90
ggaaatatga taatggcggt acc 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/032 Reverse Primer
<400> 91
ggtaccgcca ttatcatatt tcc 23
<210> 92
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/033
<400> 92
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr His Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/033 Forward Primer
<400> 93
ggaaatatca taatggcggt acc 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/033 Reverse Primer
<400> 94
ggtaccgcca ttatgatatt tcc 23
<210> 95
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/034
<400> 95
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Ala Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/034 Forward Primer
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gaagaagcgg cggaacgcca g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/034 Reverse Primer
<400> 97
ctggcgttcc gccgcttctt c 21
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<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/035
<400> 98
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Ser Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/035 Forward Primer
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/035 Reverse Primer
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ctggcgttcg ctcgcttctt c 21
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<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 101
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1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Val Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/036 Forward Primer
<400> 102
gaagaagcgg tggaacgcca g 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/036 Reverse Primer
<400> 103
ctggcgttcc accgcttctt c 21
<210> 104
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/037
<400> 104
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Ile Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/037 Forward Primer
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gaagaagcga ttgaacgcca g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/037 Reverse Primer
<400> 106
ctggcgttca atcgcttctt c 21
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<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/038
<400> 107
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Pro Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/038 Forward Primer
<400> 108
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/038 Reverse Primer
<400> 109
ctggcgttcc ggcgcttctt c 21
<210> 110
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/039
<400> 110
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Met Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/039 Forward Primer
<400> 111
gaagaagcga tggaacgcca g 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/039 Reverse Primer
<400> 112
ctggcgttcc atcgcttctt c 21
<210> 113
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/040
<400> 113
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Gly Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/040 Forward Primer
<400> 114
gaagaagcgg gcgaacgcca g 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/040 Reverse Primer
<400> 115
ctggcgttcg cccgcttctt c 21
<210> 116
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/041
<400> 116
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Thr Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/041 Forward Primer
<400> 117
gaagaagcga ccgaacgcca g 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/041 Reverse Primer
<400> 118
ctggcgttcg gtcgcttctt c 21
<210> 119
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/042
<400> 119
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Tyr Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/042 Forward Primer
<400> 120
gaagaagcgt atgaacgcca g 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/042 Reverse Primer
<400> 121
ctggcgttca tacgcttctt c 21
<210> 122
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/043
<400> 122
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Trp Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/043 Forward Primer
<400> 123
gaagaagcgt gggaacgcca g 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/043 Reverse Primer
<400> 124
ctggcgttcc cacgcttctt c 21
<210> 125
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/044
<400> 125
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Asn Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/044 Forward Primer
<400> 126
gaagaagcga acgaacgcca g 21
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/044 Reverse Primer
<400> 127
ctggcgttcg ttcgcttctt c 21
<210> 128
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/045
<400> 128
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Cys Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/045 Forward Primer
<400> 129
gaagaagcgt gcgaacgcca g 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/045 Reverse Primer
<400> 130
ctggcgttcg cacgcttctt c 21
<210> 131
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/046
<400> 131
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Asp Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly
130 135 140
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/046 Forward Primer
