KR20220034053A

KR20220034053A - 재조합 단백질의 안정적인 제형

Info

Publication number: KR20220034053A
Application number: KR1020217042194A
Authority: KR
Inventors: 다난제이 사데; 비제이 파디; 비벡 미시라; 아누팜 재인
Original assignee: 유니켐 레버러토리스 리미티드
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2022-03-17
Also published as: EP3996680A1; US20220339241A1; CA3140609A1; CN114126584A; AU2020311050A1; JP2022539494A; BR112021023265A2; SG11202112726SA; MX2021015426A; WO2021005500A1; ZA202109011B

Abstract

본 발명은 재조합 단백질의 안정적인 제형에 관한 것이다. 발명은 특히 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴의 제형에 관한 것이다. 제형은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 발명은 또한 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴을 포함하는 안정적인 액체 및/또는 동결 건조 제형에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질의 안정적인 제형

본 발명은 토양 매개 진균류(soil borne fungus)에서 유래된 재조합 단백질 및 이의 치료적으로 유효한 제형에 관한 것이다. 발명은 특히 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 렉틴 유래 재조합 렉틴 및 이의 안정적인 액체 및/또는 동결 건조 제형에 관한 것이다.

재조합 단백질의 발달은 생의학 생물공학의 중요한 돌파구였다. 이는 표적외 부작용으로부터 안전하고, 질병, 예컨대 당뇨병, 소인증, 심근 경색, 울혈성 심부전, 뇌일혈, 다발성 경화증, 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 빈혈, 간염, 류머티스성 관절염, 천식, 크론병(Crohn's disease) 및 암을 치료하는 데 사용되는 매우 강력한 약물로 공지되어 있다. 재조합 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 성장 인자 및 효소가 규제 기관에 의해 승인된 재조합 단백질의 일부이고, 현재 약물로 이용 가능하다.

렉틴은 다른 분자의 당 모이어티(sugar moieties)에 매우 특이적인 탄수화물 결합 단백질, 거대 분자이다. 많은 렉틴이 악성 성장의 조기 발견을 나타내는 바이오 마커 또는 자가 포식 유도제로 사용되는 반면 다른 렉틴은 세포 자멸사를 통해 암 성장을 억제하는 능력을 또한 나타낸다. 렉틴은 악성 종양에 특이적으로 결합하기 때문에 암 치료에서 약물 전달 제제로 사용된다. 게다가, 렉틴은 암 관련 경로를 또한 조절하기 때문에 암 진단 및 치료제로서 가능성이 있다. 현재, 대부분의 상업적으로 이용 가능한 렉틴은 식물 및 기타 진핵 생물 유래이다.

스클레로티움 롤프시이 렉틴(Sclerotium rolfsii lectin, SRL)은 토양 매개 식물 병원성 진균류 S. 롤프시이의 균핵체에서 단리된 렉틴이다. SRL은 TF(Thomsen-Friedenreich) 항원 및 Tn 항원에 대한 특이성을 갖는다. TF 항원은 상이한 인간 암 세포의 세포 표면 상에 과발현되는 이당류(Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)이다. Tn 항원은 단당류(GalNAc-α-)이다. TF 및 Tn 항원에 대한 특이성 때문에, SRL은 인간 대장암, 난소암 및 백혈병 세포에 결합하는 것으로 나타났다.

국제 출원 WO 2010/095143은, 각각 3 및 5 개의 아미노산 치환에 의해 천연 SRL 서열에서 유래된 재조합 렉틴 변이체 Rec-2 및 Rec-3을 개시한다. 유사하게 국제 출원 WO 2014/203261은 12 개의 아미노산 치환에 의해 천연 SRL 서열에서 유래된 재조합 렉틴 변이체를 개시한다.

국제 출원 WO 2010/095143 및 WO 2014/203261은 SRL에서 유래된 렉틴이 인간 대장암, 난소암 및 백혈병 세포와 같은 몇몇 암에 대해 매우 강력함을 입증하나, 상기 참조 문헌은 인간 암의 효과적인 치료를 위한 이의 치료 제형에 대해서는 여전히 침묵한다.

(SRL에서 유래된 것이 아닌) 렉틴을 포함하는 조성물이 개시된 참조 문헌이 있다. 국제 출원 WO03010188, WO2003018617, WO03090774 및 중국 출원 CN101485880 참조 문헌은 등장제, 안정화제, 완충제 및 담체를 포함하는 만노스 결합 렉틴 조성물을 개시한다.

일본 출원 JP2011126907은 뇌 종양 세포에서 세포 자멸사를 유도하고, 당단백질의 N-결합 당 사슬 A2G2F에 대한 결합 특이성을 갖는 렉틴을 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 국제 출원 WO2014027958 및 미국 출원 US9981007은 식물 렉틴인 재조합 겨우살이(Mistletoe) 렉틴을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이나, 러시아 출원 RU2644332는 2년 반 동안 항종양 효과 및 안정성을 갖는 겨우살이에서 추출된 단백질 조성물에 관한 것이다.

따라서, 인간 암의 효율적인 치료를 위한 진균류 렉틴의 치료적으로 유효한 제형에 관한 보고는 없다. 또한 렉틴은 유기 화합물(전통적인 활성 약학 성분)에 비해 거대분자이기 때문에, 이의 제형 개발은 매우 복잡하고 힘들다. 주요 도전은 제형 내 렉틴의 안정성 및 렉틴 내 적어도 아미노산 코어 서열의 구조적 완전성의 보존이다. 안정성이 화학적 불안정성(예를 들어, 새로운 화학적 엔티티를 초래하는 결합 형성 또는 절단에 의한 단백질의 변형을 수반하는 임의의 프로세스)으로 발생할 수 있는 상기 거대 단백질의 고도의 분해 특성 또는 물리적 불안정성(예를 들어, 단백질의 보다 고차 구조 내 변화)으로 인해 중요하다. 화학적 불안정성이 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 이황화물 교환으로 발생할 수 있고, 물리적 불안정성이 변성, 응집, 침전 또는 흡착에 기인할 수 있다. 시장성 있는 단백질 제형은 투여하기에 안전해야 하며, 권장된 유통 기한 동안 물리적, 화학적 및 생물학적으로 안정하게 유지되어야 한다.

암 치료에 효과적인 진균류 렉틴의 안정적이고 효율적인 제형을 개발하기 위한 시간이 필요하다. 렉틴의 가용성 및 생리 활성을 유지하면서 안정적인 제형을 개발하는 것이 또한 필요하다. 따라서, 진균류에서 유래된 렉틴의 안정적인 제형을 개발하는 것이 본 발명의 목적이다. 약학적으로 허용 가능한, 치료적으로 유효한 렉틴 제형을 개발하는 것이 또한 목적이다. 특정 구현예에서, 경구 투여 또는 비경구 투여에 적합한 렉틴 제형을 제공하는 것이 목적이다. 취급, 보관 및 전달이 용이한 안정적인 동결 건조된 렉틴 제형을 제공하는 것이 추가 목적이다.

