JP2016520646A - Ｇｃ−マクロファージ活性化因子を含む組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｇｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む安定な医薬組成物に関する。本発明は、特に、マクロファージ活性化に関連する疾患を治療するためのＧｃＭＡＦおよび少なくとも１種類の薬学的に許容される界面活性剤ならびに／または表面活性を有する合成水溶性ポリマーを含む保存安定な医薬組成物、ならびにその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｇｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む安定な医薬組成物に関する。本発明は、特に、マクロファージ活性化に関連する疾患を治療するためのＧｃＭＡＦおよび少なくとも１種類の薬学的に許容される界面活性剤ならびに／または表面活性を有する合成水溶性ポリマーを含む保存安定な医薬組成物、ならびにその使用に関する。

マクロファージ活性化は、炎症の発達および免疫応答の調節に重要な役割を果たしている。炎症に関連するマクロファージ活性化は、ＢおよびＴリンパ球ならびに血清ビタミンＤ結合タンパク質（「グループ固有の成分」またはＧｃタンパク質としても知られている）の関与を必要としている。

Ｇｃタンパク質は、見かけの分子量が５２ｋＤａで、通常、ヒト血漿中のタンパク質の約０．５％を構成するヒト血漿のα−２マクログロブリン画分の多型糖タンパク質である。Ｇｃタンパク質は、２方向に枝分かれしたガラクトースおよびシアル酸末端を有するＮ−アセチルガラクトサミンで構成された三糖を保有する。このオリゴ糖を炎症に刺激されたＢリンパ球の誘導性膜性β−ガラクトシダーゼで加水分解すると、マクロファージ活性促進因子が得られる。次に、マクロファージ活性促進因子をＴリンパ球の膜状のＮｅｕ−１シアリダーゼで加水分解すると、マクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）が得られる。固定化されたβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼでの精製Ｇｃタンパク質の段階的な処理も、ＧｃＭＡＦを生成することが示された。

ＧｃＭＡＦは、殺腫瘍性の役割を有することが示されている。癌患者における血清Ｇｃタンパク質が癌細胞から分泌された血清α−Ｎ−アセチルガラクトシダーゼ（ナガラーゼ（Ｎａｇａｌａｓｅ））によって脱グリコシル化されるため、癌患者におけるＧｃＭＡＦ活性は消失または低下することが実証された。その結果、脱グリコシル化Ｇｃタンパク質はＧｃＭＡＦに変換されず、マクロファージの活性化が低下または消滅した。黒色腫、前立腺癌、結腸直腸癌、または転移性乳癌を有する癌患者に外因性ＧｃＭＡＦを投与すると、活性マクロファージの不足を克服することによってＧｃＭＡＦの治療効果が示された（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２２；４６１−４６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，１：６５−７２）。マクロファージ活性化に対する同様の効果が、ＧｃＭＡＦで治療されたＨＩＶ感染患者および大理石骨病患者で観察された。

米国特許第５，１７７，００２号は、マクロファージ活性化因子を生成するプロセスであって、ヒトのグリコシル化グループ固有の成分を、β−ガラクトシダーゼ、またはシアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはそれらの混合物と組み合わせたβ−ガラクトシダーゼとインビトロで接触させることと、マクロファージ活性化因子を取得することと、を含むプロセスを開示している。米国特許第５，１７７，００２号は、マクロファージ活性化をそれを必要としている個体において誘導するための方法であって、このように生成されたヒトマクロファージ活性化因子を個体に投与することを含む方法をさらに開示している。

ＷＯ ９３／０７２８８は、有力なマクロファージ活性化因子の生成プロセスであって、動物のビタミンＤ結合タンパク質をインビトロで（ｉ）β−ガラクトシダーゼ、または（ｉｉ）シアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはそれらの混合物と組み合わせたβ−ガラクトシダーゼと接触させるプロセスを開示している。ＷＯ ９３／０７２８８は、マクロファージを活性化するための方法であって、このように調製したマクロファージ活性化因子を動物に投与することを含む方法をさらに開示している。

ＷＯ ９６／４０９０３は、バキュロウイルスベクターを介したビタミンＤ結合タンパク質（Ｇｃタンパク質）およびその小ドメイン（ドメインＩＩＩとも呼ばれる）のクローニングについて開示している。固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼでクローン化Ｇｃタンパク質およびクローン化ドメインＩＩＩを処理すると、それぞれ、マクロファージ活性化因子のＧｃＭＡＦｃおよびＣｄＭＡＦをもたらした。ＷＯ９６／４０９０３は、癌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症および骨粗鬆症の治療のためのマクロファージ活性化因子の使用について開示している。

ＷＯ ２０１２／１３７１９９は、癌またはＨＩＶ感染患者を治療するための、グリコシダーゼ酵素を実質的に欠くマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）含有医薬組成物およびその使用法について開示している。

Ｐｉｈｌら（Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２０１０，１０７：８５３−８６０）は、精製された血漿由来ヒトＧｃタンパク質に対して行われた前臨床毒性試験について開示しており、５％マルトースの存在下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中約１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＧｃタンパク質が、アクチン結合能力を完全に保持し、Ｇｃタンパク質の量に有意な変化なく４年間安定であると判明したことを示している。

Ｐａｃｉｎｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１１，６０：４７９−４８５）は、ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいてＰＧＥ_１に刺激された血管形成を阻害するそれらの効力について異なるＧｃＭＡＦ調製物を評価し、１５日間、２５℃での保存により、ＧｃＭＡＦの効力が約５０％減少したことを示した。

ＧｃＭＡＦの化学的安定性および生物学的活性を維持するＧｃＭＡＦの保存安定な医薬組成物に対する必要性が、未だ満たされていない。

本発明は、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）および少なくとも１種類の薬学的に許容される界面活性剤ならびに／または表面活性を有する合成水溶性ポリマーを含み、保存時の安定性が改善された医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、マクロファージ活性化と関連する疾患または障害を治療する方法であって、前記安定な医薬組成物をそのような治療を必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。

本発明は、ＧｃＭＡＦ水溶液を低濃度で、４℃で保存するかまたは凍結融解した場合に、ＧｃＭＡＦの化学的安定性および生物学的活性が著しく失われるという知見に部分的に基づく。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルギニン、および糖アルコールのマンニトールなどのポリペプチドの従来の薬学的に許容される安定剤は、単独で添加しても、組み合わせて添加しても、ＧｃＭＡＦの水溶液（３０μｇ／ｍｌ未満）におけるＧｃＭＡＦの安定化に本質的に無効であることをこれから開示する。

本発明の発明者らは、低濃度のＧｃＭＡＦを有する水溶液に薬学的に許容される界面活性剤を添加すると、保存時の化学的安定性および生物学的活性の喪失の問題が克服されることを予想外にも発見した。例えば、１μｇ／ｍｌのＧｃＭＡＦの水溶液に非イオン性界面活性剤を添加すると、４℃、２５℃、さらには３７℃での最大３ヶ月間の保存中にＧｃＭＡＦの化学的安定性が維持された。本発明の発明者らはさらに、非イオン性界面活性剤が、低濃度、例えば、１μｇ／ｍｌのＧｃＭＡＦ溶液の１回または複数回の凍結融解サイクル後に、溶液中のＧｃＭＡＦの維持を可能にすることを明らかにした。

さらに、マクロファージの活性化によって測定した場合に、非イオン性界面活性剤が、低濃度のＧｃＭＡＦ溶液の長期保存中にＧｃＭＡＦの化学的安定性を維持するだけでなく、かかる保存中にＧｃＭＡＦの生物学的活性を保持することを開示する。

本発明の発明者らは、さらに、イオン性界面活性剤および表面活性を有する水溶性ポリマーが、長期保存中にＧｃＭＡＦを安定化するのに有効であることを明らかにした。しかし、ヒアルロン酸またはアルギン酸塩などの多糖類は、ＧｃＭＡＦに対して著しい安定化効果を発揮しなかった。したがって、本発明の組成物は、低濃度（約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ）のＧｃＭＡＦの液体製剤として製剤化された場合に、４℃での長期保存後、すなわち、少なくとも６ヶ月後にもＧｃＭＡＦの化学的安定性および生物学的活性を維持するので非常に有利である。また、本発明の組成物は、ＧｃＭＡＦの取り扱いおよび送達を単純化し、融解時にＧｃＭＡＦの化学的安定性に本質的にほとんどまたは全く影響なく本組成物を凍結でき、したがって、さらに融解直後に本組成物を使用する必要性を回避できる。

