JP7453213B2 - リコンビナントタンパク質変異体 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された印国仮出願第２０１８２１０３２７６５号（この全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、改変レクチンタンパク質と、改変レクチンタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子とに関する。本発明はまた、このような核酸分子を含むリコンビナントベクターと、リコンビナントベクターを含むトランスフォーメーション宿主細胞とに関する。加えて、本発明は、改変レクチンタンパク質を含む医薬組成物と、ガン細胞の検出、ガン診断と、患者におけるガンの処置とに関する。本発明はまた、リコンビナントSclerotium rolfsiiレクチンタンパク質を生産するための方法に関する。

発明の背景
レクチンは非常に特異的な炭水化物結合タンパク質であり、他の分子の糖部分に非常に特異的な高分子である。レクチンは細胞及び分子レベルで認識を実施し、細胞、炭水化物及びタンパク質が関与する生物学的認識現象において多数の役割を果たす。それらは、糖タンパク質に結合して沈殿して赤血球を凝集させる二価又は多価炭水化物結合タンパク質である。動物に見られるレクチンは、ほとんどの場合に細胞相互作用を支援することが見出されているが、植物のレクチンは、潜在的な捕食者又は病原体を撃退することが公知である。

精製レクチンは血液型検査に使用されるので、臨床状況において重要である。個体の赤血球上の糖脂質及び糖タンパク質のいくつかは、レクチンにより同定され得る。多くのレクチンは、悪性腫瘍成長の早期検出を示すバイオマーカーとして、又はオートファジーインデューサーとして使用されるが、他のレクチンもまた、アポトーシスを通じてガン性成長を阻害する能力を示す。レギュレーションされていない細胞増殖により、炭水化物部分のいくつかは、ガン性細胞上の抗原として発現される。レクチンは悪性腫瘍に特異的に結合するので、ガン治療における薬物送達剤として使用される。さらに、レクチンはまたガン関連経路をモデュレーションするので、ガン診断剤及び治療剤としての可能性を有する。

レクチンが結合するいくつかの抗原であって、ガン細胞表面上において特性評価されているいくつかの抗原がある；抗原のほとんどは特定のタイプのガンに特異的であり、これらの抗原へのレクチン結合は、ガン性細胞におけるアポトーシスの誘導を通じてガン性成長の阻害をもたらし得る。現在、ほとんどの市販のレクチンは、植物及び他の真核生物由来のものである。

Sclerotium rolfsiiレクチン（ＳＲＬ）は、土壌伝染性植物病原性真菌S.rolfsiiの菌核体から単離されたレクチンである。ＳＲＬは、トムセン・フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原及びＴｎ抗原に対する特異性を有する。ＴＦ抗原は、様々な異なるヒトガン細胞の細胞表面上において過剰発現される二糖（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ－α－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）である。Ｔｎ抗原は単糖（ＧａｌＮＡｃ－α－）である。ＴＦ及びＴｎ抗原に対するその特異性により、ＳＲＬは、ヒト結腸ガン、卵巣ガン及び白血病細胞に結合することが示されている。ＳＲＬの結晶構造は決定されているが(Leonidas et al., J Mol Biol. 2007 May 11;368(4):1145-61)、結晶構造から同定された炭水化物結合部位の実験的検証は実施されていない。

レクチンは抗ガンツールとして多くの利点を提供するが、それらは依然として、選択性の欠如、一貫性のない品質及び性能、並びに容易にスケーラブルではない生産などの多くの制限を伴う。また、植物由来レクチンは、広範な異なるグリカン構造に結合することが報告されているので、多くの用途に必要な選択性を欠く。また、植物レクチンを使用する場合、バッチ間のばらつきが一般的である。製品の品質は、植物材料の単離方法と、出発植物材料それ自体の品質とに依存する。

そのようにして得られたレクチンは、所望の特性に関して一貫性を欠くので、天然源からのレクチンの単離は信頼性がない。天然源からのタンパク質のさらなる単離は、高価かつ困難なプロセスである。特にタンパク質が低濃度でのみ存在する場合、天然に存在するレクチンを単離するために使用される技術は、通常、非常に低い収量を提供する。また、それらは、時折、同じレクチンのアイソフォームを区別することができない。したがって、それらは混合物として得られ、このことが広範囲の不確実性を提供する。この意味において、リコンビナントＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術によるリコンビナントレクチンの生産は、より良好な一貫した収量で単一のタンパク質を提供し、劇的に少ない時間で正確な特性評価を行い、それと同時に容易にスケーラブルであるという利点を有する。ｒＤＮＡ技術を使用することにより、目的のタンパク質を産生する遺伝子を適切な宿主に移入することができる。次いで、伝統的な方法と比較して少ない時間及び労力で、タンパク質を生産及び単離し得る。

国際公開公報第２０１０／０９５１４３号は、それぞれ３又は５個のアミノ酸の置換によりネイティブＳＲＬ配列から得られたリコンビナントレクチン変異体Ｒｅｃ－２及びＲｅｃ－３を開示している。これらの変異体の結晶構造が報告されている(Peppa et al., Molecules. 2015 Jun 12;20(6):10848-65)。

国際公開公報第２０１４／２０３２６１号は、１２個のアミノ酸の置換によりネイティブＳＲＬ配列から得られたリコンビナントレクチン変異体を開示している。

代替的な特性を示すさらなるレクチン変異体が依然として必要である。特に、ガン診断剤及び治療剤において使用すべきレクチンは、悪性腫瘍／ガン細胞に対するそれらの特異的親和性を損なわずに可溶性かつ安定であることが有利である。したがって、適切な宿主細胞において十分なレベルの導入遺伝子発現を有するリコンビナントレクチンであって、悪性腫瘍細胞に対する親和性も保持しながら溶解性及び／又は安定性を有するリコンビナントレクチンを生産するための新たなリコンビナントレクチン配列及び効率的な方法が必要である。

本発明は、上記必要性の１つ以上に対処しようとする。

本発明の一態様によれば、改変レクチンタンパク質であって、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｂ）開始メチオニンの切断がｉ）のアミノ酸配列と比較して増加するｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変、
ｃ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質のダイマー形成を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質の酸化を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含む改変レクチンタンパク質が提供される。

いくつかの実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号２～４のいずれのアミノ酸配列からもならない。いくつかのさらなる実施態様では、改変レクチンタンパク質は細胞毒性効果を有する。

本発明の一態様によれば、改変レクチンタンパク質であって、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ．ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｂ．ｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変、
ｃ．位置７６における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ．位置４４若しくは８９における少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、
前記改変レクチンタンパク質が配列番号２～４のいずれのアミノ酸配列からもならない改変レクチンタンパク質が提供される。

本発明の別の態様によれば、改変レクチンタンパク質であって、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｂ）開始メチオニンの切断がｉ）のアミノ酸配列と比較して増加するｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変、
ｃ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質のダイマー形成を減少させる位置７６における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質の酸化を減少させる位置４４若しくは８９における少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、
前記改変レクチンタンパク質が配列番号２～４のいずれのアミノ酸配列からもならない改変レクチンタンパク質が提供される。

場合により、本発明の改変レクチンタンパク質は生物学的活性を有する。

一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに別の態様によれば、改変レクチンタンパク質であって、
ｉ．配列番号１；又は
ｉｉ．ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
アミノ酸置換が、
ａ．一次炭水化物結合部位におけるアミノ酸置換であって、置換アミノ酸が、
ｉ．位置２７及び／若しくは位置２８の非極性、極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸；
ｉｉ．位置４７の非極性アミノ酸及び／若しくは位置４８の極性アミノ酸；
ｉｉｉ．位置７０の非極性アミノ酸、位置７１の極性アミノ酸及び／若しくは位置７２の非極性アミノ酸；並びに／又は
ｉｖ．位置１０５の任意の他のアミノ酸
の１つ以上から選択されるアミノ酸置換
ｂ．二次炭水化物結合部位におけるアミノ酸置換であって、置換アミノ酸が、
ｉ．位置７７の非極性アミノ酸、位置７８の非極性アミノ酸及び／又は位置８０の極性アミノ酸；
ｉｉ．位置１０１の任意の他のアミノ酸；
ｉｉｉ．位置１１２の非極性アミノ酸；及び／又は位置１１４の極性アミノ酸
の１つ以上から選択されるアミノ酸置換
の１つ以上から選択される改変レクチンタンパク質が提供される。

別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、ｉ）又はｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。

いくつかの実施態様では、炭水化物結合部位は、一次及び／又は二次炭水化物結合部位である。

一実施態様では、一次炭水化物結合部位は、配列番号１における２７、２８、４７、４８、７０、７１、７２及び１０５の１つ以上から選択される位置、又はそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％若しくは９９％の相同性を有する配列中の対応する位置を含む。

このような一実施態様では、アミノ酸改変の位置は、
ｉ）２７及び／若しくは２８；
ｉｉ）４７及び／若しくは４８；
ｉｉｉ）７０、７１及び／若しくは７２；並びに／又は
ｉｖ）１０５
の１つ以上から選択される。

別の実施態様では、二次炭水化物結合部位は、配列番号１における７７、７８、８０、１０１、１１２及び１１４の１つ以上から選択される位置、又はそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％若しくは９９％の相同性を有する配列中の対応する位置を含む。

このような一実施態様では、アミノ酸改変の位置は、
ｉ）７７、７８及び／又は８０；
ｉｉ）１０１；
ｉｉｉ）１１２及び／又は１１４
の１つ以上から選択される。

さらに別の実施態様では、アミノ酸改変は、置換アミノ酸が元のアミノ酸を置き換えるようなアミノ酸置換である。一実施態様では、アミノ酸置換は、保存的又は好ましいアミノ酸置換である。

