BR112021008961A2 - Combinação de quimioterapia com lectina s. rolfsii recombinante - Google Patents

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Sudeep Kumar
Sachin Prabhakar Bachate
Mohanish Pradeep Kankonkar
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Abstract

combinação de quimioterapia com lectina s. rolfsii recombinante. a presente invenção diz respeito à quimioterapia combinada com proteína de lectina recombinante. a invenção diz respeito especificamente ao efeito citotóxico da proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos seq id no: 1 em combinação com outros agentes terapêuticos, onde os outros agentes terapêuticos são agentes anticâncer. as combinações são altamente sinérgicas e eficazes contra vários cânceres.

Description

COMBINAÇÃO DE QUIMIOTERAPIA COM LECTINA S. ROLFSII RECOMBINANTE Referência cruzada a pedidos relacionados
[001] É reivindicado o benefício do Pedido Provisório Indiano nº 201821022667 protocolado em 18 de dezembro de 2018 e 201821043455 protocolado em 19 de novembro de 2018, cujo conteúdo inteiro está incorporado aqui por referência. Campo de Invenção
[002] A presente invenção diz respeito a combinações biofarmacêuticas de proteína de lectina recombinante com outros agentes terapêuticos e seus efeitos antiproliferativos para controlar a proliferação descontrolada de células em cânceres. Fundamento da Invenção
[003] Um câncer começa com um tumor primário, que é inchaço ou alargamento mórbido que resulta de uma superabundância de crescimento e divisão celular. Tumores podem ser benignos, pré-malignos ou malignos, ou podem significar uma lesão sem potencial cancerígeno. Um tumor benigno é um tumor não canceroso e um tumor maligno é um tumor cancerígeno. Câncer é quando células anormais se dividem de forma descontrolada. O câncer às vezes pode se espalhar para outras partes do corpo – isso é chamado de tumor secundário ou metástase.
[004] As terapias de tratamento do câncer incluem a remoção cirúrgica dos tecidos cancerígenos, quimioterapia, poliquimoterapia, radioterapia, imunoterapia, etc. Essas terapias são muitas vezes técnicas invasivas que também afetam as células saudáveis normais junto com as células cancerosas. Também essas terapias são utilizadas em combinação para alcançar efeito sinérgico, resultando em aumentar o potencial terapêutico das drogas constituintes, diminuir a dose, reduzir a toxicidade dos medicamentos e retardar a indução da resistência medicamentosa.
[005] As quimioterapias para o tratamento do câncer são decididas com base no modo de proliferação de células cancerosas. Diferentes propriedades dos agentes quimioterápicos, como agentes anti-metabólicos, que interferem na produção ou uso de metabólitos exigidos por cânceres; agentes antimicrotúbulos, que interferem na formação de microtúbulos, necessários para a mitose; agentes alquilantes, capazes de interferir na alquilação do DNA bloqueando a replicação do DNA; agentes baseados em platina que são capazes de fazer ligações cruzadas de DNA; agentes antibióticos antitumorais, e inibidores de topoisomerase, que inibem a enzima topoisomerase necessária para a replicação do DNA.
[006] O antígeno Oncofetal Thomsen-Friedenreich (Galβ1-3GalNAc-α-O- Ser/Thr, T ou TF), que é expresso em mais de 90% dos cânceres, incluindo câncer bucal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de ovário, bem como câncer de bexiga e expressão de TF está correlacionado com a progressão do tumor e metástase. O pedido de patente anterior do requerente 350/MUM/2009 divulga uma proteína de lectina recombinante isolada de corpos esclerotiais de fungos Sclerotium rolfsii com alta especificidade de ligação para o antígeno de carboidratos TF oncofetal.
[007] Uma terapia combinada para o tratamento do câncer é um tratamento eficaz devido à citotoxicidade indesejável das células saudáveis. A complexidade da doença, sua tendência a se espalhar, além de seu local original e tornar-se resistente a certas drogas e sua diversidade genética ressalta a necessidade de uma variedade de abordagens para atacá- la. A terapia combinada não só aumenta as chances de uma cura ou remissão a longo prazo, mas também reduz os danos a órgãos e tecidos vitais mais do que uma única abordagem. Um tipo de terapia às vezes pode tornar um tumor mais vulnerável a um segundo tipo. Certos medicamentos quimioterápicos, por exemplo, podem aumentar a vulnerabilidade dos tumores à radioterapia. Em outros casos, as drogas podem ter um efeito sinérgico quando administradas em conjunto e aumentar a potência umas das outras, de modo que a eficácia combinada é maior do que o impacto individual. Usá-los em combinação tem um efeito multiplicador: seus benefícios são ampliados muitas vezes. US 5053386 (1991) refere-se à composição e métodos de tratamento que compreendem lectinas, Abrin e Abrus Agglutinin para a supressão da metástase tumoral maligna pós-cirúrgica. Também revela o uso de uma proteína em combinação com o tratamento de radiação e/ou quimioterapia.
[008] Bioquímica molecular e celular (Vol – 394 (1-2); Página - 225-235; Ano - 2014) divulga os efeitos da lectina do visco coreano (Viscum album var. coloratum agglutinin, VCA) e doxorubicina (DOX) em células de câncer de mama humana MCF-7 (receptor de estrogênio positivo) e MDA-MB231 (receptor de estrogênio-negativo), em combinação e isoladas. A combinação de VCA e DOX mostrou um forte efeito sinérgico na inibição do crescimento celular, em comparação apenas com o tratamento VCA ou DOX.
[009] Oncotarget (Vol: 8 (26), Página: 42466 -42477, Ano: 2017) divulga tratamento combinado com lectina de ligação de ácido pemetrexado e sálico isolada de oócitos Ranacatesbeiana (cSBL) resultando em maior citotoxicidade dependente de dose do que a combinação de pemetrexado e cisplatina, o padrão de cuidado em mesotelioma.
[0010] No entanto, a dificuldade não é todas essas terapias combinadas que resultam em efeitos benéficos. Por isso, atualmente, a pesquisa está focada no desenvolvimento de novos e úteis parceiros de combinação anti-proliferativa.
[0011] Para combater uma doença que ameaça a vida como o câncer, é necessário um momento para desenvolver o melhor método para sua prevenção e tratamento. Terapia de combinação parece ser uma dessas opções. Objetivo da Invenção
[0012] O principal objetivo da presente invenção é fornecer um método alternativo para tratar ou prevenir o crescimento de células cancerígenas. Mais especificamente, o objetivo é desenvolver um método acessível e eficiente para tratar ou prevenir o crescimento de células cancerígenas.
[0013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma terapia eficaz para prevenção ou tratamento do câncer. Precisamente o objetivo da presente invenção é fornecer uma terapia combinada para a prevenção ou tratamento do câncer, onde a combinação é uma combinação sinérgica que compreende uma proteína de lectina recombinante.
[0014] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma combinação terapeuticamente eficaz para a prevenção e/ou tratamento do câncer.
[0015] Outro objetivo da invenção é proporcionar uma concentração eficaz da combinação sinérgica terapeuticamente eficaz para a prevenção e/ou tratamento do câncer.
[0016] Outro objetivo da invenção é fornecer uma formulação farmaceuticamente aceitável de concentrações eficazes da combinação terapeuticamente eficaz para a prevenção e/ou tratamento do câncer.
[0017] Outro objetivo da invenção é fornecer combinações de proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 útil na prevenção, tratamento ou inibição da proliferação de células cancerosas. Sumário da Invenção
[0018] O principal aspecto da presente invenção é a combinação terapeuticamente eficaz que compreende a proteína lectina recombinante e um ou mais outro agente terapêutico.
[0019] De preferência, a combinação é sinérgica.
[0020] Preferencialmente, a concentração de proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL.
[0021] Preferencialmente, a combinação terapêutica eficaz é utilizada para prevenção ou tratamento do câncer em um sujeito.
[0022] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de lectina recombinante para o tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito em que a proteína de lectina recombinante é administrada em combinação com um ou mais outro agente terapêutico, e onde o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0023] De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, existe um método de tratamento ou prevenção do câncer ou inibição do crescimento de células tumorais em um sujeito que compreende a administração ao sujeito de uma quantidade efetiva de proteína de lectina recombinante em combinação com um ou mais outro agente terapêutico, em que o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0024] De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é fornecida uma terapia combinada para prevenção, proliferação, tratamento ou cura de câncer ou tumor em um sujeito composto pela administração de proteína lectina recombinante, seja em combinação com um ou mais outro agente terapêutico, e em que o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0025] Vantajosamente, o outro agente terapêutico é um agente anticâncer.
[0026] De preferência, o agente anticâncer é um antibiótico antitumoral.
[0027] De preferência, o agente anticâncer é um antimetabólito, um agente antineoplásico alquilante, um agente anti-microtúbulo e/ou um inibidor topoisomerase I.
[0028] Mais de preferência, o agente anticâncer é uma oxazafosforina, uma mostarda de nitrogênio, um agente antineoplásico alquilante, um inibidor topoisomerase I,
um inibidor topoisomerase II, um alcaloide vinca, um taxano, um antifolato, ou um antagonista pirimidina.
[0029] Mais preferencialmente, o antimetabólito é selecionado a partir de 5- Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, Metotrexato, Pemetrexede ou Capecitabina.
[0030] Mais de preferência, o agente antineoplásico alquilante é um agente antineoplásico à base de platina selecionado de cisplatina ou carboplatina.
[0031] Mais preferencialmente, o agente antimicrotúbulo é selecionado de Paclitaxel, Docetaxel, Abraxano ou Taxotere.
[0032] Mais de preferência, o inibidor topoisomerase I é selecionado de Irinotecano ou Topotecan.
[0033] Vantajosamente, o agente anticâncer é cisplatina e a combinação é usada para o tratamento ou prevenção de câncer bucal, câncer de ovário ou câncer de bexiga em um sujeito.
[0034] Preferencialmente em que o câncer é câncer bucal e a concentração da lectina recombinante é de 10 a 90 μg/mL e a concentração de cisplatina é de 0,1 a 1,5 μM, ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 5 μg/mL e a concentração de cisplatina é de 0,5 a 1,5 μM.
[0035] Preferencialmente em que o câncer é câncer de ovário e a concentração da lectina recombinante é de 1 a 2,5 μg/mL e a concentração de cisplatina é 0. 25 a 5 μM, ou quando a concentração da lectina recombinante é de 5 μg/mL e a concentração de cisplatina é de 0,1 a 5 μM, ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 10 a 20 μg/mL e a concentração de cisplatina é de 0,01 a 5 μM.
[0036] Preferencialmente em que o câncer é câncer de bexiga e a concentração da lectina recombinante é de 5 a 80 μg/mL e a concentração de cisplatina é de 1 a 500 μM
[0037] Vantajosamente, o agente anticâncer é 5-FU e a combinação é usada para o tratamento ou prevenção do câncer oral, pancreático ou de cólon.
[0038] Preferencialmente em que o câncer é câncer bucal e a concentração da lectina recombinante é de 5 a 90 μg/mL e a concentração de 5-FU é de 0,01 a 5 μM.
[0039] Preferencialmente em que o câncer é câncer de pâncreas e a concentração da lectina recombinante é de 10 a 80 μg/mL e a concentração de 5-FU é de 1 a
250 μM, ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 5 μg/mL e a concentração de 5-FU é de 1 a 50 ou 250 μM.
[0040] Preferencialmente em que o câncer é câncer de cólon e a concentração da lectina recombinante é de 5 a 80 μg/mL e a concentração de 5-FU é de 10 a 200 μM, ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 1 μg/mL e a concentração de 5-FU é de 50 a 200 μM;
[0041] Vantajosamente, o agente anticâncer é Irinotecanand e a combinação é usada para o tratamento ou prevenção do câncer de cólon.
[0042] Preferencialmente em que a concentração da lectina recombinante seja de 40 a 80 μg/mL e a concentração de Irinotecano seja de 1 a 50 μM, ou em que a concentração da lectina recombinante seja de 20 μg/mL e a concentração de Irinotecano seja de 1 ou 10 a 50 μM.