발명의 요약

본 발명의 측면에 따라, 스클레로티움 롤프시이 렉틴(SRL)에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 단백질을 포함하는 안정적인 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 특정 측면에 따라, SRL에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴을 포함하는 안정적인 약학 조성물이 제공되고, 여기에서 상기 재조합 렉틴은:

a) 서열 번호: 1;

b) 서열 번호: 2;

c) 서열 번호: 3; 또는

d) 서열 번호: 1, 2 또는 3과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열;

중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

스클레로티움 롤프시이 렉틴 또는 SRL은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 서열 번호: 1 내지 3은 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 예이다. 특히, 서열 번호: 1, 2 및 3은 서열 번호: 4에 대해 각각 97.9%, 96.5% 및 91.5%의 상동성을 갖는다(EMBOSS Needle을 사용하여 결정된 바와 같음).

선행 측면 중 어느 하나에 따라, 재조합 렉틴은, 특히 렉틴의 정의와 관련하여 참조로 여기에 통합된 문헌[국제 출원 WO2020/044296]에 정의된 바와 같이 (탄수화물 결합 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 재조합 렉틴 단백질인) 변형된 렉틴 단백질이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 안정적인 약학 조성물은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 안정화제를 포함한다.

선행 측면 중 어느 하나에 따라, 약학적으로 허용 가능한 안정화제는:

a) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;

b) 하나 이상의 계면 활성제;

c) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 또는

d) a) 내지 c) 중 2개 이상의 혼합물;

중 하나 이상을 포함한다.

구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 안정화제는:

b) 하나 이상의 계면 활성제; 및/또는

c) 하나 이상의 탄수화물;

을 포함하고,

여기에서 재조합 렉틴 대

ⅰ. 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 비율이 약 1:0.1 내지 약 1:10의 범위 내에 있고;

ⅱ. 계면활성제의 비율이 약 1:0.0002 내지 약 1:10의 범위 내에 있으며;

ⅲ. 탄수화물의 비율이 약 1:0.1 내지 약 1:150의 범위 내에 있다.

선행 측면 중 어느 하나에 따라, 본 발명의 안정적인 약학 조성물이 국소적으로, 경구로 또는 비경구로 투여된다.

또한, 본 발명의 선행 측면 중 어느 하나에 따라, 안정적인 약학 조성물이 암의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.

본 발명의 여전히 또 다른 측면에 따라, 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴을 포함하는 안정적인 약학 조성물의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라,

b) 하나 이상의 계면 활성제;

c) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 또는

d) a) 내지 c) 중 2개 이상의 혼합물;

중 하나 이상을 포함하는 제형 안정화 성분이 제공된다.

본 발명의 특정 측면에 따라,

a) 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 약 0.0001% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 재조합 렉틴 단백질;

b) 약 0.01% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;

c) 약 0.0001% (w/v) 내지 약 1% (w/v)의 하나 이상의 계면 활성제; 또는

d) 약 0.1% (w/v) 내지 약 15% (w/v)의 하나 이상의 탄수화물 또는 당;

을 포함하는 안정적인 약학 조성물이 제공된다.

여기 사용된 백분율은 투여를 위해 준비된 부피로 최종 제형 내 성분의 양(중량)을 지칭한다. 백분율은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정된다.

· 서열 번호: 1은 (국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-2로 보고된) S. 롤프시이 렉틴 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.
· 서열 번호: 2는 (국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-3으로 보고된) S. 롤프시이 렉틴 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.
· 서열 번호: 3은 (국제 출원 WO 2014/203261에 보고된) S. 롤프시이 렉틴 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.
· 서열 번호: 4는 천연 S. 롤프시이 렉틴 아미노산 서열을 나타낸다.

정의:

여기 사용된 바와 같은 용어 “렉틴(lectin)”은 탄수화물 결합 단백질을 지칭하고, 여기 사용된 바와 같은 용어 “단백질(protein)”은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.

여기 사용된 바와 같은 용어 “재조합(recombinant)” 생성물은 유전자 조작된 생성물을 지칭한다. 유전자 조작은 유전자의 비천연 조작임이 이해될 것이다. 따라서 재조합 생성물은, 생성물이 자연에 존재하지 않는 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재하거나 합성된 생성물이다.

여기 사용된 바와 같은 용어 “재조합 단백질(recombinant protein)”, “재조합 렉틴(recombinant lectin)”, “재조합 렉틴 단백질(recombinant lectin protein)” 또는 “재조합 폴리펩티드(recombinant polypeptide)”는 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현된 단백질 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 재조합 단백질은 스클레로티움 롤프시이 렉틴(SRL)에서 유래된 렉틴이다. SRL은 토양 매개 식물 병원성 진균류 S. 롤프시이의 균핵체에서 단리된 렉틴이다. 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 재조합 렉틴의 예이다.

용어 “재조합 단백질(recombinant protein)”은, 환자에 투여 시, 여기 기재된 바와 같은 화합물을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매 화합물, 수화물, 전구 약물 또는 임의의 다른 화합물을 포함하는 것으로 여기서 의도된다. 염, 용매 화합물, 수화물 및 전구 약물의 제조는 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있다.

용어 '제형(formulation)', '조성물(composition)', '약학 제형(pharmaceutical formulation)' 및 '약학 조성물(pharmaceutical composition)'은 상호 교환적으로 사용되며, 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 하는 그런 형태로 존재하고, 따라서 치료용으로 대상체에 투여될 수 있는 제제를 지칭하며, 여기에서 상기 대상체는 바람직하게는 인간이다. 여기 사용된 바와 같은 '활성 성분(Active ingredients)'은 질병 또는 질병의 증상으로부터 대상체를 자유롭게하거나 질병의 진행을 늦추거나 지연시키는 바람직한 생물학적 또는 치료적 활성을 갖는 재조합 렉틴 또는 재조합 단백질을 지칭한다. 본 발명의 제형은 액체 제형 또는 고형 제형으로 제조된다. 액체 제형은 구강 투여 또는 주사에 적합한 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태이다. 액체 제형이 액체 비히클로서 주사용 증류수(water for Injection, WFI)와 같은 매체 내에 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 고형 제형은 고체 성분을 혼합하거나 용매 매체를 증발시킴으로써 제조된다. 고형 제형은 액체 제형의 동결 건조에 의해 또한 제조될 수 있고, 여기서 동결 건조 과정에서 건조될 물질이 먼저 냉동되고 난 뒤 얼음 또는 냉동된 용매가 진공 하에서 승화에 의해 제거된다. 안정성의 이유로, 부형제가 동결 건조되기 전에 제조에 첨가될 수 있다. 동결 건조 중, 당업자의 지식 범위 내인 적절한 선반 온도, 생성물 온도, 진공 수준, 냉동, 1차 건조 파라미터 및 2차 건조 파라미터를 확인하고 이용하는 것이 필요할 수 있다. 고형 제형은 동결 건조 제형으로도 공지될 수 있다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 '부형제(excipient)'는 활성 성분의 치료 작용에는 영향을 주지 않으나 활성 성분을 위한 비히클 또는 매질로 작용하는 제형에 첨가되는 불활성 또는 보통 비활성 물질을 지칭한다. 이는 조성물의 원하는 일관성을 제공하고/거나, 안정성을 개선하고/거나 삼투압 농도를 조정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 부형제가 단백질 제형에 사용하도록 당업자에 공지된 물질에서 선택될 수 있다. 상기 부형제의 예는, 완충제, 단백질 안정화제, 중합체, 가용화제, 동결 보호제, 동결건조 보호제, 증량제/들, 희석제 또는 이의 혼합물이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 “동결 보호제(Cryoprotectant)”는 제형 내 세포 또는 조직 또는 활성 성분을 냉동 과정 중 또는 냉동으로 인한 손상으로부터 보호하는 화합물을 지칭한다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 “동결건조 보호제(Lyoprotectant)”는 제형 내 세포 또는 조직 또는 활성 성분을 건조 단계 중 손상으로부터 보호하는 화합물을 지칭한다.