一実施態様では、一次炭水化物結合部位におけるアミノ酸置換は、
ｉ）位置２７：保存的、好ましい又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は非極性又は酸性であり；好ましいものは極性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は非極性である）；
ｉｉ）位置２８：保存的、好ましい、中立的又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は非極性であり；好ましいものは極性であり、中立的なものは酸性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は極性である）；
ｉｉｉ）位置４７：塩基性又は非極性である好ましくないアミノ酸；
ｉｖ）位置４８：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｖ）位置７０：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｖｉ）位置７１：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｖｉｉ）位置７２：非極性である好ましくないアミノ酸；及び／又は
ｖｉｉｉ）位置１０５：保存的、好ましい、中立的又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は塩基性若しくは非極性であり；好ましいものは極性であり、中立的なものは酸性、塩基性若しくは極性であり、及び／又は好ましくないアミノ酸は極性、非極性若しくは酸性である）
の１つ以上から選択される。

別の実施態様では、二次炭水化物結合部位におけるアミノ酸置換は、
ｉ）位置７７：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｉｉ）位置７８：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｉｉｉ）位置８０：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｉｖ）位置１０１：好ましい、好ましくない又は中立的アミノ酸（ここで、好ましいアミノ酸は極性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は非極性であり、中立的アミノ酸は非極性又は酸性である）；
ｖ）位置１１２：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｖｉ）位置１１４：極性である好ましくないアミノ酸
の１つ以上から選択される。

一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、ｉ）又はｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記Ｎ末端が、配列番号１における１及び／若しくは２から選択される位置、又はそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％若しくは９９％の相同性を有する配列中の対応する位置を含む。

一実施態様では、アミノ酸改変は位置１のアミノ酸置換であり、置換アミノ酸はトレオニン又はバリンではない。さらなる実施態様では、置換アミノ酸は、アラニン、グリシン、プロリン又はセリンから選択される。またさらなる実施態様では、アミノ酸改変は位置２のアミノ酸置換であり、置換アミノ酸はトリプトファンである、

いくつかの実施態様では、開始メチオニンの切断は、コントロールと比較して増加又は減少する。

別の実施態様では、位置７６のアミノ酸改変は、非極性アミノ酸によるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様では、非極性アミノ酸は、グリシン、バリン又はロイシンから選択される。

一実施態様では、位置４４又は位置８９のアミノ酸改変は、非極性アミノ酸によるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様では、アミノ酸改変は、好ましくは位置８９にある。いくつかの実施態様では、非極性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン又はバリンから選択される。

別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、可溶性、部分的に可溶性若しくは不溶性であり、及び／又は細胞毒性を有する。いくつかの実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の細胞毒性を有する。代替的な実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの１０％未満の細胞毒性率を有するか、又は細胞毒性が欠如している。別の代替的な実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールのものと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％増加した細胞毒性率を有する。

さらに別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、５００、４００、３００、２５０、２００又は１５０アミノ酸長以下である。

本発明のさらなる態様によれば、改変レクチンタンパク質と、薬学的に許容し得る希釈剤又は賦形剤と、場合によりさらなる治療成分とを含む医薬組成物が提供される。患者におけるガンの処置の方法であって、改変レクチンタンパク質又は改変レクチンタンパク質の医薬組成物を患者に投与することを含む方法も提供される。

本発明の別の態様によれば、上記改変レクチンタンパク質と、薬学的に許容し得る希釈剤又は賦形剤と、場合によりさらなる治療成分とを含む医薬組成物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、患者におけるガンの処置の方法であって、上記改変レクチンタンパク質を患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、上記医薬組成物を患者に投与することを含む。

本発明のさらに別の態様によれば、ガンの処置において使用するための改変レクチンタンパク質又は改変レクチンタンパク質の医薬組成物が提供される。さらに、ガン細胞の検出、ガン診断及び／又はガン治療において使用される改変レクチンタンパク質が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、医薬において使用するための上記改変レクチンタンパク質が提供される。あるいは、医薬において使用するための上記医薬組成物が提供される。いくつかの実施態様では、上記改変レクチンタンパク質又は医薬組成物は、ガンの処置において使用するためのものである。本発明のさらなる態様によれば、ガン細胞の検出、ガン診断及び／又はガン治療において使用される場合の上記改変レクチンタンパク質が提供される。

本発明の一態様によれば、改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記改変レクチンタンパク質が、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｂ）ｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｃ）位置７６における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）位置４４若しくは８９における少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含む核酸分子が提供される。

本発明の別の態様によれば、改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記改変レクチンタンパク質が、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｂ）開始メチオニンの切断がｉ）のアミノ酸配列と比較して増加するｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｃ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質のダイマー形成を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質の酸化を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含む核酸分子が提供される。

本発明の別の態様によれば、上記改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。本発明のさらなる態様では、この核酸分子のインサートを含むリコンビナントベクターが提供される。

いくつかの実施態様では、５’から３’方向に作動可能に連結されたベクターは、宿主細胞において機能するプロモーターと、改変レクチンタンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列と、終結シグナルとを含む。別の実施態様では、リコンビナントベクターは、単細胞生物において複製、転写、翻訳及び／又は発現されることができる。

本発明のさらに別の態様では、上記核酸分子を含むトランスフォーメーション宿主細胞が提供される。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、Escherichia coli細菌又は酵母細胞である。

本発明の別の態様によれば、核酸分子のインサートを含むリコンビナントベクターであって、前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｂ）ｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｃ）位置７６における少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）位置４４若しくは８９における少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含むリコンビナントベクターが提供される。

本発明の別の態様によれば、核酸分子のインサートを含むリコンビナントベクターであって、前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１；又は
ｉｉ）ｉ）と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
ｉ）又はｉｉ）のアミノ酸配列が、以下の（ａ）～（ｄ）：
ａ）ｉ）若しくはｉｉ）の炭水化物結合部位における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｂ）開始メチオニンの切断がｉ）のアミノ酸配列と比較して増加するｉ）若しくはｉｉ）のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸改変；
ｃ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質のダイマー形成を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変；又は
ｄ）配列番号１のレクチンタンパク質と比較して改変レクチンタンパク質の酸化を減少させる少なくとも１つのアミノ酸改変
の１つ以上（one of more）から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含むリコンビナントベクターが提供される。

本発明の最後の態様では、リコンビナントSclerotium rolfsiiレクチンタンパク質を生産するための方法であって、
ｉ）リコンビナントレクチンタンパク質をコードする上記リコンビナントベクターを含有する宿主細胞を培養すること；
ｉｉ）前記リコンビナントレクチンタンパク質を発現させること；
ｉｉｉ）前記培養物から粗リコンビナントレクチンタンパク質を単離すること
を含む方法が提供される。

添付の配列の簡単な説明
・配列番号１は、ネイティブS.rolfsiiレクチンアミノ酸配列を表す。
・配列番号２は、（Ｒｅｃ－２として国際公開公報第２０１０／０９５１４３号に報告されている）S.rolfsiiレクチンアミノ酸配列の変異体を表す。
・配列番号３は、（Ｒｅｃ－３として国際公開公報第２０１０／０９５１４３号に報告されている）S.rolfsiiレクチンアミノ酸配列の変異体を表す。
・配列番号４は、（国際公開公報第２０１４／２０３２６１号に報告されている）S.rolfsiiレクチンアミノ酸配列の変異体を表す。

発明の詳細な説明
定義：
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。

本明細書で使用される場合、「レクチン」という用語は、炭水化物結合タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「改変レクチンタンパク質」という用語は、炭水化物結合活性を有し、少なくとも１つのアミノ酸改変を含有するアミノ酸残基のポリマーを指す。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在する及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と類似の機能を有するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるものであり、タンパク質構成アミノ酸を含む。天然に存在するアミノ酸はまた、細胞における翻訳後に改変されたものを含む。合成アミノ酸は、セレノシステイン及びピロリシンなどの非標準アミノ酸を含む。典型的には、合成アミノ酸はタンパク質構成アミノ酸ではない。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸改変」という用語は、アミノ酸配列中の特定の位置におけるアミノ酸の付加、欠失又は置換を指す。一実施態様では、アミノ酸の付加は、アミノ酸配列中の特定の位置における少なくとも１、２、３、４又は５つのアミノ酸の付加を指す。付加、欠失又は置換のプロセスは、本発明にしたがって、又は当業者に公知の方法にしたがって行われる。一実施態様では、本明細書で使用される場合、「アミノ酸改変」は、アセチル化、ニトロ化、糖化及び／又はスルホン化から選択される１つ以上の改変を指す。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列中の特定の位置におけるアミノ酸の置き換えを指す。「アミノ酸置換」という用語は、保存的及び非保存的アミノ酸置換の両方を包含する。保存的アミノ酸置換は、機能的に類似のアミノ酸を提供する。換言すれば、元のアミノ酸を置き換えるアミノ酸（すなわち、「置換」アミノ酸）は、類似の生化学的特性を有する。非保存的置換は、機能的に異なるアミノ酸を提供する。換言すれば、元のアミノ酸を置き換えるアミノ酸（すなわち、「置換」アミノ酸）は、異なる生化学的特性を有する。一実施態様では、アミノ酸置換は、「好ましい」アミノ酸置換である。好ましいアミノ酸置換は、改変レクチンタンパク質の生物学的機能及び／又は他の特性を保存する。別の実施態様では、保存的及び好ましいアミノ酸置換は両方とも、レクチンタンパク質のペアワイズ又はマルチプル配列アラインメントに基づく。保存的置換は、対応する位置における最大の天然レクチンタンパク質で起こるアミノ酸による置換であり、好ましい置換は、対応する位置における少数の天然レクチンタンパク質で起こるアミノ酸による置換である。両置換は、改変タンパク質の細胞毒性を保持又は増強すると予想される。一実施態様では、生物学的機能は、以下で定義される「細胞毒性効果」である。一実施態様では、置換アミノ酸は、レクチンタンパク質、好ましくは真菌レクチンタンパク質のペアワイズ又はマルチプル配列アラインメントに基づいて、好ましいアミノ酸置換として選択される。

