AT521556A1 - Vitamin D bindendes Protein - Google Patents

Abstract

Gegenstand ist ein Vitamin D bindendes Protein, das herstellbar ist durch Umsetzung des Gc-Proteins oder des GcMAF-Proteins oder des Gc-Halo-proteins mit UDP-N-Acetylgalactosamin in Anwesenheit von N-Acetyl-galactosamin- Transferase. Dieses Protein hat wesentlich mehr N-Acetylgalactosamin- Reste gebunden als herkömmliches Gc-MAF, was sich bei der Verwendung als Arzneimittel als vorteilhaft erweist, insbesondere bei der Aktivierung der Phagozytose von isolierten Blutmakrophagen. Durch Bindung an Calciol wird die Wirkung nochmals verbessert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vitamin D-bindendes Protein.

Vitamin D-bindende Proteine und deren vorteilhafte Wirkungen sind bekannt, siehe z.B. Narasimha Swarmy et al: BaculovirusExpressed Vitamin D-Binding Protein-Marcophage Activating Factor (DBP-MAF) Activates Osteoclasts and Binding of 25-Hydrosyvitamin D3 Does not Influence This Activity, Journal of Cellular

Biochemistry 81:535-546(2001).

Für das Vitamin D-bindende Protein ist die Abkürzung Gc üblich (Group specific component). Es gibt mehrere Varianten davon, wobei Gc1 und Gc2 die wichtigsten sind. Diese unterscheiden sich lediglich in vier Aminosäuren. Die genaue Sequenz ist in Fig. 1 der oben zitierten Arbeit von Narasimha Swarmy et al.

dargestellt.

Gc hat im Bereich der Aminosäuren 416-420 eine Verknüpfung mit

N-Acetylgalactosamin, an dem entweder nur ein Galactosyl-Rest hängt oder zusätzlich noch Sialinsäure oder Mannose.

Wenn man die Zuckerreste abspaltet, erhält man Gc-MAF. (MAF steht für Macrophagen aktivierender Faktor.) Dies kann in vitro durchgeführt werden, indem man Gc mit ß-Galctosidase, α-Mannosidase und Sialidase reagieren lässt und auf diese Weise

Gc-MAF erhält.

Aus der oben zitierten Arbeit von Narasimha Swarmy et al geht hervor, dass bei Gc-MAF das N-Acetylgalactosamin bezüglich der Aktivierung von Osteoclasten entscheidend ist (Seite 540, re. Sp., letzter vollständiger Absatz sowie letzter Absatz (vor REFERENCES)). Weiters geht hervor, dass eine Bindung von GcMAF an 25-OH-D3 (also Calcidiol) die Aktivierung von Osteoclasten nicht verbessert.

In WO 2017/181213 wurde die Wirkung von GcMAF gebunden an

Calciol (auch Cholicalciferol genannt) und von GcMAF gebunden an Calcitriol verglichen und festgestellt, dass GcMAF gebunden an Calciol überlegen ist, wogegen GcMAF gebunden an Calciotriol nur etwa gleich wirksam ist wie GcMAF allein. Letzteres deckt sich / 20 mit der Feststellung von Narasimha Swarmy et al. bezüglich

Calcidiol, allerdings wurde in der WO 2017/181213 die

Aktivierung der Phagozytose getestet.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Vitamin Dbindende Protein so zu modifizieren, dass seine Wirkung noch weiter gesteigert wird.

Diese Aufgabe wird durch ein Vitamin D-bindendes Protein gelöst, das herstellbar ist durch Umsetzung des Gc-Proteins oder des GcMAF-Proteins oder des Gc-Halo-proteins mit UDP-N-Acetylgalactosamin in Anwesenheit von N-Acetyl-galactosaminTransferase. Auf diese Weise ist nicht nur - wie bekannt - an einer Stelle des Proteins (nämlich im Bereich der Proteine 416420) eine N-Acetyl-galactosamin-Gruppe vorhanden, sondern an mehreren Stellen. Es kommt dabei nicht darauf an, ob von einem

Gc-Protein, einem Gc-MAF-Protein oder einem Gc-Halo-protein ausgegangen wird, denn im Endprodukt ist dann höchstens ein

N-Acetyl-galactosamin durch Zuckerreste inaktiviert bzw. es fehlt höchstens ein N-Acetyl-galactosamin (nämlich das im Bereich der Aminosäuren 416-420, falls dort zufällig keine Reaktion stattfinden sollte).

Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass zusätzliche

Glykosilierungen mit N-Acetylgalactosamin, die vermutlich an

Serinen und Threoninen am Gc-Protein erfolgen, eine höhere Aktivität bewirken verglichen mit Gc und GcMAF, nicht nur bei

Makrophagen, sondern nun zusätzlich auch bei weiteren

Immunzellen, wie Lymphozyten (CD4, CD8), dendritischen Zellen etc. Daher wird diese neue Verbindung im Folgenden PolyNAc-IAF (Poly-N-Acetly-galactosamin-Immunaktivierender Faktor) genannt.

Diese neue derivatisierte Form des Gc-Proteins besitzt auch apoptotische Aktivitäten in Tumorzellen über die Caspase 3, 9 und Cytochrom C Ausschüttung.

Obwohl dies auf Grund der Arbeit von Narasimha Swarmy et al.

nicht zu vermuten war, hat sich herausgestellt, dass die Wirkung / 20 von PolyNAc-IAF gesteigert wird, wenn es an ein Vitamin D3, insbesondere an Calciol, gebunden ist.

PolyNAc-IAF, insbesondere wenn es an ein Vitamin D3, z.B.

Calciol gebunden ist, ist als Arzneimittel wirksam. Es ist geeignet für Patienten mit Prostatakrebs und Brustkrebs, für Autisten, für Patienten mit chronischen Darmerkrankungen, MS, ALS etc, und ganz allgemein wirksam bei allen inflammatorischen Prozessen.

Anhand der folgenden Beschreibung wird die Erfindung näher erläutert.

Es wird zunächst das Herstellungsverfahren beschrieben: Der erfindungsgemäße Komplex wird aus Gc-Protein (Sigma Aldrich) oder rekombinantem Gc-Protein (bakteriell bzw. humane Zellen, wie HKS) mit anschließender N-Acetyl-Galactosaminierung von GcProtein zu PolyNAc-IAF und einer weiteren CholecalciferolBindung hergestellt.

Herstellung des immobilisierten Enzyms mittels Sepharose 4B oder Cyano-aktivierten Magnetic beads oder anderen

Spaltungsmöglichkeiten

Verwendete Puffer bzw. Lösungen:

Coupling Puffer: 16,8 g NaHCO₃ und 58,44 g NaCl in 2 l Wasser lösen

0,2 M Glycinpuffer: 15,01 g Glycin in 1 l Wasser lösen

M NaOH-Konzentrat: 32 g NaOH in 100 ml Wasser lösen

0,1 M Azetatpuffer: 5,76 ml Essigsäure glacial (100%) zu 1 l Wasser zugeben, darin 29,22 g (0,5 M) NaCl lösen und das 8 M NaOH-Konzentrat bis pH 4,0 zutropfen (mindestens 50 Tropfen)

Wasser: Osmotisch gereinigt (auch für Operationen tauglich; Leitfähigkeit < 0,2pS/cm) / 20

A.) Cyano-aktivierte Sepharose 4B:

1) 1,2g cyano-aktivierte Sepharose 4B in 240 ml 1 M HCl (kalt;

83,3 g in 1 l) 30 min aufschwellen. Diese in ChromatographieSäule transferieren und mit 60 ml Wasser spülen. Danach 60 ml Coupling Puffer über die Chromatographie-Säule äquilibrieren. Nach der Umpufferung wird das Gel in 15 ml Couplingpuffer in zwei 7,5 ml-Röhrchen transferiert und 2 min bei 3000 rpm zentrifugiert.

Der Überstand wird abgehoben auf 4,5 ml.

2. ) Die Gele sind nun aktiviert für die Bindung von:

ml Couplingpuffer mit 1 mg N-Acetyl-galactosamin-Transferase (z.B. rhO-GlcNAc-Transferase R&D Cat.No.: 8446-GT)

Den Stoff zu 4,5 ml Gel zugeben und 2 h bei 26°C schwenken.

Das Gel mit dem Enzym wird in eine Chromatographiesäule überführt und mit 5 x 5 ml Coupling Puffer von nicht gebundenen

Enzymen befreit. (Auch möglich mittels Zentrifugation:

6000 U/min, Abheben des Puffers vom Gel und Waschen mit

Couplingpuffer und nochmaliger Zentrifugation; insgesamt 5 Mal)

3. ) Blocken der restlichen aktivierten CN-Gruppen der Sepharose mit Glycin:

In 2 x 5 ml Couplingpuffer in 15 ml-Röhrchen transferieren und min bei 3000 U/min zentrifugieren.

Dann je 10 ml 0,2 M Glycin pH 8.0 zugeben und 20 Stunden bei

4-6°C stehen lassen; mehrmals schwenken.

4. ) Reinigung des enzymaktivierten Gels von nicht gebundenem

Glycin:

Die Röhrchen werden zentrifugiert und der Überstand wird abgehoben.

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Die Reinigung des Enzym-Gels erfolgt durch 5-malige Zugabe von

Coupling-Puffer und Zentrifugation bei 3000 U/min, 2 min und

Abheben des Überstandes.

Danach das gleiche Procedere mit 5-maliger Zugabe des Azetatpuffers statt des Coupling-Puffers.

Die Lagerung erfolgt nach fünfmaligem Waschen mit 5 ml 1 M NaClLösung, der 0,05 % Natriumazid zugesetzt wurde.

Zum Ende wird das Gel in ein Röhrchen transferiert und bei 4-6°C gelagert (= ready to use)

B.) Cyano-aktivierte Magnetic Beads (CN-MB):

1. ) 1,2 g CN-MB in 100 ml 1 M HCl (kalt; 83,3 g in 1 l) mehrmals waschen (mittels Zentrifugation und Magnet-Bindung). Danach mit Wasser spülen und mit Coupling Puffer äquilibrieren.

Nach der Umpufferung werden die 1,2 g CN-MB in zwei 0,5 mlRöhrchen transferiert und 2 min bei 3000 U/min zentrifugiert.

Der Überstand wird abgehoben.

2. ) Die Magnetic Beads sind nun aktiviert für die Bindung von:

ml Couplingpuffer mit 1 mg N-Acetyl-galactosamin-Transferase (z.B. rhO-GlcNAc Transferase R&D Cat.No.: 8446-GT). Den Stoff zu den je 0,6 g CN-MB zugeben und 2 h bei 26°C schwenken.

Das CN-MB-Enzym wird mittels Magneten zurückgehalten und der

Überstand abgehoben. Zugabe von 1 ml Coupling Puffer, schütteln und wiederum magnetische Bindung des CN-MG-Enzyms und abheben des Überstandes. 4 Mal wiederholen. Dadurch wird das nicht gebundene Enzym entfernt.

3. ) Blocken der restlichen aktivierten CN-Gruppen der Magnetic

Beads mit Glycin:

Dann je 1 ml 0,2 M Glycin pH 8,0 zugeben und 20 Stunden bei 4-6°C stehen lassen; mehrmals schwenken.

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4.) Reinigung der enzymaktivierten Magnetic Beads von nicht gebundenem Glycin:

Prinzip Magnetbindung und Abheben der Reinigungspuffer

5-malige Zugabe von je 1 ml Coupling-Puffer, danach das gleiche Procedere mit 5-maliger Zugabe von 1 ml des Azetatpuffers.

Die Lagerung von N-Acetyl-galactosamin-Transferase-MBs erfolgt nach fünfmaligem Waschen mit 1 ml 1 M NaCl-Lösung, der 0,05 %

Natriumazid zugesetzt wurde, in 0,5 ml solch einer Lösung bei

4-6°C (= ready to use)

Anheftung von Galactose-gruppen aus UDP-N-Acetyl-galactosamin

Uridin-5'-diphospho-N-acetylgalactosamin (CAS 108320-87-2; Sigma U5252) wird an das Gc-Protein bzw. Gc-Halo-protein (bakterielles nicht N-Acetyl-galactosaminiertes Gc-Protein) mittels mit N-Acetyl-galactosamin-Transferase-aktivierter CN-Sephareose 4B oder CN-aktivierten Magnetic Beads unter Abspaltung der UDPGruppe gebunden.

Verwendete Puffer:

0,01-0,1 M Phosphat-Magnesiumpuffer pH 6,0 oder pH 7,0 (= Katalysator):

Zu einer Lösung von 13,608 g/l KH₂PO₄ wird zunächst festes NaOH zugegeben und danach 4 M NaOH zugetropft, bis sich der gewünschte pH-Wert einstellt. Daraus können die weiteren gewünschten Phosphatpufferkonzentrationen hergestellt werden. Zum Phosphatpuffer kommt MgCl2 hinzu.

mg Gc-Proteine werden in 1 ml 0,01-0,1 M Phosphat-Magnesiumpuffer pH 6,0 aufgelöst.

400 pg davon werden in 250 ml in Phosphat-Magnesiumpuffer pH 7,0 bei Raumtemperatur dialysiert (Dialyseschlauch;

Filtrationsröhrchen); Dauer: 24h mit 3 x Wechsel.

/ 20

Danach in 10000 Da Filtrationsröhrchen zentrifugieren (Umpufferung und Aufreinigung) in Phosphat-Magnesiumpuffer pH 7,0. Auf 1 ml verdünnen.

A.) Ankoppelung von UDP-GlcNAc (10-200facher molarer Überschuss zur Gc-Protein-Molarität) mittels immobilisierter N-Acetylgalactosamin-Transferase:

Das gereinigte Gc-Protein wird in 10 ml-Röhrchen mit der immobilisierten N-Acetyl-galactosamin-Transferase, wie oben hergestellt, und mit Uridin-5'-diphospho-N-acetylgalactosamin in Kontakt gebracht, entweder mit 3 ml aktivierter Sepharose oder mit 1 ml aktivierten Magnetic Beads und bei 37°C, 500 U/min, 2h inkubiert.

Nach der Inkubation

a. ) Für N-Acetyl-galactosamin-Transferase aktiviertes Sepharose-

Gel: Zentrifugieren bei 6000 U/min für 2 min, danach 900 pl abheben.

Die N-Acetyl-galactosamin-Transferase mit 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 mischen (= einmal nachwaschen) und wiederum 2 min bei 6000 U/min zentrifugieren und wieder 900 pl abheben. Noch zwei weitere Male nachwaschen, zentrifugieren und abheben. Die abgehobenen Überstände vereinigen.

b. ) Für N-Acetyl-galactosamin-Transferase aktivierte Magnetic beads: Die Magnetic beads zurückhalten und 900 pl abheben.

Zu den MB 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 zugeben, mischen und wieder 900 pl abheben. Vorgang ein drittes Mal durchführen und die abgehobenen Überstände vereinigen.

Reinigungsschritte für nicht gebundenes N-Acetyl-galactosaminUDP: Alle vereinigten Rückstände 1 Mal über 100.000 DaltonFilter filtrieren, danach das Filtrat 3 Mal über 10.000 DaltonFilter filtrieren und in Phosphatpuffer aufnehmen.

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Ergebnis: N-Acetyl-galactosamin-UDP abgetrennt; keine DNA, RNA.

Damit ist eine Höchstreinigung des Produktes gegeben von über 99,5%!

Mittels eines ELISAs konnte der N-Acetyl-galactosaminierungsgrad am PolyNAc-IAF mit zwei anderen Gc-Proteinen verglichen werden: einerseits dem recombinant menschlichen, andererseits einem durch humane Nierenzellen, bei welchen die Basen-Sequenzen inkludiert wurden, produzierten Gc-Protein. Das humane GcProtein hat denselben Messwert wie das einfach N-Acetylgalactosilierte, durch Nierenzellen erzeugte Gc-Protein. Das PolyNAc-IAF weist einen 15 Mal höheren Wert auf , was klar beweist, dass es wesentlich mehr N-Acetylgalactosamingruppen aufweist.

Lektinmessung (NAc-Galaktosamin)

Ein Vitamin-D-Binding Protein ELISA Kit von Cloud-Clone wurde verwendet. Dieses ist mit anti-Gc-Protein beschichtet.

Auftragen der Proben in 10 mM PBS Puffer (1h; RT)

Waschen (3 x in Washing buffer)

Auftragen von 1:1000 verdünnter Lektin-HRP (in 10 mM PBS), gerichtet gegen N-Acetylgalaktosamin-Protein, 1h bei RT.

Waschen

Auftragen von 1:1000 verdünnter Anti-Streptavidin-Eu in 10 mM PBS pH 7,4, 30 min

Waschen

200 pL Enhancement-Solution (10 min inkubiert) und danach die zeitverzögerte Fluoreszenz (DELFIA) messen.

/ 20

Das Ergebnis ist in den Fig. 1 bis 4 dargestellt. Fig. 1 zeigt die Zählraten, Fig. 2 die Standardkurve und die Fig. 3 und 4 die sich auf Grund der Standardkurve ergebenden Konzentrationen.

Die sich durch die Fluoreszenz ergebenden Zählraten sind von links nach rechts für menschliches Gc-Protein (Säule 1), durch Nierenzellen erzeugtes Gc-MAF (Säule 2) und PolyNAc-IAF (Säule 3) in Fig. 1 dargestellt.

Um diese Messwerte in Lektin-Gehalt umrechnen zu können, muss zunächst die Standardkurve mit dem Gc-Protein aus dem Testkit bestimmt werden. Das Ergebnis ist in Fig. 2 zu sehen.

Aufgetragen sind die Zählraten, abhängig vom Gc-Protein-Gehalt in ng/ml. Durch lineare Regression ergibt sich folgender

Zusammenhang:

y = 1890,7-x + 2327,9 (mit R² = 0, 9971)

Die sich auf Grund der Umrechnung mit der Standardkurve ergebenden Fluoreszenzverhältnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Fig. 4 entspricht Fig. 3, die Skalierung der Ordinate wurde aber so gewählt, dass das menschliche Gc den Wert 1 hat. Man erkennt, dass das erfindungsgemäße PolyNAc-IAF einen 15 Mal höheren Wert hat, was auch bei Berücksichtigung der Messfehler eine deutlich stärkere N-Acetylgalaktosaminierung belegt, sowohl gegenüber menschlichem Gc als auch gegenüber rekombinant hergestelltem Gc.

Um den Komplex Poly-NAc-IAF-Chlolecalciferol zu bilden, wird dem Poly-NAc-IAF Cholecalciferol zugesetzt. Der sich ergebende Komplex wird von überschüssigem Cholecalciferol durch ein

10000 Da-Molekularfilter getrennt (drei Mal 10 min mit

6000 U/min zentrifugieren und mit 10 mM PBS pH 7,4 waschen). Die

Proteinbestimmung ergab 398 ng/ml des gewünschten Komplexes.

Es ist aber ebenso möglich, Cholecalciferol zu Beginn mit dem

Gc-Protein reagieren zu lassen und danach die Zuckerreste anzubinden.

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Nachweis der höheren Phagozytose-Aktivität

In Fig. 5 ist die Aktivierung der Phagozytose von isolierten Blutmakrophagen dargestellt. Die Bestimmung erfolgte entsprechend den Absätzen [0039] und [0040] der

WO 2017/181213 A1, also wie beschrieben von Hammarstrom S and Kabat EA in Studies on specificity and binding properties of the blood group A reactive hemagglutinin from Helix pomatia, Biochemistry 10: 1684-1692, 1971.

Man sieht deutlich die Überlegenheit von Poly-NAc-IAF-Calciol (am besten) und Poly-NAc-IAF gegenüber GcMAF-Calciol (etwas schlechter) und GcMAF-Calcitriol und GcMAF (beide weit abgeschlagen). LPS (Lipopolysaccharide) liegen zwischen GcMAFCalciol und GcMAF-Calcitriol bzw. GcMAF.

Nachweis der Apoptoseaktivität von PolyNAc-IAF-Calciol auf aus Patienten isolierten Tumorzellen

Die Induktion der Apoptose (programmierter Zelltod in Tumorzellen) führt zur Aktivierung von Caspasen. Bei diesen

Enzymen handelt es sich um Cysteinproteasen, die als inaktive

Proenzyme in der Zelle synthetisiert werden.

Nach Aktivierung der Apoptose erfolgt die Hydrolyse der Procaspase zur aktiven Caspase. Caspasen bilden eine Familie von

Proteasen, die für die Induktion des Zelltodes verantwortlich sind. Beim Menschen sind bisher 14 verschiedene Caspasen bekannt, die in Signalkaskaden angeordnet sind. Caspase 3 (CPP32, Yama, and apopain) gehört zu den kritischen Enzymen im Apoptoseprozess und ist im menschlichen Organismus am besten untersucht. Sie ist in der Lage, weitere Procaspasen zu aktivieren (Caspase 9, Cytochrom-c) und hydrolysiert spezifisch

Zellsubstrate und Strukturproteine.

Resultat der Caspaseaktivierung ist somit die Fragmentierung der Zelle, die in der Bildung der apoptotic bodies endet (Sakahira et al. 1998).

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In einer Untersuchung wurden zirkulierende Tumorzellen aus dem

Blut isoliert und die direkte Auswirkung von GcMAF und PolyNAcIAF-Calciol auf die Caspaseaktivität in diesen isolierten

Tumorzellen untersucht. Hierbei handelt es sich um eine direkte

Wirkung auf Tumorzellen ohne den Einfluss von Immunzellen wie

Makrophagen, T-Zellen oder B-Zellen, die bei dem Versuchsansatz zuvor entfernt wurden. Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt.

Es sind von Caspase 3, Caspase 9 und Cytochrom-c jeweils der

Normalwert, der Gc-MAF-Wert (schlechter) und der Poly-NAc-IAFCalciol-Wert dargestellt.

Ergebnis der Untersuchung:

GcMAF alleine besitzt keinerlei Caspaseaktivität. Dies konnte in der oben stehenden Untersuchung bestätigt werden. Die normale

Caspaseaktivität liegt sogar höher als unter Einfluss von GcMAF.

Unter Zugabe von Poly-NAc-IAF-Calciol wurde die Aktivität von

Caspase 3 um das 4fache, von Caspase 9 um das fast 7fache und von Cytochrom-c um das 6fache gesteigert werden. Somit liegt die Vermutung nahe, das die neue Substanz nicht nur eine immunzellaktivierende Wirkung besitzt, sondern auch unerwarteter Weise eine direkte Apoptosewirkung auf Tumorzellen besitzt.

Auswirkung auf weitere Immunzellen (T-Zellen)

Die Rezeptor-Typ Tyrosin-Proteinphosphatase C (synonym CD45,

PTPRC) ist ein Oberflächenprotein aus der Gruppe der Proteinphosphatasen. PTPRC dephosphoryliert Phosphotyrosinreste in Proteinen. Sie ist beteiligt an der Aktivierung von T-Zellen. Sie ist glykosyliert und phosphoryliert. Die Glykosylierung von PTPRC ändert sich, und damit auch die Protein-ProteinInteraktionen. In T-Zellen wird Lck durch die PTPRC dephosphoryliert, in B-Zellen dagegen Lyn. In T-Zellen wird die

Aktivierbarkeit des T-Zell-Rezeptors verstärkt.

Das CD45-Antigen ist ein membranständiges Protein, dessen intrazellulärer Abschnitt eine Tyrosin-Phosphatase-Aktivität aufweist. Es wird angenommen, dass CD45 als Oberflächenrezeptor wirkt. Für die immunhistologische Differenzialdiagnostik / 20 (mikroskopische Bilder mit Anfärbung von bestimmten Strukturen aus Gewebeproben) hat dieses Protein eine herausragende

Bedeutung, da es sehr viele Blutzellen verlässlich markiert und als Pan-Leukozytenmarker fungiert.

Mit dem Pan-Leukozytenmarker CD45 werden lymphoide Zellen membranständig markiert. Makrophagen und Histiozyten zeigen ein variables Reaktionsmuster. Neutrophile Granulozyten werden in der Regel nicht markiert, ebenso sind Plasmazellen negativ für

CD45.

Eine lokale Injektion von PolyNAc-IAF-Calciol in einen Tumor führt zu einer deutlichen Anfärbung von CD45 in Tumorarealen.

Die kräftige Färbung zeigt eine sogenannte RO-Reaktion (starke

Aktivierung der Zellen).

Anlagerung von PolyNAc-IAF-Calciol an T-Zellen und Induktion von cytotoxischen T-Zellen durch PolyNAc-IAF-Calciol

Bei dieser Untersuchung wurde einer Blutprobe einmal GcMAF und zum anderen PolyNAc-IAF-Calciol zugegeben und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Es zeigt sich, dass, im Unterschied zum GcMAF, eine Induktion von cytotoxischen T-Zellen durch die Zugabe von PolyNAc-IAF-Calciol stattfindet. Diese Reaktion korreliert mit den Ergebnissen aus der zuvor beschriebenen immunhistochemischen Untersuchungen des Gewebes aus den Probeentnahmen.

Anlagerung von PolyNAc-IAF-Calciol an aktivierte BlutMakrophagen (CD14+/CD16+)

Untersuchungen zeigen zum einen eine nachweisliche Anlagerung von PolyNAc-IAF-Calciol an Makrophagen. Dies führt zu einer höheren Aktivierung der Makrophagen (siehe oben). Weiterhin konnte aber eine Anlagerung und sogar eine Induktion von

T-Lymphozyten beobachtet werden. Dies führt zu einer hohen

Aktivität dieser Zellen im Tumor bei lokaler Applikation. Dies ist bisher noch nicht beschrieben worden und war keine zu erwartende Reaktion.

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Klinischer Test

Bei einem Patienten wurde mehrfach ultraschallgezielt PolyNAcIAF-Calciol in die bioptisch (durch Gewebeprobe) gesicherte Karzinomregion appliziert. Laut radiologischem Befund besteht bei dem behandelten Patienten in der Bildgebung vom 16.04.2018 kein Hinweis mehr auf eine tumoröse Läsion, so wie es noch am

29.12.2016 der Fall war.

Claims (4)

1. Patentansprüche :

   1. Vitamin D bindendes Protein, herstellbar durch Umsetzung des Gc-Proteins oder des GcMAF-Proteins oder des Gc-Haloproteins mit UDP-N-Acetyl-galactosamin in Anwesenheit von N-Acetyl-galactosamin-Transferase.
2. 2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an ein Vitamin D₃, insbesondere an Calciol, gebunden ist.
3. 3. Protein nach Anspruch 1 oder 2 als Arzneimittel.
4. 4. Arzneimittel nach Anspruch 3 zur Bekämpfung von Krebs, insbesondere Prostatakrebs und Brustkrebs, Autismus, chronischen Darmerkrankungen, Multipler Sklerose (MS) oder amyotrophischer Lateralsklerose (ALS).