동결 보호제 및 동결건조 보호제는 증량제로도 사용될 수 있다. 증량제는 생성된 동결 건조된 케이크의 구조를 강화하며 당업자에 의해 이해된다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 '치료적 유효량(therapeutically effective amount)'은 원하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 (즉, 치료 효능을 달성하는) 양이다. 치료적 유효량이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 재조합 단백질의 치료적 유효량은 질병 상태의 진행을 완화, 개선, 안정화, 반전, 방지, 늦추거나 지연시키기에 충분한 양이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "상동성(homology)" 또는 "상동성의(homologous)"는 주어진 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 일부 동일성을 공유하는 2개 이상의 참조된 엔티티(entities)를 지칭한다. 상동성 또는 동일성의 구역, 영역 또는 도메인은 상동성을 공유하거나 동일한 2개 이상의 참조된 엔티티의 일부를 지칭한다. 따라서, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이들은 상기 영역에서 동일성을 공유한다. 실질적인 상동성은, 구조적 또는 기능적으로 보존되어 참조 분자 또는 상동성을 공유하는 참조 분자의 관련/대응 영역 또는 부분의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성) 중 하나 이상의 적어도 일부 구조 또는 기능을 갖거나 가질 것으로 예측되는 분자를 지칭한다.

실온은 22℃ 내지 28℃ 범위의 온도이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 '안정적인 조성물(stable composition)' 및 '안정적인 제형(stable formulation)'은 동일한 의미를 가지며, 보관 시 그 안의 단백질이 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성 및 이의 치료 효능을 본질적으로 보유하는 단백질 조성물을 지칭한다. 조성물 내 단백질은 결합 형성 또는 절단에 의한 임의의 변형을 겪지 않거나 단백질의 기본적인 구조에 어떠한 변형도 없다. 예를 들어, “안정적인(stable)” 제형은 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만의 단백질이 제형 내 응집체로 존재하는 것일 수 있다. 게다가, 안정적인 제형은 그 안에 용해된 단백질의 응집 또는 침전에 대한 보호를 또한 제공할 수 있다. 단백질 제형의 안정성은 생물학적 활성 평가(생물학적 정량)를 이용하여 또한 측정될 수 있다. 안정적인 조성물은 신선하게 제조된 조성물과 비교하여 유통 기한 중 분석 수치에서 상당한 변이를 나타내지 않을 것으로 예측된다.

예를 들어, 본 발명에서 생물학적 정량이 난소암 세포주(PA-1 세포주)에 대한 제형의 세포 독성을 테스트함으로써 관측되었다. PA-1 세포주에 대한 완충제 내 서열 번호: 1의 표준 세포 독성이 31.58% 내지 58.05%이다. 서열 번호: 1의 조성물이 PA-1 세포주 상에서 유사한 효과를 나타낼 것으로 예측된다. 상기 세포주 상에서 0 개월 및 6 개월 후에 조성물의 효과가 동일(31.58% 내지 58.05%)한 경우 조성물은 6 개월 동안 안정적인 것으로 추정된다.

조성물의 안정성이 몇몇 다른 파라미터를 이용하여 또한 테스트될 수 있다. 예를 들어, 조성물이 육안으로 관찰했을 때 6 개월 동안 외관이 변하지 않은 경우 6 개월 동안 안정적인 것으로 추정된다. 또는 조성물은, 예를 들어 제형 제조의 1 개월 내지 최대 6 개월 후 안정성 기간 동안 형성된 불순물이 허용 가능한 한도 내이면 안정적인 조성물인 것으로 추정된다. 불순물은 고분자량 불순물 또는 기타 미지의 불순물을 포함할 수 있다.

또한, 조성물은, 이의 '평가(assay)'가 안정성 기간 동안 동일하거나 허용 가능한 한도 내이면 안정적인 것으로 추정될 수 있다. 여기에 사용된 용어 “평가(assay)”는 활성 물질의 순도 또는 강도를 결정하기 위한 분석적 절차를 지칭한다. 이는 조성물에 존재하는 활성 성분의 백분율 분석이다. 단백질을 분석하는 평가는 크로마토그래피 방법 또는 화학적 분석 또는 적정과 같은 당업계에 공지된 방법에서 선택될 수 있다. 제형 내 단백질의 백분율이 제조 당일의 그것과 동일하거나 안정성 기간 후 분석되었을 때 한도 내에서 가변적이어야 한다.

여기에 사용된 용어 “안정성 기간(Stability period)”은 제형 및 제형 내 활성 성분이 동일성, 강도, 품질, 순도 및 활성과 같은 이의 특성을 모두 보유하는 기간을 지칭한다. 안정성 기간은 제형의 제조 또는 생산 날짜로부터 계산되고, 수 일에서, 수 주까지, 수 개월까지, 수 년까지 다양할 수 있다. 예를 들어, 제형은 제조 후 며칠 동안 안정성을 나타낼 수 있거나 제조 날짜로부터 3 년 동안 안정적으로 유지될 수 있다.

'제형 안정화 성분(formulation stabilizing component)'은 냉동 단계 중 또는 냉동-건조 중 수용액에서 단백질의 분해를 감소 또는 방지하는 물질을 지칭한다. '제형 안정화 성분(formulation stabilizing component)'은 상이한 조건 하에서 단백질의 구조를 유지한다. 다양한 제형 성분, 예컨대 완충제, 표면 활성제, 아미노산 안정화제, 탄수화물 안정화제 및 긴장 조절제가, 단백질 및 따라서 단백질 제형을 안정화하도록 개별적으로 또는 조합하여 이용된다.

제형의 성분 또는 부형제로 지칭될 경우 용어 “아미노산(Amino acids)”은 카르보실기(-COOH) 및 아미노기(-NH2)를 모두 함유하는 간단한 유기 화합물이다. 본 발명의 목적을 위해 아미노산이 개별적으로 또는 이의 혼합물로 또는 다른 안정화 성분과 조합하여 단백질 안정화제로 이용된다.

여기 사용된 바와 같은 용어 'w/v'는 조성물 내 부형제의 중량 백분율을 지칭하고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 측정 또는 계산된다.