第一の態様によれば、本発明は、安定なもしくは安定化されたＧｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）またはその生物学的に活性のある変異体もしくは断片と、界面活性剤および水溶性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦは、独立してアミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有するヒトＧｃＭＡＦおよび動物のＧｃＭＡＦからなる群から選択される。一実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦは、アミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有するヒトＧｃＭＡＦである。追加の実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦは、配列番号１〜３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦ断片は、Ｇｃタンパク質のアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦ断片は、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる。

追加の実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦは、組成物が液体形態である場合には、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在するか、あるいはＧｃＭＡＦは、組成物が液体形態である場合には、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、さらにあるいは約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、さらにあるいは約２００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、組成物が液体形態である場合には、約２００ｎｇ／ｍｌ〜〜約１μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する。

さらなる実施形態によれば、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤からなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレン高級アルコールエーテル類、およびポリオキシアルキレン高級アルコールエステル類からなる群から選択される。非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、オクチルグルコシド、およびアルキルマルトシドが挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、トリトンＸ−１００、ブリジ５８、ポロキサマー１８８、チロキサポール、ステアリン酸ＰＥＧ−４０、ＮＰ−４０、プルロニック（商標）Ｆ−６８、およびポロキサマー４０７０からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。特定の実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）である。

さらなる実施形態によれば、水溶性ポリマーは、表面活性を有する合成水溶性ポリマーである。さらなる実施形態によれば、表面活性を有する合成水溶性ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドブロックコポリマー、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、プロピレングリコールホモポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールからなる群から選択される。例示的な実施形態によれば、表面活性を有する水溶性ポリマーはポリビニルアルコールである。

さらなる実施形態によれば、本医薬組成物は、さらに等張化剤を含むことができる。特定の実施形態によれば、等張化剤は塩化ナトリウムである。

さらなる実施形態によれば、本医薬組成物は、さらに緩衝剤を含むことができる。緩衝剤の例としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、およびクエン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに別の実施形態によれば、本医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。特定の実施形態によれば、担体は水である。

さらに別の実施形態によれば、本医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、錠剤、およびカプセル剤からなる群から選択される形態で製剤化される。特定の実施形態によれば、本組成物は、水溶液の形態で製剤化される。例示的な実施形態によれば、本医薬組成物は、ＧｃＭＡＦ、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、リン酸緩衝液、および水を含み、組成物のｐＨが約５〜約８の範囲であり、組成物中のＧｃＭＡＦの濃度は約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、さらにあるいは約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、さらにあるいは約２００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

別の態様によれば、本発明は、マクロファージの活性化に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、そのような治療を必要としている対象に本発明の原理に従って治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態によれば、対象はヒトまたは動物である。特定の実施形態によれば、動物は、イヌなどのペット動物である。

さらなる実施形態によれば、マクロファージの活性化に関連する疾患または障害は、癌、ウイルス性疾患、細菌感染症、自己免疫疾患、自閉症、および慢性疲労症候群からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

さらなる実施形態によれば、安定なＧｃＭＡＦは、独立してアミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有するヒトＧｃＭＡＦまたは動物のＧｃＭＡＦである。特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、アミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有するヒトＧｃＭＡＦである。さらなる実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、配列番号１〜３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

さらなる実施形態によれば、本医薬組成物は、非経口によって、または経口投与経路によって投与される。特定の実施形態によれば、本医薬組成物は、静脈内、筋肉内または皮下投与経路によって投与される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

別の態様によれば、本発明は、マクロファージの活性化に関連する疾患または障害の治療に使用するための本発明の原理に従った医薬組成物を提供する。

本発明のこれらのおよび他の実施形態は、以下の明細書、実施例および特許請求の範囲に関連してより良く理解されるであろう。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０またはその両方の存在下または非存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。図１Ａは、ＰＢＳ単独でまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＨＳＡもしくはその両方を含むＰＢＳで希釈し、その後、免疫ブロッティングのために４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上にロードしたＧｃＭＡＦ試料のウエスタンブロット分析を示す。 図１Ｂは、ＰＢＳ単独でまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＨＳＡもしくはその両方を含むＰＢＳで希釈し、４℃で１週間インキュベートし、その後、免疫ブロッティングのために４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上にロードしたＧｃＭＡＦ試料のウエスタンブロット分析を示す。ＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質を対照として使用した。 アルギニン、ＨＳＡ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、もしくはマンニトールの非存在下または存在下でのＰＢＳで希釈するか、またはクエン酸緩衝液で希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図２Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図２Ｂ）、２５℃で２週間（図２Ｃ）、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）、もしくは３７℃で３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料をＰＢＳ（図２Ａ〜２Ｅ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図２Ｅ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 アルギニン、ＨＳＡ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、もしくはマンニトールの非存在下または存在下でのＰＢＳで希釈するか、またはクエン酸緩衝液で希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図２Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図２Ｂ）、２５℃で２週間（図２Ｃ）、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）、もしくは３７℃で３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料をＰＢＳ（図２Ａ〜２Ｅ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図２Ｅ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 アルギニン、ＨＳＡ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、もしくはマンニトールの非存在下または存在下でのＰＢＳで希釈するか、またはクエン酸緩衝液で希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図２Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図２Ｂ）、２５℃で２週間（図２Ｃ）、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）、もしくは３７℃で３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料をＰＢＳ（図２Ａ〜２Ｅ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図２Ｅ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 アルギニン、ＨＳＡ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、もしくはマンニトールの非存在下または存在下でのＰＢＳで希釈するか、またはクエン酸緩衝液で希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図２Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図２Ｂ）、２５℃で２週間（図２Ｃ）、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）、もしくは３７℃で３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料をＰＢＳ（図２Ａ〜２Ｅ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図２Ｅ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 アルギニン、ＨＳＡ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、もしくはマンニトールの非存在下または存在下でのＰＢＳで希釈するか、またはクエン酸緩衝液で希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図２Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図２Ｂ）、２５℃で２週間（図２Ｃ）、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）、もしくは３７℃で３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料をＰＢＳ（図２Ａ〜２Ｅ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図２Ｅ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 異なる濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図３Ａ）、または免疫ブロッティング前に３７℃で１週間インキュベートした（図３Ｂ）。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を、ＰＢＳ（図３Ａ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図３Ａおよび３Ｂ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 異なる濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図３Ａ）、または免疫ブロッティング前に３７℃で１週間インキュベートした（図３Ｂ）。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を、ＰＢＳ（図３Ａ）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳ（図３Ａおよび３Ｂ）で希釈し、すぐに免疫ブロッティングを行った。 非イオン性界面活性剤のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を、免疫ブロッティング前に４℃で一晩（図４Ａ）、３７℃で１週間（図４Ｂ）、または３７℃で１ヶ月間（図４Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 非イオン性界面活性剤のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を、免疫ブロッティング前に４℃で一晩（図４Ａ）、３７℃で１週間（図４Ｂ）、または３７℃で１ヶ月間（図４Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 非イオン性界面活性剤のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を、免疫ブロッティング前に４℃で一晩（図４Ａ）、３７℃で１週間（図４Ｂ）、または３７℃で１ヶ月間（図４Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ブリジ（登録商標）５８、トリトンＸ−１００、ＰＥＧ４０００、もしくはトレハロースの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図５Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図５Ｂ）、もしくは３７℃で１ヶ月間（図５Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ブリジ（登録商標）５８、トリトンＸ−１００、ＰＥＧ４０００、もしくはトレハロースの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図５Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図５Ｂ）、もしくは３７℃で１ヶ月間（図５Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ブリジ（登録商標）５８、トリトンＸ−１００、ＰＥＧ４０００、もしくはトレハロースの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図５Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図５Ｂ）、もしくは３７℃で１ヶ月間（図５Ｃ）インキュベートした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 非イオン性界面活性剤のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図６Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１ヶ月間インキュベートした（図６Ｂ）。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 非イオン性界面活性剤のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図６Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１ヶ月間インキュベートした（図６Ｂ）。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 凍結融解後のＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦに凍結／融解を１サイクル行い、次いで免疫ブロッティングの前に様々な期間、４℃または室温（ＲＴ）でインキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を、ＰＢＳまたは０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行った。 ３サイクルの凍結融解後のＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦ試料に凍結融解を３サイクル行い、その後に免疫ブロッティングを行った。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、カゼイン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図９Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図９Ｂ）もしくは３７℃で２週間（図９Ｃ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行った。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、カゼイン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図９Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図９Ｂ）もしくは３７℃で２週間（図９Ｃ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行った。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、カゼイン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図９Ａ）、または免疫ブロッティングの前に３７℃で１週間（図９Ｂ）もしくは３７℃で２週間（図９Ｃ）インキュベートした。対照として、Ｇｃタンパク質の試料を０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行った。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図１０Ａ）または３７℃で１週間インキュベートした（図１０Ｂ）。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポロキサマー１８８、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の非存在下または存在下で、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦのウエスタンブロットを示す。試料を希釈直後にロードするか（図１０Ａ）または３７℃で１週間インキュベートした（図１０Ｂ）。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈し、その直後に免疫ブロッティングを行ったＧｃタンパク質の試料を対照として使用した。