アミノ酸は、異なる生化学的特性にしたがって分類され得ると理解される。例としては、極性アミノ酸、非極性アミノ酸、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸が挙げられる。一実施態様では、アミノ酸改変に使用されるアミノ酸は、限定されないが、極性、非極性、酸性、塩基性、セレノシステイン、ピロリシン及び非標準からなる群より選択される少なくとも１つである。

本明細書で使用される場合、「相同性」又は「相同」という用語は、所定の領域又は部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有する２つ以上の参照実体を指す。相同性又は同一性の範囲、領域又はドメインは、相同性を共有するか又は同じである２つ以上の参照実体の一部を指す。したがって、２つの配列が１つ以上の配列領域にわたって同一である場合、それらは、これらの領域において同一性を共有する。実質的な相同性は、参照分子の構造若しくは機能（例えば、生物学的機能又は活性）１つ以上の少なくとも部分的な構造若しくは機能、又はそれが相同性を共有する参照分子の関連／対応する領域若しくは部分を有するか又は有すると予測されるように構造的又は機能的に保存された分子を指す。

一実施態様では、２つの配列間の「相同性」率は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される(Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402)。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＵＲＬ：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを使用してインターネット上でアクセスされ得る。代替的な実施態様では、グローバル配列アラインメントの場合、２つの配列間の相同性率は、デフォルトパラメータを使用したＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアルゴリズムを使用して決定される。特に、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアルゴリズムは、ＵＲＬ：https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/を使用してインターネット上でアクセスされ得る。

特に指示がない限り、「相同性」という用語は、本明細書における「配列同一性」という用語と互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「対応する位置」という用語は、２つ以上の配列間の類似の位置を指す。一実施態様では、対応する位置は、少なくとも第１及び第２の配列の配列アラインメントにより決定される。少なくとも第１及び第２の配列中の対応する位置は、配列アラインメントからのアウトプットでアラインメントされ、それ故に同定され得る。一実施態様では、配列アラインメントは、ペアワイズ又はマルチプル配列アラインメントである。一実施態様では、配列アラインメントは、アルゴリズムにより実施される。一実施態様では、アルゴリズムは、上記ＢＬＡＳＴ又はＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅである。

本明細書で使用される場合、「炭水化物結合部位」という用語は、炭水化物構造の認識及び結合に関与するレクチンタンパク質におけるアミノ酸残基を指す。一実施態様では、炭水化物結合部位は、ＴＦ抗原（二糖；Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ－α－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）及び／又はＴｎ抗原（単糖；ＧａｌＮＡｃ－α－）の認識及び結合に関与する。一実施態様では、「炭水化物結合部位」は、「一次炭水化物結合部位」及び／又は「二次炭水化物結合部位」を包含する。

本明細書で使用される場合、「一次炭水化物結合部位」という用語は、特定の炭水化物構造の認識及び結合に関与する１つ以上のアミノ酸残基を指す。一実施態様では、特定の炭水化物構造はＴＦ抗原である。一実施態様では、一次炭水化物結合部位を構成するアミノ酸残基は、配列番号１における位置２７、２８、４７、４８、７０、７１、７２及び／若しくは１０５の１つ以上、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列中の対応する位置から選択される。一実施態様では、対応する位置は、配列アラインメントにより決定される。

本明細書で使用される場合、「二次炭水化物結合部位」という用語は、特定の炭水化物構造の認識及び結合に関与する１つ以上のアミノ酸残基を指す。一実施態様では、特定の炭水化物構造はＴｎ抗原である。一実施態様では、二次炭水化物結合部位を構成するアミノ酸残基は、配列番号１における位置７７、７８、８０、１０１、１１２及び／若しくは１１４の１つ以上、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列中の対応する位置から選択される。一実施態様では、対応する位置は、配列アラインメントにより決定される。

本明細書で使用される場合、「細胞毒性効果」という用語は、ガン性細胞を殺傷するか又はガン性細胞の成長を阻害する（すなわち、抗増殖活性を発揮する）物質を指す。一実施態様では、物質の細胞毒性率は、実施例５に詳述されているスルフォルホダドミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して決定される。一実施態様では、ＳＲＢアッセイにより決定された少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％の細胞毒性率は、細胞毒性効果を示す。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールのものの少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の細胞毒性率を有する。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」という用語は、アミノ酸配列の開始方向に（すなわち、アミノ末端方向に）位置するアミノ酸残基を指す。一実施態様では、Ｎ末端は、アミノ酸配列の最初の１０％又は５％に位置するアミノ酸残基を指す。

本明細書で使用される場合、「開始メチオニンの切断」という用語は、アミノ酸配列からのＮ末端（開始）メチオニンの除去を指す。一実施態様では、開始メチオニンの切断は、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により触媒される。一実施態様では、開始メチオニンの切断は、当業者に公知の質量分析又はＨＰＬＣ分析を使用して決定される。

本明細書で使用される場合、「開始メチオニンの切断が増加する」という用語は、コントロールと比べた開始メチオニン切断の程度の増加を指す。一実施態様では、それは、コントロールと比べた開始メチオニン切断の程度の少なくとも５％、１０％、２５％又は５０％の増加を指す。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

本明細書で使用される場合、「ダイマー形成」という用語は、同一又は非同一のいずれかである２つのモノマーを含有するオリゴマーの形成を指す。一実施態様では、ダイマー形成は、（同一又は非同一のいずれかの）２つの本発明の改変レクチンタンパク質を含有するダイマーの生成を指す。代替的な実施態様では、ダイマー形成は、本発明の改変レクチンタンパク質と、代替的なレクチンタンパク質、例えば配列番号１の配列からなるものとを含有するダイマーの生産を指す。一実施態様では、ダイマー形成は、各モノマーにおけるシステイン残基間のジスルフィド結合により媒介される。一実施態様では、システイン残基は、配列番号１の位置７６、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列中の対応する位置にある。一実施態様では、対応する位置は、配列アラインメントにより決定される。一実施態様では、ダイマー形成のレベルは、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のいずれか１つを使用して決定される。

本明細書で使用される場合、「減少したダイマー形成」という用語は、コントロールと比べたダイマー形成のレベルの減少を指す。一実施態様では、「減少したダイマー形成」は、コントロールと比べたダイマー形成のレベルの少なくとも５％、１０％、２５％又は５０％の減少を指す。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

本明細書で使用される場合、「酸化」という用語は、電子の喪失又は酸化状態の増加を指す。一実施態様では、「酸化」という用語はアミノ酸残基の酸化を指し、その例としては、メチオニン、システイン、トリプトファン、チロシン及び／又はヒスチジンが挙げられる。一実施態様では、「酸化」という用語は、メチオニンスルホキシドへのメチオニン残基の酸化を指す。一実施態様では、酸化されやすいメチオニン残基は、配列番号１の位置４４若しくは８９、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列中の対応する位置にある。一実施態様では、対応する位置は、配列アラインメントにより決定される。一実施態様では、酸化のレベルは、質量分析及び／又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して決定される。酸化は、タンパク質の発現及び活性に影響を与えると考えられる。一実施態様では、酸化の効果は、レクチンタンパク質の可溶性発現及び／又は活性に対する、配列番号１の位置４４又は８９の酸化されやすいアミノ酸の置換の効果により決定される。

本明細書で使用される場合、「減少した酸化」という用語は、コントロールと比べた酸化のレベルの減少を指す。一実施態様では、「減少した酸化」は、コントロールと比べた酸化のレベルの少なくとも５％、１０％、２５％又は５０％の減少を指す。代替的な実施態様では、「減少した酸化」は、レクチンタンパク質の増強した可溶性発現及び／又は活性を指す。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

本明細書で使用される場合、「可溶性」という用語は、可溶性又は少なくとも部分的に可溶性形態で発現される改変レクチンタンパク質を指す。一実施態様では、改変レクチンタンパク質の溶解性は、改変レクチンタンパク質を発現する宿主細胞の細胞溶解と、溶解上清及びペレットのその後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析とにより決定される。溶解上清中の改変レクチンタンパク質の存在は、それが可溶性であることを示す。溶解上清及びペレット中の改変レクチンタンパク質の存在は、それが部分的に可溶性であることを示す。一実施態様では、本明細書で使用される場合、「可溶性」という用語は、封入体を形成しない改変レクチンタンパク質を指す。上記方法を使用して、ペレット中の改変レクチンタンパク質の存在は、それが封入体として発現されることを示す。

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、複数のヌクレオチドのポリマーを指す。核酸分子は天然に存在する核酸を含み得るか、又は人工核酸を含み得る。一実施態様では、核酸分子は、ＤＮＡ又はその誘導体である。代替的な実施態様では、核酸分子は、ＲＮＡ又はその誘導体である。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、細胞酵素により認識される天然に存在するヌクレオチド及び合成ヌクレオチド類似体を指す。

変化及び／又は改善された物理化学的特性及び／又は生物学的活性を有する新たなレクチンを開発するために、本発明の発明者らは、活性部位及び非活性部位におけるネイティブレクチン配列への改変を用いて、いくつかのレクチン変異体を開発した。

一実施態様では、本発明は、変化した特性を示す；好ましくは、特定のガン細胞にユニークに見られる特定の糖鎖に対する特異性、並びに／又はネイティブタンパク質と比較して増強した溶解性及び／若しくは安定性を示すネイティブレクチン配列由来のリコンビナントレクチン変異体を提供する。これらのリコンビナントレクチンは、意図的な改変をネイティブレクチンに行うことにより得られる。本発明の実施態様では、ネイティブレクチンは、限定されないが、真菌及び植物からなる群に由来する。典型的には、ネイティブレクチンは、土壌伝染性植物病原性真菌に由来する。本発明の例示的な実施態様では、植物病原性真菌はS. rolfsiiである。ネイティブレクチンのアミノ酸配列由来のリコンビナントレクチンは、Ｔｎ抗原及び／又はＴＦ抗原に対する特異性を有し、それ故に、ヒト結腸ガン、卵巣ガン及び白血病細胞に結合することが好ましい。