용어 “암(cancer)”, “종양(tumor)” 및 “종양(tumour)”은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본 출원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 암 또는 종양은 비정상적인 세포 성장으로 발생한다. 이는 정상 세포가 통제 불능으로 성장하며 밀어낼 때 형성된다. 종양의 형성은 종종 조직, 기관 또는 유기체의 정상적인 기능에 영향을 미친다.

암은 신체의 어느 곳에서든 시작될 수 있으며 신체의 다른 부분으로 또한 확산될 수 있다. 암 세포의 확산은 전이로 지칭된다. 따라서, 용어 “암(cancer)”은 1차 및 전이 암을 모두 포괄한다. 여기 사용된 바와 같은 용어 “암(cancer)”은 고형 종양을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

용어 “치료(treatment)”는 암을 치료, 질병의 진행을 방지 또는 늦추거나 질병의 중증도 감소, 전이의 방지 또는 감소, 종양 성장의 억제, 종양 부피의 감소 또는 종양의 제거 및/또는 질병과 관련된 증상의 개선(일시적 또는 영구적)을 실질적으로 포함할 수 있다. 증상이 암의 유형에 따라 달라질 수 있으나 통증, 기능 감소 또는 기능 상실, 메스꺼움 및/또는 구토, 발열, 종양 형성, 면역 억제 및/또는 피로를 포함 할 수 있음이 이해될 것이다. 용어 “치료(treatment)”는 예방 또는 치료 또는 방지 수단을 포함한다.

용어 “재구성 시간(Reconstitution time)”은 입자가 없는 투명해진 용액으로 액체 내 동결 건조 제형과 같은 고형 제형을 완전히 용해시키는 데 필요한 시간이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 동결 건조 제형의 재구성에 필요한 짧은 기간이 제형의 안정성을 결정하는 기여 인자이다. 일반적으로 주사용 증류수인 첨가되는 액체의 양은 대상체에 제형의 투여 전에 제형 내 필요한 단백질의 최종 농도에 좌우될 것이다.

본 발명의 제1 특정 측면에 따라, 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 단백질을 포함하는 안정적인 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, SRL에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴을 포함하는 안정적인 약학 조성물이 제공되고, 여기에서 상기 재조합 렉틴은:

a) 서열 번호: 1;

b) 서열 번호: 2;

c) 서열 번호: 3; 또는

중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일 구현예에서, 2개의 서열 사이 "상동성(homology)" 백분율은 기본 파라미터를 갖는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정된다(Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402). 특히, BLAST 알고리즘은 URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.을 이용하여 인터넷에서 액세스할 수 있다. 대안적 구현예에서, 전체 서열 정렬을 위해, 2개의 서열 사이 상동성 동일성 백분율이 기본 파라미터를 이용한 EMBOSS Needle 알고리즘을 사용하여 결정된다. 특히, EMBOSS Needle 알고리즘은 URL:https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/을 이용하여 인터넷에서 액세스할 수 있다.

스클레로티움 롤프시이 렉틴 또는 SRL은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 서열 번호: 1 내지 3은 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 예이다. 특히, 서열 번호: 1, 2 및 3은 (EMBOSS Needle을 사용하여 결정된 바와 같이) 서열 번호: 4에 대해 각각 97.9%, 96.5% 및 91.5%의 상동성을 갖는다.

서열 번호: 1은 (국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-2로 보고된) SRL 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.

서열 번호: 2는 (국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-3으로 보고된) SRL 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.

서열 번호: 3은 (국제 출원 WO 2014/203261에 보고된) SRL 아미노산 서열의 변이체를 나타낸다.

서열 번호: 4는 천연 S. 롤프시이 렉틴 아미노산 서열을 나타낸다.

선행 측면 중 어느 하나에 따라, 재조합 렉틴은, 특히 렉틴의 정의와 관련하여 참조로 여기에 통합된 문헌[국제 출원 WO2020/044296]에 정의된 바와 같이 변형된 렉틴 단백질(즉, 탄수화물 결합 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 재조합 렉틴 단백질)이다. 특정 구현예에서, 재조합 렉틴은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 탄수화물 결합 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.

또 다른 특정 측면에서, 탄수화물 결합 부위는 1차 및/또는 2차 탄수화물 결합 부위이다.

또 다른 특정 측면에서, 1차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 내 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 & 105 중 하나 이상에서 선택된 위치를 포함한다.

또 다른 특정 측면에서, 아미노산 변형의 위치는:

ⅰ) 27 및/또는 28;

ⅱ) 47 및/또는 48;

ⅲ) 70, 71, 및/또는 72; 및/또는

ⅳ) 105;

중 하나 이상에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 2차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 내 77, 78, 80, 101, 112, 및 114 중 하나 이상에서 선택된 위치를 포함한다.

또 다른 특정 측면에서, 아미노산 변형의 위치는:

i) 77, 78 및/또는 80;

ii) 101; 및/또는

iii) 112 및/또는 114;

중 하나 이상에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 아미노산 변형은 아미노산 치환이어서 치환 아미노산이 원래의 아미노산을 대체한다.

또 다른 특정 측면에서, 1차 탄수화물 결합 부위 내 아미노산 치환은:

i) 27번 위치: 보존적, 유리 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 비극성 또는 산성; 유리는 극성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 비극성임 - ;

ii) 28번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 극성임 - ;

iii) 47번 위치: 염기성 또는 비극성인 불리한 아미노산;

ⅳ) 48번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ⅴ) 70번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ⅵ) 71번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ⅶ) 72번 위치: 비극성인 불리한 아미노산; 및/또는

ⅷ) 105번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 염기성 또는 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성, 염기성 또는 극성 및/또는 불리한 아미노산은 극성, 비극성 또는 산성;

중 하나 이상에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 2차 탄수화물 결합 부위 내 아미노산 치환은:

i) 77번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ii) 78번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

iii) 80번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ⅳ) 101번 위치: 유리, 불리 또는 중성 아미노산 - 여기에서 상기 유리한 아미노산은 극성 또는 염기성, 불리한 아미노산은 비극성이고 중성 아미노산은 비극성 또는 산성임 - ;

ⅴ) 112번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;

ⅵ) 114번 위치: 극성인 불리한 아미노산;

중 하나 이상에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질은 서열 번호: 4의 N-말단 또는 서열 번호: 4에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서 상기 N-말단은 서열 번호: 4 내 1 및/또는 2 또는 상기에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열 내 대응 위치 중에서 선택된 위치를 포함한다.

또 다른 특정 측면에서, 아미노산 변형은 1번 위치의 아미노산 치환이고, 치환 아미노산은 트레오닌 또는 발린이 아니다.

또 다른 특정 측면에서, 치환 아미노산은: 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 세린 중에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 아미노산 변형은 2번 위치의 아미노산 치환이고, 여기에서 치환 아미노산은 트립토판이다.

또 다른 특정 측면에서, 시작 메티오닌의 절단이 대조군에 비해 증가 또는 감소된다.

또 다른 특정 측면에서, 76번 위치의 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로 아미노산 치환이다.

또 다른 특정 측면에서, 비극성 아미노산은: 글리신, 발린 또는 류신 중에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 44 또는 89번 위치의 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로 아미노산 치환이다.

