KR101549457B1 - 폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(g-csf)의 신규 접합체 - Google Patents

폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(g-csf)의 신규 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR101549457B1
KR101549457B1 KR1020137001860A KR20137001860A KR101549457B1 KR 101549457 B1 KR101549457 B1 KR 101549457B1 KR 1020137001860 A KR1020137001860 A KR 1020137001860A KR 20137001860 A KR20137001860 A KR 20137001860A KR 101549457 B1 KR101549457 B1 KR 101549457B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
csf
conjugate
peg
unmodified
polyethylene glycol
Prior art date
Application number
KR1020137001860A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130043167A (ko
Inventor
타티아나 베니아미노브나 체르노프스카야
레프 알렉산드로비치 데니슬로프
엘레나 게오르기예브나 루덴코
엘레나 레오니도브나 모로조바
Original Assignee
클로즈드 조인트-스탁 컴퍼니 “바이오캐드”
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45567857&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101549457(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 클로즈드 조인트-스탁 컴퍼니 “바이오캐드” filed Critical 클로즈드 조인트-스탁 컴퍼니 “바이오캐드”
Publication of KR20130043167A publication Critical patent/KR20130043167A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101549457B1 publication Critical patent/KR101549457B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 약제 및 의약, 즉 화학식 (I)로 표시되는 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 신규 생리학적 활성 접합체로, G-CSF의 활성을 가진 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 청구된 접합체를 함유하는 의약, 약학 조성물, 활성 성분으로서 과립구 콜로니 자극 인자를 보유하는 약물 및 의약에 사용되는 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 용도, 호중구를 예방 및/또는 치료하기 위한 접근법, 약학 조성물을 함유하는 용기에 관한 것이다:
화학식 (I)