<400> 132
gaagaagcgg atgaacgcca g 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/046 Reverse Primer
<400> 133
ctggcgttca tccgcttctt c 21
<210> 134
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/047
<400> 134
Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe
1 5 10 15
Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala His Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu
115 120 125
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130 135 140
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<223> ULLB-0005/047 Forward Primer
<400> 135
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ULLB-0005/047 Reverse Primer
<400> 136
ctggcgttca tgcgcttctt c 21

Claims (37)

1.一种修饰凝集素蛋白，其特征在于，所述修饰凝集素蛋白包含选自以下任一种序列中选择的氨基酸序列：
i)SEQ ID NO.1；或
ii)与i)具有至少60％同源性的氨基酸序列；
其中i)或ii)的氨基酸序列包含至少一种从以下(a)至(d)一项或几项中选择的一种氨基酸修饰:
a)i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰；或
b)在i)或ii)的N端至少有一种氨基酸修饰；
c)第76位至少一种氨基酸修饰；或
d)第44或89位至少一种氨基酸修饰；
其中修饰凝集素蛋白不包含SEQ ID NO.2至4中的任何序列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述修饰凝集素蛋白包含与SEQ ID NO.1具有至少70％，80％，90％，95％，97％或99％同源性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述修饰凝集素蛋白包含i)或ii)的碳水化合物结合位点至少一种氨基酸修饰。
4.根据权利要求3所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述碳水化合物结合位点是主要和/或次要碳水化合物结合位点。
5.根据权利要求4所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述主要碳水化合物结合位点包含选自SEQ ID NO.1中的27、28、47、48、70、71、72和105中的一个或多个的位置或序列中与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性的相应位置。
6.根据权利要求5所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述氨基酸修饰的位置选自以下一个或多个位置：
i)27和/或28；
ii)47和/或48；
iii)70,、71和/或72；和/或
iv)105。
7.根据权利要求4所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述次要碳水化合物结合位点包含选自SEQ ID NO.1中的77、78、80、101、112和114中的一个或多个位置或序列中与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性的相应位置。
8.根据权利要求7所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述氨基酸修饰的位置选自以下一个或多个位置：
i)77、78和/或80；
ii)101；
iii)112和/或114。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述氨基酸修饰是氨基酸替换，使得替换氨基酸替换了原始氨基酸。
10.根据权利要求6所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述主要碳水化合物结合位点中的氨基酸替换选自以下一种或多种：
i)第27位：保守的、有利的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是非极性的或酸性的；有利的是极性的或碱性的，不利的氨基酸是非极性的；
ii)第28位：保守的、有利的、中性的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是非极性的；有利的是极性的，中性的是酸性或碱性的，不利的氨基酸是极性的；
iii)第47位：不利的氨基酸，其是碱性或非极性的；
iv)第48位：不利的氨基酸，是非极性的；
v)第70位：不利的氨基酸，是非极性的；
vi)71位：不利的氨基酸，是非极性的；
vii)第72位：不利的氨基酸，是非极性的；和/或
viii)第105位：保守的、有利的、中性的或不利的氨基酸，其中保守的氨基酸是碱性或非极性的；有利的是极性的，中性的是酸性的，碱性的或极性的和/或不利的氨基酸是极性的，非极性的或酸性的。
11.根据权利要求8所述的凝集素蛋白，其特征在于，其中所述次要碳水化合物结合位点中的氨基酸替换选自以下一种或多种：
i)第77位：不利的氨基酸，是非极性的；
ii)第78位：不利的氨基酸，是非极性的；
iii)第80位：不利的氨基酸，是非极性的；
iv)第101位：有利的、不利的或中性的氨基酸，其中有利的氨基酸是极性或碱性的，不利的氨基酸是非极性的，中性的氨基酸是非极性的或酸性的；
v)第112位：不利的氨基酸，是非极性的；
vi)第114位：不利的氨基酸，是极性的。
12.根据权利要求1所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述修饰凝集素蛋白在i)或ii)的N端包含至少一个氨基酸修饰，其中N端包含选自SEQ ID NO.1中的1和/或2位或序列中与之具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％同源性的相应位置。
13.根据权利要求12所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述氨基酸修饰是1位处的氨基酸替换，并且其中替换氨基酸不是苏氨酸或缬氨酸。
14.根据权利要求13所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述替换氨基酸选自：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
15.根据权利要求12所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述氨基酸修饰是2位的氨基酸替换，并且其中替换氨基酸是色氨酸。
16.根据权利要求12所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述引发剂甲硫氨酸的切割与对照相比增加或减少。
17.根据权利要求1所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述76位处的氨基酸性是用非极性氨基酸替换的氨基酸。
18.根据权利要求17所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述非极性氨基酸选自：甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
19.根据权利要求1所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中在44或89位的氨基酸修饰是被非极性氨基酸替换的氨基酸。
20.根据权利要求19所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述非极性氨基酸选自：亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰的凝集素蛋白可溶、部分可溶或不溶和/或具有细胞毒性。
22.根据权利要求21所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰的凝集素蛋白的细胞毒性为对照至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
23.根据权利要求21所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰的凝集素蛋白具有小于对照10％的细胞毒性，或不具有细胞毒性。
24.根据权利要求21所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰的凝集素蛋白与对照相比具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞毒性增加。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰的凝集素蛋白长度等于或小于500、400、300、250、200或150个氨基酸。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1至25中任一项所述的修饰凝集素蛋白和药学上可接受的稀释剂或赋形剂以及任选的另一种治疗成分。
27.一种治疗患者癌症的方法，包括向患者施用权利要求1至25中任一项所述的修饰凝集素蛋白或权利要求26所述的药物组合物。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中根据权利要求26所述的药物组合物，用于药物。
29.根据权利要求28所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中修饰凝集素蛋白或药物组合物，用于治疗癌症。
30.根据权利要求1至26中任一项所述的修饰凝集素蛋白，其特征在于，其中所述修饰凝集素蛋白用于检测癌细胞、癌症诊断和/或癌症治疗。
31.一种核酸分子，其包含如权利要求1至26中任一项所述的修饰凝集素蛋白的核苷酸序列。
32.一种重组载体，其包含权利要求31所述的核酸分子的插入片段。
33.根据权利要求32所述的重组载体，其特征在于，其中包括在5’至3’方向可操作地连接：在宿主细胞中起作用的启动子；根据权利要求31所述的修饰凝集素蛋白的核苷酸序列；和终止信号。
34.根据权利要求32或33所述的重组载体，其特征在于，其中所述重组载体能够在单细胞生物体中复制、转录、转译和/或表达。
35.一种转化的宿主细胞，其包含根据权利要求31的核酸分子或根据权利要求32至34中任一项所述的重组载体。
36.根据权利要求35所述的转化的宿主细胞，其特征在于，其中所述宿主细胞是大肠杆菌或酵母细胞。
37.一种生产重组核盘菌凝集素蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
i)培养含有权利要求32至34中任一项所述的编码重组凝集素蛋白的重组载体的宿主细胞；
ii)表达重组凝集素蛋白；及
iii)从培养物中分离粗重组凝集素蛋白。
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