또 다른 특정 측면에서, 비극성 아미노산은: 류신, 이소류신 또는 발린 중에서 선택된다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질은 가용성, 부분적 가용성 또는 불용성이고/거나 세포 독성을 갖는다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성을 갖는다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질은 대조군에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100% 증가된 세포 독성 백분율을 갖는다.

또 다른 특정 측면에서, 변형된 렉틴 단백질의 길이는 500, 400, 300, 250, 200 또는 150개 또는 미만의 아미노산이다.

상기 기재된 바와 같은 재조합 단백질은 문헌[국제 출원 WO2020/044296, WO2010/095143 및 WO2014/203261]에 기재된 프로세스에 의해 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 종래의 기술, 전형적으로 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다.

또 다른 주요 측면에 따라, 본 발명은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 안정적인 약학 조성물을 제공한다.

약학적으로 허용 가능한 부형제는, 완충제, 안정화제, 중합체, 가용화제, 동결 보호제, 동결건조 보호제, 증량제, 희석제, 유화제 및 방부제일 수 있다.

완충제는, 예를 들어 인산나트륨, 1수소 인산 탈수나트륨, 2수소 인산 탈수나트륨, 구연산 나트륨, 아세트산 나트륨, TRIS-염화나트륨, 인산 완충제, 예컨대 2염기 인산 칼륨, 1염기 인산 칼륨 또는 히스티딘 중에서 선택될 수 있다. 완충제의 농도는 1 mM 내지 300 mM의 범위일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, TRIS-염화나트륨 완충제 시스템의 완충제에서, TRIS(트리스아미노메탄)의 농도는 1 mM - 200 mM이고, 염화 나트륨(NaCl)의 농도는 1 mM - 300 mM이다. 완충제가 제형의 pH를 유지하는 데 사용됨이 이해될 것이다. pH가 5 내지 9로 조절될 수 있다. 특히, 제형의 pH가 7 내지 9 범위 내이다.

발명의 측면에 따라, 안정화제가, 계면 활성제, 세제, 아미노산, 아미노산의 약학적으로 허용 가능한 염, 탄수화물 또는 당 안정화제, 아민, 폴리올 또는 이의 조합물 중에서 선택될 수 있다.

상기 구현예에 따라, 계면 활성제의 비제한적인 예는, Tween® 20(폴리소르베이트 20), Tween® 40(폴리소르베이트 40), Tween® 60(폴리소르베이트 60), Tween® 80(폴리소르베이트 80), 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, Triton™ X-100, Pluronic® F-68, Pluronic® F-88, Pluronic® F-127(폴록사머), 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 폴록사머 188 및 Brij 35(폴리옥시에틸렌 알킬 에테르) 또는 이의 조합물이다.

일부 구현예에서, 계면 활성제는 0.001 mg/ml 내지 10 mg/ml 또는 0.0001% (w/v) 내지 1.0% (w/v)의 범위 내일 수 있다.

일부 구현예에서, 안정적인 조성물은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴 및 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 여기에서 상기 단백질 대 계면 활성제의 비율은 1:0.0002 내지 1:10의 범위 내이다.

또한, 구현예에 따라, 아미노산은, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌 또는 이의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산일 수 있다. 아미노산은 예컨대 또는 이의 염으로 사용될 수 있다. 염은, 당업자에게 공지된 바와 같은 알칼리염 또는 알칼리 토금속염, 암모늄염, 유기 아민염, 예컨대 트리에틸아민염 또는 트리에탄올아민염, 아르기닌염, 예컨대 염기성 아미노산염 또는 산성염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염, 무기산염, 구연산염, 옥살산염, 타르트르산염 또는 아미노산의 임의의 다른 염일 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산이 L-히스티딘, L-아르기닌, 글루탐산 또는 메티오닌 중에서 선택된다. 또 다른 구현예에서, 아미노산은 L-히스티딘, L-아르기닌, 글루탐산 또는 메티오닌 중에서 선택된 아미노산의 염산염이다. 바람직한 구현예에서, 아미노산은 L-히스티딘 또는 L-아르기닌의 염산염에서 선택된다.

일부 구현예에서, 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 0.01% (w/v) 내지 10% (w/v) 또는 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 범위 내이다.

또 다른 구현예에서, 안정적인 조성물은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴 및 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 단백질 대 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 비율은 1:0.1 내지 1:10의 범위 내이다.

여전히 또 다른 구현예에 따라, 탄수화물 또는 당 안정화제는, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 글리세롤, 만니톨, 락토스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 글루코스, 라피노스, 말토스, 덱스트란, 이노시톨 또는 이의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 수크로스 또는 만니톨이다. 또 다른 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.1% (w/v) 내지 15% (w/v) 또는 1.0 mg/ml 내지 150.0 mg/ml의 범위 내이다.

여전히 또 다른 구현예에서, 안정적인 조성물은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴 및 하나 이상의 탄수화물 또는 당 안정화제를 포함하고, 여기에서 단백질 대 탄수화물의 비율은 1:0.1 내지 1:150의 범위 내이다.

발명의 측면에 따라, 안정화제가, 아민 유사 염기성 단백질, 예컨대 프로타민 또는 프로타민의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 폴리리신과 같은 아민 잔기를 갖는 천연 또는 합성 중합체 중에서 더 선택될 수 있다. 프로타민은, 예를 들어 인간 또는 어류에서 수득되거나 유래될 수 있다. 안정화제는 폴리올, 예컨대 PEG 400 내지 PEG 20,000, 글리세롤 또는 자일리톨 중에서 또한 선택될 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 안정화제는 계면 활성제, 아미노산, 아미노산 및/또는 탄수화물의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나 이상의 조합이다. 예를 들어, 안정화제는 계면 활성제 및 아미노산의 조합일 수 있거나 아미노산 또는 이의 염 및 탄수화물의 조합일 수 있다. 미국 출원 US9981007은 전이성 종양을 치료하기 위한 재조합 겨우살이 렉틴을 포함하는 조성물을 개시하고, 여기에서 실시예에 따라 상기 조성물은 안정화제로 폴리소르베이트 및 글루탐산 또는 폴리소르베이트 및 트레할로스의 조합물을 포함한다. 다중 안정화제가, 상이한 메커니즘 및/또는 가능한 상승 작용 효과를 통해 상이한 안정성 이슈를 해결할 것으로 기대하여 단백질 조성물에서 동시에 사용됨이 이해될 것이다. 그러나 단지 다중 안정화제의 사용이 항상 안정적인 단백질 제형을 산출하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에서 L-히스티민 및 다양한 양의 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형은 안정적인 제형을 제공하지 않았다. 육안으로 검사한 결과 25℃에서 1 개월 보관 후 백색 침전이 나타났다.

발명의 측면에 따라, 조성물 내 부형제는, 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 덱스트란, 히드록시 에틸 전분(hydroxyl ethyl starch, HETA) 또는 PEG-4000 또는 이의 조합물; 및 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 방부제, 예컨대 벤질 알콜, m-크레졸, 메틸 파라벤, 페놀 또는 이의 조합물; 장성 변형제, 예컨대 염화 나트륨, 텍스트로스, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 수크로스 또는 이의 조합물; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌 디아민 테트라 아세트산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및/또는 동결 보호제, 예컨대 만니톨, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 수크로스, 트레할로스 및/또는 덱스트로스;를 선택적으로 더 포함할 수 있다.