Description

폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 신규 접합체{A NOVEL CONJUGATE OF GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR(G-CSF) WITH POLYETHYLENE GLYCOL}
본 발명은 약제 및 의약, 즉 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 신규 생리학적 활성 접합체, 더 상세하게는 의약용, 예를 들어 백혈구감소증, 주로 골수억제 화학요법으로 치료받은 환자, 조혈줄기세포 이식을 받은 환자, 만성 호중구감소증 환자, AIDS 환자 및 다른 감염 환자에서 다양한 종류의 호중구감소증을 치료하는데 적합한, 폴리에틸렌글리콜과 G-CSF의 신규 접합체에 관한 것이다.
G-CSF는 과립구의 증식, 분화 및 성숙을 자극하는 조혈 성장인자이다(Metcalf, 1992). 외인성 G-CSF의 도입은 말초 혈액에 급격하고 특이적이며 용량 의존적인 호중구 증가를 유발한다(Welte et al., 1985; Hartung et al., 1995).
사람 G-CSF 유전자는 세균 세포 및 포유동물 세포에서 클로닝 및 발현되었고; 그 결과 사람 G-CSF(rhG-CSF)의 다양한 재조합 변형체가 개발 및 정제되었다(Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986; Komatsu et al., 1987). 이. 콜리(E.coli)와 CHO 세포에서 각각 수득되는 2가지 rhG-CSF 변형체는 필그라스팀(filgrastim) 및 레노그라스팀(lenograstim)이다. 필그라스팀은 175개의 아미노산으로 구성되고, 글리코실화되지 않으며, 아미노산 서열은 천연 단백질과 동일하나, 분자의 N-말단에 추가 메티오닌 잔기를 함유한다. 레노그라스팀은 174개의 아미노산으로 구성되고, 글리코실화되며, 아미노산 서열이 천연 사람 G-CSF 서열과 완전히 일치한다.
글리코실화 및/또는 단백질 서열이 다른 다양한 rhG-CSF 산물도 화학요법후 발생하는 호중구감소증, 특발성, 선천성 및 주기성 호중구감소증을 치료하기 위한; 항생제와 병용하여 중증 감염을 치료하기 위한, 그리고 호중구 AIDS 환자의 중증 감염을 치료하기 위한 임상용으로 이용가능하다(Molineux, 2004).
하지만, rhG-CSF의 임상 용도는 피하 주사 부위로부터의 빠른 흡수, 단백분해성 불안정성, 대량 분포, 빠른 제거율 및 짧은 혈청 반감기로 인해 제한적이었다(Mashkovsky, 2006; de Wit et al., 1996).
결과적으로, rhG-CSF는 적절한 효율성을 위해 매일 주사로 환자에게 투여해야만 한다. 그리고 전체 말초 백혈구 세포수를 매일 모니터링해야 한다.
G-CSF의 치료 효능은 천연 단백질 분자가 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)에 화학적으로 결합된, 더 장기간 작용성 약제 형태로 사용 시 개선될 수 있다. G-CSF의 PEG화(PEGylation)는 약동학 개선, 반감기 증가, 제거율 저하, 혈액내 농도 변동 축소, 면역원성 및 독성 감소, 생체내 활성 증가 및 안정성 증가를 야기한다(Molineux, 2003; Molineux, 2004).
PEG-G-CSF 접합체의 생물학적 성질은 주로 분자량과 사용한 활성화된 mPEG의 종류에 의존적이다. 활성화된 PEG의 반응성 작용기는 그 후 단백질의 특정 부위, 주로 아민, 설프하이드릴 또는 다른 친핵성 기들에 부착될 수 있다. 대부분의 경우에 바람직한 변형 부위는 리신의 아미노 기 및 폴리펩타이드 사슬의 N-말단이다(Kinstler et al. 1996, Roberts et al., 2002). 아민 PEG화에는 매우 다양한 mPEG 유도체가 사용되었고; 예를 들어 PEG-트리아진, PEG-석신이미딜 카보네이트, PEG-석신이미딜 석시네이트, PEG 트레실레이트, PEG-알데하이드, PEG-N-하이드록시석신이미드-활성화된 에스테르 등이 있다.
여러 PEG-G-CSF 접합체가 공지되어 있다.
특허 US 2007/0014762는 분자량이 5000 Da인 다양한 활성화된 mPEG를 사용한 PEG-G-CSF 접합체, 구체적으로 mPEG-석신이미딜 부타노에이트, mPEG-석신이미딜 프로피오네이트, mPEG-석신이미딜 a-메틸부타노에이트의 생산에 대해 기술하고 있다. 접합체를 수득하기 위해, 다른 위치에 여러 아미노산 치환을 함유하는 CHO 세포에서 유래된 rhG-CSF를 사용했다. 접합 반응은 pH 7 내지 9에서 수행했다. 그 결과 수득되는 PEG-G-CSF 접합체는 여러 위치 이성질체로 구성되었고; 각 이성질체는 리신 잔기의 엡실론-아미노 기 및 N-말단 아미노산의 알파-아미노 기를 가진 다른 부위에서 PEG 5000에 접합되어 있다. PEG-G-CSF 접합체는 SP-세파로스 컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피로 정제했다.
이 특허에서 수득된 접합체의 활성과 순도에 대한 데이터는 없었다.
이 최종 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. G-CSF에 접합된 mPEG의 낮은 분자량;
2. PEG가 여러 리신 잔기 및 N-말단 아미노산의 자유 아미노 기를 통해 G-CSF와 접합되어 있는 여러 위치 이성질체의 형성.
EP 특허 0401384는 다른 반응성 기에 의해 활성화된 분자량이 4,500 내지 10,000 Da인 선형 및 분지형 구조의 mPEG를 사용하여 수득한, PEG-G-CSF 접합체(석신이미딜 석시네이트, 클로로-s-트리아진, 폴리옥시에틸렌디아민)를 기술한다. 이 PEG-G-CSF 접합체는 생체내에서 지속적인 효과를 나타냈고, 지속 정도는 접합된 PEG의 분자량에 의존적이었다. PEG 10000인 PEG-G-CSF 접합체 및 미변형 G-CSF의 반감기는 각각 7.05h 및 1.79h이었다.
최종 접합체의 단점은 다음과 같다:
석신이미딜 석시네이트-PEG는 mPEG를 석신산 무수물과 반응시킨 뒤, 석신이미딜 에스테르로 카르복시산을 활성화시켜 제조했다. 중합체 주쇄는 단백질과 접합 반응 후에도 남아 있는 제2의 에스테르 결합을 함유한다. 이 결합은 중합체가 단백질에 부착된 후의 가수분해에 매우 민감하다. 이 가수분해는 PEG 부착의 이점을 상실시킬 뿐만 아니라 가수분해후 단백질에 남아 있는 석시네이트 태그가 합텐으로서 작용하여 남은 단백질의 면역원성을 유도할 수 있다(Roberts, 2002).
1. 클로로-s-트리아진 mPEG 유도체는 리신 및 시스테인 잔기의 작용기와 접합할 수 있어, 많은 이성질체의 발생을 야기하고, 이 중 일부는 불안정한 결합을 특징으로 한다. 더욱이, 트리아진 mPEG 유도체는 독성이 커서 현재 사용되지 않는다(Veronese & Pasut, 2005).
EP 특허 0335423은 분자량이 300 내지 30000 Da인 트리아진 mPEG 유도체와 G-CSF의 접합체를 기술한다. 이 PEG-G-CSF 접합체는 지속적인 작용을 나타내며, 그 비활성은 미변형 G-CSF 활성의 11 내지 60% 범위이다.
최종 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. 낮은 비활성.
2. 다수의 위치 이성질체를 초래하고, 이 중 일부는 불안정한 결합을 특징으로 하는 mPEG-트리아진 유도체의 사용. 더욱이, mPEG-트리아진 유도체는 독성이 커서 현재 사용되지 않는다(Veronese & Pasut, 2005).