本発明は、Ｇｃ由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）と、薬学的に許容される界面活性剤および表面活性を有する薬学的に許容される合成水溶性ポリマーからなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤と、を含む安定な医薬組成物を提供する。本発明は、ＧｃＭＡＦ水溶液を低濃度で、４℃で保存した場合に、ＧｃＭＡＦの化学的安定性および生物学的活性が著しく失われるという知見に部分的に基づく。作用の任意の機構に縛られることなく、界面活性剤の安定効果は、タンパク質−界面活性剤の直接相互作用および疎水性ドメインの結合に起因し得るＧｃＭＡＦの凝集および／もしくは分解および／もしくは容器表面への吸着の防止または減少の結果であり得る。

Ｇｃタンパク質およびＧｃＭＡＦ
ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）とも命名されたＧｃタンパク質は、見かけの分子量が５２ｋＤａで、特定のオリゴ糖が結合している血漿タンパク質である。Ｇｃタンパク質は、当業者に公知の任意の方法により血清または血漿から精製できる。高純度のＧｃタンパク質は、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３−セファロースアフィニティークロマトグラフィーにより血清または血漿から単離できる。Ｇｃタンパク質はまた、アクチンに対するＧｃタンパク質の結合特異性を利用するアクチン−アガロースアフィニティークロマトグラフィーによっても精製できる。

あるいは、Ｇｃタンパク質は、Ｇｃタンパク質またはＧｃタンパク質小ドメイン（ドメインＩＩＩ）をコードする単離されたｃＤＮＡから取得できる。Ｇｃタンパク質およびＧｃドメインＩＩＩのクローニングならびに発現は、本明細書に完全に記載されるように参照により組み込まれる米国特許第６，４１０，２６９号に記載された。そこに記載された方法では、ヒトＧｃタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを単離するためにはバクテリオファージλｇｔ１１（クロンテック社、カリフォルニア州パロアルト）中のヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを使用し、タンパク質発現には昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を使用している。しかし、Ｇｃタンパク質またはその活性断片をコードするｃＤＮＡを発現させるには、哺乳動物細胞系が好ましい。好ましくは、発現は、Ｇｃタンパク質またはその活性ドメインが正しくグリコシル化されるように真核細胞中で行われる。当技術分野で公知の任意のこのような細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞および出芽酵母が使用されてもよい。したがって、任意の真核生物発現ベクターが使用でき、それらにはｐＣＩ−ＮＥＯ、ｐＷＥ３、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＣＭ１８２が含まれるが、これらに限定されない。選択された細胞系へのベクターの挿入は、増幅の有無に関わらず、例えば、エレクトロポレーションによって、ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎなどの脂質トランスフェクションにより、または当業者に公知の任意の化学的方法によって行うことができる。トランスフェクションは一過性のまたは安定な発現をもたらすことができ、両方の形態は所望のＧｃタンパク質またはその断片を得るのに適切である。活性ＭＡＦの前駆体である発現タンパク質は、その後、細胞から抽出するか、または当技術分野で公知の任意の方法によって増殖培地から収集することができる。

Ｇｃタンパク質は、ゲル電気泳動分析によって実証できるような２つの主要な表現型：Ｇｃ１およびＧｃ２に現れる多型タンパク質である。Ｇｃ１およびＧｃ２遺伝子の配列をコードする全ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列が報告されている（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２４２０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ７９９４）。Ｇｃ１は、１つのアミノ酸残基の変化により２つのバンド（「速い」および「遅い」）として電気泳動で移動するＧｃ１ｆおよびＧｃ１ｓサブタイプにさらに分けられる。

Ｇｃ１タンパク質は、ヒトＧｃタンパク質の主要なサブタイプである。Ｇｃ１タンパク質は、ガラクトースおよびシアル酸（Ｇｃ１ｆ中）またはガラクトースおよびマンノースもしくはシアル酸（Ｇｃ１ｓ中）の末端を有するコアタンパク質に結合したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）で構成された分岐状三糖を保有している。Ｇｃ２は、末端ガラクトース部分に連結されたコアＧａｌＮＡｃを有する単純なグリコシル化パターンを有する。Ｇｃ１ｆオリゴ糖は、炎症刺激されたＢ細胞の膜状のβ−ガラクトシダーゼによって加水分解されて、マクロファージ活性促進因子をもたらし、次に、Ｔ細胞のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼとしても知られている）によって加水分解されて、マクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）をもたらす。動物、例えば、マウスまたはイヌのＤＢＰは、末端ガラクトースを有するＮ−アセチルガラクトサミンで構成された二糖を保有する。Ｂ細胞単独のβ−ガラクトシダーゼによるこの二糖類の加水分解は、有力なＭＡＦ（ＧｃＭＡＦとも命名されている）を生成する。

本明細書で使用する用語「Ｇｃタンパク質」または「ビタミンＤ結合タンパク質」は、ヒトまたは動物のＧｃタンパク質を指し、グリコシル化形態、例えば、Ｇｃ１、Ｇｃ２、Ｇｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓおよびＧｃ１ｓ^＊を含む全ての遺伝子型および多型体、ならびに生物学的に活性のある変異体およびその断片を指す。本明細書で使用する用語「生物学的に活性のある」変異体または断片は、脱グリコシル化の際にＧｃＭＡＦ変異体または断片を生成するＧｃタンパク質の任意の変異体または断片を指し、このように生成されたＧｃＭＡＦ変異体または断片は、マクロファージを活性化でき、アミノ酸残基、典型的にはスレオニンに連結されたＮ−アセチルガラクトサミン基を有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｇｃタンパク質は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列（それぞれ、Ｇｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓおよびＧｃ２）を含むか、またはそれらからなる。これらのアミノ酸配列中のＮ−アセチルガラクトサミン基は、成熟Ｇｃタンパク質の４１８位または４２０位のスレオニンに連結されている。

本明細書で使用する用語「断片」は、Ｇｃタンパク質の全長アミノ酸配列よりも、例えば、配列番号１〜３のＧｃタンパク質の４５８個のアミノ酸よりも少ないアミノ酸を有するＧｃタンパク質の全長アミノ酸配列の任意の部分を指し、その一部は、なおもアミノ酸残基、典型的にはスレオニンに連結されたＮ−アセチルガラクトサミン基を含み、なおもマクロファージ活性化の活性を保持している。典型的には、全長タンパク質の一部は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。「ペプチド」とは、５０個以下のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味する。「ポリペプチド」とは、一般に５０個を上回るアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を意味する。「タンパク質」とは、１つまたは複数の共有結合ポリペプチド鎖を意味する。用語ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書を通して互換的に使用される。