一般に、本発明は、改変レクチンタンパク質であって、配列番号１から選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１における、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸改変を含む改変レクチンタンパク質に関する。配列番号１の配列は、（国際公開公報第２０１０／０９５１４３号に報告されている）ネイティブS.rolfsiiレクチン配列に対応する。アミノ酸改変は、配列番号１若しくはそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列の炭水化物結合部位におけるアミノ酸改変；配列番号１若しくはそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列のＮ末端におけるアミノ酸改変；改変レクチンタンパク質のダイマー形成を減少させるアミノ酸改変；及び／又は酸化を減少させるアミノ酸改変の１つ以上から選択される。

改変レクチンタンパク質は、（Ｒｅｃ－２リコンビナント変異体として国際公開公報第２０１０／０９５１４３号に報告されている）配列番号２、（Ｒｅｃ－３リコンビナント変異体として国際公開公報第２０１０／０９５１４３号に報告されている）配列番号３又は（国際公開公報第２０１４／２０３２６１号に報告されている）配列番号４のいずれのアミノ酸配列からもならないことが好ましい。配列番号図２～４は、配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列の例である。特に、配列番号２、３及び４は、（ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して決定した場合）それぞれ配列番号１と９７．９％、９６．５％及び９１．５％の相同性を有する。

炭水化物結合部位
本発明の第１の実施態様では、炭水化物結合部位は、（Leonidas et al. 2007に報告されている）配列番号１におけるアミノ酸位置２７、２８、４７、４８、７０、７１、７２及び１０５、又は配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有する配列の対応する位置を含む一次炭水化物結合部位である。一次炭水化物結合部位は、ガン細胞の表面上において発現されるＴＦ抗原（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ－α－Ｓｅｒ／／Ｔｈｒ）に対する特異性を示す。第１の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、一次結合部位の位置の１つ以上（one of more）においてアミノ酸置換を含有する。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、２７及び／若しくは２８；４７及び／若しくは４８；７０、７１及び／若しくは７２；並びに／又は１０５から選択される１つ以上の位置においてアミノ酸置換を含有する。

本発明の第２の実施態様では、炭水化物結合部位は、（Leonidas et al. 2007に報告されている）配列番号１におけるアミノ酸位置７７、７８、８０、１０１、１１２及び１１４、又は配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有する配列の対応する位置を含む二次炭水化物結合部位である。二次炭水化物結合部位は、Ｔｎ抗原（ＧａｌＮＡｃ－α－）に対する特異性を示す。第２の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、二次結合部位の位置の１つ以上においてアミノ酸置換を含有する。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、７７、７８及び／若しくは８０；１０１；並びに／又は１１２及び／若しくは１１４から選択される１つ以上の位置においてアミノ酸置換を含有する。

第１及び／又は第２の実施態様のアミノ酸置換は、保存的又は好ましいアミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換は、元のアミノ酸のものと類似の生化学的特性を有する置換アミノ酸（すなわち、元のアミノ酸を置き換えるもの）を指す。一実施態様では、極性アミノ酸は異なる極性アミノ酸で置き換えられ；非極性アミノ酸は異なる非極性アミノ酸で置き換えられ；酸性アミノ酸は異なる酸性アミノ酸で置き換えられ；又は塩基性アミノ酸は異なる塩基性アミノ酸で置き換えられる。それはまた、レクチンタンパク質のペアワイズ又はマルチプル配列アラインメントに基づいて、対応する位置における最大の天然レクチンタンパク質で起こるアミノ酸による置換を指す。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、改変レクチンタンパク質が改変レクチンタンパク質の生物学的機能及び／又は他の特性を保存するような好ましいアミノ酸置換を含有する。好ましい実施態様では、改変レクチンタンパク質は、改変レクチンタンパク質が細胞毒性効果を保持し及び／又は可溶性であるような好ましいアミノ酸置換を含有する。一実施態様では、アミノ酸残基は、天然レクチンタンパク質、好ましくは真菌レクチンタンパク質のペアワイズ又はマルチプル配列アラインメントに基づいて、好ましいアミノ酸置換について選択される。好ましい置換は、対応する位置における少数の天然レクチンタンパク質で起こるアミノ酸による置換である。理論に縛られるものではないが、相同配列中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の選択及び改変レクチンタンパク質へのその封入は、改変レクチンタンパク質の生物学的機能及び／又は他の特性（例えば、細胞毒性効果及び／又は溶解性）を維持する可能性が高いと考えられる。

代替的な実施態様では、第１及び／又は第２の実施態様のアミノ酸置換は、非保存的又は好ましくないアミノ酸置換である。非保存的又は好ましくないアミノ酸置換は、元のアミノ酸のもとは異なる生化学的特性を有する置換アミノ酸（すなわち、元のアミノ酸を置き換えるもの）を指す。例えば、極性アミノ酸は非極性アミノ酸で置き換えられ、その逆も同様である。非保存的又は好ましくないアミノ酸置換はまた、ペアワイズ又はマルチプル配列アライメントにした場合に他の天然レクチンタンパク質の対応する位置に存在しないアミノ酸による置換を指す。一実施態様では、非保存的又は好ましくないアミノ酸置換は、コントロールに対して改変レクチンタンパク質の細胞毒性効果及び／又は溶解性を変化させる。一実施態様では、変化した細胞毒性効果及び／又は溶解性は、配列番号１のレクチンタンパク質に対して決定され、別の実施態様では、細胞毒性効果及び／又は溶解性は、配列番号２のレクチンタンパク質に対して決定される。

一実施態様では、一次炭水化物結合部位における置換アミノ酸は、
ａ．位置２７：保存的、好ましい又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は非極性又は酸性であり；好ましいものは極性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は非極性である）；
ｂ．位置２８：保存的、好ましい、中立的又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は非極性であり；好ましいものは極性であり、中立的なものは酸性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は極性である）；
ｃ．位置４７：塩基性又は非極性である好ましくないアミノ酸；
ｄ．位置４８：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｅ．位置７０：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｆ．位置７１：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｇ．位置７２：非極性である好ましくないアミノ酸；及び／又は
ｈ．位置１０５：保存的、好ましい、中立的又は好ましくないアミノ酸（ここで、保存的アミノ酸は塩基性若しくは非極性であり；好ましいものは極性であり、中立的なものは酸性、塩基性若しくは極性であり、及び／又は好ましくないアミノ酸は極性、非極性若しくは酸性である）
の１つ以上から選択される。

特に、一次炭水化物結合部位における置換アミノ酸は、
ａ．位置２７のグリシン（Ｙ２７Ｇ）、トリプトファン（Ｙ２７Ｗ）、フェニルアラニン（Ｙ２７Ｆ）、グルタミン酸（Ｙ２７Ｅ）若しくはヒスチジン（Ｙ２７Ｈ）；及び／又は位置２８のグリシン（Ａ２８Ｇ）、トリプトファン（Ａ２８Ｗ）、セリン（Ａ２８Ｓ）、アスパラギン酸（Ａ２８Ｄ）若しくはヒスチジン（Ａ２８Ｈ）；
ｂ．位置４７のロイシン（Ｓ４７Ｌ）；及び／又は位置４８のトリプトファン（Ｇ４８Ｗ）；
ｃ．位置７０のイソロイシン（Ｈ７０Ｉ）；位置７１のトリプトファン（Ｎ７１Ｗ）；及び／又は位置７２のグリシン（Ｙ７２Ｇ）；並びに
ｄ．位置１０５のフェニルアラニン（Ｒ１０５Ｆ）、グルタミン（Ｒ１０５Ｑ）、グルタミン酸（Ｒ１０５Ｅ）、ロイシン（Ｒ１０５Ｌ）、リジン（Ｒ１０５Ｋ）、アラニン（Ｒ１０５Ａ）、セリン（Ｒ１０５Ｓ）、バリン（Ｒ１０５Ｖ）、イソロイシン（Ｒ１０５Ｉ）、プロリン（Ｒ１０５Ｐ）、メチオニン（Ｒ１０５Ｍ）、グリシン（Ｒ１０５Ｇ）、トレオニン（Ｒ１０５Ｔ）、チロシン（Ｒ１０５Ｙ）、トリプトファン（Ｒ１０５Ｗ）、アスパラギン（Ｒ１０５Ｎ）、システイン（Ｒ１０５Ｃ）、アスパラギン酸（Ｒ１０５Ｄ）又はヒスチジン（Ｒ１０５Ｈ）
の１つ以上から選択される。

一実施態様では、二次炭水化物結合部位における置換アミノ酸は、
ａ．位置７７：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｂ．位置７８：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｃ．位置８０：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｄ．位置１０１：好ましい、好ましくない又は中立的アミノ酸（ここで、好ましいアミノ酸は極性又は塩基性であり、好ましくないアミノ酸は非極性であり、中立的アミノ酸は非極性又は酸性である）；
ｅ．位置１１２：非極性である好ましくないアミノ酸；
ｆ．位置１１４：極性である好ましくないアミノ酸
の１つ以上から選択される。

特に、二次炭水化物結合部位における置換アミノ酸は、
ａ．位置７７のフェニルアラニン（Ｄ７７Ｆ）、位置７８のグリシン（Ｉ７８Ｇ）及び位置８０のトリプトファン（Ｔ８０Ｗ）；
ｂ．位置１０１のフェニルアラニン（Ｒ１０１Ｆ）、グルタミン（Ｒ１０１Ｑ）、メチオニン（Ｒ１０１Ｍ）、グルタミン酸（Ｒ１０１Ｅ）；及びリジン（Ｒ１０１Ｋ）；
ｃ．位置１１２のグリシン（Ｙ１１２Ｇ）及び／又は位置１１４のアスパラギン（Ｖ１１４Ｎ）
の１つ以上から選択される。

