JPH03504008A - 均質な二量体ｍ‐ｃｓｆおよびその貯蔵安定性製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 均質な二量体Ｍ−ＣＳＰおよびその貯蔵安定性製剤マクロファージ・コロニー刺 激因子（Ｍ−Ｃ９Ｆ）は造血細胞の増殖および分化を促進する調節糖蛋白質であ る。Ｍ−Ｃ９Ｐをイン・ビトロのコロニー促進検定に用いる場合、それは単核細 胞系列型コロニー優勢な形成をもたらす。

Ｍ−ＣＳＦは重要な治療用途を有している。たとえば、Ｍ−ＣＳＦは重症の感染 の場合に成熟した白血球の活性化に、または自然に発生する、または放射線で誘 発される白血球減少症用の治療剤として用いられ得る。それは、また単独か、ま たは１９８８年９月７日に国際出願公開８８１０６４５２として公開された国際 出願／米国８８１００６１８に記載された腫瘍関連抗原に対する成る種の抗体と それとの併用によりガン細胞を殺すのに用いられ得る。Ｍ−Ｃ９Ｆは血液のコレ ステロール濃度を有利に変えるのに投与され得る。

完全な長さのＭ−Ｃ８Ｆは、ウオングら、サイエンス、第２３５巻、１５０４− １５０８頁（１９８７年）に記載されている。組換えＤＮＡ技術による完全な長 さのＭ−Ｃ９Ｆの製造はクラークらの１９８７年１１月１９日に国際出願公開８ ７１０６９５４として公開された国際出願／米国８７１００８３５に記載されて いる。端を切取った変異形のＭ−ＣＳＰの相補ＤＮＡ配列は川崎ら、サイエンス 、第２３０巻、２９１−２９６頁（１９８５年）により報告された。上記端を切 取った変異形のＭ−Ｃ９Ｆの組換え法による製造は１９ｉ１１６年８月１４日に 国際出願公開８６１０４６０７として公開された国際出願／米国８６１０　Ｏ２ ３８に記載されている。トランスメンブラン領域に特徴的な疎水性アミノ酸の欠 失または置換を有している上記端を切取った変異形の変形は１９８７年１２月１ ６日に公開されたヨーロッパ特許公開２４９４７７に記載されている。組換え技 術により製造される他のＭ−ＣＳＦの短形および長形およびそれに対応している 変異蛋白質は、コースらの１９８８年５月５日に国際出願公開８８１０３１７３ として公開された国際出願／米国８７１０２６７９に記載されている。上記のＭ −Ｃ９Ｆポリペプチド類は、本発明に用いられ得ることは意図されている。

Ｍ−Ｃ８Ｆの組換え製造に用いる適当な細胞または細胞系は、チャイニーズ　ハ ムスター卵巣（Ｃ）（Ｏ）細胞、国際出願８’７１０６９５４に記載されたモン キーＣＯ５−１細胞系およびＣＶ−１細胞系のような晴乳類細胞を含む。細菌細 胞もまた、たとえばエシェリヒア・コリおよびバチルス・ズブティリスを発現系 として用い得る。さらに、酵母細胞の多くの株は宿主細胞として有効である。

天然のＭ−ＣＳＦ蛋白質が２つの全く同じ、大量にグリコジル化したサブユニッ トからなるという一般的な合意がある。この二量体ポリペプチドは共有と非共有 の結合により支持される複雑な四次構造を有している。

出願人は、この四次構造の完全な状態が多量体分子集合体の形成に導いている予 想外に緩和なｐＨおよび溶媒の影響により危うくさせられることを見出した。” 多量体分子集合体”の語はＭＣ９Ｆの３つまたはそれ以上の完全なサブユニット から成っている高分子量種を呼ぶものとして本明細書で用いられる。さらに、高 分子量種は、またクラークらの国際出願公開８７１０６９５４の方法により製造 したＭ−ＣＳＦでも発生する。

出願人は、またＭ−Ｃ９Ｐの凍結乾燥およびその後の貯蔵がまた多量体分子集合 体の形成および増殖を起し得ることを見出した。これらの集合体は互に共有また は非共有に結合され得る。非共有の凍結乾燥で誘発される集合体はウオング、サ イエンス第２３５巻、前掲に記載されるウオング・マウス骨髄検定によると実質 的に生物学的活性をもたないことを確認した。