여기 언급된 바와 같은 부형제의 예는 발명의 명확성 및 이해를 위한 것이고, 어떠한 방식으로든 발명을 한정하려는 것이 아님이 이해될 것이다. 게다가, 상이한 부형제가 제형에서 상이한 역할을 한다는 것을 당업자는 또한 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트가 제형에서 안정화제 또는 가용화제 또는 유화제로 사용될 수 있다. 본 발명의 제형은 상이한 기능을 나타내는 부형제를 포함하고, 여기 명시된 기능으로 제한되지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물 내 재조합 렉틴의 농도는 0.001 mg/ml 내지 100 mg/ml의 범위 내이다. 일부 구현예에서, 농도는, 0.25 mg/ml 이상, 0.5 mg/ml, 1 mg/ml 이상, 1.5 mg/ml 이상, 2 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 3 mg/ml 이상, 3.5 mg/ml 이상, 4 mg/ml 이상, 4.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 5.5 mg/ml 이상, 6 mg/ml 이상, 6.5 mg/ml 이상, 7 mg/ml 이상, 7.5 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 8.5 mg/ml 이상, 9 mg/ml 이상, 9.5 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상 또는 20 mg/ml 이상, 30 mg/ml 이상, 40 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상이다.

일부 구현예에서, 조성물 내 재조합 렉틴의 농도는 0.0001% (w/v) 내지 10% (w/v)의 범위 내이다.

본 발명의 또 다른 주요 측면에 따라,

b) 하나 이상의 계면 활성제;

c) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 또는

d) a) 내지 c) 중 2개 이상의 혼합물;

중 하나 이상을 포함하는 제형 안정화 성분이 제공된다.

본 발명의 측면에 따라, “제형 안정화 성분(formulation stabilizing component)”은 바람직하게는 단백질 제형에 사용된다.

특정 구현예에서, 단백질 제형은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 재조합 렉틴을 포함하는 제형이다.

매우 특정 측면에 따라, 본 발명의 안정적인 약학 조성물은;

을 포함한다.

본 발명의 조성물은 수용액 또는 고체로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체, 현탁액, 분말, 멸균 분말 또는 용액 제형의 경우 동결 건조될 수 있다. 동결 건조 제형은 주사용 증류수(WFI) 및/또는 임의의 적합한 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 이의 혼합물과 재구성되어 당업자에게 공지된 바와 같은 필요한 농도를 얻을 수 있다. 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량에 적합하다. 투약 형식이 다양한 인자, 예컨대 체중 및 무게, 체표면적, 연령, 성 또는 환자의 일반적 건강 및 투여될 제제, 특히 투여 기간 및 투여 형식 및 동시에 투여될 수 있는 다른 약물에 따라 다름이 당업자에게 공지되어 있다.

렉틴은 약학적을 허용 가능한 형태, 예컨대 액체(예를 들어, 수용액 또는 현탁액 내 또는 오일 기반 용액 또는 현탁액으로), 고체(예를 들어, 캡슐 또는 정제), 동결 건조된 분말, 스프레이, 크림, 로션 또는 겔, 소낭 약물 전달 시스템, 예컨대 비제한적으로 빌로솜(bilosomes), 리포솜, 니오솜(niosomes), 트랜스페로솜(transferosome), 에토솜(ethosomes), 스핑고솜(sphingosomes), 파마코솜(pharmacosomes), 다중막 소낭, 미소 구체 등으로 제공될 수 있다.

여기 사용된 바와 같은 “수용액(aqueous solution)”은, 고체 또는 동결 건조된 제제, 예컨대 물 또는 물을 함유하는 완충제에 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 렉틴을 용해시킴으로써 생성되는 용액이다. 수용액은, 제제, 예컨대 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 렉틴이 액체 형태이고, 물 또는 물을 함유하는 완충제와 혼합될 때 또한 형성된다.

본 발명의 조성물은 적합한 투여량으로 개체에 투여될 수 있다. 투여가, 국소적으로, 경구적으로 또는 비경구적으로, 예를 들어 정맥 내로, 복강 내로, 피하 내로, 근육 내로, 국소적으로, 비강 내로, 기관지 내로, 진피 내로, 또는 동맥 내 지점에서 카테터를 통해 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있다.

구현예에서, 본 발명의 액체 제형은 2 년 이상 또는 1 년 이상 동안 냉장 온도(2℃ - 8℃)에서 안정적이다. 또 다른 구현예에서, 액체 제형은 6 개월 이상 또는 3 개월 이상 또는 2 개월 이상 또는 1 개월 이상 동안 실온에서 안정적이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 동결 건조 제형은 2 년 이상 또는 1 년 이상 동안 냉장 온도(2℃ - 8℃)에서 안정적이다. 또 다른 구현예에서, 동결 건조 제형은 6 개월 이상 또는 5 개월 이상 또는 4 개월 이상 또는 3 개월 이상 동안 실온에서 또한 안정적이다. 동결 건조 제형은 상승된 온도, 예컨대 30℃ 내지 40℃에서 4 개월 이상 또는 3 개월 이상 또는 2 개월 이상 또는 1 개월 이상, 15 일 이상 또는 7 일 이상 동안 또한 안정적이다.

또 다른 주요 측면에 따라, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.

용어 “암(cancer)”은 피부, 조직, 기관, 뼈, 연골의 질병을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 암의 예는, 담관암, 방광암, 뼈암, 뇌암, 유방암, 자궁 경부암, 결장암, 식도암, 위장암(회장, 결장, 직장 및/또는 항문 포함), 머리암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 목암, 난소암, 취장암, 전립선암, 피부암, 위암, 고환암, 혀암, 갑상선암, 요막관암, 질 & 자궁암을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

암은 양성 또는 악성일 수 있고, 악성 종양의 임의의 단계에 있을 수 있다.

암은, 상피 조직, 비상피 조직, 피부 또는 기관의 막을 형성하는 조직을 구성하는 세포, 면역 시스템의 세포, 결합 조직 또는 척수 또는 뇌 세포의 암일 수 있다.

일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다.

암은 암종일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 선암이다. 선암은 식도, 췌장, 전립선, 자궁 경부, 유방, 결장 또는 결장직장, 폐, 담관, 질, 요막관 또는 위 선암일 수 있다.

일부 구현예에서, 암은 편평상피 세포 암종이다. 편평상피 세포 암종은, 피부, 구강, 폐, 갑상선, 식도, 질, 자궁 경부, 난소, 두경부, 전립선 또는 방광 편평상피 세포 암종일 수 있다.

일부 특정 구현예에서, 암은, 신경교아종, 수막종, 성상 세포종, 신경교종 및 신경아 세포종을 포함할 수 있는 뇌 종양/암일 수 있다.

또 다른 구현예에 따라, 본 발명은, 암의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학적으로 안정적인 렉틴 조성물을 제공한다.