第１及び／又は第２の実施態様のアミノ酸置換を含有する改変レクチンタンパク質は、細胞毒性効果を有することが好ましい。一実施態様では、細胞毒性効果は、ＳＲＢアッセイを使用して決定される。特に好ましい実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールのもの以上の細胞毒性率を有する。一実施態様では、コントロールは、配列番号１のレクチンタンパク質である。代替的な実施態様では、コントロールは、配列番号１以外のレクチンタンパク質である。一実施態様では、改変レクチンタンパク質の細胞毒性率は、コントロールのものと比較して２０％パーセンテージの増加を表す。好ましい実施態様では、それは、４５％パーセントの増加を表す。代替的な実施態様では、改変レクチンタンパク質の細胞毒性率は、コントロールのものと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加を表す。第１及び／又は第２の実施態様のアミノ酸置換を含有する改変レクチンタンパク質は可溶性又は部分的に可溶性であることも好ましい。

Ｎ末端改変
本発明の第３の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１の位置１及び／若しくは２、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列の対応する位置においてアミノ酸置換を含む。位置１の置換アミノ酸（すなわち、元のアミノ酸を置換するもの）は、バリン又はトレオニンの１つではないことが好ましい。特に、位置１の置換アミノ酸は小さな側鎖を有することが好ましい。好ましくは、置換アミノ酸は、アラニン、グリシン、プロリン又はセリンの１つから選択される。さらなる実施態様では、位置２の置換アミノ酸はトリプトファンである。代替的な実施態様では、位置２の置換アミノ酸は異なる非極性アミノ酸である。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１の位置１及び２、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列の対応する位置において上記で定義されるアミノ酸置換を含む。好ましい実施態様では、位置１及び２の置換アミノ酸は、それぞれアラニン及びトリプトファンである。

第３の実施態様の改変レクチンタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端（開始）メチオニンの切断を、コントロールと比較して増加させることが好ましい。一実施態様では、コントロールは配列番号１のアミノ酸配列であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。一実施態様では、開始メチオニンの切断は、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により触媒される。開始メチオニン切断の程度は、当業者に公知の方法を使用して、好ましくは質量分析又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定される。理論に縛られるものではないが、ＭＡＰによる開始メチオニン切断の程度は、開始メチオニンの後の第１及び／又は第２の位置（例えば、配列番号１の位置１及び／又は２）のアミノ酸残基により影響を受けると考えられる。特に、開始メチオニンの後の第１の位置において小さな側鎖を有するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列は、（上記のように）開始メチオニン切断の程度を増加させると考えられる。

さらに、第３の実施態様の改変レクチンタンパク質は可溶性であり、及び／又は細胞毒性効果を有することが好ましい。より好ましくは、改変レクチンタンパク質は可溶性であり、細胞毒性効果を有する。一実施態様では、細胞毒性効果は、ＳＲＢアッセイを使用して決定される。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の細胞毒性率を示す。別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの１０％未満の細胞毒性率を有するか、又は細胞毒性が欠如している。さらなる実施態様では、細胞毒性率は、配列番号１のレクチンタンパク質のものの少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％である。

第３の実施態様の変形では、Ｎ末端におけるアミノ酸置換は、配列番号１の位置１及び／若しくは２、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列中の対応する位置以外の位置にある。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、（位置１及び／又は２以外の）アミノ酸配列の最初の１０％又は５％においてアミノ酸置換を含有する。

減少したダイマー形成
ネイティブS.rolfsiiタンパク質は、酸性条件下ではモノマーとして存在し、中性又は塩基性ｐＨではダイマーを形成することが報告されている(Leonidas et al. 2007)。理論に縛られるものではないが、配列番号１の位置７６のシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成を介してダイマー形成を媒介すると考えられる。特定の実施態様では、１つの形態のタンパク質（すなわち、モノマー形態）のみが存在するように、ダイマー形成を減少させることが好ましい。

したがって、本発明の第４の実施態様では、その位置のアミノ酸残基がもはやシステインではないように、改変レクチンタンパク質は、配列番号１の位置７６、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有する配列の対応する位置においてアミノ酸置換を含有する。好ましい実施態様では、位置７６の置換アミノ酸（すなわち、元のアミノ酸を置換するもの）はグリシンである。代替的な実施態様では、位置７６の置換アミノ酸は、異なる非極性アミノ酸残基である。一実施態様では、置換アミノ酸は、Leonidas et al. 2007の図６に報告されているように、真菌レクチンタンパク質の配列アラインメントに基づいて選択される。したがって、一実施態様では、非極性置換アミノ酸は、バリン又はロイシンの１つから選択される。

第４の実施態様のアミノ酸置換を含有する改変レクチンタンパク質は、配列番号１のレクチンタンパク質と比較して減少したダイマー形成を示す。一実施態様では、ダイマー形成のレベルは、質量分析を使用して決定される。代替的な実施態様では、ダイマー形成のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用して決定される。第４の実施態様の改変レクチンタンパク質は可溶性であり、及び／又は細胞毒性効果を有することが好ましい。より好ましくは、改変レクチンタンパク質は可溶性であり、細胞毒性効果を有する。一実施態様では、細胞毒性効果は、ＳＲＢアッセイを使用して決定される。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の細胞毒性率を示す。別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの１０％未満の細胞毒性率を有するか、又は細胞毒性が欠如している。さらなる実施態様では、細胞毒性率は、コントロールのものの少なくとも６０％、８０％又は９０％である。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

第４の実施態様の変形では、ダイマー形成を減少させるアミノ酸置換は、位置７６以外の位置にある。例えば、理論に縛られるものではないが、一実施態様では、ジスルフィド結合以外の代替結合がダイマー形成に寄与し、代替的なアミノ酸置換を用いて、これらの結合の形成を破壊し、それ故にダイマー形成を減少させる。

減少した酸化
本発明の第５の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１の位置８９、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列の対応する位置においてアミノ酸置換を含有する。さらなる実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１の位置４４及び／若しくは８９、又はそれと少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列の対応する位置においてアミノ酸置換を含有する。好ましい実施態様では、位置８９の置換アミノ酸（すなわち、元のアミノ酸を置換するもの）はバリンである。代替的な実施態様では、位置８９の置換アミノ酸は、異なる非極性アミノ酸残基である。一実施態様では、置換アミノ酸は、Leonidas et al. 2007の図６に報告されているように、真菌レクチンタンパク質の配列アラインメントに基づいて選択される。したがって、一実施態様では、非極性アミノ酸残基は、ロイシン又はイソロイシンの１つから選択される。さらなる実施態様では、改変レクチンタンパク質は、位置８９について上記で定義されるものにしたがって、位置４４においてアミノ酸置換を含有する。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、上記で定義される位置４４及び８９においてアミノ酸置換を含有する。

理論に縛られるものではないが、配列番号１の位置４４及び／又は８９のメチオニン残基は酸化されやすく、これが、これらの位置におけるメチオニンスルホキシドの形成をもたらすと考えられる。メチオニンスルホキシドへのメチオニン残基の酸化は、レクチンの生物学的活性を損なう可能性を有する。したがって、特定の実施態様では、レクチンタンパク質の酸化を減少させることが好ましい。したがって、第５の実施態様により定義されるアミノ酸置換を含有する改変レクチンタンパク質は、配列番号１のレクチンタンパク質と比較して減少した酸化を示す。一実施態様では、酸化のレベルは、質量分析を使用して決定される。代替的な実施態様では、酸化のレベルは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して決定される。さらに、第５の実施態様の改変レクチンタンパク質は可溶性であり、及び／又は細胞毒性効果を有することが好ましい。より好ましくは、改変レクチンタンパク質は可溶性であり、細胞毒性効果を有する。一実施態様では、細胞毒性効果は、ＳＲＢアッセイを使用して決定される。一実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の細胞毒性率を示す。別の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、コントロールの１０％未満の細胞毒性率を有するか、又は細胞毒性が欠如している。さらなる実施態様では、細胞毒性率は、コントロールのものの少なくとも６０％、７０％又は９０％である。一実施態様では、コントロールは配列番号１のレクチンタンパク質であり、別の実施態様では、コントロールは配列番号２である。

第５の実施態様の変形例では、酸化を減少させるアミノ酸置換は、位置４４及び／又は８９以外の位置にある。例えば、理論に縛られるものではないが、一実施態様では、代替的なアミノ酸残基、例えばシステイン、トリプトファン、チロシン及びヒスチジンアミノ酸残基は、レクチンタンパク質の酸化に寄与する。したがって、代替的なアミノ酸置換を用いて、これらの部位における酸化を制限し、それ故にタンパク質全体の酸化を減少させる。

さらなる実施態様
上記第１～第５の実施態様では、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。しかしながら、第１～第５の実施態様のいずれか１つの変形では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換以外の改変である。一変形では、アミノ酸改変は、アミノ酸配列中の特定の位置におけるアミノ酸の付加又は欠失である。一実施態様では、アミノ酸の付加は、アミノ酸配列中の特定の位置における少なくとも１、２、３、４又は５つのアミノ酸の付加である。

上記第１～第５の実施態様では、改変レクチンタンパク質は細胞毒性効果を有することが好ましい。第１～第５の実施態様のいずれか１つに関連するさらなる実施態様では、改変レクチンは、（細胞毒性効果を有することに加えて）さらなる生物学的機能を有する。一実施態様では、生物学的機能は、抗原に対する改変レクチンタンパク質の特異性に関する。

上記第１～第５の実施態様では、改変レクチンタンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列においてアミノ酸改変を含有し得る。第１～第５の実施態様のいずれか１つに関連するさらなる実施態様では、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％又は８５％の相同性を有する。アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有することが特に好ましい。