出願人は、Ｍ−ＣＳＰの多量体分子集合体が強く損なわれた生物学的活性および その結果としての治療効果により、また免疫原性と推測される毒性により特徴づ けられることを観察した。マウスがこれらの高分子量種を注入された場合、それ らは本発明の均質な二量体Ｍ−ＣＳＦを注入されたマウスよりも高力価でＭ−Ｃ ９Ｐに対する抗体を生産した。これは、高分子量種が均質な二量体Ｍ−Ｃ９Ｆよ りも高い毒性を有することを示唆する。さらに、高分子量Ｍ−ＣＳＦ種は、ウオ ング骨髄検定により測定されたところでは、均質な二量体Ｍ−ＣＳＦに比較して １０倍も低い生物学的活性を示した。

安全性、活性、治療効果を保ち、最も重要なこととして可能性のある毒性副作用 の危険率を減少するため、Ｍ−ＣＳＦの医薬的製剤は上記の高分子量種を含まな いことが必要である。さらに、蛋白質溶液内での凝集は、それが血栓症、用量の 不均質性および注射器の詰まりのような周知の危険を引き起し得るため、有害で ある沈澱物をしばしば生ずる。

本発明は、また凍結乾燥およびその後の長期の貯蔵に安定である均質な二量体Ｍ −Ｃ９Ｆの製剤を提供することにより上記の問題を解決する。Ｍ−ＣＳＦは、高 分子量種（より低い生物学的活性をもつ）が除去されたならば、より強い治療効 果を有する。本発明の生成物は免疫原性応答について少い危険率しか示さない。

本出願に用いる“均質な二量体Ｍ−Ｃ９Ｆは、（ａ）ウオングらの第２図に示さ れるＤＮＡ配列にストリンゼントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によ りコード化され、（ｂ）ウォングらサイエンス、前掲に記載されたウオング　マ ウス骨髄検定で少くともｌミリグラム当り約０．４Ｘ１０”稀釈単位（ＤＵ／１ ９）の活性を示し、（ｃ）実質的に３つまたはそれ以上のＭ−Ｃ９Ｆサブユニツ トを有している多量体分子集合体を含まない蛋白質として定義される。これは、 勿論天然の蛋白質に対応し、特にウォングらの第２図に示される配列のみならず 、また点突然変異、対立形質変異、付加および欠失を有している関連した配列で あって前記の要件をみたすものを包含する。

均質な二量体Ｍ−ＣＳＦはゲル濾過クロマトグラフィーを用いることにより部分 的に精製した粗製調製品から得られ得る。他の段階も勿論上澄液から粗製の二量 体Ｍ−ＣＳＦ調製品を部分的に精製するのに用いられ得るが、それらの性質およ び順序は絶対的なものではない。本発明の他の特徴として、均質な二量体Ｍ−Ｃ ＳＦはゲル濾過カラムにＭ−ＣＳＦの部分的に精製した調製品を通して製造され る。

ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、ベッドは特定のサイズ範囲の分子に多孔 性を示すビーズで形成したゲル媒質またはマトリックスで充填される。このサイ ズの範囲は分画範囲と称せられる。約１Ｏ−１５００ＫＤの分画範囲（分子量） をもっているゲル濾過マトリックスが用いられ得る。セファクリル（Ｓ　ｅｐｈ ａｃｒｙｌ）　Ｓ　−３００［ファルマシア・バイオテクノロジー・プロダクツ ・カタログ８６．１９８６年、カタログ１７−０４．３Ｂ−０１番］は上記のマ トリックスであって、本発明の目的に現在好ましい市販のゲル濾過マトリックス である。セファクリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００［ファルマシア カタログ１７−０８７１−０１番コ、バイオシル（Ｂ　１ｏｓｉｌ）Ｔ　Ｓ　Ｋ −２５０［バイオ−ラドカタログ１２５−００６６番］およびＴＳＫＧ−３００ ０ＳＷ（ＬＫＢ、カタログ２１３５−３６０番）のような他の機能的に同一なゲ ル　マトリックスもまた用いられる。

均質な二量体Ｍ−ＣＳＦは、約１Ｏ−１５００ＫＤの分画範囲（分子量）をもつ ゲル濾過マトリックスを用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより検定した場合 単一のピークであるという特性をもっている。本発明の物質はウオング　マウス 骨髄検定で少くとも約０゜４　ｘ　１０　＠Ｄ　Ｕ／ｕの比活性をもっている。