본 발명의 원형으로서, US 특허 5,824,784(실시예 2)에 기술된 PEG-G-CSF 접합체가 선택되었다. 이 특허는 활성화된 프로피온알데하이드 기와 분자량이 6,000 내지 25,000인 선형 mPEG를 가진 이.콜리 유래 rhG-CSF(ALD-mPEG)의 환원성 알킬화의 반응에 대해 기술한다. PEG화 반응은 pH 5에서 수행했다. 산성 조건 하에, 알데하이드는 다른 친핵체에 비해 a-아민의 낮은 pK로 인해 N-말단 a-아민에 대해 주로 선택적이다. 알데하이드의 커플링은 동일계 내에서 환원되어 안정한 2차 아민 결합을 제공하는 쉬프 염기를 통해 진행된다(Kinstler et al., 1996).
이러한 방식으로 제조된 rhG-CSF의 PEG 20 kDa에 의한 N-말단 PEG화는 여러 호중구감소증 상태의 치료 및 예방에 사용되는 peg필그라스팀("Neulasta")의 개발에 사용되었다.
모노-mPEG-G-CSF 접합체는 SP 세파로스 HP 컬럼을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피로 분리했다. 결과적으로 수득되는 정제된 PEG-G-CSF 접합체의 생물학적 활성은 천연 G-CSF 활성의 68%였다. 최종 접합체 중에 존재하는 미변형 G-CSF의 함량은 5% 이하였다. 이 접합체의 약동학적 파라미터는 미변형 G-CSF보다 우수했다. 동물 실험은 PEG-G-CSF 접합체의 도입이 백혈구 세포수를 증가시키고 PEG-G-CSF 접합체가 미변형 G-CSF에 비해 더욱 지속적인 효과가 있음을 보여주었다. G-CSF PEG-접합체의 단일 용량을 사용 시, 동물의 백혈구 세포 함량은 주사 1일 후 최대에 도달했고, 이 수준은 그날 동안 유지되었고, 주사 4일 후에는 백혈구 세포 수준이 기준선 수준으로 감소했다. 미변형 G-CSF의 도입 시, 동물 혈액에 존재하는 백혈구 최대 수준은 주사 1일 후 관찰되었고, 이 백혈구 함량은 빠르게 감소했다.
최종 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. 수득된 접합체의 낮은 비활성(미변형 G-CSF 활성의 68%);
2. 접합체에 미변형 G-CSF의 존재.
본 발명의 목적은 높은 활성, 더욱 장기지속적인 효과, 개선된 안정성, 개선된 약동학적 파라미터, PEG 분자량 및 비활성 파라미터의 최적 조합, 고도의 순도 및 의약용으로의 적합성을 가진, 안정하고 고도로 정제된 신규 PEG화된 G-CSF 접합체, 뿐만 아니라 이 접합체를 기반으로 하는 약학 조성물을 수득하는 것이다.
이 문제는 G-CSF의 활성을 가진 PEG-G-CSF 접합체의 신규 기능적 활성 분자의 제조에 의해 해결되는데, 이때 분자량이 30000 Da인 선형 PEG 분자는 엄격하게 N-말단 아미노산(메티오닌)의 알파 아미노 기를 통한 안정한 결합에 의해 G-CSF 분자와 접합하여 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물을 생산한다:
화학식 (I)
Figure 112013006800697-pct00001
이때, n 은 681 내지 1000의 정수이고; m은 ≥4의 정수이며; NαH-G-CSF는 G-CSF의 활성을 가진 천연 또는 재조합 폴리펩타이드이다.
이와 같이 유도된 접합체에서, 분자량이 30000 내지 40000 Da인 선형 PEG는 G-CSF 분자의 N-말단 아미노산의 알파 아미노기와 접합한다.
알파-아미노 N-말단 아미노산을 통한 G-CSF 변형의 선택성은 하기 화학식 (II)로 표시되는 알데하이드-활성화된 mPEG의 사용과 pH ≤5에서의 PEG화 반응을 통해 달성된다:
화학식 (II)
Figure 112013006800697-pct00002
이때, n은 681 내지 1000의 정수이고; PEG의 분자량은 약 30000 내지 40000 Da이며; m은 ≥4의 정수이다.
PEG 분자량과 특이적 G-CSF 활성의 최적 비는 m≥4인 활성화된 mPEG(II)의 사용을 통해 달성되는데, 이로써 수용체와 본원에서 청구된 접합체의 더욱 효과적인 상호작용이 초래되어 생물학적 활성이 더 높아진다. 저하된 면역원성, 독성 및 개선된 약동학적 파라미터는 부착된 PEG의 분자량을 증가시킴으로써 달성된다. 원형과 비교했을 때 본 발명의 신규 특징은 다음과 같다:
1. 활성화된 mPEG의 알데하이드 유도체(화학식 II)가 본원에서 청구된 PEG-G-CSF의 생산에 사용된다;
2. PEG-G-CSF 접합체의 화학식이 신규하다;
3. PEG-IFN 접합체의 분자량이 PEG의 분자량으로 인해 증가한다;
4. 비활성의 수준이 더 높다;
5. 약동학적 파라미터가 개선된다.
본원에서 청구된 PEG-G-CSF 접합체는 고도로 정제되고 지속적인 효과가 있으며, 높은 생물학적 비활성(미변형 G-CSF의 적어도 84 내지 94%), 단백질 순도 ≥97%, 높은 열안정성, 단백질분해효소 작용에 대한 증가된 내성, 개선된 약동학적 파라미터를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 유효한 양으로 함유하는 본원에서 청구하는 PEG-G-CSF 접합체를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 이 조성물은 또한 약학적 허용성 담체, 완충제(유기산 및 무기산과 이의 염들, 예컨대 구연산염, 석신산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 옥살산염, 젖산염, 아세트산염 완충액), 안정제(당 알코올, 아미노산, 유기 당 또는 당 알코올, 이노시톨, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산의 중합체, 황-환원제, 예컨대 우레아, 글루타치온, 티오글리세롤 등, 저분자량 단백질, 예컨대 사람 혈청 알부민, 면역글로불린을 가진 폴리펩타이드, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 만노스, 자일로스, 프럭토스, 글루코오스와 같은 단당류, 락토스, 말토스, 수크로오스와 같은 이당류, 라피노스와 같은 삼당류, 및 덱스트란과 같은 다당류), 보존제(페놀, 벤질 알코올, 메타크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알칸 할로제나이드, 알킬 파라벤), 산화방지제(메티오닌, 비타민 E, 아스코르브산), 등장제(당 알코올(염화나트륨, 소르비톨, 만니톨, 아라비톨, 자일리톨 등), 비이온성 계면활성제 및 계면활성제(폴리소르베이트, 폴리올, 트윈), 공용매, 충전제(전분), 킬레이트제(예, EDTA)를 포함할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 다양한 형태, 예컨대 동결건조물 또는 액체 제형(주사액, 분무액, 드롭제 등)으로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 청구된 접합체를 기반으로 하는 의약, 특히 호중구감소증 치료용 의약을 포함한다.
청구된 PEG화된 G-CSF, 뿐만 아니라 이를 기반으로 하는 약학 조성물 및 의약 산물은 화학요법 후 발생하는 호중구감소증의 치료, 골수 이식 시에 면역억제 약물의 허용성 개선, AIDS 및 다른 감염을 앓고 있는 면역 상태 환자, 특히 전신 또는 침투성 칸디다증 환자의 호전에 사용될 수 있다.
화학식 (I)의 접합체는 선택적인 약학적 허용성 충전제, 희석제 및/또는 약학적 허용성 부형제와 함께 정맥내, 피하, 근육내 또는 임의의 다른 적합한 수법으로 투여된다. 투여 경로는 예컨대 증상 및 연령, 투여 빈도 및 주사 간격에 따라 달라진다. 질병 및 이의 중증도 또는 투여 목적(치료용 또는 예방용)에 따라, PEG-G-CSF 제제의 유효량은 전술한 요인들에 따라 선택된다.