Ｇｃタンパク質断片は、成熟Ｇｃタンパク質の多型のそれぞれのアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含んでよい。あるいは、Ｇｃ断片は、成熟タンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応するＧｃタンパク質ドメインＩＩＩであり得る。

成熟Ｇｃタンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応するＧｃ断片ドメインＩＩＩは、配列番号４または配列番号５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる。これらのアミノ酸配列におけるＮ−アセチルガラクトサミンは、４４位または４６位のスレオニンと結合している。

ＧＣタンパク質の生物学的に活性のある変異体または断片は、対象に投与された場合に、変異体または断片ポリペプチドが天然ポリペプチドと同じ治療効果を有するような天然ポリペプチドの所望の生物学的活性を保持していなければならない。すなわち、変異体または断片ポリペプチドは、天然ポリペプチドについて観察されたものと同様の方法で、医薬組成物中の治療活性成分として機能する。用語「変異体」は、天然Ｇｃタンパク質または天然Ｇｃタンパク質の断片のいずれかの変異体を指し、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有する天然のポリペプチド配列の断片または全長を含む。

Ｇｃタンパク質の生物学的に活性のある変異体は、一般に、Ｇｃタンパク質の全長アミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および最も好ましくは約９９％の配列同一性を有し、比較のためのベースとして役立つ。あるいは、生物学的に活性のある変異体は、Ｇｃタンパク質のドメインＩＩＩと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および最も好ましくは約９９％の配列同一性を有し、比較のためのベースとして役立つ。用語「配列同一性」は、変異体のアミノ酸配列の特定の連続したセグメントを参照分子のアミノ酸配列と整列させ、比較した場合に基準となる変異体ポリペプチドおよびポリペプチド分子内に見られる同一のアミノ酸残基を指す。２つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、同一のアミノ酸残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を取得し、マッチした位置の数をセグメント内の位置の総数で割って、参照分子と比較し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを取得することによって計算される。

アミノ酸配列同一性のパーセンテージを考慮する場合、いくつかのアミノ酸残基は、タンパク質機能の特性に影響を与えない保存的アミノ酸置換の結果として異なっていてもよい。これらの場合において、パーセント配列同一性は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性のために上方に調整することができる。したがって、配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような置換は、保存的置換として知られている。

本明細書の上記および本明細書に完全に記載されたかのように参照により組み込まれる米国特許第５，１７７，００２号に開示されているように、特定のグリコシダーゼ酵素を用いたいくつかのオリゴ糖の段階的な除去により、Ｇｃタンパク質は非常に強力なマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）に変換される。ＧｃＭＡＦは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１３７１９９に開示されているように、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、および／または疎水性クロマトグラフィー、例えば、フェニルセファロースクロマトグラフィーによってさらに精製できる。

ＧｃＭＡＦ組成物
液体製剤における低濃度でのポリペプチドの安定性は、例えば、製剤のｐＨおよび／またはイオン強度、保存温度、凍結−融解の反復サイクル、容器への吸着、および処理の間などの機械的せん断力への曝露などの要因により影響を受ける可能性がある。凝集体形成および生物学的活性の喪失はまた、物理的な撹拌ならびに溶液中および保存バイアル内の液体−空気界面でのポリペプチド分子の相互作用の結果として生じ得る。撹拌の結果として、タンパク質は凝集し、粒子を形成し、最終的には他の吸着タンパク質と沈殿し得る。

本発明の医薬組成物は、賦形剤として薬学的に許容される界面活性剤を含むことができる。用語「界面活性剤」（表面活性剤としても知られる）は、２種類の液体間、または液体と固体の間、または気体と液体の間の表面張力（または界面張力）を低下させる任意の薬剤を含む。界面活性剤は、洗浄剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および／または分散剤として作用し得る。界面活性剤は、エマルジョンの形態で組成物中の油と水を結合している乳化剤であり得る。本発明で用いられる界面活性剤には、ヒト用または動物用の医薬に有用である任意の非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、および両性の薬学的に許容される界面活性剤が含まれる。

非イオン性界面活性剤には、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレン高級アルコールエーテル類、およびポリオキシアルキレン高級アルコールエステル類が含まれるが、これらに限定されない。したがって、非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）およびポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）などのポリオキシエチレンソルビトールエステル類、チロキサポール；トリトンＸ−１００などのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、ＮＰ−４０などのポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類、ブリジ５８などのポリオキシエチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコシド、およびｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドなどのアルキルマルトシド；ポロキサマー４０７０；ポロキサマー１８８；ならびにステアリン酸ポリオキシル４０が含まれる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）およびポロキサマー界面活性剤は、ヒトに使用するためにＦＤＡに認可されているので好ましい。

非イオン性界面活性剤には、脂肪族アルコールエトキシレート（アルキルポリエチレングリコール類）、アルキルフェノールポリエチレングリコール類、アルキルメルカプタンポリエチレングリコール類、脂肪アミンエトキシレート類（アルキルアミノポリエチレングリコール類）、脂肪酸エトキシレート類（アシルポリエチレングリコール類）、ポリプロピレングリコールエトキシレート類（プルロニック（商標）、例えば、プルロニックＦ−６８）、脂肪酸アルキロールアミド類、（脂肪酸アミドポリエチレングリコール類）、Ｎ−アルキルポリヒドロキシ脂肪酸アミド、Ｎ−アルコキシポリヒドロキシ脂肪酸アミド、スクロースエステル類、ソルビトールエステル類およびポリグリコールエーテル類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル類、グリセロールモノオクタノエート、グリセロールジオクタノエートおよびグリセロールトリオクタノエートも含まれ得るが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

陰イオン界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸ジオクチルナトリウムを含む、アルキル硫酸塩、オレフィン硫酸塩、エーテル硫酸塩、モノグリセリドスルフェート、スルホン酸アルキル、スルホン酸アリール、オレフィンスルホネート、アルキルスルホスクシネート、アリールスルホスクシネートが含まれるが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

陽イオン界面活性剤には、ステアリルアミン、トリエタノールアミンオレエート、塩化ベンゼトニウムを含む、ベンザルコニウム塩類、ポリオキシアルキレンアルキルアミン類、アルキルアミン類、アルカノールアミン脂肪酸エステル類、第四級アンモニウム脂肪酸エステル類、ジアルキルアンモニウム塩類、アルキルピリジニウム塩類が含まれるが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

両性界面活性剤には、例えば、（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキシド−１−カルボキシエチルオキシ−２−ナトリウム塩などの）イミダゾリン系両性界面活性剤、（アルキルベタイン、アミドベタイン、およびスルホベタインなどの）ベタイン系界面活性剤、およびアシルメチルタウリンが含まれる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

界面活性剤は、組成物の総重量の約０．００１重量％〜約１０重量％の量で、あるいは組成物の総重量の約０．００１重量％〜約０．５重量％の量で、または約０．００１重量％〜約０．２重量％の量で、または約０．００１重量％〜約０．０５重量％の量で本発明の医薬組成物中に存在する。

本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される用語「約」は、示された値±１０％を意味する。

本発明の組成物は、水溶性ポリマーを含むことができる。水溶性ポリマーは、表面活性を有する合成ポリマーであり得る。用語「表面活性」は、２種類の液体間、もしくは液体と固体の間、もしくは気体と液体の間の表面張力（または界面張力）を低下または排除するための薬剤の活性を指す。表面活性を有する水溶性ポリマーには、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールが含まれるが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。特定の実施形態によれば、表面活性を有する水溶性ポリマーは、ポリビニルアルコールまたはポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマーである。

水溶性ポリマーは、半合成ポリマーでもあり得る。半合成水溶性ポリマーの例としては、水溶性セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。

水溶性ポリマーは、本組成物の総重量の約０．００１重量％から約５重量％の範囲、あるいは本組成物の総重量の約０．００１重量％〜約０．５重量％の範囲、さらにあるいは約０．０１重量％〜約０．２重量％の範囲の量で本組成物中に存在する。

本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含むことができる。用語「担体」は、治療化合物と共に投与される希釈剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、およびゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油類などの無菌の液体類、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として使用することもできる。

本医薬組成物は、さらに塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むが、これらに限定されない浸透圧の調整のための薬剤を含み得る。塩化ナトリウムは、特に約２５ｍＭ〜約３００ｍＭの量で、注射用製剤に適する本発明の医薬組成物の浸透圧を維持するために用いられる。

本医薬組成物は、さらに緩衝剤を含むことができる。「緩衝剤」とは、再構成されたときに、溶液製剤または凍結乾燥製剤のｐＨ値を調整するために組成物に添加される薬剤（複数可）を意味する。液体組成物のｐＨは、主に、ポリペプチド凝集体形成に対するその効果を介して、その中に含まれるポリペプチドの安定性に影響することを理解されたい。したがって、本発明の組成物中に存在する緩衝剤の量は、ＧｃＭＡＦの安定性のための至適ｐＨに依存する。この至適ｐＨの決定は、当技術分野において一般的に利用可能な方法を用いて達成することができる。

本発明の組成物に含めることができる代表的な緩衝剤は、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液およびクエン酸緩衝液である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。ＧｃＭＡＦの安定性が維持されるように、緩衝剤は、溶液のｐＨ値を調整する。本組成物のｐＨ値は、約５〜約８の範囲であることが好ましい。本組成物中の緩衝剤の最終濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。

本医薬組成物は、さらに安定剤を含むことができる。本明細書で使用する用語「安定剤」は、ＧｃＭＡＦの化学構造および／もしくは生物学的活性または本発明のその任意の変異体もしくは断片を維持する賦形剤を指す。

本発明の実施に有用な安定剤には、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはグリシンなどのアミノ酸類、またはカゼインもしくはアルブミンなどのタンパク質類が含まれる。あるいは、安定剤は、糖または糖アルコールであってよい。例えば、トレハロース、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンならびにセルロース誘導体、例えば、ヒドロキシエチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンなどの任意の糖が使用できる。糖アルコールは、−ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールを含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。上記の糖類または糖アルコール類は、個々にまたは組み合わせて使用してもよい。好ましくは、糖または糖アルコールの濃度は、約１ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％、より好ましくは約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％である。安定剤はまた、グリセリンまたはプロピレングリコールなどの多価アルコールであってもよい。

追加の安定剤は、メチオニン、ＥＤＴＡまたは二ナトリウム塩などのその塩の１種であり得、それぞれ、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護することが知られている。

本発明の医薬組成物は、液体として製剤化することができる。液体組成物はそのままで保存できるか、または凍結状態で保存するか、または対象への投与に適する液体形態または他の形態に後で再構成するための乾燥形態で保存することができる。用語「乾燥形態」は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）（すなわち、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））、噴霧乾燥、または空気乾燥のいずれかによって乾燥される液体組成物を指す。例えば、ＧｃＭＡＦは、注射用蒸留水、緩衝液、生理食塩水などの適切な水性溶媒に溶解でき、そこに界面活性剤および／または水溶性ポリマー、ならびに必要に応じて緩衝剤、塩、および安定化剤を加えることができ、このようにして得られた溶液をフィルターに通して濾過することにより滅菌できる。その後、この溶液を４℃、もしくは−２０℃で保存するか、または凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を得ることができる。

本発明の医薬組成物は、「安定な」または「安定化された」組成物である。用語「安定な」または「安定化された」組成物は、本明細書に開示されるような界面活性剤および／または水溶性ポリマーの非存在下で調製された組成物と比較して、保存安定性が増加した組成物を指す。この保存安定性の増加は、典型的には、後の使用のためにその形態で直接保存された液体製剤で観察されるが、安定性の増加はまた、凍結状態で保存されて使用前に融解される液体製剤で得られるか、または使用前に液体形態または他の形態へ後で再構成するために凍結乾燥形態、空気乾燥形態、もしくは噴霧乾燥形態などの乾燥形態で調製された製剤で得られる。好ましくは、本発明の組成物は、本組成物が静菌剤と互換性がある場合には、液体形態で保存安定性が増加した利便性、再構成なしの投与の容易さ、および予め充填されているためにすぐに使用できる注射器もしくは容器に製剤を供給する能力、または複数回投与用の製剤として最大限に活用するために液体形態で保存される。本発明の組成物は、好ましくは２〜８℃で少なくとも１ヶ月間、あるいは、２〜８℃で少なくとも２ヶ月、３ヶ月、４、５、または少なくとも６ヶ月間安定である。あるいは、本発明の組成物は、３７℃で少なくとも１週間、または３７℃で少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月間安定である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。本発明の組成物の安定性は、保存前、すなわちＧｃＭＡＦの生成直後、および保存後に、界面活性剤および／または水溶性ポリマーを含む液体組成物中のＧｃＭＡＦのタンパク質含有量を測定することによって決定できる。したがって、安定な組成物は、保存前、すなわちＧｃＭＡＦの生成直後のＧｃＭＡＦの量と比較して、２〜８℃での１ヶ月間保存した後のＧｃＭＡＦタンパク質量の少なくとも５０％、あるいは保存前のＧｃＭＡＦ量と比較して２〜８℃で１ヶ月間保存した後のＧｃＭＡＦタンパク質量の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９７％を有する液体組成物を意味する。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。本発明の組成物中のＧｃＭＡＦは、「安定」であるか、または「安定化」されている。用語「安定な」または「安定化」されたＧｃＭＡＦは、界面活性剤および／または水溶性ポリマーを欠く組成物と比較して、本明細書で詳述した界面活性剤および／または水溶性ポリマーを含む組成物において保存安定性、例えば、化学的安定性が増加したＧｃＭＡＦを指す。

本医薬組成物は、必要に応じて、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を少量含むこともできる。

注射または注入などの選択された経路を介して対象に投与するために、本医薬組成物は、安全で無菌でなければならず、ＧｃＭＡＦの所望の治療活性を保持しなければならない。

本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、またはエマルジョン、すなわち、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョンなどの液体として製剤化できる。本医薬組成物は、非経口投与経路または経口投与経路を含む任意の方法によって投与前に液体、懸濁液、またはエマルジョンに再構成できる凍結乾燥粉末などの乾燥形態で調製できる。安定化された医薬組成物は、好ましくは膜濾過により滅菌され、密封されたバイアルもしくはアンプルなどの単位用量または複数回用量の容器に保存される。製剤のそれぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

本医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、および徐放製剤などの形態をとることもできる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。本医薬組成物は、トリグリセリド、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの従来の結合剤および担体と共に坐剤として製剤化できる。

経口投与のための製剤、例えば、錠剤およびカプセル剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「レミントンの薬学」に記載されている。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、好ましくは実質的に精製された形態で治療有効量のＧｃＭＡＦを含む。

ＧｃＭＡＦの使用
本発明は、マクロファージ活性化に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、本発明の原理に従って、治療有効量の安定な医薬組成物をそのような治療を必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。

一実施形態によれば、対象はヒトである。さらなる実施形態によれば、対象は、家庭内のペット動物などの動物である。特定の実施形態によれば、ペット動物はイヌである。

「治療有効量」とは、マクロファージ活性化に関連する疾患もしくは障害の治療または予防に有用な量である。

本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内および腹腔内注射または注入などの非経口投与経路を介して投与できる。あるいは、本医薬組成物は、局所的、経鼻投与、または経口投与により投与できる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。例示的な実施形態では、本医薬組成物は、注射により、好ましくは、筋肉内または皮下注射により投与できる。

治療を必要としている領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、例えば、外科手術後の創傷包帯と組み合わせた局所適用、注射、カテーテル、坐薬、医療用パッチまたはインプラントによって達成することができ、前記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料である。いくつかの実施形態によれば、投与は、腫瘍もしくは新生物または新生物発生前の組織の部位に、例えば、注射器による直接注射によって行うことができる。

いくつかの実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、約５０ｎｇ／注射〜約１０００ｎｇ／注射の用量で投与できる。

いくつかの実施形態によれば、マクロファージ活性化に関連する疾患または障害は、癌、ウイルス性疾患、細菌感染症、自己免疫疾患、および慢性疲労症候群からなる群から選択される。

さらなる実施形態によれば、本発明の医薬組成物により治療される癌には、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮種（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、乏突起神経膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫などの固形腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。さらなる実施形態によれば、治療されるべき癌は、白血病などの非固形腫瘍である。

さらなる実施形態によれば、治療されるべきウイルス性疾患には、例えば、薬剤耐性株を含むヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１および２（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バン・ウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８、カポジ肉腫関連ウイルスとしても知られている）、および黄熱病ウイルスを含むフラビウイルス、デングウイルス、日本脳炎および西ナイルウイルス、インフルエンザウイルスなどのウイルスに関連する疾患が含まれる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

さらに別の実施形態によれば、細菌感染症には、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性およびメチシリン感受性）、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、スタフィロコッカス・キャピティス、スタフィロコッカス・カプラエ、スタフィロコッカス・サッカロリティカス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・ワーネリー、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・インターメディウス、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス、およびスタフィロコッカス・リリカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｒｉｃｕｓ）を含むブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエの亜種、ストレプトコッカス・アンギノサス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ボビス、およびストレプトコッカス・ミュータンスを含む連鎖球菌、フェカリス菌およびエンテロコッカス・フェシウムを含む腸球菌、淋菌、および髄膜炎菌を含むナイセリア種、クロストリジウム・ディフィシレを含むクロストリジウム種、百日咳菌を含むボルデテラ種、炭疽菌を含むバチルス種、ジフテリア菌を含むコリネバクテリウム種からなる群から選択される細菌によって引き起こされる感染症が含まれる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

さらなる実施形態によれば、自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、湿疹、痛風、炎症性腸疾患、および多発性硬化症からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態である。

本発明の医薬組成物はまた、自閉症を治療するのに有用であり得る。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示される。これは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者なら、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。

実施例１
ＧｃＭＡＦ安定性に対するポリソルビタン（ポリソルベート ８０）およびヒト血清アルブミンの影響
様々な期間の溶液中のＧｃＭＡＦの安定性を決定するために、いくつかの安定剤をＧｃＭＡＦ溶液に添加して、ＧｃＭＡＦの量を評価した。

以前に記載された（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７：１００７−１０１６）ように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に述べると、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて、Ｇｃタンパク質をヒト血清または血漿から精製した。精製したＧｃを、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、以下の添加剤のうちの１種を含むｐＨ７．５のＰＢＳに、最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した：０．２％のポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、６００ｎｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその両方。溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、４℃で維持した。ＧｃまたはＧｃＭＡＦの検出を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、時間０および１週間後にウエスタンブロット分析によって行った。ゲルを電気泳動し、ニトロセルロース（ＮＣ）膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体でプローブし、化学発光検出を行った。

図１Ａは、０時点（希釈試料を調製した日）に行ったウエスタンブロット分析を示す。図に示すように、ＧｃＭＡＦは全ての試料において検出されるが、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の存在下で希釈した試料は、ＰＢＳ単独でまたはＰＢＳとＨＳＡで希釈した試料よりも強いバンド強度を示した。ＰＢＳで希釈した市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を対照として使用し、ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦと同様の強度を示した。

図１Ｂは、１週間４℃で放置したＧｃＭＡＦまたはＧＣ試料のウエスタンブロット分析を示す。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈した市販のＧｃタンパク質によって得られるものと同様の強いバンド強度を示した。ＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦ試料は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦ試料によって得られるものと比較して弱い強度を示した。ＨＳＡを含むＰＢＳで希釈したＧｃＭＡＦ試料は、ＰＢＳ単独で希釈したＧｃＭＡＦ試料よりも強い強度を示したが、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＧｃＭＡＦ試料よりも低い強度を示した。したがって、４℃で１週間保存した後に、０．２％の濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０は溶液中でＧｃＭＡＦを維持することが判明し、この非イオン性界面活性剤はＧｃＭＡＦ安定性を維持するのにＨＳＡよりも効果的であることが示された。

ＧｃＭＡＦ試料をポリプロピレンバイアル中で保存した場合に、同様のバンド強度が得られた。

実施例２
異なる期間、異なる温度でのＧｃＭＡＦの安定性
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて、Ｇｃタンパク質をヒトの血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを、滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで異なる緩衝液：ｐＨ７．５のＰＢＳまたはｐＨ５．５のクエン酸塩緩衝液で希釈した。ＰＢＳ溶液はまた、以下の添加剤のうちの１種を含んでいた：０．０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、６００ｎｇのＨＳＡ、または５０μΜのアルギニン。全ての溶液を、２％のマンニトールの存在下または非存在下で調製した。次いで、この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに１ｍｌアリコートで無菌的に充填し、異なる温度（４℃、２５℃、および３７℃）に保った。試料を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃタンパク質またはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる期間、ウエスタンブロット分析により分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体でプローブし、化学発光検出を行った。

図２Ａは、０時点（希釈試料を調製した日）で行ったウエスタンブロット分析を示す。全てのＧｃＭＡＦ試料は、標準的な市販のＧｃタンパク質（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社）と比較して、同様の強度の可視バンドを示した。

図２Ｂは、３７℃で１週間インキュベートしたＧｃＭＡＦ試料のウエスタンブロット分析を示す。ＰＢＳ単独中、４℃でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料も評価した。図に示すように、ＧｃＭＡＦ試料をＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈した場合に、強い強度が観察された。これらＧｃＭＡＦ試料について観察された強度は、新たに希釈したＧｃ試料によって得られたものと同様であった。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ＧｃＭＡＦ安定性を維持する際に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０よりも活性がないことが示された。

図２Ｃは、２５℃で２週間インキュベートしたＧｃＭＡＦ試料のウエスタンブロット分析を示す。ＰＢＳ単独中、４℃でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料も評価した。図に示すように、ＧｃＭＡＦ試料をＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで希釈した場合に、強い強度が観察された。これらのＧｃＭＡＦ試料について観察された強度は、新たに希釈した市販のＧｃ試料によって得られたものと同様であった。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ＧｃＭＡＦ安定性を維持する際に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０よりも活性がないことが示された。

図２Ｄおよび図２Ｅは、新たに希釈したＧｃ試料と比較して、３７℃で１ヶ月間（図２Ｄ）または３ヶ月間（図２Ｅ）インキュベートしたＴＷＥＥＮ８０含有ＧｃＭＡＦ試料のウエスタンブロット分析を示す。図に示すように、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質について観察されたものと同様の高い強度を示した。３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後（４℃で２４ヶ月にほぼ等しい）でさえ、高いバンド強度が取得された。

ＥＬＩＳＡを、９６ウェルプレートにＧＣまたはＧｃＭＡＦ試料を吸着させ、ウサギポリクローナル抗Ｇｃ抗体、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、吸光度を検出することにより行った。３７℃で３．５ヶ月間インキュベートした０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０含有試料の吸光度は、新たに希釈したＧｃタンパク質（２１０ｎｇ／ｍｌ）の吸光度と同じであった。

生物活性試験を、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞株における過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の放出を測定することにより行い、ＧｃＭＡＦ（０．２ｎｇ／μｌ）による刺激後のマクロファージ活性化を決定した。ＧｃＭＡＦを含まない対照と比較して、２倍以上の値を活性があると見なした。過酸化水素（＞２倍）の放出は、３７℃で３．５ヶ月間インキュベートしたＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．０１％）含有ＧｃＭＡＦ試料において観察された。

実施例３
ＧｃＭＡＦ安定性に対する異なる濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、０〜０．０１％の範囲の異なる濃度の非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、３７℃に保った。これらの試料を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でウエスタンブロット分析によって行った。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図３Ａは、０時点（希釈した試料を調製した日）に行ったウエスタンブロット分析を示す。全ての試料は、標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して、同様の強度を示した。

図３Ｂは、３７℃で１週間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０含有ＧｃＭＡＦ試料（０．００１％の濃度でも）が、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の強度で明確な可視バンドを示した。ＰＢＳ単独（界面活性剤の非存在下）で調製したＧｃＭＡＦ試料は、標準的なＧｃタンパク質と比較して非常に弱い強度を示した。したがって、０．００１％以上の濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０は、溶液中のＧｃＭＡＦを維持するのに、ひいては、その安定性を保持するのに非常に有効である。

実施例４
ＧｃＭＡＦ安定性に対する様々な非イオン性界面活性剤の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、以下に示した濃度の非イオン性界面活性剤の非存在下または存在下で、ｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した：ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．００５％）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．００５％、０．０１％または０．０２％）、ポロキサマー１８８（０．０２％、０．１％または０．２％）およびＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（０．０１％、０．０２％または０．０５％）。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、逆さの位置で３７℃に保つか、または４℃に保った。これらの試料（２組づつ）を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でウエスタンブロット分析によって分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗Ｇｃ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図４Ａは、４℃で一晩インキュベートした後に行ったウエスタンブロット分析を示す。界面活性剤の非存在下でインキュベートし、４℃で一晩おいた後にほとんど検出できなかった試料を除いて、全ての試料は標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して同様の染色強度を示した。

図４Ｂは、３７℃で１週間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。（試験した濃度全てにおいて）非イオン性界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の染色強度を示した。ＰＢＳ単独で調製し、界面活性剤の非存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、これらの条件下では検出されなかった。

図４Ｃは、３７℃で１ヶ月間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。（試験した濃度全てにおいて）非イオン性界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の染色強度で明確な可視バンドを示した。（界面活性剤の非存在下で）ＰＢＳ単独でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は可視バンドを示さなかった。したがって、ポリソルベート２０、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドまたはポロキサマー１８８などの非イオン性界面活性剤は、３７℃で１ヶ月間保存した場合であっても、溶液中のＧｃＭＡＦを維持するのに非常に有効であり、したがって、これらの非イオン性界面活性剤は、ＧｃＭＡＦ安定性を保持するのに有用である。

実施例５
ＧｃＭＡＦ安定性に対する非イオン性界面活性剤および他の安定剤の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、以下に示した濃度の非イオン性界面活性剤：ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．００５％）、トリトンＸ１００（０．０６％もしくは０．１２％）、ブリジ（登録商標）５８（０．０１５％もしくは０．０５％）の非存在下もしくは存在下で、または安定剤トレハロース（１％もしくは２％）およびＰＥＧ４０００（１％もしくは３％）の存在下で、ｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、逆さの位置で３７℃に保った。これらの試料（２組づつ）を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でウエスタンブロット分析によって分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗Ｇｃ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図５Ａは、０時点（希釈した試料を調製した日）に行ったウエスタンブロット分析を示す。界面活性剤の非存在下でインキュベートし、ほとんど検出できなかった試料を除いて、全ての試料は標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して同様の染色強度を示した。

図５Ｂは、３７℃で１週間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。（試験した濃度全てにおいて）非イオン性界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の強度の明確な可視バンドを示した。（界面活性剤の非存在下で）ＰＢＳ単独でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は検出されず、トレハロースまたはＰＥＧ４０００の存在下でインキュベートした試料は、ほぼ検出できなかった。

図５Ｃは、３７℃で１ヶ月間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。（試験した濃度全てにおいて）非イオン性界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと比較して、ほんの少しの弱い強度で明確な可視バンドを示した。（界面活性剤の非存在下で）ＰＢＳ単独で、またはトレハロースもしくはＰＥＧ４０００を添加してインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、試験した濃度の全てにおいてこれらの実験条件下では検出されなかった。したがって、非イオン性界面活性剤、例えば、トリトンＸ−１００およびブリジ５８は、３７℃で１ヶ月間保存した場合であっても、ＧｃＭＡＦ安定性を維持することが判明した。トレハロースまたはＰＥＧ４０００は、ほとんど効果がないことが判明した。

実施例６
高濃度のＧｃＭＡＦの安定性に対する非イオン性界面活性剤の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、以下の異なる濃度の非イオン性界面活性剤を含むｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２．５μｇ／ｍｌになるまで希釈した：ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．００５％）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．００５％）、ポロキサマー１８８（０．０５％）およびドデシルマルトシド（０．０１％）。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、逆さの位置で３７℃に保った。これらの試料（２組づつ）を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量５ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析によって分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗Ｇｃ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図６Ａは、０時点（試料を調製した直後）に行ったウエスタンブロット分析を示す。全ての試料は標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して同様の染色強度を示した。

図６Ｂは、３７℃で１ヶ月インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。非イオン性界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の染色強度で明確な可視バンドを示した。（界面活性剤の非存在下で）ＰＢＳ単独でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに調製した標準的なＧＣまたは界面活性剤含有ＧｃＭＡＦ試料と比較して非常に弱い染色を示した。

９６ウェルプレートにＧｃまたはＧｃＭＡＦ試料を吸着させ、ウサギポリクローナル抗Ｇｃ抗体、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、吸光度を検出することによりＥＬＩＳＡを行った。非イオン性界面活性剤の存在下で、３７℃で１ヶ月間インキュベートしたＧｃＭＡＦの試料は、時間０の試料と同様の吸光度を示した。界面活性剤の非存在下で、ＰＢＳ中でインキュベートしたＧｃＭＡＦは、濃度の著しい減少（時間０でシグナルの３９％）を示した。

実施例７
非イオン性界面活性剤の存在下または非存在下で融解した後のＧｃＭＡＦ安定性に対する時間および保存温度の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、ｐＨ７．５のＰＢＳまたは０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、−２０℃で凍結させた。これらの試料（２組づつ）を融解し、室温または４℃で一晩保ち、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でウエスタンブロット分析によって分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図７は、ウエスタンブロット分析の結果を示す。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＧｃＭＡＦ試料は、室温で一晩保存し、融解させた後でさえ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む新しいＧｃ試料の強度と同じ染色強度を示したが、ＰＢＳ単独中で融解し、室温で一晩保存した試料では検出されなかった。ＰＢＳで調製したＧｃＭＡＦを融解直後にポリアクリルアミドゲル上にロードした場合でさえ、ＧｃＭＡＦバンドの強度の有意な減少が認められた（時間０；図７）。界面活性剤の非存在下で、５時間室温でまたは４℃でＧｃＭＡＦを保存すると、ＧｃＭＡＦバンド強度がさらに減少し、短い期間のインキュベーション後でさえ、（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０などの非イオン性界面活性剤の非存在下で）ＧｃＭＡＦが不安定であることが示された。したがって、凍結を行った場合には、ＧｃＭＡＦへのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の添加は、融解後のＧｃＭＡＦの安定性を維持することが示された。

実施例８
ＧｃＭＡＦの凝集体／二量体形成に対するポリソルベート８０の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、ｐＨ７．５のＰＢＳまたは０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで最終濃度が６μｇ／ｍｌになるまで希釈した。これらの試料に凍結融解を３サイクル行うと、凝集体形成が増加した。これらの試料（２組づつ）を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量７５ｎｇのＧｃＭＡＦをロードすることによって、ウエスタンブロット分析により分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図８は、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むＰＢＳで調製した試料が、約５２ｋＤａのＭＷの高い強度のバンドおよび約１００ｋＤａのＭＷ（おそらく分子の二量体）の非常にかすかなバンドを示したことを示している。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の非存在下で調製した試料は、同じ強度の５２ｋＤａのバンドを示したが、約１００ｋＤａの高いＭＷバンドはより強かった。これらの結果は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が、ＧｃＭＡＦの凝集体／二量体形成を減少させることができることを示す。

実施例９
ＧｃＭＡＦ安定性に対するイオン性界面活性剤、水溶性ポリマーおよび他の安定化剤の影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、以下に示した濃度の界面活性物質の存在下でｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した：ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．００５％）、ＳＤＳ（０．０２％）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ｋ９０（０．２％）、ポリビニルアルコール（３０〜７０ｋＤ）、カゼインナトリウム（０．２％）、アルギン酸ナトリウム（０．２％）、およびヒアルロン酸（０．１５％）。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、逆さの位置で３７℃に保った。これらの試料（２組づつ）を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによって、異なる時点でウエスタンブロット分析により分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗ＧＣ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図９Ａは、０時点（試料を調製した直後）に行ったウエスタンブロット分析を示す。弱いシグナルを示したカゼイン含有試料を除いて、全ての試料は、標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して同様の染色強度を示した。

図９Ｂは、３７℃で１週間のインキュベーション後のＧｃＭＡＦのウエスタンブロット分析を示す。非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、イオン性界面活性剤ＳＤＳまたは表面活性ポリマーＰＶＡを含むＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の強度の明確な可視バンドを示した。ＰＢＳ単独またはアルギン酸ナトリウムを含むＰＢＳで調製したＧｃＭＡＦ試料は、可視バンドを示さなかった。ヒアルロン酸、ＰＶＰまたはカゼインの存在下で調製した試料は、著しく弱いバンドを示した。したがって、表面活性を有していない水溶性ポリマーのＰＶＰは、ＧｃＭＡＦの安定化にはあまり効果的ではないことが判明した。

図９Ｃは、３７℃で２週間のインキュベーション後のＧｃＭＡＦのウエスタンブロット分析を示す。非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、イオン性界面活性剤ＳＤＳまたは表面活性ポリマーＰＶＡを含むＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の強度の明確な可視バンドを示した。ＰＢＳ単独またはアルギン酸ナトリウムもしくはヒアルロン酸を含むＰＢＳで調製したＧｃＭＡＦ試料は、可視バンドを示さなかった。ＰＶＰまたはカゼインを含むＰＢＳで調製した試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質バンドよりも著しく弱いバンドを示した。

これらの結果は、イオン性界面活性剤ＳＤＳがＧｃＭＡＦ安定性を維持するのに非常に有効であることを示している。表面活性を有する水溶性ポリマーＰＶＡも、ＧｃＭＡＦ安定性を維持するのに有効であることが示された。しかしながら、多糖類、ヒアルロン酸、およびアルギン酸塩は、溶液中のＧｃＭＡＦを維持するのにあまり有効ではないことが示された。

実施例１０
ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の存在下でのＧｃＭＡＦの生物活性
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌになるまで希釈した。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、０、１、３、６、および１２ヶ月間−２０℃で（直位置）、または０、１、３、および６ヶ月間４℃で逆さの位置で保った。保存終了時に、これらの試料を生物活性試験により分析した。

ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞株における過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の放出を測定し、ＧｃＭＡＦによる刺激後のマクロファージ活性化を決定することにより生物活性試験を行った。ＧｃＭＡＦを含まない対照と比較して２倍以上の値を活性と見なした。（２倍を上回る）過酸化水素の放出が、上述の時点で試験した全てのＧｃＭＡＦ試料において観察され、ＧｃＭＡＦが、４℃では少なくとも６ヶ月間または−２０℃での凍結時には１２ヶ月間、その生物学的活性を維持することが示された。

実施例１１
ＧｃＭＡＦの化学的および生物学的安定性に対する非イオン性界面活性剤またはＰＶＡの影響
上記の実施例１に記載したように、ＧｃＭＡＦを調製した。簡単に説明すると、Ｇｃタンパク質を、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−親和性クロマトグラフィーを用いて血清または血漿から精製した。精製したＧｃタンパク質を、固定化したβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと順次インキュベートし、ＧｃＭＡＦを形成した。ＧｃＭＡＦを滅菌のために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。次いで、これを、以下に示した濃度の賦形剤を含むｐＨ７．５のＰＢＳで最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した：ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（０．００５％）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．００５％）、ポロキサマー１８８（０．０５％）、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（０．０１％）、および表面活性を有する水溶性ポリマーのＰＶＡ（０．２％）。この溶液を濾過し、ゴム栓およびアルミニウムキャップを備える２ｍｌのガラスバイアルに無菌的に１ｍｌアリコートで充填し、逆さの位置で３７℃に保った。これらの試料（２組づつ）を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上のレーン当たり総量２．６ｎｇのＧｃまたはＧｃＭＡＦをロードすることによってウエスタンブロット分析により分析した。ゲルを電気泳動し、ＮＣ膜に移し、ポリクローナルウサギ抗Ｇｃ抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体をプローブにして、化学発光検出を行った。

図１０Ａは、（試料を調製した直後）の時点０で行ったウエスタンブロット分析を示す。全ての試料は、標準的な市販のＧｃタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）と比較して同様の染色強度を示した。

図１０Ｂは、３７℃で１週間インキュベートしたＧｃＭＡＦまたはＧｃ試料のウエスタンブロット分析を示す。示した非イオン性界面活性剤またはポリマーＰＶＡの存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに希釈したＧｃタンパク質によって得られたものと同様の強度の明確な可視バンドを示した。（界面活性剤の非存在下で）ＰＢＳ単独中でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料は、新たに調製した標準的なＧＣまたは界面活性剤の存在下でインキュベートしたＧｃＭＡＦ試料と比較して有意に弱い染色を示した。

ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞株における過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の放出を測定し、ＧｃＭＡＦによる刺激後のマクロファージ活性化を決定することにより生物活性試験を行った。ＧｃＭＡＦを含まない対照と比較して２倍以上の値を活性と見なした。（２倍を上回る）過酸化水素の放出が、３７℃で１週間後に非イオン性界面活性剤およびポリマーを含むＧｃＭＡＦ試料において観察され、ＧｃＭＡＦがその生物学的活性を維持することが示された。

本発明が、特に図示し、上記で説明してきたものに限定されないことは当業者なら理解するであろう。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。

Claims (32)

1. 安定なＧｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）またはその生物学的に活性のある変異体もしくは断片、ならびに界面活性剤および表面活性を有する合成水溶性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
2. 前記安定なＧｃＭＡＦが、アミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有し、ヒトＧｃＭＡＦおよび動物のＧｃＭＡＦからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記安定なＧｃＭＡＦが、アミノ酸残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミン基を有するヒトＧｃＭＡＦである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記安定なＧｃＭＡＦが、配列番号１〜３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記安定な断片が、前記Ｇｃタンパク質のアミノ酸４００〜４３５に相当するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記安定な断片が、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記安定なＧｃＭＡＦが、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記安定なＧｃＭＡＦが、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記安定なＧｃＭＡＦが、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、および両性イオン性界面活性剤からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 前記非イオン性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレン高級アルコールエーテル類、およびポリオキシアルキレン高級アルコールエステル類からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類、ポリオキシエチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコシド、およびアルキルマルトシドからなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、トリトンＸ−１００、ブリジ５８、およびポロキサマー１８８からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
14. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
15. 表面活性を有する前記合成水溶性ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドブロックコポリマー、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、プロピレングリコールホモポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
16. さらに等張化剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
17. 前記等張化剤が塩化ナトリウムである、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. さらに緩衝剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
19. 前記緩衝剤が、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、およびクエン酸緩衝液からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. さらに医薬担体または希釈剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
21. 溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、錠剤、およびカプセル剤からなる群から選択される形態で製剤化される、請求項１に記載の医薬組成物。
22. 水溶液の形態で製剤化される、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. ＧｃＭＡＦ、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、リン酸緩衝液、および水を含む組成物であって、前記組成物のｐＨが約５〜約８の範囲であり、ＧｃＭＡＦの濃度が約１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
24. マクロファージ活性化に関連する疾患または障害の治療に使用するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
25. 前記対象がヒトである、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 前記対象が動物である、請求項２４に記載の医薬組成物。
27. 前記動物が犬である、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記マクロファージ活性化に関連する疾患または障害が、癌、ウイルス性疾患、細菌感染症、自己免疫疾患、自閉症、および慢性疲労症候群からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
29. 前記医薬組成物が、非経口経路による投与に適している、請求項２４に記載の医薬組成物。
30. 前記医薬組成物が、静脈内、筋肉内または皮下注射に適する、請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 前記癌が、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮種（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、乏突起神経膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽腫からなる群から選択される固形腫瘍である、請求項２８に記載の医薬組成物。
32. マクロファージ活性化に関連する疾患または障害を治療する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の治療有効量の安定な医薬組成物を、そのような治療を必要としている対象に投与することを含む方法。

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