好ましい特別な具体例として、それは少くとも約０．７　ｘ　１０”ＤＬ＋１０ の比活性をもっている。たとえば、国際出願公開８７１０６９５４として公開さ れた国際出願／米国８７１００８３５に記載されたＭ−ＣＳＦは、７Ｏ−９０Ｋ Ｄの見掛けの分子量範囲を示しているグリコジル化の変化により、非還元性ドデ シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ） によって幅広いバンドを示す。Ｍ−Ｃ５Ｆの報告された変形の中で１．：：の７ ０−９０ＫＤＣ）Ｍ−ＣＳＦは天然のヒトＭ−ＣＳＦの特性と最も近く匹敵する 。本発明にしたがって均質性に精製した場合、この二量体蛋白質はウオング検定 で測定して約０．８　ｘ　１０＠ＤＵ／１１９の平均を示す比活性をもっている 。

本発明の生成物は、約０．１−１０％のＭ−ＣＳＦ、約０．５−２０％の医薬的 に許容可能なポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤、約４０−７５％のグリ シン、約１５−４０％のスクロースおよび約２５％までの医薬的に許容可能な緩 衝剤を含んでいる凍結乾燥した組成物に製剤化され得る。好まし、い具体例とし て、本発明の生成物は、約０．１−２％のＭ−ＣＳＰ、約０．１　９％（７）医 薬的に許容可能なポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤、約６５−７５％の グリシン、約１７−２１％のスクロースおよび４−７％の医薬的に許容可能な緩 衝剤を含んでいる凍結乾燥した組成物に製剤化される。特にことわらない限り、 ％は重量％である。再構成すると、これらの製剤は約ｐＨ６である。製剤の蛋白 質分析は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより検定した場合単一のピークのみを 示しおよび非還元性ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにより単一の分子量バンドを示す。

これらの製剤はＭ−ＣＳＦ集合体を欠く貯蔵の安定な均質な二量体としてＭ−Ｃ ９Ｐを保持する。安定の語は、ウォングら、サイエンス第２３５巻、前掲に記載 したウォング　マウス骨髄検定において優勢にマクロファジーを含んでいるコロ ニーが生成することにより測定されるものとして生物学的活性の水準を実質的に 保持することを称する。

非共有的に結合したＭ−ＣＳＦ集合体の存在は、本明細書に記載したゲル濾過に おいて二量体Ｍ−Ｃ９Ｐピークと異質のゲル濾過ピークにより示される。共有的 に結合した集合体は非還元性５ＤＳＰＡＧＥでの高分子量バンドにより立証され る。

上記の組成物に用いるポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤の好ましい種類 はポリシルバートである。好ましいポリシルバートはポリシルバート８０である 。好ましい製剤は凍結乾燥前に０．００５％ポリシルバート８０をもっている。

ポロキサメルは本発明に有用な市販のポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤 の他のグループで、詳しくはポロキサメル３３８である。好ましい予備凍結乾燥 ポロキサメル製剤は０．０５％のポロキサメル３３８を含んでいる。

本発明の製剤は、さらにグリシンおよびスクロースを含み、クエン酸ナトリウム のような医薬的に許容可能な緩衝剤で約６のｐＨに緩衝され得る。０．２５−（ １，７５Ｍのグリシン、０．５−３％のスクロースおよび０−５０ｍＭのクエン 酸ナトリウムの範囲の予備凍結乾燥した製剤がその例である。−例として好まし い予備凍結乾燥した製剤は０．５Ｍのグリシン、１％のスクロースおよび１０＋ ｎＭのクエン酸ナトリウムを含んでいる。

凍結乾燥の方法は当業界で公知である。レミイングトンズ・ファルマステカル・ サイエンセス１５３８頁（１７版、１９８５年）参照。

均質な二量体Ｍ−Ｃ３Ｆおよびその貯蔵の安定な、凍結乾燥した、好ましい製剤 は、非経口投与用の医薬的製剤に用いるのに特に適している。上記の医薬的製剤 は非経口的に許容可能な賦形薬に治療的に有効量の均質な二量体を含み得る。非 経口的に投与した場合、本発明に用いる治療組成物は発熱物質を含まない、好ま しくは等張の水性溶液の形である。凍結乾燥した製剤に関して、非経口投与は好 ましくは注射用水（ＷＦＩ）による再構成後に行ない得る。

Ｍ−ＣＳＦの治療的に有効量は、全身の毒性作用を引き起すのに不充分でなけれ ばならないが、目的とする治療応答を引き出すのに充分でなければならない。上 記の製剤による実際の薬の用量用法は、たとえば患者の状態、体重、性および食 餌、投与の回数および疾病の発病の程度のような薬剤の作用を変更する種々の因 子を考慮して看護する医師により決定され得る。