청구된 접합체 PEG-G-CSF를 수득하기 위해, 고도로 정제된 재조합 사람 G-CSF(필그라스팀, CJSC 제품 "Biocad")가 분자량이 30000 내지 40000 Da인 화학식 (II)의 부티르알데하이드 mPEG 유도체와 함께 사용되었다.
접합 반응은 20℃ 이하의 온도에서 환원제 존재 하에 pH 5.0 이하에서 수행했다. PEG/단백질의 몰 비는 2.5 내지 5/l였다. 반응 과정은 환원 조건 하의 SDS-PAGE 및 RP-HPLC로 모니터했다. 반응 산물(단백질 분자당 PEG 2개 이상의 사슬을 함유하는 PEG-G-CSF의 바람직하지 않은 형태 및 미변형 G-CSF)로부터 양이온교환 크로마토그래피에 의해 모노PEG-G-CSF(분자당 하나의 PEG 사슬을 보유하는 G-CSF)가 정제되었다. 모노PEG-IFN 접합체 용출은 pH 5 이하인 완충 용액 중의 0.05 내지 0.2M 염화나트륨 농도의 선형 구배를 통해 수행했다. 정제된 모노PEG-G-CSF는 pH 4 내지 5의 10 내지 50mM 완충 용액에 대하여 투석하고, 염, 또는 다당류, 또는 알코올, 또는 폴리비닐피롤리돈, 또는 단당류와 아미노당, 또는 단백질 또는 아미노산, 및 비이온성 계면활성제를 첨가하고, 표면에 실리콘처리된 플라스틱 병 또는 유리 병에 4±2℃에서 보관했다.
최종 모노PEG-G-CSF 접합체의 특성을 규명하기 위해, 순도, 균일성, 물리적-화학적, 생물학적 및 약동학적 파라미터를 미변형 G-CSF와 비교하여 조사했다.
본 발명은 다음과 같은 도면에 의해 예증된다:
도 1은 G-CSF PEG화의 동역학이다.
도 2는 PEG-G-CSF 접합체의 역상 고성능 액체 크로마토그램(RP-HPLC)이다.
도 3은 PEG-G-CSF 접합체의 크기 배제 고성능 액체 크로마토그램(SEC-HPLC)이다.
도 4는 PEG-G-CSF 접합체(라인 1) 및 미변형 G-CSF(라인 2)의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 미변형 G-CSF(A)및 PEG-G-CSF 접합체(B)의 MALDI 질량 스펙트럼이다.
도 6은 G-CSF(A) 및 PEG-G-CSF 접합체(B)의 트립신분해 펩타이드들에 대한 질량 스펙트럼을 비교한 것이다.
도 7은 PEG-G-CSF 접합체(녹색선) 및 미변형 G-CSF(적색선)의 +(50±2)℃에서의 열안정성을 나타낸 것이다.
도 8은 PEG-G-CSF 접합체(녹색선) 및 미변형 G-CSF(적색선)의 단백분해 안정성을 나타낸 것이다.
도 9는 PEG-G-CSF 접합체(녹색선) 및 미변형 G-CSF(적색선)의 면역반응성을 나타낸 것이다.
도 10은 PEG-G-CSF 접합체(녹색선) 및 미변형 G-CSF(적색선)의 약동학을 나타낸 것이다.
PEG-G-CSF 생산 방법의 구체적인 성능의 예 및 성질 연구를 이하에 제시한다.
실시예 1
재조합 사람 G- CSF ( rhG - CSF , 필그라스팀 )의 제조
rhG-CSF의 분리 및 정제는 RU 특허 2278870에 기술된 바와 같이 수행했다.
실시예 2
peg화된 rhG - CSF 의 제조
1M 소듐 시아노보로하이드라이드 용액 50ml를, 실시예 1에 따라 제조된 정제된 rhG-CSF 2500mg을 함유하는 완충액(50mM 아세트산나트륨, pH 5.0±0.2) 2300ml에 첨가했다. 이 혼합물을 교반한 뒤, 평균 분자량이 30kDa인 고체 mPEG-ButyrALD(메톡시-PEG-부티르알데하이드) 10g을 첨가했다. 접합 반응 혼합물을 (20± 2)℃에서 22시간 동안 교반했다. 다양한 시간 간격 후, 반응 혼합물로부터 50 ㎕ 샘플을 취하고, 환원 조건 하에 12.5% 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 PEG-G-CSF 접합체 형성의 동역학을 분석했다. 이를 위해, 채취한 샘플에 125mM 트리스-HCl, pH 6.8, 20% 글리세롤, 3% SDS, 15% 2-머캅토에탄올, 0.005% 브롬페놀 블루를 함유하는 완충액 17㎕를 첨가하고, 비등 수조에서 3분 동안 가열했다. 5㎕ 부피의 샘플을 각 웰에 부하했다. SDS-PAGE는 미니 Protean System(BioRad)을 사용하여 수행했다. 겔은 쿠마시 R-250으로 염색했다. G-CSF PEG화의 동역학은 도 1에 제시했다. PEG-G-CSF의 함량이 70%를 초과하는 시기에, 반응 혼합물을 10mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.8±0.2에 3배 희석했다.
실시예 3
모노 PEG -G- CSF 접합체 정제
실시예 2에 따라 제조된 희석된 반응 혼합물을 10mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.8(완충액 A)로 평형화된 CM-세파로스 300ml가 채워진 컬럼에 10ml/min의 유속으로 부하했다. 혼합물을 부하한 후, 컬럼은 완충액 A 1500ml를 이용해 세정하여 미결합 물질을 제거했다. 완충액 A(6000ml) 중의 0 내지 0.2M NaCl 선형 구배를 이용하여 컬럼으로부터 모노PEG-G-CSF를 5ml/min의 유속으로 용출시켰다. 분획(50ml)을 수집하고, 280nm 및 260nm에서 흡광도를 측정했다. 단백질을 함유하는 분획은 RP-HPLC와 SDS-PAGE로 실시예 2에 기술된 바와 같이 분석했다. 모노PEG화된 G-CSF를 95%가 넘는 순도로 함유하는 분획을 모아서, 10 부피의 1.6mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.0±0.2에 대하여 투석했다. 그 다음, 멸균 여과를 수행하고 샘플을 4±2℃에서 보관했다.
실시예 4
역상 고성능 액체 크로마토그래피( RP - HPLC )에 의한 PEG -G- CSF 접합체의 순도 분석
실시예 3에 따라 제조된 정제된 PEG-G-CSF 접합체는 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0으로 단백질 농도가 0.3mg/ml가 되게 희석했다. 분석용 RP HPLC는 C4 Symmetry 컬럼(4.6cm x 150mm)에서의 구배 워터스 'Breeze' 크로마토그래프를 이용하여 214nm에서 UV 검출하여 수행했다. 수득한 샘플 100㎕를 컬럼에 주입했다. RP_HPLC(도 2)에 의해 모노 PEG-G-CSF는 컬럼으로부터 단일 대칭 피크로 용출되고, 주요 UV 흡수 피크 전과 후에 용출되는 불순물이 소량뿐인 것으로부터 판단했을 때 고 순도인 것으로 관찰되었다(도 2). 불순물은 주 피크에서 용출되는 물질의 1.15% 미만이었다. 따라서, 제시된 데이터로부터 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 순도는 RP-HPLC에 따라 ≥98%인 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 5
고성능 크기배제 크로마토그래피( SEC - HPLC )에 의한 PEG -G- CSF 접합체의 순도 분석