改変レクチンタンパク質は、第１～第５の実施態様に関して、上記アミノ酸改変のいずれか１つの組み合わせ又は複数を含有し得ると理解すべきである。

本発明のさらなる実施態様では、上記改変レクチンタンパク質を含む医薬組成物が提供される。加えて、医薬組成物は、薬学的に許容し得る希釈剤又は賦形剤を含む。例示的な希釈剤及び賦形剤としては、滅菌水、生理食塩水及びリン酸緩衝液が挙げられる。いくつかの実施態様では、医薬組成物はまた、さらなる治療成分を含む。

医薬組成物のさらなる構成要素の詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAに見られ得る。

使用では、上記で説明されている改変レクチンタンパク質（以下、「医薬」）は、処置を必要とする患者に投与される。一実施態様では、医薬のための適切な用量は、０．１～１mg/kgである。一実施態様では、患者はガンを患っている。一実施態様では、ガンは、卵巣ガン、白血病及び／又は結腸ガンの１つから選択される。原則として、任意の医薬投与様式が使用され得る。一実施態様では、医薬は、以下の様式：注射、噴霧又は吸入の１つにより投与される。

一実施態様では、上記改変レクチンタンパク質は、ガン細胞の検出において使用される。

一実施態様では、上記改変レクチンタンパク質は、診断方法において；好ましくはガンの診断方法において使用される。

さらなる実施態様では、本発明は、上記改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。一実施態様では、核酸分子は、限定されないが、置換、欠失及び／又は付加を含むヌクレオチド配列中の任意の変化を含む。

遺伝暗号の縮重により、特定の改変レクチン変異体をコードする核酸分子は、ある範囲のヌクレオチド配列を有し得ると理解すべきである。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＴは全て、アミノ酸アラニンをコードする。

核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの誘導体のいずれかであり得る。

一実施態様では、本発明は、ベクターを含むリコンビナントＤＮＡ分子に関する。ベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであることが好ましい。一実施態様では、上記改変レクチンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子のインサートを含むリコンビナントベクターが提供される。さらなる実施態様では、リコンビナントベクターは発現ベクターであり、５’から３’方向に作動可能に連結された、宿主細胞において機能するプロモーターと、上記改変レクチンタンパク質をコードする構造核酸配列と、終結シグナルとを含む。

本発明のさらなる実施態様では、リコンビナントSclerotium rolfsiiレクチンタンパク質；特に上記改変レクチンタンパク質を生産するための方法が提供される。一実施態様では、クローニングされたヌクレオチド配列は、ネイティブレクチンアミノ酸配列に近いが代替的な特性を提供する改変レクチンタンパク質をコードする。あるいは、化学的又はリコンビナント的な手段を使用して、改変レクチン変異体をコードするヌクレオチド配列を合成し、適切な宿主において発現させて、リコンビナントタンパク質を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核細胞並びに下等真核細胞及び高等真核細胞の両方が挙げられる。宿主細胞へのリコンビナント分子の導入は、当技術分野で公知の方法を使用して行われ得る。本発明の例示的な実施態様では、適切な宿主は微生物細胞である。好ましい実施態様では、微生物細胞は、限定されないが、酵母細胞、Escherichia coli、昆虫細胞株又は哺乳動物細胞株からなる群より選択される。

上記リコンビナントタンパク質は、リコンビナント宿主からの発現産物として単離により得られ得る。一実施態様では、本発明のリコンビナントタンパク質は、従来の技術、典型的には従来のクロマトグラフィー法により精製される。本発明の別の例示的な実施態様では、リコンビナントレクチンの分子量はＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定され、約１６，０００Ｄａである。本発明のさらに別の例示的な実施態様では、リコンビナントレクチンは、典型的にはヒト血液型に対する血液型特異性を有し得る。本発明のさらに別の例示的な実施態様では、リコンビナントタンパク質は、ＴＦ抗原及びその潜在形態を認識する排他的能力を有し得る。

したがって、例示的な実施態様を参照して本発明を説明したが、この説明は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。例示的な実施態様の様々な改変及び本発明の他の実施態様は、この説明を参照することにより当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の真の範囲内に入るような任意の改変又は実施態様をカバーすると企図される。

実施例１：部位特異的突然変異誘発
ネイティブS.rolfsiiレクチン配列のアミノ酸配列（配列番号１）を、本明細書の以下の表１に記載されているように、部位特異的突然変異誘発により異なる特定の位置で改変した。ｐＥＴ２０ｂベクターにクローニングしたネイティブＳＲＬ配列のアミノ酸配列をコードするE. coli ＢＬ２１ＤＥ３細胞からプラスミドを抽出し、これをテンプレートとして使用した。蒸留水で総量を５０μlにした、５×Ｑ５反応バッファー １０μl、１０mM ｄＮＴＰ １μl、１０μM フォワードプライマー ２．５μl、１０μM リバースプライマー ２．５μl、Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ酵素 ０．５μl及びテンプレート ２０ngを含有する５０μlにＰＣＲ反応を設定した。

９８℃で３０秒間の初回変性工程の後、９８℃で３０秒間の変性工程、５５℃で３０秒間のアニーリング工程及び７２℃で３０秒間の伸長工程からなる３５回の増幅サイクルによるＰＣＲを使用して、目的の遺伝子を増幅した。最後に、さらなる伸長工程を７２℃で５分間行った。Mastercycler Proを用いて、全てのＰＣＲ反応を実施した。エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含有する１．２％アガロースゲルでＰＣＲ産物を分析した。
表１：ネイティブＳＲＬ配列由来の異なるレクチン変異体の構築に使用したプライマーのリスト：
ａ．開始メチオニンの効率的な切断のためのクローン変異体

ｂ．一次炭水化物結合部位を変化させるためのクローン変異体

ｃ．二次炭水化物結合部位を変化させるためのクローン変異体

ｄ．ダイマー形成及びタンパク質酸化の防止のためのクローン変異体

実施例２：制限消化
ＰＣＲ産物／プラスミド ５００ng、10xCutSmartバッファー １μl並びにＮｄｅＩ １～２単位及びＢａｍＨＩ １～２単位を最終容量 １０μlにしたものを使用して、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて、（実施例１から得られた）ＰＣＲ産物又はプラスミドを消化した。反応物を３７℃で４５分間～１時間インキュベーションし、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含有する１．２％アガロースゲルで消化の結果を観察した。

次いで、アガロースゲルからＤＮＡを抽出及び精製した。

実施例３：ｐＥＴベクターライゲーション及びコロニーＰＣＲによるトランスフォーマントの確認
ＤＮＡサンプル（実施例２からの制限酵素消化産物） １００ng、消化ｐＥＴベクター ５０ng、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー １μl及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素 １μlからなる混合物を最終容量 １０μlにしたものを使用して、ｐＥＴベクターへのライゲーション反応を行った。この反応を２２℃で１時間行った。

ヒートショック法により、ライゲーションミックスをE. coli ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフォーメーションした。次いで、細胞をＬＡ／カナマイシンプレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、以下のＰＣＲ条件でｐＥＴフォワード及びｐＥＴリバースプライマーを用いて、トランスフォーマントをＰＣＲに供して、インサートの完全性及びインタクト性をチェックした。ＰＣＲプログラムは、９５℃で１０分間の初回変性工程の後、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で３０秒間のアニーリング工程及び７２℃で４５秒間の伸長工程からなる３５回の増幅サイクルを含んでいた。最後に、さらなる伸長工程を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ反応物は、細菌コロニー（ＤＮＡテンプレート）、１０μM ｐＥＴフォワードプライマー、１０μM ｐＥＴリバースプライマー、EconoTaq PLUS GREEN 2X Master Mix (Lucigen) ５μl及び最終容量 １０μlにするための蒸留水から構成されていた。ＥｔＢｒを含有する１．２％アガロースゲルでＰＣＲ産物を分析した。

実施例４：プラスミドＤＮＡの抽出及び発現分析
陽性トランスフォーマントをＬＢ／カナマイシンの液体培養物に接種し、次いで、E. coliからプラスミドＤＮＡ抽出を行った。ｐＥＴベクター中にインサートを有するこの研究で調製した全ての構築物をシークエンシングにより確認した。

レクチン変異体をコードする各改変ヌクレオチド配列を含有するｐＥＴ２７ｂベクターをE. coli ＢＬ ２１ＤＥ３ ＧＯＬＤ細胞にトランスフォーメーションした。自動誘導培地における発現分析により、陽性クローンを選択した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、リコンビナントレクチンの発現レベル及びサイズを確認した。陽性クローンのグリセロールストックを調製し、－８０℃で維持した。

グリセロールストック（４０μl）を（２０μg/mlカナマイシンを含有する）ＬＢブロス ５０mlに接種し、３７℃、１４０rpmで１６時間インキュベーションした。１％培養物を、１％酵母抽出物（w/v）、１．２％デキストロース（w/v）、０．３％ＫＨ_２ＰＯ_４（w/v）、１．２５％Ｋ_２ＨＰＯ_４（w/v）、０．５％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（w/v）、０．０５％ＮａＣｌ（w/v）、０．１％ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ（w/v）及び０．１％（v/v）微量金属溶液を含む生産培地 ２００mlに接種した。カナマイシンを最終濃度 ２０μg/mlで追加した。フラスコを３７℃及び１４０rpmでインキュベーションした。培養物のＯＤ_６００が１．５に達したら、温度を１８℃に低下させ、培養物をさらに１時間インキュベーションした。次いで、培養物を０．２５mM ＩＰＴＧで誘導し、１８℃でさらに２０時間インキュベーションした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、タンパク質発現及び溶解性について、誘導前及び誘導後の培養サンプルを分析した。培養ブロスを９０００rpm、１５℃で１５分間遠心分離した。得られたペレットを溶解バッファー（２５mM トリス、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。１８０００psi（１２４，１００kPa）の高圧ホモジナイゼーションにより、細胞を溶解させた。溶解バッファーで予め平衡化した０．１ミクロン中空繊維を使用して、溶解物を清澄化した。