均質な二量体Ｍ−Ｃ９Ｆが得られ得る一つの方法を説明する実施例を以下に示す 。

実施例１ 完全な長さのＭ−Ｃ９Ｆをクラークら、国際公開ＷＯ３７１０６９５４の方法に よりＣＨＯ細胞中で生産した。粗製蛋白質を条件培地から採取し、膜型陰イオン 交換カラム［カニ（ＱＡＥ）ゼータプレグ陰イオン交換ディスク（ＬＫＢプロダ クターＡＢ）］に適用した。

Ｍ−ＣＳＦは宿主他の陰性荷電した蛋白質と同様に、このディスクに結合した。

カラムを洗浄し、Ｍ−Ｃ９Ｆを０．５Ｍ　　ＮａＣ＋２を含んでいる緩衝液で溶 離した。

カニ・ゼータ・プレグ・ディスクの溶離液を、０．０５％（Ｖ／Ｖ）の濃度にポ リシルベート２０を添加することにより、固定化レンズ豆レクチン［レンズ豆レ クチン　セファロース（ファルマンア）］でのクロマトグラフィー用に調整した 。生成物はメチル−α、Ｄ−マンノビラノンドを含んでいる緩衝液でカラムから 溶離した。

固定化レンズ豆レクチンカラムの溶離液を次に高分解能陰イオン交換カラム［モ ノＱ樹脂（ファルマシア）］に用いるために調整した。

レンズ豆レクチン段階からの生成物画分を２００ｍＭ　　ＭＥＳ緩衝液でｐＴ（ ５，８に酸性化し、モノＱ　カラムに充填した。Ｍ−Ｃ９Ｆは０．０５Ｍ　　Ｎ ａＣ１−０，３Ｍ　　ＮａＣ１の直線勾配でカラムから溶離した。ある種のＭ− ＣＳＰの高分子量種が後半の溶離画分に存在し、これはＭ−ＣＳＦブールから除 外した。

モノＱ　クロマトグラフィ一段階からプールした生成物画分をＣ４（Ｖ　ｙｄａ ｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにそれを充填する前に 酸性化した。０４カラムを２７％水性アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの緩 衝液で平衡にした。カラムを次に洗浄し、Ｍ−ＣＳＦは４０，５％−５８，５％ 水性アセトニトリルと０゜１％ＴＦＡの直線勾配で溶離した。Ｍ−Ｃ９Ｆ含有画 分をプールした。

Ｃ４逆相ＨＰＬＣ段階後、Ｍ−Ｃ３Ｆ含有画分をＤＥＡＥ−セファロース陰イオ ン交換カラムで濃縮した。Ｍ−Ｃ９ＦブールをＤＥＡＥ平衡緩衝液で５倍に希釈 し、ＤＢＡＥカラムに充填した。Ｍ−ＣＳＦは０．５Ｍ　　ＮａＣ１含有緩衝液 で溶離した。

ＤＥＡＥ−セファロース溶離液を９０ＣＩＸ９ＣＩのカラムサイズを有するセフ ァクリルＳ−３００（ファルマシア）ゲル濾過カラムに直接適用し、２舷／分の 流速で、ｐＨ６、クエン酸ナトリウム、５０ｍＭ　　ＮａＣ１により溶離した。

Ｍ−ＣＳＦ”を平衡緩衝液により非勾配モードで溶離した。生成りロマトグラム は２つの充分に解像したピークを示した。均質な二量体（７０−９０ＫＤ）Ｍ− Ｃ９Ｆに対応するピークは、速い泳動のピークである高分子量種の後に現れた。

均質な二量体Ｍ−ＣＳＰをプールし、分析用に、１ＩＩＱＺ分の流速で、５０　 ｍＭ　　ＮａｔＳ　０４．２０ｍＭ　　ＮａｔＨＰＯ４、ｐＨ６，８および０゜ ０２％アジドナトリウムの緩衝液により溶離する６００ａｕｓＸ７．５＋＊ｍバ イオーラド　バイオシル２５０カラムを通してクロマトグラフィーにかけ、単一 のピークを示しているクロマトグラフィーを得た。

プールした均質な二量体Ｍ−ＣＳＦを凍結し、−８０℃で貯蔵した。

有効なカラム条件およびゲル濾適用の溶離緩衝液の決定は一般に当業者の技術に 属するが、出願人の現在本発明の目的に好ましい条件は上記のものである。

Ｍ−ＣＳＦの貯蔵安定性凍結乾燥製剤を説明する実施例は下記に示す。

実施例２ 完全な長さのＭ−ＣＳＦをクラークら、国際公開ＷＯ３７１０６９５４の方法に よりＣＨＯ細胞中で生産した。均質な二量体Ｍ−ＣＳＰを実施例１の方法により 得た。

ｐＨ６の０．１２５次９／ＭＱ　Ｍ−Ｃ３ＦＳ　１０ｍＭクエン酸ナトリウム、 ０．５Ｍグリシン、１％スクロースおよび０．００５％ポリシルバート８０の２ ００ｘＱ溶液を０．２μ夏濾紙（デュラボール）を通して濾過した。濾過した溶 液を２ｘＱアリコートで凍結乾燥に適した１００個の１０１１Ｑ小瓶に分けた。

小瓶を凍結乾燥器に詰め、１時間−４０℃で凍結した。凝集器を一７０℃に冷却 し、生成物の温度を半時間−３７℃に上げ、チャンバー圧力を５０ミリトルに下 げた。圧力を乾燥窒素により保持した。棚の温度を、生成物の温度が最初の乾燥 を開始するために一３５℃に上がるように上げた。生成物の温度および棚の温度 が平衡に入った場合最初の乾燥を完全と考えた。棚表面の温度を、次に棚表面の 温度および生成物の温度が１０℃以上異ならないような速度で２０℃に増大した 。水蒸気の部分的圧力が５ミリトル以下になったとき、系を固体窒素で逆に充填 し、生成物の小瓶に栓をした。

０．２％Ｍ−Ｃ９Ｆ１０．１％ポリシルバート８０．７４．１％グリンン、１９ ．７％スクロースおよび５８％クエン酸ナトリウムを含んでいる代表的な凍結乾 燥した試料を次に注射用水により２ｚＱに再構成し、ゲル濾過および非還元性Ｓ ＤＳ　　ＰＡＧＥにより分析した。ゲル濾過クロマトグラムは単一のピークを示 し、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ分析は約８０ＫＤで単一の分子量バンドを示した。

当業者は多くの改善を本発明思想の範囲内で上記の製剤になし得る。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）約１０−１５００ＫＤの分画範囲をもっているゲル濾過マトリックスを用 いたゲル濾過クロマトグラフィーにより検定した場合、単一ピークを特徴とする 、均質な二量体Ｍ−ＣＳＦ。
2. （２）ウオングマウス骨髄検定で少くとも約０．４×１０８ＤＵ／ｍｇの比活性 をもっている、請求項１記載のＭ−ＣＳＦ。
3. （３）さらに非還元性ＳＤＳＰＡＧＥによると約７０−９０ＫＤの分子量をもっ ことを特徴とする、請求項２記載のＭ−ＣＳＦ。
4. （４）非経口的に許容可能な賦形薬中に、治療的に有効な量の請求項１記載のＭ −ＣＳＦを含んでいる、非経口的投与用医薬製剤。
5. （５）Ｍ−ＣＳＦがウオング骨髄検定で少くとも約０．４×１０８ＤＵ／ｍｇの 比活性をもっている、請求項４記載の製剤。
6. （６）Ｍ−ＣＳＦがさらに非還元性ＳＤＳＰＡＧＥによると約７０−９０ＫＤの 分子量をもつことを特徴とする請求項４記載の製剤。
7. （７）約０．１−２．０％のＭ−ＣＳＦ、約０．１−９％の医薬的に許容可能な ポリオキシエチレン性非イオン界面活性剤、約６５−７５％のグリシン、約１７ −２１％のスクロースおよび約４−７％の医薬的に許容可能な緩衝剤を、製剤を 維持するのに充分な量で含む、再構成したとき約ｐＨ６である、請求項１記載の 貯蔵安定性凍結乾燥したＭ−ＣＳＦ製剤。
8. （８）上記の界面活性剤がポリゾルパート８０である、請求項７記載の製剤。
9. （９）約１０−１５００ＫＤの分画範囲をもつゲル濾過マトリックスを用いたゲ ル濾過カラムにＭ−ＣＳＦの部分的に精製した調製品を通過させ、緩衝剤により 上記の調製品を溶離することを含む、均質な二量体Ｍ−ＣＳＦの製造方法。