실시예 3에 따라 제조된 정제된 PEG-G-CSF 접합체는 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0으로 단백질 농도가 0.3mg/ml가 되게 희석했다. 분석용 SEC HPLC는 TSK G3000SWX 컬럼(30cm x 7.8mm)상의 워터스 'Breeze' 크로마토그래프를 이용하여 214nm에서 UV 검출하여 수행했다. 수득한 샘플 100㎕를 컬럼에 주입했다. SEC-HPLC 결과는 도 3에 제시했다. 특이한 하나의 대칭 피크로서 컬럼으로부터 용출된 PEG-G-CSF 샘플은 98.47%인 것으로 확인된다. 도 3에 제시된 결과로부터, 청구된 PEG-G-CSF 접합체가 자유 변형된 G-CSF를 함유하지 않는다는 것을 알 수 있다. 청구된 접합체 중의 고분자량 응집체의 함량은 1.53%를 초과하지 않는다. SEC HPLC에 따른 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 순도는 98%가 넘는다.
실시예 6
PEG -G- CSF 접합체에 존재하는 내독소 수준의 측정
실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF 접합체 샘플 중의 세균 내독소(BE)의 함량은 FFS 42-0002-00의 요건에 따라 투구게 아메바양 용해물(LAL) 방법(겔 응고 시험의 변형)을 사용하여 시험관내에서 측정했다. 다 성분 진단 키트 <<Associates of CAPE COD, Inc.>>, LAL-시약 PYROTELL® (민감도 0.03 EU/ml), 내독소 참조 표준물(CSE, 0.5mg 바이엘) 및 LAL-시험용 물을 사용했다. 표 1에 제시된 결과는 PEG-G-CSF 접합체 샘플 중의 BE 함량이 단백질 mg당 3EU(내독소 단위) 미만이고, 이는 재조합 단백질을 기반으로 하는 약물에서 허용되는 BE 수준보다 훨씬 낮은 것이다.
PEG-G-CSF 접합체 중의 세균 내독소 함량
PEG-G-CSF 접합체 세균 내독소 함량(EU/mg 단백질)
실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF ≤3.0
실시예 7
SDS - PAGE 에 의한 PEG -G- CSF 접합체의 순도 분석
실시예 3에 따라 제조된 정제된 PEG-G-CSF 접합체 샘플은 실시예 2에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석했다. PEG-G-CSF 및 미변형 G-CSF를 모두 40㎍ 함유하는 샘플을 각 웰에 부하했다. 겔은 쿠마시 R-250으로 염색했다. 도 4는 PEG-G-CSF의 SDS-PAGE 프로필(라인 1) 및 미변형 G-CSF의 SDS-PAGE 프로필(라인 2)을 도시한 것이다. 정제된 PEG-G-CSF는 겉보기 분자량이 미변형 G-CSF보다 높은 단일 확산 밴드로서 나타났다. PEG화된 단백질의 정확한 분자량 값은, 단백질에 대한 친수성 PEG 분자의 접합이 PEG화된 단백질의 스토크스(Stokes) 반경을 증가시키기 때문에 SDS-PAGE로 측정할 수 없음을 유념해야 한다. 결과적으로, 겔에서 PEG-단백질 복합체의 전기영동성 이동성은 감속되어, 그 분자량 값은 미변형 단백질 및 PEG 분자량 합계보다 훨씬 높다.
실시예 8
미변형 G- CSF 대비, PEG -G- CSF 접합체의 질량분광분석적 분자량 측정
MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption time-of-fight mass spectrometry)를 사용하여 PEG-G-CSF의 참 분자량을 측정했다. MALDI TOF MS는 UV 레이저(Nd)가 장착된 Ultraflex II(Bruker Daltonics) 질량분석계로 수행했다. 실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF 접합체 샘플 1㎕ 및 2,5-디하이드록시벤조산 용액(Aldrich, 0.5% TFA를 함유한 20% 아세토니트릴 수용액 중에 10mg x ml-1) 0.3㎕를 혼합하고 공기 중에서 건조했다. 동일한 방식으로 미변형 G-CSF 샘플을 제조했다.
질량 스펙트럼은 포지티브 모드 MS 스펙트럼에서 수득했고, 평균 질량 오차는 10 내지 15 Da를 초과하지 않는다.
m/z 10000 내지 50000 범위에서 PEG-접합된 G-CSF 및 미변형 G-CSF의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 도 5에 제시했다.
도 5A는 G-CSF의 질량 스펙트럼이 분자량이 18,816 Da인 단일 하전성 이온[M]+에 해당하는 주 피크를 함유한다는 것을 보여준다.
도 5B에 제시된 PEG-G-CSF 접합체의 질량 스펙트럼에서, 분자량 중심이 약 49,600 Da 주위인 광범한 스펙트럼 피크가 존재한다. 광범한 스펙트럼은 PEG 중합체 종의 불균일한 집단 때문이다.
G-CSF(19,295Da) 및 PEG(30,000Da)의 분자량을 감안하여 볼 때, 수득된 접합체의 분자량(49,600)은 각 분자의 계산된 질량 합과 매우 일치하는 것이다.
실시예 9
PEG -G- CSF 접합체 중의 PEG 화 부위 측정
15 mcg x ml-1 농도로 0.05M NH4HCO3 중에 용해된 변형 트립신(Promega) 용액 5㎕를 실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF 접합체 프로브 5㎕에 첨가했다. 가수분해는 온도 37℃에서 16h 동안 수행한 뒤, 이 용액에 10% 아세토니트릴 수용액 중의 0.5% TFA 10㎕를 첨가하고 충분히 혼합했다. 동일한 방식으로 미변형 G-CSF 샘플도 제조했다. 이 트립신 분해물을 MALDI-MS로 분석했다.
G-CSF 분자와 PEG 접합되는 부위는 PEG-G-CSF 접합체와 미변형 G-CSF의 트립신분해 펩타이드의 질량 스펙트럼을 비교하여 측정했다. PEG-G-CSF 접합체의 트립신 분해 시, 변형이 일어난 단백질 부분에 해당하는 펩타이드는 없어야 한다. 표 2에는 미변형 G-CSF와 PEG-G-CSF 접합체의 실험적 트립신분해 펩타이드들의 질량 스펙트럼이 제시된다. 이 표는 미변형 G-CSF의 트립신분해 펩타이드의 질량 스펙트럼이 PEG-G-CSF 접합체의 것과 거의 일치한다는 것을 보여준다(표 2). 하지만, PEG-G-CSF 접합체의 트립신분해물에는 미변형 G-CSF의 트립신분해물에 존재하는 분자량 1432.7의 펩타이드가 없다. 미변형 G-CSF와 PEG-G-CSF 접합체의 트립신분해 펩타이드들로부터 실험적으로 수득된 질량 스펙트럼은 도 6에 제시했고, 이 도면은 PEG-G-CSF 접합체의 트립신분해물에 분자량이 1432.7인 펩타이드가 존재하지 않음을 보여준다. G-CSF의 트립신분해 펩타이드의 이론적 질량 분석에 따르면, m/z 1432.7에서의 피크는 단백질의 N-말단 펩타이드에 해당한다(표 2). PEG-G-CSF 접합체의 트립신 분해물에 이 피크의 부재는 PEG의 중량에 의해 더 무거워지게 된 N-말단 펩타이드의 변형에 부합하는 것으로, 조사된 스페트럼의 영역을 벗어난 것이다. G-CSF 분자와 PEG의 접합은 이 펩타이드에 존재하는 유일한 자유 아미노 기인 N-말단 메티오닌의 아미노 기에서 일어났다.
이론적 값과 비교한, PEG-G-CSF 접합체와 미변형 G-CSF의 트립신분해 펩타이드들의 실험적 질량 스펙트럼
실험적 펩타이드의 m/z 이론적 펩타이드
G-CSF PEG-G-CSF 질량 펩타이드 서열
1432.7 - 1432.75 1-14 MTPLGPASSLPQSF
747.4 747.4 747.36 18-23 CLEQVR
1129.6 1129.6 1129.61 20-29 EQVRKIQGDG
1359.7 1359.7 1359.75 42-53 LCHPEELVLLGH
2527.3 2527.3 2527.30 54-78 SLGIPWAPLSSCPSQ
953.6 953.6 952.56 55-63 LGIPWAPLS