清澄化したタンパク質溶液をイオン交換クロマトグラフィーに供して、リコンビナントレクチンを精製した。

実施例５：バイオアッセイ－卵巣ガン細胞株（ＰＡ－１）に対する精製レクチンの抗増殖活性
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して、リコンビナント精製レクチン変異体の抗増殖活性を決定した。レクチンタンパク質は、ＴＦ／Ｔｎ抗原への結合を介して、ＰＡ－１卵巣ガン細胞株に対する細胞毒性効果を有すると考えられる；したがって、アッセイはまた、レクチンタンパク質の特異性に関する情報を提供し得る。活性を保持するためにタンパク質のコンフォメーションは維持されると考えられるので、抗増殖活性は、レクチンタンパク質の安定性をさらに示す。アッセイは、ＳＲＢで細胞タンパク質を染色することにより、総バイオマスを測定した。ＳＲＢは、弱酸性条件下でトリクロロ酢酸固定細胞のタンパク質の塩基性アミノ酸残基と静電複合体を形成し得る明るいピンク色のアミノキサンテン色素である。それは、弱塩基性条件下では解離し得、測定のためにそれを可溶化し得る。それは、異なるタイプのガン性及び非ガン性細胞株に対する薬物毒性スクリーニングに広く使用されている。細胞を簡単に洗浄し、固定し、前記色素で染色した。次いで、取り込まれた色素を、トリス塩基溶液を用いて細胞から遊離させた。染色細胞から放出された取り込まれた色素は細胞バイオマスに正比例するので、これを測定して、試験材料により引き起こされた細胞毒性の程度を示し得る。

細胞が対数増殖期にある際に、細胞の細胞毒性をモニタリング／測定した。試験は最終容量 ２００μlで実施し、ブランク吸光度の読み取り値として使用すべき無細胞培地のコントロールサンプル ２００μlを含んでいた。無血清培地で試験の希釈を実施してバックグラウンドを減少させ、所望の濃度よりも１０倍高い希釈物を調製した。

１日目に、初回トリプシン処理工程により細胞を播種し、ノイバウアーチャンバー中でトリパンブルー法によりカウントし、平底９６ウェルプレート（暗壁プレート）のウェルに細胞５０００個／ウェルの密度でプレーティングした。２日目に、一晩のインキュベーション後、プレート中の培地に１８０μL/ウェルを補充し、次いで、各ウェルの総量が２００μlになるように２．５～８０μg/mlの範囲の濃度の各試験品 ２０μlで細胞を処理した。２日目から４日目まで、プレートをインキュベーションした。次いで、５日目に、ＳＲＢで細胞を処理した。次いで、滅菌条件下の顕微鏡下でプレートを観察した。

成長培地の上に５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液（冷） ５０μlを穏やかに積層することにより、細胞を固定した。固定工程の後、不正確性をもたらす細胞の脱落を回避するために、プレートを移動させなかった。次いで、これらのプレートを４℃で１時間インキュベーションし、次いで、精製水で４回洗浄して、過剰な固定液及び血清タンパク質を除去した。プレートを空気乾燥させた。さらなる使用のために、これらのプレートのいくつかを室温で保存した。次いで、０．４％（５０μl）ＳＲＢ色素溶液を追加してウェルの培養物表面を覆い、続いて、２８℃で３０分間インキュベーションすることにより、ＳＲＢ色素でプレートを染色した。

次いで、デカンテーションにより染色を除去し、次いで、洗浄溶液（１％酢酸）でリンスした。取り込まれていない色素が除去されるまで、５回の洗浄サイクルでプレートを洗浄した。水分が見えなくなるまで、プレートをさらに空気乾燥させた。

可溶化のために、ＳＲＢ可溶化バッファー（１０mmトリス） ２００μlをウェルに追加した。すなわち、ウェルの元の容量と同等にし、続いて、２８℃で５分間インキュベーションした。次いで、プレートを穏やかに５～１０分間撹拌して色素を溶解させ、５８０nmで吸光度を測定した。

実施例６：ネイティブS.rolfsiiレクチン配列のアミノ酸改変
以下に記載されているように物理化学的特性を変化させるように、ネイティブレクチン配列を改変した。

ａ）開始メチオニンの切断の効率の増強：
E. coliにおけるリコンビナントタンパク質の高い発現率は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）酵素によるＮ末端メチオニン（開始メチオニン）の切断を制限して、Ｍｅｔ－レクチン及びＭｅｔ－遊離レクチンを含有するタンパク質の混合物をもたらす。開始メチオニン切断に影響を与える１つの重要な要因は、メチオニン残基の後のアミノ酸である。ＭＡＰは、２番目の位置の残基（すなわち、開始メチオニンの後の１番目のアミノ酸残基）に小さな側鎖を有する全てのタンパク質を切断する。開始メチオニンの後にバリン又はトレオニン残基を有するタンパク質は、この位置にアラニン、グリシン、プロリン又はセリンを有するものよりもかなり低い効率でＭＡＰにより切断される。ネイティブレクチン配列のＮ末端の１番目（トレオニン）及び２番目（チロシン）のアミノ酸を４つの異なるアミノ酸（表２）で置き換えるようにクローンを構築して、開始メチオニンの切断、溶解性、特異性及び生物学的活性に対する効果をチェックした。レクチン変異体の溶解性、特異性及び生物学的活性は、変更を行うことにより影響を受けなかった。

振盪フラスコレベルにおける効率的なメチオニン切断のために設計したネイティブレクチン配列の５つの変異体全てから、リコンビナントレクチンを精製した。位置１のトレオニンをアラニン、グリシン、セリン及びプロリンで置き換えたネイティブレクチン配列の変異体は全て、コントロールと比較して可溶性であり類似の発現を示した。全ての変異体の生物学的活性もまた、コントロールのものと類似していた。したがって、レクチン配列の１番目及び／又は２番目のアミノ酸の変更は、コントロールと比較して発現又は生物学的活性に影響を与えないことが観察された。

ｂ）ダイマー形成及びタンパク質酸化の防止：
S.rolfsiiレクチンモノマーに存在するシステイン残基は、ジスルフィド結合によるダイマー形成に寄与すると考えられるので、レクチンの特異性及び生物学的活性に影響を与え得る。S.rolfsiiレクチンのメチオニン残基は、精製プロセス中に酸化されやすいと考えられる。それぞれダイマー形成及びタンパク質酸化を防止するために、アミノ酸置換により、位置７６及び８９のシステイン及びメチオニン残基を置き換えた。ダイマー形成を防止するために位置７６のシステインをグリシンで置き換えたネイティブレクチン配列のＵＬＬＢ－０００５／０１５変異体は、コントロールと比較して生物学的活性に影響を与えずに可溶性形態のリコンビナントレクチンで発現された。同様に、タンパク質酸化を防止するために位置８９のメチオニンをバリンで置き換えたネイティブレクチン配列のＵＬＬＢ－０００５／０１６変異体は、コントロールと比較して生物学的活性に影響を与えずに可溶性形態で発現された。したがって、それぞれグリシン及びバリンによる位置７６及び８９のシステイン及びメチオニンの変更は、レクチンの発現、溶解性、特異性及び生物学的活性に影響を与えない。
表２．開始メチオニンの効率的な切断、ダイマー形成及びタンパク質酸化の防止のために設計したクローンの概要
ｉ．開始メチオニンの効率的な切断のために行った変更

ｉｉ．ダイマー形成及びタンパク質酸化の防止のために行った変更

また、以下に記載されているように生物学的活性を変化させるように、ネイティブレクチン配列を改変した。

ｃ）一次炭水化物結合部位の改変：
一次炭水化物結合部位は、ガン細胞において発現されるＴＦ抗原（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ－α－Ｓｅｒ／／Ｔｈｒ）に対する特異性を示す。一次炭水化物結合部位におけるアミノ酸を変化させ、タンパク質の溶解性、特異性及び生物学的活性に関して改変レクチンタンパク質を調査した。特異性及び生物学的活性に対する効果に関して、卵巣ガン細胞株（ＰＡ－１）に対する改変レクチンタンパク質の細胞毒性を評価した。一次炭水化物結合部位で行ったアミノ酸改変は表３に示されている。ネイティブレクチン配列のＵＬＬＢ－０００５／００８（Ｙ２７Ｇ及びＡ２８Ｗ）及びＵＬＬＢ－０００５／０１１（Ｒ１０５Ｆ）変異体は、可溶性形態のリコンビナントレクチンで発現された；しかしながら、生物学的活性は喪失した。ＵＬＬＢ－０００５／０１０（Ｈ７０Ｉ、Ｎ７１Ｗ及びＹ７２Ｇ）変異体は部分的に可溶性として発現され、この変異体の細胞毒性はリコンビナントレクチンよりも高かったのに対して、変異体ＵＬＬＢ－０００５／００９（Ｓ４７Ｌ及びＧ４８Ｗ）は封入体として発現された。したがって、一次炭水化物結合部位の変更は、レクチンの溶解性及び生物学的活性に影響を与える。この実施例におけるデータは、位置２７、２８、４７、４８、７０、７１、７２及び１０５のアミノ酸残基が一次炭水化物結合部位を規定することを実証している。一次炭水化物結合部位は、ガン性細胞の表面上に存在するＴＦ抗原との結合に関与すると結論付けた。
表３．一次炭水化物結合部位を変化させるように設計したクローンの概要

ｄ）二次炭水化物結合部位の改変：
ＧａｌＮＡｃ－α－（Ｔｎ抗原）との結合に関与する二次炭水化物結合部位を改変した。二次炭水化物結合部位におけるアミノ酸を変化させ、タンパク質の溶解性、特異性及び生物学的活性に関して改変レクチンタンパク質を調査した。卵巣ガン細胞株（ＰＡ－１）に対する特異性及び生物学的活性に対する効果を評価した。二次炭水化物結合部位で行ったアミノ酸改変は表４に示されており、リコンビナントレクチンの溶解性、特異性及び／又は生物学的活性に影響を与える。

７７、７８、８０、１０１、１１２又は１１４から二次結合部位を選択し、それぞれＤ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｙ及びＶからＦ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、Ｇ及びＮに置換するように改変して、ネイティブレクチン配列からいくつかの新たな変異体を調製した。二次炭水化物結合部位を変化させるように設計した変異体ＵＬＬＢ－０００５／０１２（Ｄ７７Ｆ、Ｉ７８Ｇ及びＴ８０Ｗ）及びＵＬＬＢ－０００５／０１４（Ｙ１１２Ｇ及びＶ１１４Ｎ）は、それぞれ封入体及び部分的に可溶性の形態のリコンビナントレクチンで発現された。ＵＬＬＢ－０００５／０１２変異体で行った好ましくないアミノ酸置換は、このタンパク質の不溶性発現に寄与した可能性がある。変異体ＵＬＬＢ－０００５／０１３は、ＰＡ－１細胞株に対する抗増殖活性の喪失を示したが、変異体ＵＬＬＢ－０００５／０１４は、コントロールクローンと比較して類似のＰＡ－１細胞株に対する抗増殖活性を示した。この実施例におけるデータは、位置７７、７８、８０、１０１、１１２及び１１４のアミノ酸残基が二次炭水化物結合部位を規定することを実証している。二次炭水化物結合部位の改変は、レクチンの溶解性及び生物学的活性に影響を与えると結論付けた。
表４．二次炭水化物結合部位を変化させるように設計したクローンの概要

実施例７：新たな部位特異的突然変異誘発
実施例１と同様に、配列番号２の変異体レクチン配列のアミノ酸配列を、本明細書の以下の表５に記載されているように、部位特異的突然変異誘発により異なる特定の位置で改変した。
表５：配列番号２の変異体レクチン配列由来の異なるレクチン変異体の構築に使用したプライマーのリスト。
ａ．一次炭水化物結合部位を変化させるためのクローン変異体

ｂ．二次炭水化物結合部位を変化させるためのクローン変異体

実施例８：配列番号２の変異体レクチン配列のアミノ酸改変。
以下に記載されているように物理化学的特性を変化させるように、ネイティブレクチン配列を改変した。

ａ．一次炭水化物結合部位の改変：
一次炭水化物結合部位は、ガン細胞において発現されるＴＦ抗原（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ－α－Ｓｅｒ／／Ｔｈｒ）に対する特異性を示す。一次炭水化物結合部位におけるアミノ酸を変化させ、タンパク質の溶解性、特異性及び生物学的活性に関して改変レクチンタンパク質を調査した。特異性及び生物学的活性に対する効果に関して、卵巣ガン細胞株（ＰＡ－１）に対する改変レクチンタンパク質の細胞毒性を評価した。一次炭水化物結合部位で行ったアミノ酸改変は表６に示されている。ネイティブレクチン配列の変異体ＵＬＬＢ－０００５／０２８（Ｙ２７Ｅ）、ＵＬＬＢ－０００５／０３２（Ａ２８Ｄ）、ＵＬＬＢ－０００５／０１８（Ｒ１０５Ｑ）、ＵＬＬＢ－０００５／０３５（Ｒ１０５Ｓ）、ＵＬＬＢ－０００５／０４３（Ｒ１０５Ｗ）及びＵＬＬＢ－０００５／０４５（Ｒ１０５Ｃ）は、可溶性形態のリコンビナントレクチンで発現された；しかしながら、生物学的活性は喪失した。変異体ＵＬＬＢ－０００５／０２１（Ｒ１０５Ｋ）ＵＬＬＢ－０００５／０４７（Ｒ１０５Ｈ）は可溶性形態で発現され、この変異体の細胞毒性は他の変異体よりもかなり高かった。これは、置換されたアミノ酸の基本的性質のためである可能性がある。同様に、非極性グラルギンによるＡ２８の保存的置換（Ａ２８Ｇ－ＵＬＬＢ－０００５／０３１）も可溶性形態で発現され、この変異体の細胞毒性は他の変異体よりもかなり高かった。変異体ＵＬＬＢ－０００５／０１９（Ｒ１０５Ｅ）及びＵＬＬＢ－０００５／０４６（Ｒ１０５Ｄ）は封入体として発現された。酸性アミノ酸によるＲ１０５の置換は、このタンパク質の不溶性発現に寄与した可能性がある。変異体ＵＬＬＢ－０００５／０３４（Ｒ１０５Ａ）、ＵＬＬＢ－０００５／０３７（Ｒ１０５Ｉ）、ＵＬＬＢ－０００５／０３８（Ｒ１０５Ｐ）及びＵＬＬＢ－０００５／０４１（Ｒ１０５Ｔ）は可溶性形態で発現されたので、コントロールと比較して影響を受けなかった。したがって、一次炭水化物結合部位の変更は、レクチンの溶解性及び生物学的活性に影響を与える。この実施例におけるデータは、位置２７、２８及び１０５のアミノ酸残基が一次炭水化物結合部位を規定することを実証している。一次炭水化物結合部位は、ガン性細胞の表面上に存在するＴＦ抗原との結合に関与すると結論付けた。
表６．一次炭水化物結合部位を変化させるように設計したクローンの概要

ｂ．二次炭水化物結合部位の改変：
ＧａｌＮＡｃ－α－（Ｔｎ抗原）との結合に関与する二次炭水化物結合部位を改変した。二次炭水化物結合部位におけるアミノ酸を変化させ、タンパク質の溶解性、特異性及び生物学的活性に関して改変レクチンタンパク質を調査した。卵巣ガン細胞株（ＰＡ－１）に対する特異性及び生物学的活性に対する効果を評価した。二次炭水化物結合部位で行ったアミノ酸改変は表７に示されており、リコンビナントレクチンの溶解性、特異性及び／又は生物学的活性に影響を与える。ＲをＱ、Ｍ、Ｅ及びＫで置換するように二次結合部位１０１を改変して、ネイティブレクチン配列からいくつかの新たな変異体を調製した。位置１０１の好ましい及び中立的置換は、変異体ＵＬＬＢ－０００５／０２２（Ｒ１０１Ｑ）、ＵＬＬＢ－０００５／０２３（Ｒ１０１Ｍ）、ＵＬＬＢ－０００５／０２４（Ｒ１０１Ｅ）及びＵＬＬＢ－０００５／０２５（Ｒ１０１Ｋ）の可溶性発現をもたらし、コントロールクローンと比較して類似のＰＡ－１細胞株に対する抗増殖活性を示した。この実施例におけるデータは、位置１０１のアミノ酸残基が二次炭水化物結合部位を規定することを実証している。二次炭水化物結合部位の改変は、リコンビナントレクチンの可溶性発現をもたらし、コントロールと同程度の生物学的活性を示すと結論付けた。
表７．二次炭水化物結合部位を変化させるように設計したクローンの概要

配列の概要
配列番号１

配列番号２

配列番号３

配列番号４

この説明では、このユニークな統合された本発明を構成するプロセス、機器及びシステムへの複数のアプローチについて言及したが、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、記載されている実施態様の多くの変更及び改変を行い得ると理解される。添付の実施例は、例示として、本発明の特定の例示的なアプローチを示す。これらのアプローチは、当業者による本発明の実施を可能にするために十分に詳細に記載されており、様々な開示されているアプローチの改変が当業者により行われ得ると理解すべきである。

上記方法及び工程が特定の順序で起こる特定の事象を示す場合、当業者は、特定の工程の順序を改変し得ること、及びこのような改変が本発明の原理に従うことを認識するであろう。加えて、可能な場合には、特定の工程を並行プロセスで同時に実施してもよいし、逐次に実施してもよい。

Claims (13)

1. 改変レクチンタンパク質であって、
   配列番号５及び配列番号１４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、
   改変レクチンタンパク質。
2. 請求項１に記載の改変レクチンタンパク質と、薬学的に許容し得る希釈剤又は賦形剤と、場合によりさらなる治療成分とを含む、医薬組成物。
3. ガンの処置において使用するための、請求項１に記載の改変レクチンタンパク質。
4. ガン細胞の検出、ガン診断及び／又はガン治療において使用するための、請求項１に記載の改変レクチンタンパク質。
5. 請求項１に記載の改変レクチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
6. 請求項５に記載の核酸分子のインサートを含む、リコンビナントベクター。
7. ５’から３’方向に作動可能に連結された、宿主細胞において機能するプロモーターと、改変レクチンタンパク質をコードする請求項５に記載のヌクレオチド配列と、終結シグナルとを含む、請求項６に記載のリコンビナントベクター。
8. 単細胞生物において複製、転写、翻訳及び／又は発現されることができる、請求項６又は７に記載のリコンビナントベクター。
9. 請求項５に記載の核酸分子又は請求項６～８のいずれか一項に記載のリコンビナントベクターを含む、トランスフォーメーション宿主細胞。
10. 宿主細胞が、Escherichia coli細菌又は酵母細胞である、請求項９に記載のトランスフォーメーション宿主細胞。
11. リコンビナントSclerotium rolfsiiレクチンタンパク質を生産するための方法であって、
    ｉ）リコンビナントレクチンタンパク質をコードする請求項６～８のいずれか一項に記載のリコンビナントベクターを含有する宿主細胞を培養すること；
    ｉｉ）前記リコンビナントレクチンタンパク質を発現させること；及び
    ｉｉｉ）前記培養物から粗リコンビナントレクチンタンパク質を単離すること
    を含む、方法。
12. ガンの処置において使用するための、請求項２に記載の医薬組成物。
13. ガン細胞の検出、ガン診断及び／又はガン治療において使用するための、請求項２に記載の医薬組成物。