[0043] Vantajosamente, o agente anticâncer é Paclitaxel para o tratamento ou prevenção de ovário ou câncer de mama.
[0044] Preferencialmente em que o câncer é câncer de ovário e a concentração da lectina recombinante é de 1 a 20 μg/mL e a concentração de Paclitaxel é de 0,25 a 5 nM.
[0045] Preferencialmente em que o câncer é câncer de mama e a concentração da lectina recombinante é de 20 a 80 μg/mL e a concentração de Paclitaxel é de 0,1 a 10 nM; ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 10 μg/mL e a concentração de Paclitaxel é de 1 a 10 nM.
[0046] Vantajosamente, o agente anticâncer é Gemcitabina e a combinação é usada para o tratamento ou prevenção de câncer de bexiga ou pâncreas.
[0047] Preferencialmente em que o câncer é câncer de bexiga e a concentração da lectina recombinante é de 2,5 a 80 μg/mL e a concentração de Gemcitabina é de 1 a 300 μM.
[0048] Preferencialmente em que o câncer é câncer de pâncreas e a concentração de lectina recombinante é de 5 a 20 μg/mL e a concentração de Gemcitabina é de 5 a 25 μM; ou na qual a concentração da lectina recombinante é de 40 a 80 μg/mL e a concentração de Gemcitabina é de 1 a 25 μM.
[0049] Vantajosamente, o agente anticâncer é carboplatina e a combinação é utilizada para o tratamento ou prevenção do câncer de mama;
[0050] Preferencialmente em que a concentração da lectina recombinante seja de 5 a 80 μg/mL e a concentração de Carboplatina seja de 50 a 1000 μM; ou em que a concentração da lectina recombinante é de 2,5 μg/mL e a concentração de Carboplatina é de 100 a 1000 μM.
[0051] Vantajosamente, a proteína lectina recombinante é uma proteína com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou ter pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de homologia ao SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[0052] Preferencialmente, a concentração da proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL. Mais de preferência, a concentração da proteína de lectina recombinante está na faixa de 1 μg/mL a 90 μg/mL.
[0053] Preferencialmente, a concentração do outro agente terapêutico está na faixa de 0,001 nM a 1000 μM.
[0054] Preferencialmente, a concentração de Cisplatina está na faixa de 0,01 μM a 500 μM.
[0055] Preferencialmente, a concentração de 5-Flurouracil (5-FU) está na faixa de 0,01 μM a 250 μM.
[0056] De preferência, a concentração de Irinotecano está na faixa de 0,1 μM a 50 μM.
[0057] Preferencialmente, a concentração de Paclitaxel está na faixa de 0,001 nM a 10 nM.
[0058] Preferencialmente, a concentração de Gemcitabina está na faixa de 0,01 μM a 300 μM.
[0059] Preferencialmente, a concentração de Carboplatina está na faixa de 10 μM a 1000 μM.
[0060] Vantajosamente, a combinação compreende uma dosagem da lectina recombinante e uma dosagem do outro agente terapêutico adequado para alcançar um efeito terapêutico.
[0061] Preferencialmente, a dosagem da lectina recombinante é adequada para alcançar uma concentração da lectina recombinante in vivo de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL.
[0062] Preferencialmente, a dosagem do outro agente terapêutico é adequada para atingir uma concentração do outro agente terapêutico in vivo de 0,001 nM a 1000 μM.
[0063] Preferencialmente, a dosagem de Cisplatina é adequada para atingir uma concentração de Cisplatina in vivo de 0,01 μM a 500 μM.
[0064] Preferencialmente, a dosagem de 5-Flurouracil (5-FU) é adequada para alcançar uma concentração de 5-Flurouracil (5-FU) in vivo de 0,01 μM a 250 μM.
[0065] Preferencialmente, a dosagem de Irinotecano é adequada para alcançar uma concentração de Irinotecano in vivo de 0. 1 μM a 50 μM.
[0066] Preferencialmente, a dosagem de Paclitaxel é adequada para atingir uma concentração de Paclitaxel in vivo de 0,001 nM a 10 nM.
[0067] Preferencialmente, a dosagem de Gemcitabina é adequada para alcançar uma concentração de Gemcitabina in vivo de 0,01 μM a 300 μM.
[0068] Vantajosamente, a combinação da proteína de lectina recombinante e do outro agente terapêutico, é uma composição. Preferencialmente, a composição compreende ainda mais um ou mais excipientes farmacêuticos aceitáveis.
[0069] De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecida uma proteína de lectina recombinante em combinação com um ou mais outro agente terapêutico para o tratamento ou prevenção do câncer em que o outro agente terapêutico é selecionado de um ou mais de 5-Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, cisplatina, Paclitaxel, carboplatina ou Irinotecano.
[0070] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento de câncer bucal, câncer de ovário ou câncer de bexiga, onde a proteína de lectina recombinante é administrada em combinação com Cisplatina, e onde a Cisplatina é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0071] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento de câncer oral, pancreático ou cólon, onde a proteína de lectina recombinante é administrada em combinação com 5-FU, e onde 5-FU é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0072] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento do câncer de cólon, onde a proteína de lectina recombinante é administrada ou em combinação com Irinotecan, e onde Irinotecano é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0073] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento do câncer de ovário ou câncer de mama, onde a proteína de lectina recombinante é administrada ou em combinação com Paclitaxel, e onde o Paclitaxel é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0074] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento de câncer de bexiga ou câncer de pâncreas, onde a proteína de lectina recombinante é administrada ou em combinação com Gemcitabina, e onde Gemcitabina é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0075] Preferencialmente, a lectina recombinante é para o tratamento do câncer de mama, onde a proteína de lectina recombinante é administrada ou em combinação com carboplatina, e onde a carboplatina é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0076] De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido um agente terapêutico para o tratamento ou prevenção do câncer, em combinação com uma proteína de lectina recombinante, em que o agente terapêutico é selecionado de um ou mais de 5- Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, Cisplatina, Paclitaxel, Carboplatina ou Irinotecano.
[0077] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento de câncer bucal, câncer de ovário ou câncer de bexiga, em que o agente terapêutico é Cisplatina, e onde a Cisplatina é administrada em combinação com a proteína de lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombinante é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0078] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento de câncer oral, pancreático ou cólon, em que o agente terapêutico é 5-FU, e em que o 5-FU é administrado em combinação com a proteína lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombinante é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0079] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento do câncer de cólon, no qual o agente terapêutico é Irinotecan, e onde o Irinotecano é administrado em combinação com a proteína de lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombinante é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0080] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento do câncer de ovário ou câncer de mama, no qual o agente terapêutico é Paclitaxel, e onde o Paclitaxel é administrado em combinação com a proteína de lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombinante é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0081] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento de câncer de bexiga ou câncer de pâncreas, em que o agente terapêutico é Gemcitabina, e em que a Gemcitabina é administrada em combinação com a proteína de lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombina é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[0082] Preferencialmente, o agente terapêutico é para o tratamento do câncer de mama, no qual o agente terapêutico é Carboplatina, e onde a Carboplatina é administrada em combinação com a proteína de lectina recombinante, e onde a proteína de lectina recombinante é administrada simultaneamente, separadamente ou sequencialmente. Descrição da Invenção Definições
[0083] O termo "proteína" como aqui usado refere-se a um polímero de resíduos de aminoácidos.
[0084] O termo "aminoácido" como aqui usado refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que têm uma função semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético e incluem os aminoácidos proteinogênicos. Aminoácidos que ocorrem naturalmente também incluem aqueles modificados após a tradução em células. Aminoácidos sintéticos incluem aminoácidos não canônicos, como selenocisteína e pirrolisina. Aminoácidos tipicamente sintéticos não são aminoácidos proteinogênicos.
[0085] Os termos "Câncer" e "Tumor", são intercambiáveis na presente invenção, têm o mesmo significado compreendido pela pessoa versada na técnica. Elas se formam quando as células normais ficam fora de controle e aglomeram células saudáveis do corpo. A formação de um crescimento tão grande afeta o funcionamento normal do tecido/órgão/organismo. O câncer pode começar em qualquer lugar do corpo e também pode se espalhar para outras partes do corpo. Quando as células cancerígenas se espalham dentro do corpo, é chamada de metástase.
[0086] O termo "recombinante" significa que um ácido nucleico ou um polipeptídeo foi artificial ou sinteticamente (ou seja, não naturalmente) alterado pela intervenção humana. A alteração pode ser realizada no material dentro ou removido de seu ambiente natural ou estado. Por exemplo, um "ácido nucleico recombinante" é aquele que é feito por ácidos nucleicos recombinados, por exemplo, durante a clonagem, embaralhamento de DNA ou outros procedimentos biológicos moleculares bem conhecidos. Uma "molécula de DNA recombinante" é composta por segmentos de DNA unidos por meio de tais técnicas biológicas moleculares. O termo "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombinante" como aqui usado refere-se a uma molécula de proteína que é expressa usando uma molécula de DNA recombinante.
[0087] O termo "lectina" como aqui usado refere-se a uma proteína de ligação de carboidratos. Mais especificamente, a proteína de lectina recombinante da presente invenção é a lectina derivada de lectina Sclerotium rolfsii (SRL). Lectina Sclerotium rolfsii (SRL) é uma lectina que foi isolada dos corpos esclerotiais do fungo fitopatagênico S. rolfsii.
[0088] Os termos "homologia" ou "homólogos" utilizados aqui referem-se a duas ou mais entidades referenciadas que compartilham pelo menos identidade parcial sobre uma determinada região ou porção. Áreas, regiões ou domínios de homologia ou identidade referem-se a uma parcela de duas ou mais entidades referenciadas que são semelhantes ou são as mesmas. Assim, onde duas sequências são idênticas ao longo de uma ou mais regiões sequenciais, elas compartilham identidade nessas regiões. A homologia substancial refere-se a uma molécula que é estrutural ou funcionalmente conservada de tal forma que tenha, ou é previsto ter, pelo menos uma estrutura ou função semelhante (por exemplo, uma função biológica ou atividade) a uma molécula de referência. Ou pode significar que a molécula tem uma região ou porção relevante/correspondente que compartilha a homologia com a da molécula de referência.
[0089] Em uma modalidade, a porcentagem de "homologia" entre duas sequências é determinada usando o algoritmo BLASTP com parâmetros padrão (Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Set 1;25(17):3389-402). Em particular, o algoritmo BLAST pode ser acessado na internet usando a URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Em uma modalidade alternativa, para alinhamentos de sequência global, a disselogia percentual entre duas sequências é determinada usando o algoritmo EMBOSS Needle usando parâmetros padrão. Em particular, o algoritmo EMBOSS Needle pode ser acessado na internet usando a URL: https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/.
[0090] Salvo indicação em contrário, o termo "homologia" é usado intercambiavelmente com o termo "identidade sequencial" no presente relatório.
[0091] O termo "proteína de lectina recombinante" destina-se aqui a cobrir qualquer sal, solvato, hidratado, prodroga ou qualquer outro composto que, após a administração do paciente, seja capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o composto conforme descrito aqui. A preparação de sais, solvates, hidratados e pró-medicamentos pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica.
[0092] Como aqui utilizado, os termos "terapias" e "terapia" podem se referir a qualquer método, composição e/ou ingrediente ativo que possa ser usado no tratamento, prevenção e/ou manejo da doença ou um ou mais sintomas.
[0093] O termo "terapia de combinação" como usado ao longo da especificação, destina-se a abranger a administração a um paciente que sofre de câncer dos agentes terapêuticos referidos nas mesmas formulações farmacêuticas referidas, e ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Se os agentes terapêuticos forem administrados em momentos diferentes, eles devem ser administrados suficientemente perto a tempo de prover a resposta potencializante ou sinérgica a ocorrer.
[0094] O termo "quimioterapia" refere-se ao uso de drogas para tratar o câncer. Como aqui usado, um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento do câncer.
[0095] O agente terapêutico que pode ser usado em combinação com proteína de lectina recombinante é preferencialmente um agente quimioterápico. Não há limitações no agente quimioterápico (o termo agente quimioterápico tem o mesmo significado que o conhecido por uma pessoa qualificada na técnica) que pode ser usado nesta invenção. Exemplos não limitadores de tais agentes quimioterápicos são agentes alquilantes como, por exemplo, mitomicina C, ciclofosfame, busulfan, ifosfamida, isosfamida, melfalan, hexametilmelamina, thiotepa, clorofilicida, mecloethamina ou dacarbazina; antimetabólitos como, por exemplo, gemcitabina, capecitabina, 5-fluorouracil, cytarabina, 2-fluorodeoxy cytidine, metotrexate, idatrexate, tomudex ou trimetrexate; inibidores topoisomerase II como, por exemplo, doxorubicina, epirubicina, etoposide, teniposide ou mitoxantrone; inibidores topoisomerase I tais como, por exemplo, irinotecano (CPT-11), 7-ethyl-10-hidroxi- camptothecin (SN-38) ou topotecan; drogas antimitóticas como, por exemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina ou vinorelbina; e derivados de platina como, por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, espirrraplatina ou carboplatina.
[0096] Os agentes quimioterápicos podem ser amplamente classificados como descrito acima. Eles também podem ser classificados em subclasses como descrito na tabela abaixo. Classe principal Subclasse Agentes quimioterápicos oxazafosforina ciclofosfamatida, ifosfamida, isosfamida, melfalano, clorambucil, busulfano, Mostardas de nitrogênio mecloretamina Agentes alquilantes Agentes baseados em Cisplatina, Carboplatina, Oxaliplatina, platina Espiroplatina tiotepa, dacarbazina; mitomicina C, Outros hexametilmelamina irinotecano (CPT-11), 7-etil-10- Topoisomerase I Inibidores de hidroxicamptotecina (SN-38) ou topotecano topoisomerase doxorrubicina, epirrubicina, etoposido, Topoisomerase II teniposido ou mitoxantrona; Inibidores Alcaloides vinca vinblastina, vincristina ou vinorelbina; mitóticos Taxanes paclitaxel, docetaxel, Antifolatos metotrexato, ou trimetrexato; tomudex Antimetabólitos Antagonistas da gencitabina, capecitabina, 5-fluorouracil, pirimidina citarabina, 2-fluorodeoxi citidina,
Outros idatrexato,
[0097] O termo "radioterapia" ou "radioterapia" é o tratamento do câncer e outras doenças com radiação ionizante. A radiação ionizante deposita energia que fere ou destrói células na área que estão sendo tratadas danificando seu material genético, tornando impossível que essas células continuem a crescer. Embora a radiação danifique tanto as células cancerígenas quanto as células normais, estas últimas são capazes de se reparar e funcionar corretamente. A radioterapia utilizada de acordo com a presente invenção pode incluir, mas não se limita a, o uso de raios gama, raios-X e/ou a entrega direcionada de radioisótopos às células tumorais. Outras formas de fatores nocivos ao DNA também são contempladas, como micro-ondas e irradiação UV. Contempla-se ainda que a radioterapia pode incluir o uso de anticorpos radiorotulados para fornecer doses de radiação diretamente ao local do câncer (radioimunoterapia) e/ou incluir o uso de um radiossensibilizador.
[0098] O termo "imunoterapia" depende do uso de células e moléculas de efeito imunológico para atingir e destruir células cancerígenas. O anticorpo sozinho pode servir como efeito da terapia ou pode recrutar outras células para realmente afetar a matança celular. O anticorpo também pode ser conjugado a uma droga ou toxina (quimioterápico, radionuclídeo, cadeia de ricina A, toxina de cólera, toxina da coqueluche, etc.) e servir apenas como um agente de alvo. Alternativamente, o efeito pode ser um linfócito carregando uma molécula superficial que interage, direta ou indiretamente, com um alvo de célula tumoral. Várias células efeitos incluem células T citotóxica e células NK. A combinação de modalidades terapêuticas, ou seja, atividade citotóxica direta e inibição ou redução do ErbB2 proporcionaria benefício terapêutico no tratamento de cânceres superexpressos ErbB2.
[0099] Como aqui usado, "Sal farmacêutico aceitável" refere-se a sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades de compostos que não são biologicamente ou indesejáveis. Sais farmacêuticos aceitáveis referem-se a sais farmacêuticos aceitáveis dos compostos, que os sais são derivados de uma variedade de íons orgânicos e inorgânicos bem conhecidos na técnica.
[00100] O termo "combinação farmacêutica" refere-se a qualquer combinação de um primeiro e segundo ingrediente farmacêutico, seja misturado em uma única composição ou mantido separadamente. O termo "composição farmacêutica" ou
"composição farmacêutica aceitável" ou "formulação farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma mistura de um composto aqui divulgado com excipientes farmacêuticos, como diluentes ou portadores (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (15 de setembro de 2012) e Manual de Excipientes Farmacêuticos, 6ª edição, Raymond Rowe, Pharmaceutical Press (2009)). A composição farmacêutica facilita a administração do composto a um organismo. As composições farmacêuticas serão geralmente adaptadas à rota específica pretendida da administração.
[00101] Os termos "eficaz" ou "terapêutico efetivo" referem-se a um efeito suficiente para provocar a resposta biológica desejada. Como será apreciado pelos versados na técnica, o efeito de uma combinação inventiva pode variar dependendo de fatores como o ponto final biológico desejado, a farmacocinética dos agentes que estão sendo entregues, a doença sendo tratada, o modo de administração e o paciente. O tratamento é geralmente "eficaz" se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Alternativamente, o tratamento é "eficaz" se a progressão de uma doença, desordem ou condição médica for reduzida ou interrompida.
[00102] Os valores do Índice de Combinação (IC) foram determinados no modelo de aditividade de Loewe para avaliar a natureza das interações medicamentosa- medicamentosa que podem ser aditivas (CI=1), antagônicas (CI>1) ou sinérgicas (CI<1) para várias concentrações de medicamentos e níveis de efeito (Fa, fração afetada; inibição da proliferação celular do câncer). Os valores de CI foram calculados com base em linhas de tendência de regressão linear usando o software CompuSyn (CompuSyn Inc., Paramus, N.J.), seguindo o método por Chou et al., pelo qual as curvas de efeito de dose hiperbólica e sigmoidal são transformadas em uma forma linear (Chou TC (2010) Estudos de combinação de drogas e sua quantificação de sinergia usando o método Chou-Talalay. Cancer Res 70: 440- 6, instruções também disponíveis em ComboSyn, Inc., www.combosyn.com).
[00103] Um efeito sinérgico permite o tratamento efetivo de uma doença usando quantidades menores (doses) da terapia individual. As doses mais baixas resultam em menor toxicidade sem eficácia reduzida. Além disso, um efeito sinérgico pode resultar em uma melhor eficácia. Finalmente, a sinergia pode resultar em uma melhor prevenção ou redução da doença em comparação com qualquer terapia única. O termo "aditivo" refere-se à soma de qualquer dois ou mais agentes terapêuticos em combinação. Como aqui usado, o termo "antagônico" refere-se a bloquear (por exemplo, reduzir ou prevenir) uma atividade biológica. O termo "inibir" ou "inibição" significa reduzir por uma quantidade mensurável.
[00104] Como aqui utilizado, o termo "agente anticâncer" refere-se a uma substância ou tratamento (por exemplo, radioterapia) que inibe a função das células cancerosas, inibe sua formação e/ou causa sua destruição in vitro ou in vivo.
[00105] O termo "antibiótico antitumor" refere-se a uma substância química que tem um efeito antitumoral. Em algumas modalidades, "antibiótico antitumor" referido aqui não é um antibiótico antibacteriano usado para tratar infecções. É um tipo de droga anticancerígena que bloqueia o crescimento celular interferindo no DNA.
[00106] O termo "Citotóxico" é usado em contexto com o efeito de agentes terapêuticos da presente invenção nas linhas celulares cancerígenas e significa "tóxico para as células". Os agentes terapêuticos eficazes na destruição das células cancerosas são chamados de citotóxicos ou descritos como tendo citotoxicidade.
[00107] O termo "IC50" ou IC50 refere-se a uma dose inibitória que causa 50% de inibição de um determinado parâmetro quantitativamente medido. Esta medida quantitativa indica quanto de uma determinada droga ou outra substância (inibidor) é necessária para inibir um determinado parâmetro biológico, bioquímico ou químico (ou componente de um parâmetro, ou seja, uma enzima, célula, receptor celular ou microrganismo) pela metade.
[00108] O termo "sinérgico" refere-se a uma combinação de dois ou mais agentes terapêuticos, que é mais eficaz do que os efeitos aditivos de qualquer dois ou mais agentes únicos. A sinergia dos agentes farmacológicos pode ser determinada quantitativamente através do cálculo dos valores do Índice de Combinação (CI).
[00109] Os valores de IC podem ser calculados com base nos valores de IC50 medidos para duas drogas A e B, utilizando a fórmula conforme dado abaixo. DA(50) DB(50) DA(50) × DB(50) CI = + + ICA(50) ICB(50) ICA(50) × ICB(50) onde
DA(50) = Concentração da droga A em combinação com B para produzir 50% de citotoxicidade ICA(50) = Concentração de droga A sozinha para produzir 50% de citotoxicidade DB(50) = Concentração da droga B em combinação com A para produzir 50% de citotoxicidade ICB(50) = Concentração da droga B sozinha para produzir 50% de citotoxicidade
[00110] Em que a droga A é uma lectina da invenção (por exemplo, uma proteína de SEQ ID NO: 1) e a droga B é o outro agente terapêutico que foi testado.
[00111] O sinergismo, aditivo ou antagonismo é determinado com base nos seguintes critérios: CI > 1 – o antagonismo é indicado CI = 1 – efeito aditivo é indicado CI < 1 – sinergismo é indicado
[00112] Como tal, se o valor de IC for calculado como inferior a um, isso indica que as drogas A e B têm um efeito sinérgico.
[00113] Como aqui utilizado, um "sujeito" refere-se a um animal que é objeto de tratamento, observação ou experimento. "Animal" inclui vertebrados e invertebrados de sangue frio e quente, como peixes, mariscos, répteis e, em particular, mamíferos. "Mamífero" inclui, sem limitação, ratos, ratos, coelhos, cobaias, cães, gatos, ovelhas, cabras, vacas, cavalos, primatas, como macacos, chimpanzés e macacos, e, em particular, humanos.
[00114] Além disso, qualquer droga referida aqui pode estar em forma amorfa ou cristalina, seja como composto livre ou como solvatos (por exemplo, hidratantes) e pretende-se que ambas as formas estejam no escopo da presente invenção. Métodos de solvação são geralmente conhecidos dentro da técnica. Breve Descrição das Sequências Anexas: SEQ ID NO: 1: representa uma variante da sequência de aminoácidos de lectina S. rolfsii (relatado como Rec-2 em WO 2010/095143). SEQ ID NO: 2: representa uma variante da sequência de aminoácidos de lectina S. rolfsii (relatado como Rec-3 em WO 2010/095143).
SEQ ID NO: 3: representa uma variante da sequência de aminoácidos de lectina S. rolfsii (relatado em WO 2014/203261).
[00115] Proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1
TYKIT VRVYQ TNPDA FFHPV EKTVW KYANG GTWTI TDDQH VLTMG GSGTS GTLRF HADNG ESFTA TFGVH NYKRW CDIVT NLAAD ETGMV INQQY YSQKN REEAR ERQLS NYQVK NAKGR NFQIV YTEAE GNDLH ANLII G
[00116] Proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2
VYKIT VRVYQ TNPDA FFHPV EKTVW KYANG GTWSI TDDQH VLTMG GSGTS GTLRF HADNG ESFTA TFGVH NYKRW CDIVT NLAAD ETGMV INQQY YSQKN REEAR ERQLS NYQVK NAKGR NFQIV YTEAE GNDLH ANLII G
[00117] Proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3
VYKIT VRVYQ TNPDA FFHPV EKTVW KYADG GTWSI TDDQH VLTMG GSGTS GTLRF HADNG ESFTA TFGVH DYKRW CDIVT DLAAD ETGMV INQEY YSEKD REEAR ERQNS
NYEVK DAKGR NFEIV YTEAE GNDLH ADLII G Descrição detalhada da invenção
[00118] A presente invenção relaciona-se, em geral, a uma combinação terapêutica eficaz que compreende uma proteína de lectina recombinante e um ou mais outros agentes terapêuticos.
[00119] Em certas modalidades, é fornecida uma combinação terapeuticamente eficaz que compreende uma proteína de lectina recombinante e um ou mais outros agentes terapêuticos, onde a combinação é sinérgica. Em algumas modalidades, a concentração da proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL. Terapia
[00120] A combinação terapeuticamente eficaz da presente invenção é para a prevenção do crescimento ou metástase do tumor, tratamento ou cura do câncer. De acordo com algumas modalidades, a combinação sinérgica pode ser usada para prevenção ou tratamento de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transitórias, carcinoma de células basais, sarcomas, linfomas, carcinomas de células epiteliais ou carcinomas de células não epiteliais. De acordo com uma modalidade particular, a terapia combinada da presente invenção pode ser usada para prevenção ou tratamento de câncer de pâncreas, câncer abdominal, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer bucal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de rim, câncer de estômago, câncer de mama, câncer de medula óssea, melanoma, leucemia ou câncer do sistema nervoso central em um sujeito.
[00121] De acordo com uma modalidade específica, a terapia combinada da presente invenção pode ser usada para prevenção ou tratamento de câncer de pâncreas, câncer bucal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de mama. Proteína Lectina
[00122] A proteína de lectina recombinante é a proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou, em algumas modalidades, uma proteína composta por uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia para SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína de lectina recombinante pode incluir uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia para SEQ ID NO: 2 ou 3. Em algumas modalidades, a proteína de lectina recombinante compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ao SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína de lectina recombinante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalidades, a proteína lectina compreende menos de 200 resíduos de aminoácidos, de preferência menos de 150 resíduos de aminoácidos. Outro Agente Terapêutico
[00123] Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é um agente anticâncer usado na quimioterapia para o tratamento do câncer. Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é selecionado a partir de agentes alquilantes como, por exemplo, mitomicina C, ciclofosfamida, busulfano, ifosfamida, isosfamida, melfalano, hexametilmelamina, tiotepa, clorambucil, mecloretamina ou dacarbazina; antimetabolitos tais como, por exemplo, gencitabina, capecitabina, 5-fluorouracilo, citarabina, 2-fluorodeoxi citidina, metotrexato, idatrexato, tomudex ou trimetrexato; inibidores da topoisomerase II,
tais como, por exemplo, doxorrubicina, epirrubicina, etoposido, teniposido ou mitoxantrona; inibidores da topoisomerase I, tais como, por exemplo, irinotecano (CPT-11), 7-etil-10- hidroxicamptotecina (SN-38) ou topotecano; fármacos antimitóticos, tais como, por exemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina ou vinorelbina; e derivados de platina tais como, por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, espiroplatina ou carboplatina.
[00124] De acordo com a sociedade americana de câncer (www.cancer.org), um agente quimioterápico usado para o tratamento de câncer de mama é selecionado de Paclitaxel Taxol, Docetaxel Taxotere, Doxorrubicina, Epirrubicina, Cisplatina, Carboplatina, Vinorelbina, Capecitabina, Gemcitabina, Ixabepilona e Eribulina. Da mesma forma, para o tratamento de cânceres de pâncreas, um agente quimioterapêutico é selecionado a partir de Gemcitabina, 5-fluorouracil, Oxaliplatina, paclitaxel, Capecitabina, Cisplatina e Irinotecano. Além disso, para o tratamento de câncer da cavidade oral e orofaringe, um agente quimioterápico é selecionado a partir de Cisplatina, Carboplatina, 5-Fluorouracil (5-FU), Paclitaxel, Docetaxel e Hidroxiureia. Da mesma forma, para o tratamento de cânceres do cólon ou reto, um agente quimioterápico é selecionado a partir de 5-FU, Capecitabina, Irinotecano, Oxaliplatina e uma combinação de Trifluridina e Tipiracil. Para o tratamento de câncer de ovário, a droga é selecionada a partir de compostos de platina, como cisplatina ou carboplatina e taxano, como Paclitaxel ou Docetaxel ou em combinação e para o tratamento de câncer de bexiga, o agente quimioterapêutico é selecionado de gemcitabina, cisplatina, metotrexato, vinblastina, Doxorrubicina, Carboplatina ou suas combinações.
[00125] De acordo com a modalidade específica da presente invenção, outroagente terapêutico pode ser selecionado entre Paclitaxel, Cisplatina e Carboplatina para câncer de mama ou câncer de ovário, Cisplatina e 5-FU para câncer oral, Cisplatina e Gemcitabina para câncer de bexiga, 5-FU e Gencitabina para câncer de pâncreas e 5-FU e irinotecano para câncer de cólon. Regime
[00126] A combinação terapeuticamente eficaz pode incluir a administração da proteína de lectina recombinante e do outro agente terapêutico ao sujeito nas mesmas formulações farmacêuticas ou separadas, e ao mesmo tempo ou em momentos diferentes em que a proteína de lectina recombinante e o outro agente terapêutico podem ser administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente em relação uns aos outros.
[00127] O termo "administração simultânea", como aqui usado, significa que a composição composta pela proteína lectina recombinante e o outro agente terapêutico são administradas com uma separação de tempo de no máximo cerca de 15 minutos(s), mais especificamente não mais do que qualquer um de 10, 5 ou 1 minutos. Quando a proteína lectina recombinante e o agente terapêutico são administrados simultaneamente, a proteína de lectina recombinante e o agente terapêutico podem estar contidos na mesma composição (por exemplo, uma composição composta por ambos, proteína lectina recombinante e um ou mais agente terapêutico) ou em composições separadas (por exemplo, a proteína lectina recombinante está contida em uma composição e um ou mais agentes terapêuticos estão contidos em outra composição).
[00128] Na "administração sequencial" o outro agente terapêutico é administrado antes ou depois da administração da proteína de lectina recombinante. Na administração sequencial, a proteína de lectina recombinante e o outro agente terapêutico/s podem ser administrados com uma separação de tempo de mais de 15 minutos, mais especificamente, mais do que qualquer um de 20, 30, 40, 50 e 60 ou mais minutos. Ou a proteína de lectina recombinante ou o outro agente terapêutico pode ser administrado primeiro. A proteína de lectina recombinante e o outro agente terapêutico/s estão contidos em composições separadas, que podem estar contidas nas mesmas ou diferentes embalagens.
[00129] Na "administração separada" a proteína de lectina recombinante e o outro agente terapêutico/s podem ser administrados de forma sequencial em que um é administrado primeiro e o outro segundo ou vice-versa. A separação de tempo entre as duas administrações é de mais de 60 minutos.
[00130] Em outra modalidade, é fornecido o uso de proteína de lectina recombinante para o tratamento ou prevenção de câncer que compreende a administração de proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 em combinação com outro agente terapêutico, em que o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00131] Em uma modalidade específica, há o uso de proteína de lectina recombinante para prevenção ou tratamento de câncer em um sujeito que compreende a administração ao sujeito uma quantidade efetiva de lectina recombinante em combinação com outro agente anticâncer selecionado de um antimetabólito, um agente antineoplásico alquilante, um agente antimicrotúbulo e um inibidor topoisomerase I, no qual o antimetabólito é selecionado a partir de 5-FU, Gemcitabina, Metotrexato, Pemetrexedo ou Capecitabina, o agente antineoplásico alquilante é um agente antineoplásico à base de platina selecionado de Cisplatina ou Carboplatina, o agente anti-microtúbulo é Paclitaxel, Docetaxel, Abraxane ou Taxotere inibidor e isomerase I de topoisomerase Topotecano, e em que o outro agente anticâncer é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00132] Em outra modalidade específica, há o uso de proteína de lectina recombinante para o tratamento ou prevenção de câncer que compreende a administração de proteína de lectina rcombinante em combinação com um outro agente anticâncer selecionado de Paclitaxel, 5-Fluorouracil, Cisplatina, Carboplatina, Irinotecano e Gemcitabina e onde o outro agente anticâncer é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00133] Outro aspecto da presente invenção é um método de tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade efetiva de proteína recombinante em combinação com outro agente terapêutico, em que o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00134] Em uma modalidade específica, é fornecido um método de tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito que compreende a administração ao sujeito uma quantidade efetiva de proteína de lectina recombinante em combinação com outro agente anticâncer selecionado de um agente antineoplásico alquilante, um agente anti-microtúbulo e um inibidor topoisomerase I, no qual o antimetabólito é selecionado a partir de 5-FU, Gemcitabina, Metotrexato, Pemetrexedo ou Capecitabina, o agente antineoplásico alquilante é um agente antineoplásico à base de platina selecionado de Cisplatina ou Carboplatina, o agente anti-microtúbulo é Paclitaxel, Docetaxel, Abraxane ou Taxotere e o inibidor topoisomerase I é Irinotecano ou Topotecano, e onde o outro agente anticâncer é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00135] Em outra modalidade específica, é fornecido um método de tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito que compreende a administração ao sujeito uma quantidade efetiva de proteína de lectina recombinante em combinação com um outro agente anticâncer selecionado de Paclitaxel, 5-FU, Cisplatina, Carboplatina, Irinotecano e Gemcitabina e onde o outro agente anticâncer é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente Combinações Exemplares
[00136] A proteína de lectina recombinante quando utilizada autônoma exibiu citotoxicidade eficaz. No entanto, quando combinada com outro agente terapêutico, o efeito nas linhas celulares de teste foi altamente surpreendente. A combinação não só apresentou efeito aditivo, mas também foi observado alto sinergismo. As combinações foram altamente eficazes para a inibição do crescimento das células cancerosas.
[00137] Em outra modalidade específica da presente invenção, há uma combinação sinérgica composta por proteína de lectina recombinante e um outro agente anticâncer selecionado de Paclitaxel, 5-FU, Carboplatina, Cisplatina, Irinotecano e Gemcitabina. A combinação é usada para o tratamento ou prevenção do câncer.
[00138] O principal aspecto da presente invenção é a combinação sinérgica composta por proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina, em que a combinação é usada para o tratamento ou prevenção do câncer de mama, oral, ovário ou bexiga.
[00139] Outro aspecto principal da presente invenção é a combinação sinérgica composta por proteína lectina recombinante e 5-FU, em que a combinação é usada para tratamento ou prevenção de câncer de pâncreas, oral ou cólon.
[00140] Outro aspecto principal da invenção atual é a combinação sinérgica composta por proteína de lectina recombinante e Irinotecan, onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção do câncer de cólon.
[00141] Outro aspecto principal da presente invenção é a combinação sinergia composta por proteína de lectina recombinante e Paclitaxel, onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção do câncer de ovário e de mama.
[00142] Outro aspecto principal da presente invenção é a combinação sinérgica composta por proteína de lectina recombinante e gemcitabina, onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção de câncer de bexiga e pâncreas.
[00143] Outro aspecto principal da invenção é a combinação sinérgica que compreende proteína de lectina recombinante e carboplatina, em que a combinação é usada para tratamento ou prevenção do câncer de mama.
[00144] De acordo com outra modalidade, a terapia combinada pode incluir a administração de constituintes da presente invenção simultaneamente com radioterapia. Composição Farmacêutica
[00145] Outro aspecto da presente invenção é uma composição composta por proteína de lectina recombinante em combinação com outro agente terapêutico e um ou mais excipientes farmacêuticos aceitáveis.
[00146] De acordo com o aspecto da invenção, a preparação combinada está em uma forma / composição farmacêutica farmaceuticamente aceitável. A preparação pode ser uma forma oral adequada ou uma forma administracional ou um implante. A preparação, por exemplo, pode ser na forma de comprimidos, cápsulas, pastilhas, suspensões, soluções, emulsões, pós ou xaropes para intravenosas, intramusculares, intraperitoneais, subcutâneas, intradérmicas, injeção de depósito, intratecal, transdérmico, sublingual, intrahepática, oral ou por administração de inalação.
[00147] De acordo com o aspecto da invenção, a composição farmacêutica também compreende um ou mais excipientes farmacêuticos aceitáveis. Excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a ingredientes farmacêuticos não ativos na formulação conhecida pela pessoa qualificada, como um estabilizador, um solubilizador, um conservante, desintegradores, aglutinantes, enchimentos e lubrificantes ou qualquer outro conhecido pela pessoa versada na técnica.
[00148] A composição usada na presente invenção compreende 50 mM de Tris Base (Trometamina), 150 mM de Cloreto de Sódio com pH 8,0 ± 0,2. No entanto, essa composição parentérica compreende excipientes não limitados a Dextrose, Glicerol, Cloreto de Sódio ou Manitol como modificadores de tonicidade; Ácido ascórbico, acetilcisteína, sais de ácido sulfuroso (bissulfito, metabissulfito) ou Monotioglicercol como antioxidantes; Fenol, Metacresol, Álcool benzílico, Parabenos (metil, propil, butil), Clorobutanol, Thimerosal e Sais fenilmercúricos (acetato, borato, nitrato) como agentes antimicrobianos; Cálcio dissódico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), EDTA dissódico, EDTA de sódio, cálcio ou ácido dietilenotriaminopenta acético como agentes quelantes; Monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80), monooleato de sorbitano monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween 20), Lecitina, copolímeros de polioxietileno polioxipropileno (Pluronics) ou trioleato de sorbitano (span 85) como surfactantes; e Propilenoglicol, Glicerina, Etanol, Polietilenoglicol, Sorbitol, Dimetilacetamida ou Cremophor EL como co-solvente. Outras composições farmacêuticas são preparadas de acordo com o conhecimento prévio do versado na técnica usando excipientes listados em livros padrão e aceitáveis pelas autoridades regulatórias em todos os países.
[00149] A quantidade preferencial de proteína de lectina recombinante e o outro agente terapêutico em composição farmacêutica varia de acordo com a forma de composição, rota de administração, tipo, idade e composição genética do sujeito e estágio do câncer e do método de tratamento. Concentrações e Dosagens
[00150] De acordo com algumas modalidades, a concentração efetiva da proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL. Em uma modalidade particular, a concentração eficaz está na faixa de 1 μg/mL a 90 μg/mL. De acordo com algumas modalidades, a concentração efetiva do outro agente terapêutico está na faixa de 0,001 nM a 1000 μM. Uma pessoa qualificada estará ciente do fato de que, no caso de combinações, a concentração efetiva é a concentração de todos os ingredientes que, quando combinados, dão um efeito sinérgico. Assim, a concentração efetiva da proteína de lectina recombinante difere com base no outro agente terapêutico, método de tratamento e tipo de câncer. Da mesma forma, a concentração efetiva de cada agente terapêutico será diferente para diferentes cânceres, quando utilizada juntamente com a proteína de lectina recombinante ou individualmente. Por exemplo, na presente invenção, a concentração sinérgica eficaz no caso das linhas celulares cancerígenas do ovário, de proteína de lectina recombinante foi de 1 μg/mL a 20 μg/mL, enquanto nenhum efeito sinérgico foi visto para a linha celular câncer de mama em uma concentração de 2,5 μg/mL de proteína de lectina recombinante, mesmo que Paclitaxel tenha sido usado como outro agente terapêutico em ambos os casos. Da mesma forma, as concentrações sinérgicas eficazes do Paclitaxel em ambos os cânceres são diferentes. Assim, a concentração de todos os agentes ativos varia de acordo com o tipo de câncer e a pessoa habilitada na técnica está bem ciente disso.
[00151] Os inventores realizaram vários estudos em diferentes linhas de células cancerosas para examinar o efeito da proteína lectina recombinante autônoma e em combinação com agente terapêutico listado acima para o tratamento de vários cânceres. Os inventores selecionaram Gemcitabina e 5-FU para câncer de pâncreas, Paclitaxel e carboplatina para câncer de mama, Cisplatina e 5-FU para câncer bucal, 5-FU e Irinotecano para câncer de cólon, Cisplatina e Paclitaxel para câncer de ovário e Cisplatina e Gemcitabina para câncer de bexiga.
[00152] O tratamento ou prevenção pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica e eficaz da lectina ao sujeito. Em algumas modalidades, a lectina é administrada a uma dose de 0,1 a 1000 mg/kg, de 0,5 a 100 mg/kg ou de 1 a 50 mg/kg. Estará dentro das capacidades da pessoa qualificada determinar uma quantidade de lectina a ser administrada de acordo com a natureza da condição que está sendo tratada e do sujeito.
[00153] O tratamento ou prevenção pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica efetiva do outro agente terapêutico ao sujeito. Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é administrado a uma dose de 1-10,000 mg por unidade de superfície corporal (mg/m2), preferencialmente 10-1.000 mg/m2, preferencialmente 50-600 mg/m2.
[00154] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica composta por uma proteína de lectina e um diluente ou excipiente farmacêutico aceitável. Diluentes e excipientes exemplares incluem água esterilizada, soro fisiológico e/ou tampão farmacêutico aceitável. A administração da lectina ou composição pode ser por qualquer rota adequada, incluindo, mas não limitada a, injeção (incluindo intravenosa (bolus ou infusão), intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea (bolus ou infusão), intraventricular, intramuscular,
ou subaracnoidal), ingestão oral (por exemplo, de um comprimido, gel, pastilha ou líquido), inalação, tópico, via mucosa (como a mucosa oral, nasal ou retal), mediante entrega na forma de spray, comprimido, patch transdérmico, implante subcutâneo ou na forma de um supositório. Em algumas modalidades, uma lectina (como uma lectina com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3) ou uma composição farmacêutica como aqui descrito é administrada ao sujeito enteralmente, paraenteralmente ou topicamente. A lectina ou composição farmacêutica pode ser administrada como uma forma de dosagem sólida (como comprimido ou cápsula), um pó liofilizado, um líquido (como solução ou suspensão), uma forma semissólida ou qualquer outra, como conhecida pela pessoa habilitada na técnica. A lectina ou a composição farmacêutica podem ser administradas ao sujeito injetando uma solução ou suspensão por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou intradermicamente, por injeção de depósito, ou pode ser administrada intratecalmente, transdermicamente, sublingual ou por métodos orais, tópicos ou inalação. O sujeito pode ser um sujeito mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito é humano. Em particular, o sujeito pode ser um sujeito humano que sofre de câncer. Exemplos
[00155] Os exemplos da presente invenção são para a demonstração do efeito do SEQ ID NO: 1 autônomo e em combinação com agentes anticâncer representativos contra células cancerígenas selecionadas. Os agentes anticâncer selecionados aqui representam cada classe de agentes quimioterápicos que são anti-etabólitos, agentes antineoplásicos alquilantes, agentes anti-microtúbulos e inibidores topoisomerase I. Assim, a pessoa habilitada na técnica estará bem ciente do fato de que qualquer outro agente anticâncer, não incluído nos exemplos abaixo, mas pertencente à classe de agente quimioterápico listado acima, demonstraria efeito sinérgico semelhante com algum grau de variações de concentração. Portanto, os exemplos listados abaixo são apenas para fins de demonstração e não limitam o escopo desta invenção de forma alguma.
[00156] As linhas celulares utilizadas nos experimentos foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC).
Exemplo 1: Efeito citotóxico de SEQ ID NO: 1, Gemcitabina e 5-Fluorouracil (5-FU) autônomo, e efeito citotóxico sinérgico de SEQ ID NO: 1 em combinação com Gemcitabina e 5-FU em células cancerígenas pancreáticas (linha celular PANC-1)
[00157] Foi realizado um estudo para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, Gemcitabina e 5- Fluorouracil, na linha de células cancerígenas pancreáticas (PANC-1). O estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 1-1 e Exemplo 1-2. Exemplo 1-1 – Medição dos valores IC50 de Gemcitabina e 5-FU na presença de SEQ ID NO: 1 para citotoxicidade em linhas celulares PANC-1
[00158] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de Gemcitabina para citotoxicidade em células PANC-1. Por outro lado, o efeito da concentração de Gemcitabina no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00159] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para 5-FU em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00160] A célula foi mantida em contato com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1 e o agente de quimioterapia por 48h e o efeito citotóxico (percentual citotóxico) foi medido.
[00161] O efeito citotóxico foi determinado pelo conhecido ensaio colorimétrico MTT (Mossman, T. 1983 Rápido ensaio colorimétrico para crescimento celular e sobrevivência: aplicação à proliferação e ensaios de citotoxicidade, volume 65, páginas 55-63) para avaliação da atividade metabólica celular.
[00162] Com base em dados percentuais de citotoxicidade, os valores IC50 foram determinados usando o software GraphPad Prism versão 4.01. Estes valores IC50 determinados são dados na Tabela 1 e Tabela 2 abaixo. Tabela 1: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina sozinho e em combinação para citotoxicidade em linhas celulares PANC-1 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Gemcitabina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) Gemcitabina (μM)
0 25.060 0 7,407 0,01 55.490 2,5 15,940
0.1 19.450 5 10,790 1 14.130 10 3,036 5 12.230 20 0,039 25 2.044 40 0,038 50 0.917 80 10,610 Tabela 2: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e 5-Flurouracil (5-FU) sozinho e em combinação com linhas celulares PANC-1 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de 5-FU (μM) 5FU (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) 0 24,630 0 86,99 0,1 686,900 2,5 296,80 1 22,490 5 1,409 10 6,842 10 1,257 50 1,690 20 0,869 100 1,070 40 8,454 250 0,098 80 0,725
[00163] Tabela 1 e 2 referem-se ao IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho ou em combinação com Gemcitabina ou 5-FU. Observa-se que o IC50 em relação às células cancerígenas pancreáticas foi reduzido consideravelmente quando a proteína de lectina recombinante com sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 foi usada em combinação com Gemcitabina ou 5-Flurouracil (5-FU). Exemplo 1-2 – Cálculo dos valores de IC para Gemcitabina e 5-FU com SEQ ID NO: 1
[00164] Em outro estudo, as células PANC-1 foram tratadas com Gemcitabina (0,01 μM- 50 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL) por 48 h. O efeito citotóxico em cada combinação foi determinado pelo ensaio MTT. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com 5-FU (0,1 μM- 250 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL).
[00165] Utilizando o mesmo método do exemplo 1-1, o valor IC50 para Gemcitabina em dada concentração da lectina recombinante de SEQ ID NO: 1 foi medido e o valor IC50 para a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1 em uma dada concentração de Gemcitabina foi determinado. O valor IC50 para cada Gemcitabina e a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1 sozinho também foi medido. O mesmo método foi realizado para 5-FU no lugar de Gemcitabina.
[00166] Os valores do Índice de Combinação (IC) foram determinados para cada combinação de concentração de drogas. Os valores de IC foram calculados com base nos valores IC50 utilizando a fórmula conforme abaixo. DA(50) DB(50) DA(50) × DB(50) CI = + + ICA(50) ICB(50) ICA(50) × ICB(50) onde DA(50) = Concentração da droga A em combinação com B para produzir 50% de citotoxicidade ICA(50) = Concentração de droga A sozinha para produzir 50% de citotoxicidade DB(50) = Concentração da droga B em combinação com A para produzir 50% de citotoxicidade ICB(50) = Concentração da droga B sozinha para produzir 50% de citotoxicidade
[00167] Em que a droga A é SEQ ID NO: 1 e a droga B é outro agente terapêutico que foi testado.
[00168] O sinergismo, aditivo ou antagonismo foram determinados com base nos seguintes critérios: CI > 1 – o antagonismo é indicado CI = 1 – efeito aditivo é indicado CI < 1 – sinergismo é indicado
[00169] Os resultados dos cálculos do índice de combinação para estudo sobre a combinação de SEQ ID NO: 1 com Gemcitabina e 5-FU contra linhas celulares PANC-1 é tabulado abaixo. Tabela 3: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina após 48 horas na linha de células PANC-1
Concentração de Gemcitabina (μM) 0,01 0,1 1 5 25 50 2,5 9,131 6,897 3,532 2,231 2,231 6,819 5 4,598 3,363 1,504 0,786 0,785 3,320 Conc, de 10 3,929 2,842 1,205 0,572 0,572 2,804 SEQ ID NO: 1 20 3,690 2,656 1,098 0,496 0,496 2,620 (μg/mL) 40 2,409 1,657 0,525 0,087 0,087 1,631 80 2,267 1,547 0,461 0,042 0,042 1,521
[00170] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular pancreática como tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00171] Para 5 μg/mL, 10 μg/mL e 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 5 μM e 25 μM de Gemcitabina
[00172] Para 40 μg/mL e 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM, 5 μM e 25 μM de Gemcitabina
[00173] Observou-se antagonismo em todas as concentrações de SEQ ID NO: 1 com 0,01 μM, 0,1 μM e 50 μM de Gemcitabina. A 2,5 μg/mL de SEQ ID NO: 1, observou-se antagonismo para todas as concentrações de Gemcitabina. Antagonismo também observado para 5 μg/mL e 10 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM de Gemcitabina.
[00174] O efeito aditivo foi observado a 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM de Gemcitabina.
Tabela 4: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU contra linhas celulares PANC-1 Concentração de 5-FU (μM) 0,1 1 10 50 100 250 2,5 126,454 28,357 28,306 28,177 30,696 28,129 5 7,440 0,944 0,941 0,932 1,099 0,929
10 4,637 0,298 0,296 0,291 0,402 0,288 Conc, de 20 3,715 0,086 0,084 0,079 0,172 0,078 SEQ ID NO: 1 40 3,604 0,060 0,059 0,054 0,145 0,052 (μg/mL) 80 3,429 0,020 0,018 0,014 0,102 0,012
[00175] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular pancreática como tabuladas acima. São sublinhadas as concentrações que mostraram efeito sinérgico. Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00176] Para 5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM a 50 μM, e 250 μM de 5-FU.
[00177] Para 10 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM a 250 μM de 5- FU.
[00178] O antagonismo foi observado em concentrações mais baixas tanto do SEQ ID NO: 1 e 5-FU.
[00179] O efeito aditivo foi observado a 5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 100 μM de 5-FU.
[00180] Os resultados das Tabelas 1 a 4 demonstram que SEQ ID NO: 1 mostra efeitos sinérgicos em combinação com Gemcitabina e 5-Fluorouracil. As combinações foram altamente eficazes para inibir o crescimento de células cancerosas. A concentração de SEQ ID NO: 1 utilizado foi de cerca de 2,5 μg/mL para cerca de 80 μg/mL. A concentração de outro agente terapêutico/s ou seja, diferente do SEQ ID NO: 1, de acordo com a presente invenção é de 1 μM a cerca de 250 μM. Exemplo 2: Efeito citotóxico de SEQ ID NO: 1, paclitaxel e carboplatina autônomo, efeito citotóxico sinérgico de SEQ ID NO: 1 em combinação com paclitaxel e carboplatina em células cancerosas de mama (linha celular MDA-MB-231)
[00181] Estudo foi realizado para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, paclitaxel e carboplatina, em uma linha celular de câncer de mama (MDA-MB-231). O estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 2-1 e Exemplo 2-2.
Exemplo 2-1 - Medição dos valores IC50 para células MDA-MB-231 de Paclitaxel e Carboplatina na presença de SEQ ID NO: 1
[00182] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de Paclitaxel para citotoxicidade em células MDA-MB-231. Por outro lado, o efeito da concentração de Paclitaxel no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00183] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para Carboplatin em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00184] Isso foi realizado utilizando-se as mesmas técnicas como no Exemplo 1-
1. Os valores IC50 determinados são dados na Tabela 5 e Tabela 6 abaixo. Tabela 5: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel sozinho e em combinação com as linhas celulares MDA-MB-231. Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Paclitaxel Paclitaxel (nM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (nM) 0 19,800 0 1,638 0,001 25,370 2,5 3,980 0,01 21,220 5 9,307 0,1 13,700 10 0,389 1 8,720 20 0,123 5 5,775 40 3,56 x 10-5 10 2,248 80 5,75 x 10-10 Tabela 6: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e Carboplatina sozinho e em combinação com as linhas celulares MDA-MB-231. Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Carboplatina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) Carboplatina (μM) 0 14,310 0 477,100 10 7,188 2,5 226,100 50 3,584 5 3,985
100 4,290 10 4,925 200 2,073 20 8,444 500 0,523 40 1,421 1000 0,044 80 5,874
[00185] Tabelas 5 e 6 referem-se ao IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho e em combinação com Paclitaxel ou Carboplatina. Observa-se que o IC50 em relação às células cancerígenas de mama foi reduzido consideravelmente quando SEQ ID NO: 1 foi usado em combinação com Carboplatina ou Paclitaxel. Exemplo 2-2 - Cálculo dos valores de IC para Paclitaxel e Carboplatina com SEQ ID NO: 1
[00186] Em outro estudo, as células MDA-MB-231 foram tratadas com Paclitaxel (0,001nM- 10nM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL) por 48h. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com Carboplatina (10 μM- 1000 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL). Os valores do Índice de Combinação foram determinados para cada combinação de drogas e o efeito antagônico, aditivo ou sinérgico resultante foi determinado, conforme descrito no Exemplo 1-2. Os resultados estão tabulados abaixo. Tabela 7: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel contra linha celular MDA- MB-231. Concentração de Paclitaxel (nM) 0,001 0,01 0,1 1 5 10 2,5 6,824 14,244 1,823 1,453 1,281 1,281 5 6,106 12,843 1,564 1,227 1,072 1,072 Conc. de 10 4,803 10,305 1,094 0,819 0,692 0,692 SEQ ID NO: 1 20 3,940 8,625 0,782 0,549 0,440 0,440 (μg/mL) 40 3,430 7,631 0,598 0,389 0,292 0,292 80 2,819 6,441 0,378 0,197 0,114 0,114
[00187] De acordo com o aspecto da invenção, observou-se sinergismo tanto para as combinações contra a linha celular cancerígena de mama quanto tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00188] Para 10 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 nM a 10 nM de Paclitaxel.
[00189] Para 20 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,1 nM de Paclitaxel.
[00190] O antagonismo foi observado em concentrações mais baixas tanto do SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL e 5 μg/mL) e do Paclitaxel (0,001 nM e 0,01 nM).
[00191] O efeito aditivo foi observado a 5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 5 nM e 10 nM de Paclitaxel e 10 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,1 nM de Paclitaxel. Tabela 8: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Carboplatina contra linha celular MDA-MB-231. Concentração de Carboplatina (μM) 10 50 100 200 500 1000 2,5 2,005 1,214 0,515 0,518 0,529 0,507 5 1,501 0,843 0,261 0,263 0,273 0,254 Conc. de 10 1,600 0,916 0,311 0,313 0,323 0,304 SEQ ID NO: 1 20 1,290 0,687 0,154 0,157 0,165 0,148 (μg/mL) 40 1,073 0,528 0,045 0,047 0,055 0,040 80 1,006 0,478 0,011 0,013 0,021 0,006
[00192] O sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular contra o câncer de mama como tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Carboplatin, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00193] Para 2,5 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 100 μM a 1000 μM de Carboplatina.
[00194] Para 5 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 50 μM de Carboplatina.
[00195] O antagonismo foi observado em 2,5 μg/mL a 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 10 μM de Carboplatina. O antagonismo também foi observado a 2,5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 50 μM de Carboplatina.
[00196] O efeito aditivo foi observado em 40 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 10 μM de Carboplatina
[00197] Os resultados demonstraram que SEQ ID NO: 1 mostra efeitos sinérgicos em combinação com Paclitaxel ou Carboplatina. Exemplo 3: Efeito citotóxico de SEQ ID NO: 1, 5-FU e Cisplatina autônomo e efeito citotóxico sinérgico do SEQ ID NO: 1 em combinação com 5-FU e Cisplatina em células cancerosas orais (linha celular KB).
[00198] Estudo foi realizado para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, 5-FU e Cisplatina, em uma linha de células cancerosas orais (linha celular KB). O estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 3-1 e Exemplo 3-2. Exemplo 3-1 - Medição dos valores IC50 para células KB de 5-FU e Cisplatina na presença de SEQ ID NO: 1
[00199] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de 5-FU para citotoxicidade em células KB. Por outro lado, o efeito da concentração de 5-FU no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00200] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para Cisplatina em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00201] Isso foi realizado utilizando as mesmas técnicas do Exemplo 1-1. Os valores IC50 determinados são dados na Tabela 9 e Tabela 10 abaixo. Tabela 9: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e 5-FU sozinho e em combinação com linhas celulares
KB Concentração de 5- IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de 5-FU (μM) FU (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL)
0 17,3800 0 0,01498 0,01 0,5800 5 0,00010 0,1 0,9080 10 5,31 x 10-6 0,25 0,5010 20 1,34 x 10-5 0,5 0,1141 30 1,19 x 10-6 1 0,0555 40 5,22 x 10-11 5 0,0871 90 1,40 x 10-8 Tabela 10: Valores IC50 de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina sozinho e em combinação com linhas celulares KB Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Cisplatina Cisplatina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (μM) 0 38,110 0 0,72200 0,1 21,190 5 0,37490 0,25 11,240 10 0,26880 0,5 2,694 20 0,13390 0,75 0,597 30 0,06616 1,0 0,316 40 0,00712 1,5 0,303 90 0,00993
[00202] Tabelas 9 e 10 referem-se ao IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho e em combinação com 5-FU ou Cisplatina. Observa-se que o IC50 em relação às células cancerígenas bucais foi reduzido consideravelmente quando SEQ ID NO: 1 foi utilizado em combinação com 5-FU e Cisplatina. Exemplo 3-2 – Cálculo dos valores de IC para 5-FU e Cisplatina com SEQ ID NO: 1
[00203] Em outro estudo, as células KB que foram tratadas foram tratadas com 5-FU (0,01 μMa 5,0 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (5,0 μg/mL – 90 μg/mL) por 48 h. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com Cisplatina (0,1 μM a1,5 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (5,0 μg/mL- 90 μg/mL). Os valores do Índice de Combinação foram determinados para cada combinação de drogas e o efeito antagônico, aditivo ou sinérgico foi determinado, conforme descrito no Exemplo 1-2.
[00204] Os resultados estão tabulados abaixo. Tabela 11: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU contra linha de célula KB Concentração de 5-FU (μM) 0,01 0,1 0,25 0,5 1 5 5 0,0406 0,0338 0,0343 0,0335 0,0334 0,0334 10 0,0596 0,0526 0,0532 0,0523 0,0522 0,0522 Conc. de 20 0,0360 0,0292 0,0297 0,0289 0,0288 0,0288 SEQ ID NO: 1 30 0,0136 0,0069 0,0075 0,0066 0,0066 0,0066 (μg/mL) 40 0,0102 0,0035 0,0041 0,0033 0,0032 0,0032 90 0,0120 0,0054 0,0059 0,0051 0,0050 0,0050 Tabela 12: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina contra linhas celulares
KB Concentração de Cisplatina (μM) 0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,5 5 1,364 1,135 0,845 0,699 0,571 0,577 10 0,967 0,777 0,535 0,414 0,308 0,313 Conc. de 20 0,627 0,469 0,269 0,169 0,081 0,085 SEQ ID NO: 1 30 0,543 0,394 0,204 0,109 0,026 0,030 (μg/mL) 40 0,532 0,384 0,195 0,101 0,018 0,022 90 0,531 0,383 0,195 0,100 0,018 0,022
[00205] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra linhas celulares KB como tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). A combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU exibiu sinergismo em todas as concentrações (SEQ ID NO: 1 – de 5,0 μg/mL a 90 μg/mL e 5-FU – de 0,01 μM a 5 μM) que foram estudados. Considerando que em caso de combinação de SEQ ID NO: 1 e sinergismo de Cisplatina foi observado nas concentrações: 10 μg/mL a 90 μg/mL de SEQ ID NO: 1 e 0,1 μM a 1,5 μM de Cisplatina, e 5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 e 0,5 μM a 1,5 μM de Cisplatina.
[00206] O antagonismo foi observado na menor concentração tanto do SEQ ID NO: 1 quanto da Cisplatina. Exemplo 4: Efeito citotóxico do SEQ ID NO: 1, 5-FU e efeito citotóxico sinérgico de SEQ ID NO: 1 em combinação com 5-FU e Irinotecano em células cancerosas de Cólon (Linha celular HT-29):
[00207] Estudo foi realizado para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, 5-FU e Irinotecan, em uma linha de células cancerígenas de cólon (HT-29). O estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 4-1 e Exemplo 4-2. Exemplo 4-1 – Medição dos valores IC50 para células HT-29 de 5-FU e Irinotecano na presença de SEQ ID NO: 1
[00208] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de 5-FU para citotoxicidade em células HT-29. Por outro lado, o efeito da concentração de 5-FU no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00209] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para Irinotecano em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00210] Isso foi realizado utilizando as mesmas técnicas do Exemplo 1-1. Os valores IC50 determinados são dados na Tabela 13 e Tabela 14 abaixo. Tabela 13: IC50 de SEQ ID NO: 1 e 5-FU sozinho e em combinação com linhas celulares HT-29 Concentração de 5- IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de 5-FU (μM) FU (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) 0 25,470 0 137,300 5 22,990 1 172,600 10 6,374 5 25,860
50 1,667 10 4,513 100 1,387 20 0,282 150 1,216 40 1,241 200 1,334 80 4,884 Tabela 14: IC50 de SEQ ID NO: 1 e Irinotecano sozinho e em combinação contra linhas celulares HT-29 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Irinotecano Irinotecano (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (μM) 0 18,320 0 16,200 0,1 73,480 1 49,240 1 36,280 5 2,779 5 23,520 10 5,449 10 9,995 20 1,338 25 8,258 40 0,278 50 1,395 80 0,167
[00211] As tabela 13 e 14 referem-se ao IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho e em combinação com 5-FU ou Irinotecano. Observou-se que o IC50 em relação às células cancerígenas do cólon foi reduzido consideravelmente quando SEQ ID NO: 1 foi usado em combinação com 5-FU e Irinotecano. Exemplo 4-2 - Cálculo dos valores de IC para 5-FU e Irinotecano com SEQ ID NO: 1
[00212] Em outro estudo, as células HT-29 foram tratadas com 5-FU (5 μM – 200 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (1 μg/mL – 80 μg/mL) por 48h. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com Irinotecano (0,1 μM – 50 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (1 μg/mL – 80 μg/mL). Os valores do Índice de Combinação foram determinados para cada combinação de drogas e o efeito antagônico, aditivo ou sinérgico resultante foi determinado, conforme descrito no Exemplo 1-2. Os resultados estão tabulados abaixo. Tabela 15: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU contra linhas celulares HT-29
Concentração de 5-FU (μM) 5 10 50 100 150 200 1 3,294 1,261 0,965 0,907 0,920 0,970 5 1,822 0,486 0,291 0,253 0,262 0,295 Conc. de 10 1,405 0,266 0,100 0,068 0,075 0,103 SEQ ID NO: 1 20 1,380 0,253 0,089 0,057 0,064 0,092 (μg/mL) 40 1,365 0,245 0,082 0,050 0,057 0,085 80 1,375 0,251 0,087 0,055 0,0619 0,0898
[00213] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para a combinação contra a linha celular do câncer de cólon como tabulado acima. São sublinhadas as concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e 5-FU, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00214] Para 5 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 10 μM to200 μM de concentração de 5-FU.
[00215] Para 1 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 50 μM a 200 μM de concentração de 5-FU.
[00216] Observou-se antagonismo em todas as concentrações de SEQ ID NO: 1 com concentração de 5 μM 5-FU e em combinação composta por 1 μg/mL de concentração SEQ ID NO: 1 e 10 μM 5-FU concentração. Tabela 16: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Irinotecano contra linhas celulares HT-29 Concentração de Irinotecano (μM) 0,1 1 5 10 25 50 1 19,321 4,894 5,723 4,446 4,117 4,082 Conc. de 5 11,039 2,492 2,983 2,227 2,031 2,011 SEQ ID NO: 1 10 8,226 1,676 2,052 1,472 1,323 1,307 (μg/mL) 20 5,243 0,811 1,065 0,673 0,572 0,562
40 4,860 0,700 0,939 0,571 0,476 0,466 80 3,347 0,261 0,438 0,165 0,095 0,087
[00217] O efeito sinérgico foi observado tanto para as combinações contra a linha de câncer de cólon como tabulados acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Irinotecan, a concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico foi superservida para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00218] Para 20 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 1 μM - 50 μM (exceto 5 μM) de concentração de Irinotecano.
[00219] Antagonasm foi observado com SEQ ID NO: 1 concentração a 1 μg/mL a 80 μg/mL com 0,1 μM ou Irinotecano e a 1 μg/mL – 10 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,01 a 50 μM de Irinotecano.
[00220] O efeito aditivo foi observado a 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 5 μM de Irinotecano. Exemplo 5: Efeito citotóxico de SEQ ID NO: 1, Cisplatina e Paclitaxel efeito citotóxico autônomo e sinérgico de SEQ ID NO: 1 em combinação com Cisplatina e Paclitaxel em células cancerígenas ovarianas (Linha celular PA-1):
[00221] Foi realizado um estudo para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, Cisplatina e Paclitaxel, na linha celular do câncer de ovário (linha celular PA-1). O estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 5-1 e Exemplo 5-2. Exemplo 5-1 – Medição dos valores IC50 de Cisplatina e Paclitaxel na presença de SEQ ID NO: 1 para citotoxicidade nas linhas celulares PA-1
[00222] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de Cisplatina para citotoxicidade em células MDA-MB-231. Por outro lado, o efeito da concentração de Cisplatina no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00223] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para Paclitaxel em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00224] Isso foi realizado utilizando as mesmas técnicas do Exemplo 1-1. Os valores IC50 determinados são dados na Tabela 17 e Tabela 18 abaixo. Tabela 17: IC50 de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina sozinho e em combinação contra linhas celulares PA-1 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Cisplatina Cisplatina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (μM) 0 12,070 0 0,08566 0,01 8,520 1 0,716 0,1 6,033 2,5 0,314 0,25 4,455 5 0,093 0,5 0,912 10 0,0042 1 0,321 15 0,0005 5 0,0036 20 0,0001 Tabela 18: IC50 de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel sozinho e em combinação com linhas celulares PA-1. Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Paclitaxel Paclitaxel (nM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (nM) 0 8,822 0 4,044 0,01 5,794 1 3,622 0,1 6,545 2,5 3,478 0,25 4,893 5 0,222 0,5 3,917 10 5,37 x 10-4 1 3,031 15 4,13 x 10-6 5 0,709 20 1,02 x 10-6
[00225] Tabela 17 e 18 referem-se aos valores IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho e em combinação com Cisplatina ou Paclitaxel. Observa-se que o IC50 contra células cancerígenas de ovário foi reduzido consideravelmente quando SEQ ID NO: 1 foi usado em combinação com Cisplatina ou Paclitaxel. Exemplo 5-2 – Cálculo dos valores de CI para Cisplatina e Paclitaxel com SEQ ID NO: 1
[00226] Em outro estudo, as células PA-1 foram tratadas com Cisplatina (0,01 μM – 5 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (1 μg/mL- 20 μg/mL) por 48h. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com Paclitaxel (0,01 nM- 5 nM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (1 μg/mL- 20 μg/mL). Os valores do Índice de Combinação foram determinados para cada combinação de drogas e o efeito antagônico, aditivo ou sinérgico resultante foi determinado, conforme descrito no Exemplo 1-2. Os resultados estão tabulados abaixo. Tabela 19: Ci valores de combinação de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina contra linhas celulares PA-1 Concentração de Cisplatina (μM) 0,01 0,1 0,25 0,5 1 5 1 2,131 1,330 0,891 0,714 0,707 0,706 2,5 1,753 1,049 0,663 0,507 0,501 0,500 Conc. de 5 1,513 0,870 0,518 0,376 0,370 0,369 SEQ ID NO: 1 10 0,974 0,469 0,192 0,081 0,076 0,076 (μg/mL) 15 0,884 0,402 0,138 0,032 0,027 0,027 20 0,836 0,367 0,109 0,005 0,0009 0,0004
[00227] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular do câncer de ovário quanto tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Cisplatin, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00228] Para todas as concentrações testadas (1 μg/mL a 20 μg/mL) de SEQ ID NO: 1 com 0,25 μM a 5 μM de Cisplatina.
[00229] Para 5 μg/mL a 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,1 μM de Cisplatina.
[00230] Para 10 μg/mL a 20 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,01 μM de Cisplatina.
[00231] O antagonismo foi observado em 1 μg/mL a 5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,01 μM de Cisplatina. O antagonismo foi observado a 1 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,1 μM de Cisplatina.
[00232] O efeito aditivo foi observado a 2,5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,1 μM de Cisplatina.
Tabela 20: valores CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel contra linhas celulares PA-1 Concentração de Paclitaxel (nM) 0,01 0,1 0,25 0,5 1 5 1 2,141 2,082 0,748 0,657 0,657 0,657 2,5 2,302 2,240 0,838 0,742 0,742 0,742 Conc. de 5 1,947 1,892 0,640 0,555 0,555 0,555 SEQ ID NO: 1 10 1,737 1,686 0,523 0,444 0,444 0,444 (μg/mL) 15 1,547 1,499 0,417 0,344 0,344 0,344 20 1,048 1,009 0,140 0,080 0,0803 0,0803
[00233] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular do câncer de ovário quanto tabuladas acima, São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1), Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Paclitaxel, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00234] Para todas as concentrações testadas (1 μg/mL a 20 μg/mL) de SEQ ID NO: 1 com 0,25 nM a5 nM de Paclitaxel.
[00235] O antagonismo foi observado em 1 μg/mL a 15 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 0,01 nM a 0,1 nM de Paclitaxel. O efeito aditivo foi observado a 20 μM de SEQ ID NO: 1 com 0,01 nM a 0,1 nM de Paclitaxel.
[00236] Os resultados demonstraram que SEQ ID NO: 1 mostra efeitos sinérgicos em combinação com Cisplatina ou Paclitaxel.
Exemplo 6: Efeito citotóxico de SEQ ID NO: 1, Cisplatina e Gemcitabina autônomo e efeito citotóxico sinérgico de SEQ ID NO: 1 em combinação com Cisplatina e Gemcitabina em células cancerosas de bexiga (Linha celular T24):
[00237] Foi realizado um estudo para determinar os efeitos citotóxicos sinérgicos do SEQ ID NO: 1 em combinação com agentes quimioterápicos, cisplatina e gemcitabina, em uma linha celular cancerosa de bexiga (linha celular T24), o estudo foi realizado em duas fases, descritas no Exemplo 6-1 e Exemplo 6-2. Exemplo 6-1 – Medição dos valores IC50 para células T24 de Cisplatina e Gemcitabina na presença de SEQ ID NO: 1
[00238] Foi realizado um estudo para determinar o efeito da concentração da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1 no IC50 de Cisplatina para citotoxicidade em células T24. Por outro lado, o efeito da concentração de Cisplatina no IC50 da lectina recombinante representada por SEQ ID NO: 1.
[00239] Da mesma forma, outro estudo foi realizado para Gemcitabina em combinação com a lectina recombinante de SEQ ID NO: 1.
[00240] Isso foi realizado utilizando as mesmas técnicas do Exemplo 1-1. Os valores IC50 determinados são dados na Tabela 21 e Tabela 22 abaixo. Tabela 21: IC50 de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina sozinho e em combinação contra linhas celulares T24 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Cisplatina Cisplatina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) (μM) 0 11,470 0 39,020 1 11,460 2,5 22,870 10 2,375 5 3,79500 25 1,062 10 0,09708 50 1,081 20 0,03436 100 0,944 40 0,08363 500 0,716 80 0,01342
Tabela 22: IC50 de SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina sozinho e em combinação com linhas celulares T24 Concentração de IC50 de SEQ ID NO: Conc. de SEQ ID IC50 de Gemcitabina (μM) 1 (μg/mL) NO: 1 (μg/mL) Gemcitabina (μM) 0 10,350 0 15,420 1 2,242 2,5 0,802 10 0,892 5 0,14090 50 0,626 10 0,00032 100 0,155 20 0,00002 200 0,149 40 6,05 x 10-19 300 0,029 80 7,18 x 10-10
[00241] Tabelaa 21 e 22 referem-se ao IC50 de SEQ ID NO: 1 sozinho e em combinação com Cisplatina e Gemcitabina. O IC50 contra células cancerígenas de bexiga foi reduzido consideravelmente quando SEQ ID NO: 1 foi usado em combinação com Cisplatina e Gemcitabina. Exemplo 6-2 – Cálculo dos valores de IC para Cisplatina e Gemcitabina com SEQ ID NO: 1
[00242] Em outro estudo, as células T24 foram tratadas com Cisplatina (1 μM – 500 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL) por 48h. Da mesma forma, outro conjunto de células foi tratado com Gemcitabina (1 μM- 300 μM) em combinação com SEQ ID NO: 1 (2,5 μg/mL- 80 μg/mL). Os valores do Índice de Combinação foram determinados para cada combinação de drogas e o efeito antagônico, aditivo ou sinérgico resultante foi determinado, conforme descrito no Exemplo 1-2. Os resultados estão tabulados abaixo. Tabela 23: Valores de CI de combinação de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina contra linhas de células T24 Concentração de Cisplatina (μM) 1 10 25 50 100 500 2,5 2,171 1,194 1,004 1,001 1,003 1,000 5 0,915 0,324 0,210 0,208 0,210 0,207
10 0,733 0,199 0,095 0,094 0,095 0,093 Conc. de 20 0,736 0,201 0,097 0,095 0,097 0,095 SEQ ID NO: 1 40 0,717 0,188 0,085 0,083 0,085 0,083 (μg/mL) 80 0,685 0,166 0,065 0,063 0,065 0,063
[00243] De acordo com o aspecto da invenção, o sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular cancerígena de bexiga como tabuladas acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Cisplatina, observou-se concentração efetiva para efeito citotóxico sinérgico para SEQ ID NO: 1 concentração:
[00244] Para 5 μg/mL a 80 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com todas as concentrações testadas (1 μM – 500 μM) de Cisplatina.
[00245] O antagonismo foi observado a 2,5 μM de SEQ ID NO: 1 com 1 μM e 10 μM de Cisplatina.
[00246] O efeito aditivo foi observado a 2,5 μg/mL de SEQ ID NO: 1 com 25 μM - 500 μMde Cisplatina. Tabela 24: Valores de CI da combinação SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina contra linhas celulares T24 Concentração de Gemcitabina (μM) 1 10 50 100 200 300 2,5 0,280 0,228 0,217 0,217 0,217 0,217 5 0,143 0,096 0,086 0,086 0,086 0,086 Conc. de 10 0,116 0,070 0,061 0,060 0,060 0,060 SEQ ID NO: 1 20 0,068 0,024 0,015 0,015 0,015 0,015 (μg/mL) 40 0,067 0,024 0,014 0,014 0,014 0,014 80 0,055 0,012 0,003 0,003 0,003 0,003
[00247] O sinergismo foi observado tanto para as combinações contra a linha celular cancerígena da bexiga como tabulada acima. São sublinhados os pares de concentrações que apresentaram efeito sinérgico (ou seja, CI < 1). Para a combinação de SEQ ID NO: 1 e Gemcitabina, foi observado efeito citotóxico sinérgico em todas as concentrações (2,5 μM – 80 μM de SEQ ID NO: 1 com 1 μM – 300 μM de Gemcitabina. Resumo de Exemplos
[00248] Como uma visão geral das concentrações em que o sinergismo foi observado nas linhas celulares testadas para a invenção atual é resumida na tabela abaixo: Tabela 25. Concentrações de SEQ ID NO: 1 em combinação com diferentes agentes terapêuticos mostrando efeito sinérgico nas linhas de células cancerígenas orais, cólons, ovários e bexiga. Linhas Agentes Conc. de outros Câncer Conc. de SEQ ID NO: 1 celulares terapêuticos agentes terapêuticos 5 a 20 μg/mL 5 μM a 25 μM Gemcitabina 40 a 80 μg/mL 1 μM a 25 μM pâncreas PANC-1 10 a 80 μg/mL 1 μM a 250 μM 5-FU 5 μg/mL 1 a 50 μM e 250 μM 20 a 80 μg/mL 0,1nM a 10 nM Paclitaxel MDA- 10 μg/mL 1nM a 10 nM seio MB-231 5 a 80 μg/mL 50 μM a 1000 μM Carboplatina 2,5 μg/mL 100 μM a 1000 μM 5-FU 5 a 90 μg/mL 0,01 a 5 μM oral Kb 10 a 90 μg/mL 0,1 a 1,5 μM Cisplatina 5 μg/mL 0,5 a 1,5 μM 5 a 80 μg/mL 10 a 200 μM 5-FU 1 μg/mL 50 a 200 μM cólon HT-29 40 a 80 μg/mL 1 a 50 μM Irinotecano 20 μg/mL 1 e 10 a 50 μM 1 a 2,5 μg/mL 0,25 a 5 μM ovário PA-1 Cisplatina 5 μg/mL 0,1 a 5 μM 10 a 20 μg/mL 0,01 a 5 μM
Paclitaxel 1 a 20 μg/mL 0,25 a 5 nM Cisplatina 5 a 80 μg/mL 1 a 500 μM bexiga T-24 Gemcitabina 2,5 a 80 μg/mL 1 a 300 μM

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Combinação terapeuticamente eficaz que compreende uma proteína de lectina recombinante e um ou mais outro agente terapêutico, em que a combinação é sinérgica e em que a concentração de proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL.
2. Combinação terapêutica efetiva de acordo com a reivindicação 1, em que a combinação é usada para prevenção ou tratamento do câncer em um sujeito.
3. Uso de uma proteína de lectina recombinante para o tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito que compreende a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de lectina recombinante ao sujeito em que a proteína de lectina recombinante é administrada em combinação com um ou mais outro agente terapêutico ao sujeito, e onde o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
4. Método de tratamento ou prevenção do câncer em um sujeito que compreende a administração ao sujeito quantidade efetiva de proteína de lectina recombinante em combinação com um ou mais outro agente terapêutico ao sujeito, e em que o outro agente terapêutico é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
5. Terapia em combinação para prevenção, tratamento ou cura de câncer ou tumor ou para proliferação em um sujeito usando proteína de lectina recombinante, na qual a terapia combinada compreende a administração de proteína de lectina recombinante em combinação com um ou mais outro agente terapêutico, e onde o outro agente terapêutico é administrado deforma simultânea, separada ou sequencialmente.
6. Combinação terapeuticamente eficaz de acordo com a reivindicação 1 ou 2, o uso de acordo com a reivindicação 3, o método de tratamento de acordo com a reivindicação 4, ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 5, em que o outro agente terapêutico é um agente anticâncer.
7. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 6, em que o agente anticâncer é um antimetabólito, um agente antineoplásico alquilante, um agente antimicrotúbulo e/ou um inhibitor de topoisomerase I.
8. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 7, em que o antimetabólito é selecionado a partir de 5-Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, Metotrexato, Pemetrexedo ou Capecitabina.
9. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o agente neoplásico alquilante é um agente antineoplásico à base de platina selecionado de cisplatina ou carboplatina.
10. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com qualquer uma das alegações 7 a 9, em que o agente antimicrotúbulo é selecionado de Paclitaxel, Docetaxel, Abraxano ou Taxotere.
11. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, em que o inibidor de topoisomerase I é selecionado de Irinotecano ou Topotecan.
12. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 9, em que o agente anticâncer é cisplatina e em que a combinação é usada para o tratamento ou prevenção de câncer bucal, ovário ou bexiga em um sujeito.
13. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 8, em que o agente anticancerígeno é 5-FU e em que a combinação é utilizada para tratamento ou prevenção de câncer bucal, pancreático ou cólon em um sujeito.
14. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 11, em que o agente anticâncer é Irinotecano e onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção do câncer de cólon em um sujeito.
15. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 10, em que o agente anticâncer é Paclitaxel e onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção de câncer de ovário ou mama em um sujeito.
16. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 8, em que o agente anticâncer é Gemcitabina e onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção de câncer de bexiga ou pâncreas em um sujeito.
17. Combinação terapeuticamente eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia em combinação de acordo com a reivindicação 9, em que o agente anticâncer é carboplatina e onde a combinação é usada para tratamento ou prevenção de câncer de mama em um sujeito.
18. Combinação terapeuticamente eficaz de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 6 a 17, o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6 a 17, o método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6 a 17, ou a terapia em combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 a 17, em que a proteína de lectina recombinante é uma proteína que tem sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,2 ou 3 ou ter pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de homologia ao SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6 a 18, o método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6 a 18, ou a terapia em de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 a 18, em que a concentração da proteína de lectina recombinante está na faixa de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL.
20. Combinação terapeuticamente eficaz de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 6 a 18, o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6 a 19, o método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6 a 19, ou a terapia em combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 a 19, em que a concentração da proteína de lectina recombinante está na faixa de 1 μg/mL a 90 μg/mL.
21. Combinação terapeuticamente eficaz de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 6 a 18, ou 20, o uso de acordo com qualquer um das reivindicações 3 ou 6 a 20, o método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6 a 20, ou a terapia de combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 a 20, em que a concentração do outro agente terapêutico está na faixa de 0,001 nM a 1000 μM.
22. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 9 ou 12, em que a concentração de Cisplatina está na faixa de 0,01 μM a 500 μM.
23. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 8 ou 13, em que a concentração de 5-Flurouracil (5-FU) está na faixa de 0,01 μM a 250 μM.
24. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 11 ou 14, em que a concentração de Irinotecano está na faixa de 0, 1 μM a 50 μM.
25. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 10 ou 15, em que a concentração de Paclitaxel está na faixa de 0,001 nM a 10 nM.
26. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 8 ou 16, em que a concentração de Gemcitabina está na faixa de 0,01 μM a 300 μM.
27. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 9 ou 17, em que a concentração de Carboplatina está na faixa de 10 μM a 1000 μM.
28. Combinação terapêutica eficaz de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, ou 7 a 18, ou 20 a 27, o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, ou 6 a 27, o método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, ou 6 a 27, ou a terapia de combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 27, em que a combinação, da proteína lectina recombinante e do outro agente terapêutico, é uma composição.
29. Combinação terapêutica eficaz, o uso, o método de tratamento ou a terapia de combinação de acordo com a reivindicação 28, em que a composição compreende um ou mais excipientes farmacêuticos aceitáveis.
30. Proteína de lectina recombinante em combinação com um ou mais outro agente terapêutico para o tratamento ou prevenção do câncer em que o outro agente terapêutico é selecionado de um ou mais de 5-Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, cisplatina, Paclitaxel, carboplatina ou Irinotecano.
31. Agente terapêutico para o tratamento ou prevenção do câncer, em combinação com uma proteína de lectina recombinante, em que o agente terapêutico é selecionado de um ou mais de 5-Flurouracil (5-FU), Gemcitabina, cisplatina, Paclitaxel, carboplatina ou Irinotecano.
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