818.4 818.4 817.41 61-68 PLSSCPSQ
2033.1 2033.1 2033.10 72-90 LAGCLSQLHSGLFL
2104.1 2104.1 2104.14 75-93 CLSQLHSGLFLYQG
1241.7 1241.7 1241.68 158-167 LQSFLEVSYR
실시예 10
미변형 rhG - CSF 대비, PEG -G- CSF 특이적 접합체의 비활성의 측정
실시예 3에 따라 제조하고 0.2ng/ml 농도의 RPMI 배지로 희석한 PEG-G-CSF 접합체 및 시험할 샘플의 연속 희석물을 분석 매질로 제조했다. 미변형 G-CSF 및 G-CSF 활성의 국제 참조 표준물(1-st International Standard 88/502, 과립구 콜로니 자극 인자, 사람, rDNA-유래, 10000 IU/amp)의 연속 희석물을 나란히 분석했다. 희석한 단백질 샘플 100㎕를 평저형 96웰 조직배양판의 시험 웰에 첨가했다. 생물분석을 위해, M-NFS 세포를 세척하고 RPMI 배지에 1.5x105/ml의 농도로 재현탁시켰다. 100㎕의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하고 5% CO2 조직배양 항온배양기에서 50hr 동안 37℃하에 배양했다. 그 다음, 각 웰에 염료 Alamar Blue(또는 이의 유사물, 예컨대 MTT)를 20㎕ 첨가하고 평판을 동일한 조건 하에 14시간 동안 배양했다.
세포 수의 증가는 미량평판 판독기를 사용하여 545nm 및 630nm의 파장에서 광학 밀도의 증가를 통해 측정했다. 시험한 샘플의 특이적 생물학적 활성(B0) (IU/mg)은 다음 식을 사용하여 계산했다:
B0 = A0 / C
여기서, B0 - PEG-G-CSF 또는 G-CSF의 생물학적 비활성(IU/mg);
A0 - PEG-G-CSF 또는 G-CSF의 생물학적 활성(IU/mg);
C - PEG-G-CSF 또는 G-CSF 용액 중의 단백질 함량(mg/ml).
PEG-G-CSF 및 미변형 G-CSF의 비활성
제조물 비활성(IU/mg)
실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF 접합체 (0.845 ± 0.091) x 108
미변형 G-CSF (1.00 ± 0.081) x 108
실시예 11
미변형 G- CSF 대비, PEG -G- CSF 의 열안정성 분석
실시예 3에 따라 제조되고, 140mM NaCl을 함유하는 5mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.0으로 단백질 농도 0.28mg/ml 이하로 희석한 PEG-G-CSF 접합체 샘플을 (50±2)℃ 온도의 수조에 넣고, 다양한 시간 간격마다 단백질 용액의 혼탁도를 340nm에서 흡광도를 측정하여 조사했다. 이와 마찬가지로, 미변형 G-CSF의 열안정성 조사를 수행했다. (50±2)℃ 온도에서의 단백질의 항온처리는 불용성 응집물을 형성시키고, 이는 340nm에서 용액의 광학밀도 분석에 의해 측정될 수 있는, 단백질 용액의 혼탁도를 증가시킬 수 있다. 도 7은 본 조사의 결과를 도시한 것으로, 미변형 G-CSF 제조물의 혼탁도가 항온처리 시간에 따라 증가하는 반면, PEG-G-CSF 제조물은 전 관찰 기간 동안 안정한 상태를 유지했다. 이 데이터는 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 열안정성이 미변형 G-CSF의 열안정성보다 훨씬 높다는 것을 시사한다.
실시예 12
미변형 G- CSF 대비, PEG -G- CSF 의 단백분해 안정성
실시예 3에 따라 제조한 PEG-G-CSF 접합체 샘플을 0.6mg/ml 농도로 희석하고, 최종 샘플 850㎕에 1M Tris-HCl(pH 8.5) 150㎕를 첨가하여 샘플의 최종 pH는 7.4였다. 그 다음, 0.5M CaCl2 2㎕를 1mM의 최종 농도로 첨가하고, 교반한 뒤, 트립신(Promega, Gold) 15㎕를 0.02㎍/ml의 최종 농도로 첨가했다. 이와 마찬가지로, 미변형 G-CSF를 함유하는 샘플도 제조했다. 이 샘플들을 37℃에서 항온처리했다. 60분마다 부샘플(100㎕)을 취하고, 트립신 반응을 정지시키기 위해 10% SDS를 20㎕ 첨가하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE를 수행했다. 전기영동 후 겔은 Coomassie-R-250으로 염색하고, 염색된 겔의 농도측정 분석을 수행했다. 주 밴드의 면적은 컴퓨터 프로그램 GelPro Analyser로 측정했다. 초기 샘플(트립신 처리 전)의 주 밴드의 면적을 100%로 간주했다. 도 8은 PEG-G-CSF 접합체 및 G-CSF의 트립신 처리에 대한 민감도 데이터를 제시한 것이다. 이로부터 분명한 것은, 트립신 처리 시간이 증가할수록, PEG-G-CSF 및 G-CSF의 함량은 감소하지만, 청구된 PEG-G-CSF 접합체는 미변형 G-CSF에 비해 트립신 작용에 더욱 내성적이라는 것이다.
실시예 13
미변형 G- CSF 대비 PEG -G- CSF 접합체의 면역반응성
청구된 PEG-G-CSF 접합체의 면역반응성은 ProCon G-CSF("Protein contour" LLC) 시약 세트를 사용하는 변형 ELISA 분석에 의한 항체 결합 활성으로 측정했다. 실시예 3에 따라 제조된 PEG-G-CSF 접합체는 140mM NaCl과 1% 소혈청 알부민을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에 1mkg/ml 농도로 희석했다. 그 다음, 수득되는 샘플 100㎕를 사전에 G-CSF에 대한 모노클로널 항체로 코팅시킨 둔 미량역가 평판의 웰에 첨가했다. 37℃(60min)에서 항온처리 후, 비오틴으로 표지화된, 각각의 에피토프에 대한 모노클로널 항체를 웰에 첨가했다. 수득되는 면역 복합체는 양고추냉이 퍼옥시다제에 의해 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출했다. 웰에서 발색 반응을 일으키기 위해, 0.05M TB(pH 7.2) 중의 0.1% H2O2와 기질 용액(200㎍/ml 테트라메틸벤지딘(Sigma)) 100㎕를 첨가하고 청색이 발현될 때까지 항온처리했다. 이 반응은 2M 황산 용액 50㎕를 웰에 첨가하여 정지시켰다. 결과는 미량평판 판독기 <<Multiscan>> EX에서 405nm 파장으로 흡광도를 측정하여 고려했다. 이와 마찬가지로, 미변형된 G-CSF의 면역반응성도 조사했다. 미변형된 G-CSF와 면역글로불린의 상호작용을 100%로 간주했다. 도 9에 제시된 결과로부터, 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 면역반응성이 미변형 G-CSF의 면역반응성의 25%인 것을 알 수 있다.
실시예 14
보관 동안 PEG -G- CSF 접합체 안정성의 측정
실시예 3에 따라 제조한 샘플을 1.6mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.0±0.2) 중에 1mg/ml로 희석했다. 희석한 샘플로부터 일정량을 취해서 "에펜도르프"형의 뚜껑이 있는 멸균 튜브에 담았다. 온도 (6±2)℃에서 보관했다. PEG-G-CSF 접합체의 비활성 및 균일성은 여러 보관 시간 간격마다 측정했다. PEG-G-CSF의 균일성은 실시예 1과 실시예 5에 각각 기술된 바와 같이 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC로 분석했다. 표 4는 PEG-G-CSF 접합체가 온도 (6±2)℃에서 보관되었을 때 적어도 24개월 동안 안정하다는 것을 보여준다.