대상체는 포유류 대상체일 수 있다. 편의상, 상기 '치료(treatment)'를 받는 포유류가 “대상체(subject)”로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특히, 대상체는 암을 앓거나 암의 예방 또는 치료를 찾는 인간 대상체일 수 있다. 대상체가 '개체(individual)'로 또한 지칭될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 여전히 또 다른 주요 측면에 따라, 안정적인 조성물을 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 재조합 렉틴의 완충 용액과 하나 이상의 안정화제의 완충 용액을 조합하는 것을 포함한다. 방법은 당업자의 지식에 따라 적합한 조건에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 방법 중 온도는, 0℃ 내지 35℃, 5℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 25℃ 또는 20℃ 내지 25℃일 수 있다.

안정적인 조성물은 액체 또는 동결 건조 제형일 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은;

a) 완충제 중 재조합 렉틴의 스톡 용액의 제조;

b) 안정화제의 단일 성분 용액의 제조;

c) 필요한 양의 용액 b)에 필요한 양의 용액 a)의 첨가;

d) 필요한 양의 WFI로 c) 단계 혼합물의 선택적 희석;

e) c) 단계 또는 d) 단계의 용액에 별도로 하나 이상의 안정화제의 선택적 추가;

f) e) 단계의 용액에 다른 부형제의 추가;

g) 주사용 증류수(WFI)를 사용하여 배치 규모로 구성하여 액체 제형 수득;

h) g) 단계에서 수득된 액체 제형의 선택적인 동결 건조로 동결 건조 제형의 수득;

단계를 포함할 수 있다.

당업자의 필요와 이해에 따라, 상기 논의된 방법의 단계가 교환될 수 있다.

제형의 pH가 0.05 N 염산(HCl)을 이용하여 5 내지 9, 특히 7 내지 9로 유지된다. 조성물이 0℃ 내지 35℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 제형화된다. 최종 액체 제형이 적합한 필터, 예컨대 0.22 미크론 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(Polyvinylidene difluoride, PVDF) 또는 폴리에테르술폰(Polyethersulfone, PES) 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 상기 필터를 통해 무균적으로 여과될 수 있다.

실시예

발명은 하기 실시예를 참조하여 완전히 이해될 것이다. 이는 발명을 실시하는 최선의 방식을 입증하고, 어떠한 방식으로든 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 수성/액체 제형 제조 방법.

a) 폴리소르베이트 80의 스톡 용액(10%w/v)이 WFI로 제조되었다;

b) 서열 번호: 1의 단백질의 스톡 용액이 TBS(염분 함유 트리스 완충제)로 제조되었고 유리 비이커 내에 담겨졌다;

c) 필요한 양의 a) 단계 유래 폴리소르베이트-80 용액이 22℃ - 25℃의 온도에서 b) 단계의 유리 비이커 내로 옮겨졌고, 잘 혼합하여 무색 투명한 용액이 얻어졌다;

d) 필요한 양의 L-아르기닌 염산염(L-아르기닌 HCl)이 c) 단계의 용액에 첨가되었고, 균질한 용해를 위해 잘 혼합되었다;

e) 필요한 양의 당이 d) 단계의 용액에 첨가되었고, 균질한 용해를 위해 잘 혼합되었다;

f) e) 단계 용액의 pH가 (0.05N 염산을 이용하여) 7.4-8.0으로 조정되었다;

g) 최종 배치 규모가 WFI를 사용하여 도달되었다;

h) 최종 배치가 0.22 미크론 PVDF 필터를 통해 여과된 후 충진, 마개 및 캡핑되었다.

실시예 2: 임의의 안정화제 및 가용화제없이 재조합 단백질의 제형화

제조 절차:

a) TBS(염분 함유 트리스 완충제) 내 서열 번호: 1의 단백질 스톡 용액이 유리 비이커 내에 담겨졌다;

b) 용액의 pH가 (0.05N HCl을 이용하여) 7.4-8.0으로 조정되었다;

c) 최종 배치 규모가 WFI를 사용하여 구성되었다;

d) 배치가 0.22 미크론 PVDF 필터를 통해 여과된 후 충진, 마개 및 캡핑되었다.

e) 충진된 바이알이 2℃ - 8℃의 온도에 보관되었다.

안정성 결과: 2℃ - 8℃에서 3 개월 보관 후 분석에서 유의미한 하락이 관찰되었다.

실시예 3: L-히스티딘으로 제형화:

상기 제형이 실시예 1에서와 같은 방법으로 제조되었다.

안정성 결과:

25℃/ 60% RH(Relative Humidity, 상대 습도)에서 보관되었을 때 제조 후 1 개월에 흰색 침전이 외관 검사로 관찰되었다.

실시예 4: 재조합 단백질의 액체 제형

상기 제형이 실시예 1에서와 같은 방법으로 제조되었다.

안정성 결과: 25℃/ 60% RH 및 2℃ - 8℃에서 보관되었을 때 제조 후 3 개월에 안정성 결과가 보고되었다.

외관 검사 시 제조되었을 때와 같이 3 개월 종료 후 무색 투명한 용액으로 나타났다.

분석 결과는 유의미한 하락없이 허용 가능한 한도(90%-110%) 내에 있는 것으로 보고되었다. 생물학적 정량 결과는, PA-1 세포주의 경우 31.58% 내지 58.05%의 허용 가능한 범위 내에 있는 것으로 보고되었다.

실시예 5: 재조합 단백질의 액체 제형

상기 제형이 실시예 1에 언급된 바와 같은 방법으로 제조되었다.

안정성 결과:

외관 검사 시 25℃/ 60% RH 및 2℃ - 8℃에서 3 개월 후 무색 투명한 용액으로 나타났다.

분석 결과는 유의미한 하락없이 한도(90%-110%) 내에서 확인되었다. 생물학적 정량 결과는, PA-1 세포주의 경우 31.58% 내지 58.05%의 허용 가능한 범위 내에 있는 것으로 보고되었다.

실시예 6: 재조합 단백질의 액체 제형

상기 제형이 실시예 1에서와 같은 방법으로 제조되었다.

안정성 결과: 25℃/ 60% RH 및 2℃ - 8℃에서 6 개월 동안 안정성 결과가 보고되었다.

6 개월의 기간에 걸쳐 무색 투명한 용액이 육안 검사로 나타났다.

분석 결과는, 고분자량 불순물의 상당한 존재없이 1 개월, 2 개월, 3 개월 및 6 개월 동안 한도 내에 있는 것으로 확인되었다.

생물학적 정량 결과는, PA-1 세포주의 경우 31.58% 및 58.05%의 한도 내에 있었다.

실시예 7: 재조합 단백질의 동결 건조 제형

상기 제형은 하기 방법으로 제조되었다:

a) 폴리소르베이트 80의 스톡 용액(10%w/v)이 WFI로 제조되었다;

b) 서열 번호: 1의 단백질의 스톡 용액이 TBS(염분 함유 트리스 완충제)에서 제조되었고, 유리 비이커 내에 담겨졌다;

c) 필요한 양의 a) 단계의 폴리소르베이트-80 용액이 22℃ - 25℃의 온도에서 b) 단계의 용액에 첨가되었고, 잘 혼합하여 무색 투명해 보이는 용액을 얻었다;

d) 필요한 양의 40% WFI가 c) 단계의 용액에 첨가되었다;

e) 필요한 양의 L-아르기닌 HCl이 d) 단계의 용액에 첨가되었고, 균질한 용해를 위해 잘 혼합되었다;

f) 필요한 양의 당이 e) 단계의 용액에 첨가되었고, 균질한 용해를 위해 잘 혼합되었다;

g) 만니톨이 f) 단계의 용액에 첨가되고 혼합되어 무색 투명한 용액이 얻어졌다;

h) g) 단계 용액의 pH가 0.05N HCl을 이용하여 7.4-8.0으로 조정되었다;

i) WFI가 h) 단계의 용액에 첨가되어 배치 규모를 구성했다;

j) 배치가 바이알에 채워지고 동결 건조의 대상이 되었다;

k) 동결 건조된 바이알이 2℃ -8℃의 온도에서 보관되었다.

안정성 결과: 25℃/ 60% RH 및 2℃ - 8℃에서 12 개월 동안 안정성 결과가 보고되었다.

외관 검사 시 12 개월 후 바람직한 물리적 안정성을 나타내는 흰색 동결 건조된 케이크로 나타났다.

분석 결과는 상당한 변이없이 한도 내에 있는 것으로 확인되었다. 생물학적 정량 결과는, PA-1 세포주의 경우 31.58% 및 58.05%의 한도 내에 있었다.

실시예 8: 재조합 단백질의 동결 건조 제형

상기 제형은 하기 방법으로 제조되었다:

a) 폴리소르베이트 80의 스톡 용액(10%w/v)이 WFI로 제조되었다. 필요한 양의 폴리소르베이트 80을 상기 스톡 용액에서 취해 WFI에 첨가했다;

c) 필요한 양의 b) 단계의 서열 번호: 1의 단백질 용액이 22℃ - 25℃의 온도에서 필요한 양의 a) 단계의 용액에 첨가되었고, 잘 혼합하여 무색 투명해 보이는 용액이 수득되었다;

d) 필요한 양의 L-아르기닌 HCl이 c) 단계의 용액에 첨가되었고, 균질한 용해를 위해 잘 혼합되었다;

f) 필요한 양의 만니톨이 e) 단계의 용액에 첨가되고, 혼합되어 무색 투명한 용액이 얻어졌다;

g) 배치의 부피가 WFI를 사용하여 배치 규모의 80%까지 구성되었다;

i) WFI가 h) 단계의 용액에 첨가되어 배치 규모를 구성했다;

j) 배치가 바이알에 채워지고 동결 건조의 대상이 되었다;

k) 동결 건조된 바이알이 2℃ -8℃의 온도에서 보관되었다.

외관 검사 시 6 개월의 기간에 걸쳐 가시적인 입자가 없는 흰색 케이크로 나타났다. 분석 결과는, 고분자량 불순물의 상당한 존재없이 각각 1 개월, 2 개월, 3 개월 및 6 개월의 기간에 걸쳐 허용 가능한 한도 내에 있는 것으로 확인되었다. 생물학적 정량 결과는, PA-1 세포주의 경우 31.58% 및 58.05%의 한도 내에 있었다.

재구성 시간이 동결 건조된 생성물을 함유하는 바이알에 WFI를 첨가함으로써 분석되었다.

실시예 9: L-히스티딘으로 재조합 단백질의 제형화

Claims

안정적인 약학 조성물로서,
스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 안정적인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 부형제는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 안정화제를 포함하는, 안정적인 약학 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 안정화제는:
a) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;
b) 하나 이상의 계면 활성제;
c) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 또는
d) a) 내지 c) 중 2개 이상의 혼합물;
중 하나 이상을 포함하는, 안정적인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 약 0.001 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 양으로 재조합 렉틴 단백질을 포함하는, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 안정화제는 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 또는 이의 조합물 중에서 선택된 아미노산인 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 안정화제는 아미노산의 약학적으로 허용 가능한 염이고, 여기서 상기 염은 알칼리염 또는 알칼리 토금속염, 암모늄염, 유기 아민염, 염기성 아미노산염 또는 산성염 중에서 선택되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 산성 염은 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염, 무기산염, 구연산염, 옥살산염 및/또는 타르트르산염 중에서 선택되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 약 0.1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 농도를 갖는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 단백질 대 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 비율은 약 1 : 0.1 내지 약 1 : 10의 범위 내인 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 계면 활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, Triton™ X-100, Pluronic® F-68, Pluronic® F-88, Pluronic® F-127, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트 및 Brij 35 또는 이의 조합물 중에서 선택되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 계면 활성제의 농도는 약 0.001 mg/ml 내지 약 10 mg/ml인 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 단백질 대 계면 활성제의 비율은 약 1 : 0.0002 내지 약 1 : 10의 범위 내인 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
하나 이상의 탄수화물 또는 당은, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 글리세롤, 만니톨, 락토스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 글루코스, 라피노스, 말토스, 덱스트란, 이노시톨 또는 이의 조합물 중에서 선택되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 탄수화물 또는 당은 약 1.0 mg/ml 내지 약 150.0 mg/ml의 농도를 갖는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 단백질 대 탄수화물의 비율은 약 1 : 0.1 내지 약 1 : 150의 범위 내인 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 국소적으로, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 부형제는, 완충제, 중합체, 가용화제, 동결 방지제, 동결건조 방지제, 증량제, 희석제, 유화제 및 방부제 중에서 더 선택되는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 렉틴 단백질은, 서열 번호: 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖거나 서열 번호: 1, 2 또는 3에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 단백질인 것인, 안정적인 약학 조성물.
스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴을 포함하는 안정적인 약학 조성물의 제조 방법으로서,
상기 방법은 재조합 렉틴의 완충 용액과 하나 이상의 안정화제의 완충 용액을 조합하는 것을 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 안정적인 조성물의 생물학적 정량이 안정성 기간 중 5% 이상 변하지 않는 것인, 안정적인 약학 조성물.
제형 안정화 성분으로서:
a) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;
b) 하나 이상의 계면 활성제;
c) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 또는
d) a) 내지 c) 중 2개 이상의 혼합물;
중 하나 이상을 포함하는 것인, 제형 안정화 성분.
제 22 항에 있어서,
상기 제형은 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 치료적 유효량의 재조합 렉틴 단백질을 포함하는 안정적인 약학 조성물인 것인, 제형 안정화 성분.
안정적인 약학 조성물로서;
a) 스클레로티움 롤프시이 렉틴에서 유래된 약 0.0001% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 재조합 렉틴 단백질;
b) 약 0.01% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;
c) 약 0.0001% (w/v) 내지 약 1% (w/v)의 하나 이상의 계면 활성제; 또는
d) 약 0.1% (w/v) 내지 약 15% (w/v)의 하나 이상의 탄수화물 또는 당;
을 포함하는, 안정적인 약학 조성물.