(6±2)℃에서 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 안정성
파라미터 보관수명(개월)
0 6 12 18 24
활성(IU/mg) (0.84±0.09) x108 (0.75±0.15) x108 (0.9±0.10) x108 (0.80±0.15) x108 (0.86±0.07) x108
HPLC GF에 의한 균일성(%) >95 >95 >95 >95 >95
PAGE 중 EF에 의한 균일성(%) >98 >98 >98 >98 >98
실시예 15
PEG -G- CSF 접합체의 약동학 분석
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN 접합체 5㎍ 샘플을 ICR 계열의 수컷 마우스(20g)에게 복강내로 주사했다. 이와 나란히, 다른 그룹의 마우스에게는 미변형 G-CSF를 주사했다. 혈청 샘플은 주사 후 다른 시간에 안구뒤 천자에 의해 채취했다. 혈액 혈청은 표준 방법으로 수득했다.
천연 또는 모노PEG화된 G-CSF 중 어느 하나를 측정하기 위한 혈청 샘플은 사람 G-CSF의 여러 에피토프에 대한 마우스 모노클로널 면역글로불린을 사용하는 ELISA 분석에 사용했다.
미량역가 평판의 웰은 G-CSF에 대한 모노클로널 항체로 코팅했다(20mM Tris-HCl 완충액(TB)(pH 9.0) 100㎕ 중의 250 ng/웰). 4℃에서 밤새 항온처리 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.05% Tween-20을 함유하는 TB(pH 7.4) 200㎕를 웰에 첨가하여 비특이적 결합 부위를 차단했다. 그 다음, 1% BSA와 0.05% Tween-20을 1:2, 1:4 및 1:8의 비율로 함유하는 TB로 희석한, 분석된 혈청 100㎕를 웰에 첨가했다. 이와 나란히 표준 교정 곡선을 작도하기 위해, 1% BSA와 0.05% Tween-20을 함유하는 TB 완충액에 공지된 농도 범위 25ng/ml 내지 600ng/ml의 PEG-G-CSF 샘플을 웰에 첨가했다. 37℃에서 1hr 동안 항온처리 후, 비오틴화된 항 사람 G-CSF 모노클로널 항체와 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체를 웰에 연속해서 첨가했다. 항온처리하고 세척하여 결합되지 않은 효소를 전부 제거한 후, 기질 용액(0.015% 과산화수소와 0.2mg/ml 테트라메틸벤지딘을 함유하는 100mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0) 100㎕를 첨가하여 발색 반응 산물을 유도했다. 이 반응은 2M H2SO4를 첨가하여 정지시켰다. 광학 밀도는 미량평판 판독기에서 450nm에서 측정했다. 혈청에 존재하는 G-CSF의 농도는 교정 곡선을 사용하고 조사된 혈청의 희석률을 감안하여 측정했다.
공지된 천연 G-CSF 농도(1% BSA와 0.05% Tween-20을 함유하는 완충액 TB 중에 6.25 ng/ml 내지 200 ng/ml 범위)로 작도한 교정 곡선을, 미변형된 G-CSF 약동학 분석에 사용했다.
청구된 PEG-G-CSF 약동학의 결과는 미변형 G-CSF와 비교하여 도 10에 제시했다. 이 결과들로부터, 청구된 PEG-G-CSF 접합체가 유의적인 지속 효과가 있다는 것이 된다. 미변형된 G-CSF의 투여 시, 동물 혈액에 존재하는 이 G-CSF의 농도는 주사 후 1h째 최대에 이르렀고 그 다음 빠르게 감소했다. PEG-IFN 접합체 투여 시에는, 동물 혈액내 G-CSF의 최대 함량이 6시간 후 관찰되었고(도 10), 그 다음 혈액 내 G-CSF의 느린 감소가 140시간 동안 관찰되었다. 이 결과(도 10)를 기반으로 하여, 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 주요 약동학 파라미터를 계산했다. 그 결과는 주사 부위로부터의 흡수, 분포 용적, PEG-G-CSF 접합체의 제거율이 미변형된 G-CSF에 비해 훨씬 느렸고, 그 결과 청구된 PEG-G-CSF 접합체가 혈액에서 장기간 순환(140시간 초과)된다는 것을 보여주었다.
실시예 16
청구된 PEG -G- CSF 접합체와 원형( prototype ) 방법에서 설명된 바와 같은 PEG-G-CSF 접합체의 특성 비교
원형 방법에서 기술된 바와 같은 PEG-G-CSF 접합체와 실시예 3에 따라 수득한 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 구조, 기본 이화학적 파라미터 및 약동학 파라미터를 비교했다(표 5). 표 5에 제시된 데이터는 원형 방법의 접합체에 비해 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 성질들이 유의적으로 향상된 것을 보여준다.
원형 방법(US 특허 5,824,784)에 기술된 바와 같은 PEG-G-CSF 접합체 대비, 청구된 PEG-G-CSF 접합체의 주요 이화학적 및 약동학적 파라미터
파라미터
 PEG-G-CSF 접합체
청구된 PEG-G-CSF 접합체 원형 방법에 기술된 접합체(US 특허 5,824,784)
G-CSF 필그라스팀 필그라스팀
PEG 구조 선형 선형
PEG 분자량(kDa) 30-40 6-25
PEG-G-CSF 접합체 구조식*
Figure 112013006800697-pct00003
Figure 112013006800697-pct00004
미변형 G-CSF의 비활성 % 84-94 68
PAGE에 따른 순도(%) 100 **
HPCL에 의한 순도 결과(%) >98 **
GF HPLC에 의한 순도 결과(%) >98 **
세균 내독소 함량(EU/mg) <3 **
약동학 파라미터
PEG-G-CSF/G-CSF의 AUC 비 18 **
* - <<WHO Drug Information>>, 2,002, v.16, N.1, 101, List 47에 제시된 원형 방법에 의해 수득된 PEG-G-CSF 접합체 구조식.
** - 데이터 없음.
실시예 17
피하 주사 용액 0.6 mg / ml , 1.0 mg / ml , 2.0 mg / ml , 3.0 mg / ml
피하 주사용 용액은 활성 성분으로서 PEG화된 재조합 과립구 콜로니 자극 사람 인자(PEG-G-CSF)와 추가 약학적 허용성 성분을 다음과 같은 비율로 함유하는 의약으로서 사용했다:
활성 성분: PEG화된 재조합 과립구 콜로니-자극 사람 인자(PEG-G-CSF), - 0.6 내지 3.0mg
부형제:
폴리소르베이트 20 - 0.04mg
만니톨 - 50mg
아세트산나트륨 3수화물 - 0.23mg
빙초산 pH 4.0 이하
주사용 물 - 최고 1ml.
실시예 18
실시예 3에 따라 수득한 PEG -G- CSF 를 함유하는 수용액과 같은 최종 산물의 포장
주사기 플런저로 막힌, 보호 캡이 씌워진, 땜납 바늘을 구비한 가수분해성 클래스 I의 중성 유리로 만들어진 주사기에 포장되거나,
알루미늄 캡이 씌워진 부틸러버(butilrubber) 마개 또는 테플론-코팅된 플루오로고무로 막힌 가수분해성 클래스 I의 중성 유리로 만들어진 바이엘에 포장됨.
실시예 19
활성 성분으로서, 실시예 3에 따라 수득된 PEG -G- CSF 를 함유하는 수용액과 같은 의약을 함유하는 세트
보드판 패키지에 담긴 사용지침서와 함께 중합체 필름으로 만들어진 콘투어 셀룰라(contour cellular) 포장재 중에 피스톤으로 완전해진 주사기 1개를 함유하는 세트, 또는
보드판 패키지에 담긴, 사용지침서와 함께 중합체 필름으로 만들어진 콘투어 블리스터(contour blister) 중에 바이엘 1개를 함유하는 세트.

Claims (17)

  1. 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 접합 위치가 사람 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 N-말단 메티오닌이고, 하기 화학식 (I)로 표시되는, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜과 사람 과립구 콜로니 자극 인자의 접합체로서,
    화학식 (I)
    Figure 112014116740277-pct00005

    화학식 (I)에서, n 은 681 내지 1000의 정수이고; m은 정수 4이며; NαH-G-CSF는 G-CSF의 활성을 가진 천연 또는 재조합 폴리펩타이드이고,
    상기 접합체는 미변형 G-CSF의 적어도 84%의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜과 사람 과립구 콜로니 자극 인자의 접합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 평균분자량이 30 내지 40 kDa인 접합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 30kDa인 접합체.
  4. 유효량의 접합체와 약학적 허용성 부형제를 함유하되, 상기 접합체는
    모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 접합 위치가 사람 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 N-말단 메티오닌이고, 하기 화학식 (I)로 표시되는, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜과 사람 과립구 콜로니 자극 인자의 접합체로서,
    화학식 (I)
    Figure 112015040968445-pct00017

    화학식 (I)에서, n 은 681 내지 1000의 정수이고; m은 정수 4이며; NαH-G-CSF는 G-CSF의 활성을 가진 천연 또는 재조합 폴리펩타이드이고,
    또한, 상기 접합체는 미변형 G-CSF의 적어도 84%의 활성을 가지는 것임을 특징으로 하는, 다양한 기원의 호중구감소증 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 유효량의 접합체와 함께, 폴리소르베이트, 만니톨, 아세트산나트륨 3수화물, 아세트산 및 최고 1ml까지의 주사용 물을 함유하는 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, pH 값이 3 내지 5인 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, pH 값이 4인 약학 조성물.
  8. 제 1 항에 따른 화학식 (I)의 접합체를 포함하는, 다양한 기원의 호중구감소증 치료용 의약 제제(medicinal agent).
  9. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물을 함유하는, 멸균 환경에서 밀봉된 용기.
  10. 제 9 항에 있어서, 용기가 사전 충전된 주사기, 바이엘 또는 자동주입기(autoinjector)인 용기.
  11. 제 10 항에 기재된 용기 및 처방 정보를 포함하는 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
KR1020137001860A 2010-08-13 2011-07-19 폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(g-csf)의 신규 접합체 KR101549457B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010133875/10A RU2446173C1 (ru) 2010-08-13 2010-08-13 Новый функционально активный, высокоочищенный стабильный конъюгат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) с полиэтиленгликолем с пролонгированным биологическим действием, пригодный для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе
RU2010133875 2010-08-13
PCT/RU2011/000532 WO2012021088A1 (en) 2010-08-13 2011-07-19 A novel conjugate of granulocyte colony-stimulating factor (g-csf) with polyethylene glycol

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130043167A KR20130043167A (ko) 2013-04-29
KR101549457B1 true KR101549457B1 (ko) 2015-09-02

Family

ID=45567857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137001860A KR101549457B1 (ko) 2010-08-13 2011-07-19 폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(g-csf)의 신규 접합체

Country Status (17)

Country Link
KR (1) KR101549457B1 (ko)
CN (1) CN103140499B (ko)
CL (1) CL2013000400A1 (ko)
CO (1) CO6670557A2 (ko)
CR (1) CR20130020A (ko)
CU (1) CU24139B1 (ko)
DO (1) DOP2013000003A (ko)
EA (1) EA019043B1 (ko)
EC (1) ECSP13012399A (ko)
MA (1) MA34525B1 (ko)
MY (1) MY160732A (ko)
NI (1) NI201300007A (ko)
PE (1) PE20131085A1 (ko)
RS (1) RS20130094A1 (ko)
RU (1) RU2446173C1 (ko)
SG (1) SG187572A1 (ko)
WO (1) WO2012021088A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012110057A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Chemisches Institut Schaefer Ag Cefuroxime safety kit
RU2650962C2 (ru) 2012-06-07 2018-04-18 Чилдрен'З Хоспитал Лос Анджелес Способы лечения нейтропении с применением ретиноидных агонистов
CN103908427B (zh) * 2013-01-05 2014-12-17 石药集团百克(山东)生物制药有限公司 一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液及其制备方法
RU2535002C2 (ru) * 2013-04-04 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Средство коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием
EP3107533A4 (en) 2014-02-18 2017-10-18 Children's Hospital Los Angeles Compositions and methods for treating neutropenia
PE20220371A1 (es) 2014-07-14 2022-03-16 Gennova Biopharmaceuticals Ltd PROCEDIMIENTO NOVEDOSO PARA LA PURIFICACION DE rHU-GCSF
IL247369B (en) * 2016-08-18 2018-08-30 B G Negev Tech And Applications Ltd Polypeptides derived from CSF-m and their uses
KR102020995B1 (ko) * 2017-10-30 2019-09-16 한국코러스 주식회사 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법
CN115297844A (zh) * 2020-03-17 2022-11-04 德拉格雷丘尔公司 用于吸入的gm-csf的液体制剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080025964A1 (en) * 2006-06-23 2008-01-31 Quintessence Biosciences, Inc. Modified ribonucleases

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
KR20040083268A (ko) * 2003-03-21 2004-10-01 한미약품 주식회사 안정성이 증가된 인간 과립구 콜로니 자극인자 융합체 및이의 제조방법
RU2278870C2 (ru) * 2004-08-30 2006-06-27 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе
ES2397712T3 (es) * 2006-01-18 2013-03-08 Qps, Llc Composiciones farmacéuticas con estabilidad reforzada

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080025964A1 (en) * 2006-06-23 2008-01-31 Quintessence Biosciences, Inc. Modified ribonucleases

Also Published As

Publication number Publication date
CN103140499A (zh) 2013-06-05
EA019043B1 (ru) 2013-12-30
EA201101035A1 (ru) 2012-02-28
PE20131085A1 (es) 2013-10-10
MA34525B1 (fr) 2013-09-02
CR20130020A (es) 2013-02-20
RS20130094A1 (en) 2013-08-30
CN103140499B (zh) 2014-12-17
WO2012021088A1 (en) 2012-02-16
DOP2013000003A (es) 2013-07-31
RU2446173C1 (ru) 2012-03-27
CL2013000400A1 (es) 2013-07-26
CO6670557A2 (es) 2013-05-15
SG187572A1 (en) 2013-03-28
NI201300007A (es) 2014-05-26
KR20130043167A (ko) 2013-04-29
ECSP13012399A (es) 2013-05-31
CU20130012A7 (es) 2013-04-19
MY160732A (en) 2017-03-15
CU24139B1 (es) 2015-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101549457B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜과 과립구 콜로니 자극인자(g-csf)의 신규 접합체
TWI364295B (en) Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
JP3177251B2 (ja) Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法
CN1729018B (zh) G-csf偶联物
EP2049566B1 (en) G-csf site-specific mono-conjugates
JP5334347B2 (ja) 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法
ES2389183T3 (es) Conjugados de polietilenglicol de interferón-beta-1b con potencia biológica in vitro potenciada
KR101586372B1 (ko) 하나의 위치 이성질체로 표시되는 인터페론 알파와 폴리에틸렌글리콜의 안정한 신규 접합체
JP2008535793A (ja) ジポリマー・タンパク質コンジュゲートおよびその調製方法
JP2001064300A (ja) エリスロポエチン誘導体
KR101079993B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
US20110280826A1 (en) Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof
US20070031368A1 (en) Chemokine conjugates
WO2007009208A1 (en) Poly(ethylene glocol) modified human gm-csf with increased biological activity
EP1793859B1 (en) Treatment of oral and intestinal mucositis by administering human il-18
EP1834963A1 (en) Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
WO2011041376A1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
TW201703793A (zh) 聚乙二醇化介白素-11之組合物及方法
RU2664588C2 (ru) Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе
AU2016277147A1 (en) Pegylated granulocyte colony stimulating factor (GCSF)
RU2576372C2 (ru) МОЛЕКУЛА ИНТЕРФЕРОНА-β-1а ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЯМИ, С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, УЛУЧШЕННЫМИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИМИ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИМИ ПАРАМЕТРАМИ, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee