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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
Antikörpers,
der an alle Kongenere von cyanobakteriellen Hepatotoxinen bindet,
umfassend die Schritte des Herstellens eines ADDA-Haptens, bestehend
aus Formel (I)
welches
Teil einer Gruppe von Giften ist, die von verschiedenen Cyanobakterien
stammen, einen Antikörper, der
durch Immunisieren eines nicht-menschlichen Tieres mit einem ADDA-Hapten
mit der Formel (I) erhalten wird, und ein diagnostischer Kit, der
den Antikörper
enthält.
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Aufgrund
zunehmender Besiedlung, Industrialisierung und intensiver Landwirtschaft
sind weit verbreitete Probleme durch Wasserverschmutzung entstanden.
Diese Wasserverschmutzung und die nachfolgende Eutrophierung führten in
vielen Fällen
zur Entwicklung von Blaugrünalgenblüten (das
heißt,
Cyanobakterien). Die Umweltfaktoren, die für die Entwicklung derartiger
Blüten
von Cyanobakterien verantwortlich sind, sind bis jetzt beinahe unbekannt.
Im Allgemeinen können
Blüten
von Cyanobakterien in eutrophen Gewässern, zum Beispiel unter solchen
Bedingungen, wie relativ hohe Nährstoffgehalte
(Phosphat und Nitrat), Wassertemperaturen zwischen 15 bis 30°C und pH-Werten
zwischen 6 und 9 oder höher
(Wicks et al., 1990) gefunden werden.
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Ein
ernsthaftes Problem bei der Entwicklung von Cyanobakterienblüten besteht
darin, dass Cyanobakterien eine große Vielfalt an giftigen Substanzen
erzeugen. Dementsprechend gab es seit dem Ende des letzten Jahrhunderts
eine zunehmende Zahl an Fällen
von Vergiftungen und sogar Todesfällen von Menschen, Tieren,
insbesondere Vögel
und Fische, von denen gezeigt werden konnte, dass sie durch die
Verwendung von Wasser, das nach Chlorierung und Filtrierung für medizinische
Zwecke mit Cyanobakterien verunreinigt war (Todesfälle in den
Dialysezentren von Caruaru, Brasilien, 1996 und Evora, Portugal,
1995), durch den Konsum von verunreinigtem Trinkwasser oder sogar
von Cyanobakterienklumpen selbst verursacht wurden (Francis, 1878;
Falconer et al., 1983; Carmichael, 1984; Beasley et al., 1989; Mahmod
et al., 1988; Skolberg et al. 1984).
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Die
Gift-erzeugenden Cyanobakterien können in Spezies unterteilt
werden, die größtenteils
hepatotoxische Peptide synthetisieren, wie zum Beispiel Microcystis
sp., Nodularia sp. und Oszillatoria sp., und andere Gattungen, die
größtenteils
neurotoxische Alkaloide erzeugen, wie zum Beispiel Anabaena und
Aphanizomenon (Carmichael et al., 1990). Untersuchungen verschiedener
Stämme
von M. aeruginosa offenbarten, dass in Abhängigkeit vom Stamm und Lebensraum,
die Cyanobakterien unterschiedliche Kongenere und Mengen eines Giftes
erzeugen (Sivonen et al., 1992 a–c).
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Cyanobakterien
können
die intrazellulär
erzeugten Gifte in das umgebende Wasser ausscheiden (Watanabe et
al., 1992a, b). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das Mycrocystin-Kongenere
Mycrocystin-LR lichtbeständig
ist, jedoch kann es mikrobiell abgebaut werden (Watanabe et al.,
1992a; Tsuji et al., 1994; Cousins et al., 1996). Unter aeroben
Bedingungen und in Kulturmedien, die mit Bakterien geimpft wurden,
betrugen die Halbwertszeiten von Mycrocystin-LR und -YR mehr als
45 Tage (Watanabe et al., 1992a). Im Gegensatz dazu wurden im Meerwasser
Halbwertszeiten von weniger als 5 Tagen bestimmt (Cousins et al.,
1996). Unter ungünstigen
Bedingungen (das heißt,
kalte Temperaturen und minimale Anwesenheit spezifischer Populationen
an Mikroben) können
Mycrocystine mehrere Tage bis sogar mehrere Monate bestehen und
daher können sie über die
Trinkwasserversorgung eine potentielle Gefahr für Menschen darstellen.
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Dementsprechend
kann das erhöhte
Auftreten von Magen-Darm-Entzündung
und Leberkarzinomen in Menschen auf den Verbrauch von Trinkwasser
zurückgeführt werden,
das in mehreren Untersuchungen mit cyanobakteriellen Hepatoxinen
(insbesondere Mycrocystin-LR) verunreinigt war, obwohl eine direkte
Beziehung zwischen chronischer Mycrocystin-LR-Aussetzung und der
Entwicklung von Leberkarzinomen noch nicht bewiesen worden ist (Tisdale,
1931; Keleti et al., 1981; Billings, 1981). Klinische Anzeichen
von Mycrocystin-Toxikosen in Säugern
sind durch Schwäche,
Appetitlosigkeit, Blässe
der Mukosa, Muskelzittern, gequältes Ausatmen
und Tod durch hypovolämischen
Schock, der durch intrahepatische Hämorrhagie und/oder Leberversagen
verursacht wird, charakterisiert (Theiss et al., 1988; Jackson et
al., 1984).
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Säuger scheinen
Mycrocystin oral aufzunehmen und das Gift erreicht die Leber mit
dem Blut über
einen hochspezifischen Transportmechanismus (organischer Anionträger) (Eriksson
et al, 1990; Hooser et al., 1990; Runnegar et al., 1991). Ein molekularer
Mechanismus für
die ernsten Wirkungen von Mycrocystin scheint dessen Bindung an
die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatasen 1 und 2A zu
sein, die zu der Inhibierung führt
(Eriksson et al., 1990; Yoshezawa et al., 1990; Matsushima et al.,
1990; Honkanen et al., 1990; McKintosh et al., 1990; McKintosh et
al., 1995; Runnegar et al., 1996). Nach akuter Vergiftung mit hohen Mycrocystinkonzentrationen
führt die
Inhibierung von Proteinphosphatasen zu einer Hyperphosphorylierung intermediärer Filamente,
der wiederum der Kollaps des Zellskeletts, der Verlust der Zellstruktur,
eine beträchtliche
intrahepatische Hämorrhagie
und eine Nekrose der Hepatozyten folgt (Eriksson et al., 1990; Falconer
et al., 1981, 1992). Ähnlich
zu anderen Proteinphosphataseinhibitoren (zum Beispiel Calyculin-A,
Okadasäure) führt die
chronische Aussetzung von Mäusen
gegenüber
Mycrocystin-LR zur Förderung
von Lebertumoren (Falconer, 1991; Nishiwaki-Matsushima et al., 1992).
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Aufgrund
der hohen Toxizität
und Karzinogenität
von hepatotoxischen Cyanobakteriengiften und der möglichen
chronischen Aussetzung von Organismen (Menschen sowie auch Tiere)
gegenüber
diesen Giften über
das Trinkwasser, besteht ein dringender Bedarf, giftige Cyanobakterienblüten nachzuweisen
und die Konzentration von Cyanobakteriengiften im Trinkwasser zu
senken.
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Huang
et al. (1996) Abstracts of the General Meeting of the American Society
for Microbiology 96, 380, beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung
monoklonaler Antikörper
gegen Mycrocystin. Die Antikörper wurden
durch Verschmelzung muriner Myelomzellen mit Milzzellen aus einer
BALB/c-Maus erhalten, die mit Mycrocystin-LR-Proteinkonjugaten immunisiert worden
war. Nagata et al. (1995) Nat. Toxins 3, 78–86, beschreibt die Erzeugung
von sechs monoklonalen Antikörpern
(MAbs) gegen Mycrocystin-LR (MC-LR). Es wird berichtet, dass die
Antikörper
Schutzwirkungen gegen eine Hepatotoxizität von MC-LR in vitro und in
vivo sowie auch gegen die In hibierung von Proteinphosphatase durch
MC-LR zeigen. Nagata et al. (1997) J. AOAC Int: 80(2), 408–417 offenbart
einen ELISA zur direkten Bestimmung mehrerer Mycrocystine in natürlichem
Gewässer.
Metcalf et al. (2000) Water Res. 34(10), 2761–2769, beschreibt die Erzeugung
polyklonaler Antikörper, die
gegen Mycrocystin-LR gerichtet sind. Chu et al. (1989) Appl. and
Environ. Microbiology 55(8), 1928–1933 beschreibt die Verwendung
der Mycrocystin-Leucin-Arginin-Variante (MCYST-LR) für immunogene
Präparate (vergleiche
zum Beispiel Seite 1928, rechte Spalte, Zeilen 7 bis 10). Der Annual
Report 1996/1997 des Cooperative Research Centre for Water Quality
and Treatment (CRC) Australien gibt einen Überblick über Forschungsprojekte am CRC
Australien in den Jahren 1996 und 1997 und offenbart, dass die Synthese
von synthetischem ADDA geplant ist, um Antikörper gegen Mycrocystine zu
erzeugen (vergleiche Seite 16, linke Spalte, erster Abschnitt).
Weiterhin gibt der Annual Report 1997/1998 des Cooperative Research
Centre for Water Quality and Treatment (CRC) Australien einen Überblick über Forschungsprojekte
am CRC Australien in den Jahren 1997 und 1998 und offenbart, dass
synthetisches ADDA erhalten worden ist und, dass die Erzeugung von
Antikörpern
geplant ist, die spezifisch für
das ADDA sind.
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Da
es schwierig war, die verschiedenen Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere
mit der erforderlichen Empfindlichkeit nachzuweisen (Kenefick et
al., 1993; Lawton et al., 1994), konzentrierten sich Untersuchungen aus
dem Stand der Technik auf die Zerstörung der Cyanobakteriengifte
während
des Trinkwasserreinigungsverfahrens. Es wurden größtenteils
Durchlaufverfahren untersucht, die unter Routinebedingungen ausgeführt werden
können,
wie zum Beispiel Sandfiltration, Binden an Aktivkohle und Zerstörung durch
Chlorierung (James et al., 1994). Jedoch offenbarten diese Untersuchungen,
dass weder Sandfiltration noch Chlorierung, UV-Bestrahlung, Behandlung
mit Wasserstoffperoxid oder Kaliumpermanganat noch Filtration über Aktivkohle die
Cyanobakteriengifte wesentlich aus dem Trinkwasser entfernen konnten.
In diesem Fall scheint ein weiteres Problem die Behandlung des Rohwassers
zu sein, das mit Cyanobakterien verunreinigt ist. Die Chlorierung oder
die Behandlung der Cyanobakterien mit Kupfersulfat führt zu der
Freisetzung der Cyanobakteriengifte, die im Cytosol vorhanden sind,
ohne dass die Gifte selbst im geringsten Grad zerstört werden.
Die Chlorierung von sandfiltriertem Wasser ist ebenfalls unwirksam.
Nur die Filtration über
Aktivkohle scheint zur Entfernung einer beträchtlichen Menge (ungefähr 60% bis
80%) der Gifte geeignet zu sein. Jedoch wurde diese Reinigungswirksamkeit
aufgrund einer relativ schnellen Sättigung der Aktivkohleteilchen
nur für
eine begrenzte Zeitdauer erreicht. Daher wurden nach ungefähr 10.000
Bettvolumina (1 Bettvolumen = Volumen der Aktivkohle) die Filter
durchlässig.
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Daher
besteht die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische
Aufgabe darin, ein neues System für den zuverlässigen Nachweis
von hepatotoxischen Cyanobakteriengiften, wie zum Beispiel Mycrocystin-
und Nodularin-Kongenere, insbesondere in und aus Trinkwasser und
anderen Quellen bereitzustellen.
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Die
Lösung
der vorstehenden Aufgabe wird durch die Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung, wie sie in den Ansprüchen
charakterisiert sind, bereitgestellt.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Antikörpers,
der an alle Kongenere von cyanobakteriellen Hepatotoxinen bindet,
umfassend die Schritte
- (a) des Herstellens
eines ADDA-Haptens, bestehend aus Formel (I) welches
Teil eines Giftes ist, das von einem Cyanobacterium stammt, wobei
der Rest
R1 ein Halogenatom, vorzugsweise
Br, -OSO3, -OR' oder -NR'2 darstellt
und der Rest
R2 Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Acyl, (C1-C4)Aminoacyl oder
(C1-C4)Carboxyaminoacyl darstellt,
oder die
Reste R1 und R2 so
miteinander verbunden sind, dass sie eine cyclische Verbindung bilden,
die Reste R3, die gleich oder unterschiedlich
sein können,
jeweils unabhängig
voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und (C1-C4)Alkyl, ausgewählt sind,
der Rest R4 (C1-C4)Alkoxy
darstellt,
und wobei die Phenylgruppe substituiert oder unsubstituiert
sein kann,
- (b) des Koppelns der Verbindung von Schritt (a) an einen Träger,
- (c) des Immunisierens eines nicht-menschlichen Tieres mit dem
in Schritt (b) erhaltenen Konjugat und
- (d) des Isolierens des Blutes, Blutserums und/oder der Milzzellen
des Tieres.
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Die
Gruppe R' in Formel
(I) stellt vorzugsweise unabhängig
voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes (C1-C4)Alkyl oder (C1-C4)Acyl dar, wenn
sie an Stickstoff gebunden sind. Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
des Verfahrens, wie vorstehend definiert ist, stellen die Reste
R3 in der vorstehenden Formel (I) jeweils
Methyl und der Rest R4 Methoxy dar.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung stellt der Rest R1 Aminoacyl und der Rest R2 (C1-C4)Acyl dar, oder
der Rest R1 stellt Glycyl beziehungsweise
D-Alanyl dar und der Rest R2 stellt Acetyl
dar, oder der Rest R1 stellt -NH2 dar und der Rest R2 stellt
Glutamidyl beziehungsweise 2-Aminopropionamidyl dar.
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Das
durch die vorstehende Formel (I) dargestellte Hapten ist vorzugsweise
Teil eines Giftes, das aus der Gruppe, bestehend aus Mycrocystin-
und Nodularin-Kongeneren, ausgewählt
ist. Mycrocystin-(MC) und Nodularin-Kongenere werden nachstehend
als Mycrocystin-XY und Nodularin-XY bezeichnet.
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Die
chemischen Strukturen von M. aeruginosa- und Nodularia sp.-Hepatotoxinen
(das heißt,
Mycrocystin-XY und Nodularin-XY) sind in mehreren Untersuchungen
aus dem Stand der Technik beschrieben (Botes et al., 1982a, d, 1994,
1985; Rinehard et al., 1988). Mycrocystin-XY und Nodularin-XY sind
cyclische Peptide, die aus sieben beziehungsweise fünf Aminosäuren bestehen.
Die folgende Formel stellt Mycrocystin-LR dar.
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Nodularin-XY
und Mycrocystin-XY haben dieselbe charakteristische Aminosäure (ADDA)
gemeinsam. Die Grundstruktur von Mycrocystin-XY-Kongeneren besteht
aus fünf
nicht variablen Aminosäuren: β-Methylasparaginsäure, Alanin,
N-Methyldehydroalanin,
Glutamat und 3-Amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-diensäure (ADDA).
Die Unterschiede zwischen einzelnen Mycrocystin-Kongeneren basieren
auf den zwei variablen L-Aminosäuren,
die zum Beispiel L-Arginin und L-Leucin in Mycrocystin-LR beziehungsweise zweimal
L-Arginin in Mycrocystin-RR sind. Normalerweise erzeugen Cyanobakterien
eine Mischung aus verschiedenen Formen der Gifte. Die Isolierung
von Mycrocystin-XY aus natürlichen
Blaugrünalgenblüten führte zu
bis zu sechs verschiedenen Mycrocystin-Kongeneren, und Giftkonzentrationen
von bis zu 10 mg pro g Trockenmasse Algen wurden bestimmt (Wicks
et al., 1990; Tsuji et al., 1984; Tencallar et al., 1994, 1995).
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Ein
besonders bevorzugtes Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren
zur Herstellung eines polyklonalen, monoklonalen oder rekombinanten
Antikörpers.
Der rekombinante Antikörper
kann durch die Translation und Expression von jedem Teil der Gene,
die für
polyklonale oder monoklonale Antikörper kodieren, und/oder Auswahl
durch Screening der Anzeige einer Phagenbibliothek unter Verwendung
des durch die vorstehende Formel (I) dargestellten Haptens, erzeugt
werden.
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Der
durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhaltene Antikörper,
zum Beispiel ein polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper, weist
den Vorteil auf, dass er zum Binden an alle Kongenere der cyanobakteriellen
Hepatotoxine, zum Bei spiel Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere,
die als Teil ihrer Struktur die ADDA-Einheit enthalten, in der Lage ist.
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Der „Träger" ist nicht sonderlich
auf eine spezifische Ausführungsform
beschränkt
und kann zum Beispiel jede polymere Substanz sein. Träger, die
für das
vorstehende Verfahren geeignet sind, können zum Beispiel aus der Gruppe,
bestehend aus Polyethylenglykol, Proteinen, Polypeptiden, Polysacchariden
und Festphasenträgern,
wie zum Beispiel Kunststoffträger,
ausgewählt
werden. Der Proteinträger
wird vorzugsweise aus Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA),
kationisiertes Rinderserumalbumin (cBSA) und Meerrettichperoxidase
(HRP) ausgewählt.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, wie vorstehend definiert
ist, der durch Immunisieren eines nicht-menschlichen Tieres mit
einem ADDA-Hapten, das die Formel (I) aufweist, erhalten wird.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen diagnostischen Kit, der
den Antikörper,
wie vorstehend definiert ist, enthält.
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Die
Figuren zeigen:
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1 ist
ein Diagramm, das ein Flussdiagramm für die Strategie der Herstellung
eines erfindungsgemäßen Anti-ADDA-Antikörpers zeigt.
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2 ist
ein Diagramm, das bevorzugte Strategien für die Kopplung eines ADDA-Haptens
an ein Protein zeigt.
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3 zeigt
mehrere ADDA-Derivate, die für
die Erzeugung des Antikörpers
synthetisiert wurden, der für
einen Kongener-unabhängigen
Nachweis von Mycrocystin- und Nodularin-Kongeneren verwendbar ist.
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4 ist
ein Diagramm, das das allgemeine Prinzip des indirekten kompetitiven
Mycrocystin enzymgekoppelten Immunadsorptionsassays (MA-ELISA) zeigt.
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5 ist
ein Diagramm, das die Kreuzreaktivität in Bezug auf verschiedene
Mycrocystin-Kongenere (MC-LR, -RR und -YR) und Nodularin des in
Schafen hervorgerufenen Anti-ADDA-Antikörpers (ADDA-824neu, das heißt 26/06/00)
zeigt, der direkt gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet
ist.
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6 ist
ein Diagramm, das das direkte ELISA-Verfahren und dessen Empfindlichkeit
zum Nachweis von MC-YR zeigt. Der Anti-ADDA-Antikörper (ADDA-825-bleed,14/12/98) wurde in Schafen hervorgerufen
und war gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet.
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7 ist
ein Diagramm, das das indirekte ELISA-Verfahren unter Verwendung
eines monoklonalen Antikörpers
und dessen Empfindlichkeit zum Nachweis von MC-YR zeigt. Der Anti-ADDA-Antikörper (ADDA-3G10B10)
wurde in Mäusen
hervorgerufen und war gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele erläutert.
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BEISPIEL
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ADDA-Hapten-Synthese
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Das
Ausgangsmaterial N-Boc-ADDA-Me (35) wurde durch den veröffentlichten
Syntheseweg hergestellt: Humphrey, J. M.; Aggen, J; Chamberlin,
A. R. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11759–11770. „Synthesis of the Serine-threonine
Phosphatase Inhibitor Microcystin LA."
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N-Ac-ADDA-OMe.
Zu 31 mg (0,70 mmol) Boc-ADDA-OMe in einem Kolben wurde 2 ml TFA
gegeben. Nach einer Stunde wurde das TFA unter Vakuum entfernt und
der Rückstand
wurde dreimal aus Toluol zur Entfernung des TFA eingeengt. Das resultierende Öl wurde
in 2,5 ml frisch destilliertem CH2Cl2 gelöst
und dieses wurde auf 0°C
abgekühlt.
28 mg (0,28 mmol) wasserfreies Triethylamin, gefolgt von 0,141 g
(1,39 mmol) frisch destilliertem Essigsäureanhydrid, wurde zu der Lösung gegeben.
Eine Stunde später
wurden 5 ml gesättigte NH4Cl-Lösung
zugegeben und die Mischung wurde während 20 Minuten bei 0°C gerührt. Die
Mischung wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt und die Phasen
wurden getrennt. Die wässrige
Phase wurde zweimal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden jeweils einmal mit 50% gesättigter NH4Cl-Lösung, 50%
gesättigter
NaHCO3-Lösung
und Kochsalzlösung
gewaschen, über
MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum
eingeengt, woraus sich ein weißer
Feststoff ergab. Der Feststoff wurde über Flashchromatographie (1/1
EtOAc/Hexane) gereinigt, woraus sich 25 mg (93%) eines weißen Feststoffs
ergaben; Rf 0,23 (40:60) EtOAc-Hexane);
IR (Dünnfilm)
3330, 2919, 1731, 1654, 1454 cm–1; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99
(d, J = 6,5, 3H), 1,20 (d, J = 7, 3H), 1,57 (s, 3H), 2,02 (s, 3H),
2,58 (ddq, J = 6, 6,5, 10 Hz, 1H), 2,67 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H),
2,78 (undeutliches Multiplett, 3H), 2,79 (dd, J = 5, 13,5 Hz, 1H),
3,17 (ddd, J = 5, 6, 7 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,65 (s, 3H), 4,71
(ddd, J = 4,5, 5, 5,5 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 9,5 Hz. 1H), 5,42 (dd,
J = 15,5, 6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 9
Hz, 1H), 7,25–7,15
(m, 5H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) ‰ 175,8,
169,5, 139,5, 136,6, 136,3, 132,4, 129,5, 128,2, 126,0, 124,9, 87,1,
58,6, 3,0, 51,7, 43,6, 38,4, 36,8, 23,5, 16,2, 14,9, 12,7; HRMS
berechnet für
C23H34NO4 (M + H)+: 388,2488.
Gefunden: 388,2505.
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N-Ac-ADDA-ON.
Zu 22 mg (0,057 mmol) des geschützten
ADDA-Derivats in 2 ml THF wurden 0,57 ml (0,57 mmol) 1 M LiOH gegeben.
Nach 22 Stunden wurde die Mischung klar und sie wurde zwischen Hexanen
und Wasser verteilt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase
wurde einmal mit Hexanen gewaschen. Die vereinigten organischen
Phasen wurden dreimal mit Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässrigen
Phasen wurden mit 1 M NaHSO4 angesäuert und
dreimal mit CH2Cl2 extrahiert.
Die vereinigten CH2Cl2-Phasen
wurden einmal mit Kochsalzlösung
gewaschen, durch Baumwolle filtriert und eingeengt, woraus sich
23 mg von 83 als ein Öl
ergab, das ohne Reinigung genommen wurde: Rf 0,34
(1:49:50 HOAc:EtOAc:Hexane); IR (Dünnfilm) 3295 br, 2923, 1713,
1640 cm–1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99
(d, J = 6,5, 3H), 1,25 (d, J = 7, 3H), 1,58 (s, 3H), 2,02 (s, 3H),
2,57 (ddq, J = 6,5, 6,5, 9,5 Hz, 1H), 2,65 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H),
2,76 (teilweise undeutlich m, 3H), 2,77 (dd, J = 5, 13 Hz, 1H),
3,17 (ddd, J = 5, 6,5, 6,5 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 4,71 (ddd, J =
5, 6, 10 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 15,5,
6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 9,5 Hz, 1H),
7,25–7,15
(m, 5H), HRMS berechnet für
C22H32NO4 (M + H)+: 374,2331. Gefunden:
374,2325.
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N-Ac-ADDA-D-Ala-OMe.
Zu 17 mg (0,12 mmol) D-Ala-OMe-hydrochlorid und 14 mg (0,036 mmol) HATU
in einem Kolben wurden 9 mg (0,024 mmol) 83 in 0,6 ml DMF gegeben.
Die resultierende Lösung
wurde auf 0°C
abgekühlt
und 41 mg (0,34 mmol) Collidin wurden zugegeben. Die Lösung wurde
während
2 Stunden bei 0°C
gerührt,
gefolgt von Aufwärmen
auf Raumtemperatur und Rühren über Nacht.
Die Mischung wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt und die Phasen
wurden getrennt. Die wässrige
Phase wurde einmal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden jeweils einmal mit gesättigter NaHCO3-Lösung, Wasser,
1 M NaHSO4, Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu
einem schmutzig weißen
Feststoff eingeengt. Eine Chromatographie (80:20 EtOAc:Hexane) ergab
8 mg (73%) eines weißen
Feststoffs: Rf 0,17 (60:40 EtOAc:Hexane);
IR (Dünnfilm)
3284, 3067, 2923, 1743, 1650, 1542 cm–1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99
(d, J = 6,5, 3H), 1,23 (d, J = 7, 3H), 1,35 (d, J = 7 Hz, 3H), 158 (s,
3H), 2,04 (s, 3H), 2,52 (dq, J = 4, 7 Hz, 1H), 2,59 (ddq, J = 6,5,
7, 9,5 Hz, 1H), 2,68 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 4,5,
14 Hz, 1H), 3,19 (ddd, J = 5, 7, 7 Hz, 1H), 3,22 (s, 3H), 3,75 (s,
3H), 4,55 (dq, J = 7, 7 Hz, 1H), 4,62 (m, 1H), 5,39 (d, J = 9,5
Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 15,5, 6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz,
1H), 6,23 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,27–7,17 (m,
5H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) ‰ 12,7,
15,4, 16,2, 18,4, 23,5, 36,7, 38,2, 44,4, 47,9, 52,6, 53,7, 58,6,
86,9, 125,2, 125,9, 128,2, 129,4, 132,2, 136,2, 139,4, 169,9, 173,2,
174,6; HRMS berechnet für
C26H39N2O5 (M + H)+: 459,2859.
Gefunden 459,2869.
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N-Ac-ADDA-D-Ala-OH.
Zu 5 mg (0,011 mmol) N-Ac-ADDA-D-Ala-OMe in 1,75 ml THF wurden 0,10
ml (0,10 mmol) 1 M LiOH gegeben. Nach 50 Minuten wurde die Mischung
zwischen Ether und Wasser verteilt und die Phasen wurden getrennt.
Die wässrige
Phase wurde einmal mit Ether gewaschen. Die vereinigten Etherphasen wurde
dreimal mit Wasser nachextrahiert und die vereinigten wässrigen
Phasen wurden mit gesättigter Zitronensäure auf
pH = 3 angesäuert.
Dann wurden die wässrigen
Phasen zweimal mit EtOAc extrahiert und die vereinigten EtOAc-Phasen
wurden zweimal mit Wasser, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Der resultierende Feststoff wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC
gereinigt, Retentionszeit des Produkts = 15,7 Minuten (70 MeOH/30
0,2% wässriges
TFA), woraus sich 4 mg (85%) der Titelverbindung als weißer Feststoff
ergab: Rf 0,36 (1 HOAc/10 MeOH/89 CH2Cl2); IR (Dünnfilm)
3288 br, 2937, 1720, 1658, 1632 cm–1; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) ‰ 0,94
(d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,96 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,19 (d, J = 7,0
Hz, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,82 (s, 3H), 2,63 (dd, J = 7,0, 14,0 Hz,
1H), 2,73 (dd, J = 5,0, 14,0 Hz, 1H), 3,16 (s, 3H), 3,22 (ddd, J
= 5,5, 5,5, 6,5 Hz, 1H), 4,19 (dq, J = 7,0, 7,5 Hz, 1H), 4,40 (m,
1H), 5,38 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,44 (dd, J = 6,5, 16,0 Hz, 1H),
6,05 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 7,25 (t, J
= 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 7,0 Hz, 1H);
FAB MS berechnet für C25H37N2O5 (M + H)+: 445,2702.
Gefunden: 445,2695.
-
Kopplung von
Hapten an Proteine
-
Herstellung von BSA-,
cBSA- und OVA-N-AcADDA-AlaOH.
-
BSA
(10,6 mg), kationisiertes BSA (cBSA) (10,0 mg) und OVA (8,3 mg)
wurden jeweils in PBS (1000 μl)
gelöst.
Carbonyldiimidazol (19,81 mg, 0,12 mmol) wurde in trockenem DMF
(500 μl)
gelöst
und ein Teil der Lösung
(100 μl)
wurde zu N-Acetyl-ADDA-D-Ala-OH
(1,0 mg, 2,2 μmol)
gegeben und während
90 min stehen gelassen. DMF (BSA, 260 μl; cBSA, 260 μl; OVA, 280 μl) wurde
zu den Proteinlösungen
unmittelbar vor der Zugabe des aktivierten ADDA-Derivats gegeben.
Die Lösung
des aktivierten ADDA-Derivats (40 μl jeweils zu der BSA- und cBSA-Lösung, 20 μl zu der
OVA-Lösung)
wurde dann zu den Proteinlösungen
gegeben, und man ließ die
Reaktion während
ungefähr
16 h bei 4°C
fortschreiten. Die resultierenden Konjugate wurden wiederholt verdünnt und
dann durch Ultrafiltration (Filtron Zentrifugen-Ultrafiltrationsröhrchen, 10K Grenze) eingeengt
bis die berechnete Verdünnung
der nicht zurückbehaltenen
Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht > 106 betrug.
-
N-Ac-Adda-D-Ala-Protein-Konjugat
-
Herstellung von HRP-MC-YR
und AminoHRP.
-
Meerrettichperoxidase
(HRP) wurde durch das Verfahren von Hermanson oxidiert. HRP (19,73
mg, Boehringer) wurde in PBS gelöst
und auf 4°C
abgekühlt.
NaIO4 (36,7 mg) wurde in Wasser (2 ml) gelöst und 100 μl davon wurden
zu der HRP-Lösung gegeben,
die schnell grün
wurde. Die Reaktion wurde im Dunkeln während 20 min bei 4°C gehalten,
dann wurde das HRP von Material mit niedrigem Molekulargewicht durch Elution
mit PBS durch eine Entsalzungssäule
(Bio-Rad Econo-Pac 10DG) getrennt.
-
-
Zur
Hälfte
des oxidierten HRP wurde MC-YR-Cysteamin (51 μg, siehe unten) in MeOH (50 μl) gegeben.
Zu der anderen Hälfte
wurde Diaminoethanhydrochlorid (500 mg) in PBS (500 μl) gegeben.
NaBH3CN (16,4 mg) wurde in PBS (500 μl) gelöst und 100 μl davon wurden
zu jeder HRP-Reaktion gegeben (die sofort karminrot wurde). Nach
Stehenlassen bei 4°C
im Dunkeln während
ungefähr
16 h wurden die Reaktionen durch Zugabe von Diethanolamin in PBS
(50 μl von
300 μl Diethanolamin
in 5 ml PBS) gequencht und bei 4°C im
Dunkeln während
2 h stehen gelassen. Die HRP-Lösungen wurden
dann gereinigt, indem man sie durch Entsalzungssäulen laufen ließ (siehe
oben). Das Diaminethankonjugat (das fortan als AminoHRP bezeichnet wird)
und MC-YR-Konjugate wurden weiter durch Ultrafiltration bis zu einer
Verdünnung > 104 gereinigt
(wie vorstehend).
-
Herstellung von HRP-,
AminoHRP- und OVA-ADDA-HG.
-
HRP,
AminoHRP und OVA wurden jeweils in PBS (1 ml) gelöst. Zu Me-ADDA-HG
(0,67 mg) wurde CDI (1,16 mg) in trockenem DMF (100 μl) gegeben
und man ließ die
Reaktion bei Umgebungstemperatur 1,5 h fortschreiten, worauf trockenes
DMF (150 μl)
zugegeben wurde. Ein Teil dieser Lösung wurde zu den Lösungen der
Proteine (50 μl
zu AminoHRP, 100 μl
zu HRP und OVA) gegeben. DMSO (200 μl) wurde dann zur Unterstützung der
Solubilisierung der Reaktanden zu den HRP- und OVA-Reaktionen gegeben
und die drei Reaktionen wurden im Dunkeln während ungefähr 16 h bei 4°C bewahrt.
Dann wurden die Konjugate auf der Entsalzungssäule gerei nigt und dann weiter
durch wiederholte Ultrazentrifugation auf eine Verdünnung > 3 × 104 gereinigt
(wie vorstehend).
-
-
Herstellung
von MC-YR-Cysteamin-Konjugat
-
Das
Verfahren basiert auf denjenigen von Kondo et al. (1992) und Sherlock
et al. (1998). Cysteamin (15,6 mg) wurde in Wasser (500 μl) gelöst und MC-YR
(500 μg)
wurde in 5% K2CO3 (500 μl) gelöst. Die
Cysteaminlösung
(50 μl,
gefolgt von 100 μl
bei 30 min) wurde zu der MC-YR-Lösung
in Teilen zugegeben. Nach ungefähr
2 h wurde die Reaktion auf pH 3 bis 4 angesäuert und auf eine Umkehrphasen-Flashsäule (4 × 1 cm) gegeben.
Die Säule
wurde nacheinander mit Wasser (10 ml), 10% MeOH (10 ml), 20% MeOH
(10 ml), 30% MeOH (10 ml), 50% MeOH (2 × 10 ml), 70% MeOH (2 × 10 ml)
und MeOH (3 × 10
ml) eluiert. Eine HPLC-Analyse wies darauf hin, dass das Produkt
in den 50% MeOH und der ersten der 70% MeOH-Fraktionen war. Diese Fraktionen wurden
vereinigt und das Lösungsmittel
im Vaku um entfernt, um MC-YR-Cysteamin als farblosen Feststoff (204 μg) zu ergeben.
ESI-MS m/z 1121,9
(M – H–); 1H, COSY und HMBC NMR Spektren stimmten mit
dem erwünschten
Produkt überein.
-
Immunisierung
von Schafen und Mäusen
mit ADDA-Proteinkonjugaten Neun Schafe und neun Mäuse wurden
mit den vorstehenden BSA-ADDA-, cBSA-ADDA- und OVA-ADDA-Konjugaten (drei
Tiere für
jedes Konjugat) immunisiert. Ein mg von jedem Konjugat wurde im
Falle der primären
Injektion in einem Volumen von 1 ml Phosphatpuffer-Salzlösung zu
freundschen vollständigen
Adjuvantien gegeben und zur Bildung einer Emulsion homogenisiert,
und im Falle von Injektionen zur Auffrischung zu freundschen unvollständigen Adjuvantien
gegeben. Die Tiere erhielten mindestens drei Auffrischungen im Falle
von Schafen und sechs Auffrischungen im Falle von Mäusen in
Zeitabständen
von näherungsweise
4 Wochen.
-
ELISA
-
Indirekter ELISA unter
Verwendung des polyklonalen Antikörpers #824
-
ELISA-Platten
(NUNC MaxiSorp 1 #439454, Dänemark)
wurden mit OVA-N-acetyl-D-alanyl-ADDA-Konjugat
(OVA-ADDA-HG3/99')
in 0,05 M Natriumbicarbonatpuffer pH 9,6 (75 μl, 2,5 μl/ml) über Nacht bei 22°C (RT) beschichtet.
Nach Waschen mit PBS wurden zusätzliche
Bindungsstellen durch Inkubation mit OVA (1% w/v, 300 μl, 1 h, 20–25°C) blockiert.
Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet oder
bei 4°C
bis zu 7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard
(50 μl)
zusammen mit Antiserum (50 μl)
mit der geeigneten Verdünnung
(zum Beispiel Schaf-Serum #82426/6/00 mit
1/200000; vergleiche 5) zu den Vertiefungen gegeben.
Nach Inkubation bei 20–25°C während 2
h wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20
(PBST) und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde ein sekundärer Antikörper, Meerrettichperoxidase
konjugierter Antispezies-Antikörper,
zum Beispiel ICN/Cappel Anti-Schaf-HRP (100 μl, 1/6000) zu den Vertiefungen
gegeben und während
2 h inkubiert. Danach wurden die Vertiefungen abgesaugt, zweimal
mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde eine TMB-Lösung, hergestellt
durch Zugabe von 110 μl
TMB-Stammlösung
(10 mg/ml in DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 5,5),
der 0,005% H2O2 enthielt,
zugegeben und während
15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 μl, 2 M) gestoppt
und die Extinktion bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer
bestimmt. Standards und Proben wurden für den ELISA durch Verdünnen in
den folgenden Verdünnungsmitteln
hergestellt: (i) Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration
von 10% (v/v); (ii) PBS; (iii) Seewasser (Bodensee, Deutschland);
(iv) Leitungswasser; (v) Flusswasser, Waikato River, Neuseeland.
Alle Proben wurden mindestens in zweifacher Ausführung und über einen Bereich von Verdünnungen analysiert.
-
Ausführliche Beschreibung des ELISA-Verfahrens
unter Verwendung des Antikörpers
ADDA-#824226/6/00
-
Das
Prinzip des verwendeten indirekten kompetitiven Mycrocystin-ELISA
(MC-ELISA) ist in 4 gezeigt.
Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
- 1.
Stelle das Antigen (OVA-ADDA-HG3/99) in
Bicarbonatpuffer, pH 9,6 mit 2,5 μg/ml
(5 ml +/Platte) her.
- 2. Trage das Antigen auf eine Mikrotiterplatte mit 75 μg/Vertiefung
auf, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken, inkubiere über Nacht
bei Raumtemperatur (RT, 22°C)
- 3. Wasche zweimal in PBS, sauge ab.
- 4. Blockiere die Platte mit 1% OVA (Nr. A-5503 von Sigma) (300 μl für 1 Stunde
bei RT (22°C))
- 5. Wasche zweimal in PBS, sauge ab und verwende sofort oder
gib 2–300 μl PBS zur
Lagerung dazu.
Die Platten können in diesem Stadium in PBS
(bei 4°C)
für bis
zu 7 Tage gelagert werden.
- 6. Gib 50 μl
Probe oder Standard in PBS;
und 50 μl des Antikörpers ADDA-#82426/6/00 (entwickelt
in Schafen) mit einer Verdünnung
von 1/200000 in einem OVA-Inhibitor dazu und inkubiere während 2
Stunden bei RT (22°C).
Standardkurve:
Anfänglich
5000 ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:8 (1 + 7) in 10%
MeON/PBS.
- 7. Wasche zweimal in PBS/Tween, zweimal in PBS.
- 8. Gib 100 μl
des in OVA (Peroxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Schaf IgG (ICN
#55814)) mit einer Endverdünnung
von 1/6000 dazu und inkubiere während
2 Stunden bei RT (22°C).
- 9. Wasche zweimal in PBST, zweimal in PBS, sauge ab.
- 10. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt
13 werden 15 Minuten zum Aufwärmen
benötigt.
- 11. Gib 100 μl
Substrat dazu. Inkubiere während
15 Minuten bei RT (22°C)
bis sich eine Färbung
entwickelt.
- 12. Gib 50 μl
Stopplösung
dazu (2 M H2SO4).
- 13. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion
bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann,
falls das erforderlich ist.
-
Direkter ELISA unter Verwendung
des polyklonalen Antikörpers
#825
-
ELISA-Platten
(NUNC MXISORP 1 #439454, Dänemark)
wurden mit dem geeigneten Antiserum (#82514/12/98)
in 0,5 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6 (50 μl, 1/20000) über Nacht bei 20°C beschichtet.
Nach 2 × Waschen
mit PBS wurden zusätzliche
Bindungsstellen durch Inkubation mit BSA (1% w/v, 300 μl, 1 h, 20–25°C) blockiert.
Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet
oder bei 4°C
für bis zu
7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard
(50 μl)
zusammen mit dem geeigneten Hapten-Enzym-Konjugat (50 μl, NH2-ADDA-HRP3/99, 200
ng/ml) zu den Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation bei 20–25°C während 3
Stunden wurden die Vertiefungen zweimal mit PBST und zweimal mit
PBS gewaschen. Dann wurde die TMB-Substratlösung, hergestellt durch Zugabe
von 110 μl
TMB-Stammlösung
(10 ng/ml DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M pH 5,5), der
0,005% H2O2 enthielt,
zugegeben und anschließend
während
15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 μl, 2 M) gestoppt
und die Extinktion wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer
bei einer Wellenlänge
von 450 nm bestimmt. Standardlösungen
und Proben wurden für
den ELISA durch Verdünnen
in den folgenden Verdünnungsmitteln hergestellt:
(i) Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration von
10% (w/v); (ii) PBS; (iii) Seewasser (Bodensee, Deutschland); (iv)
Leitungswasser; (v) Flusswasser (Waikato River, Neusee land). Alle
Proben wurden mindestens in zweifacher Ausführung und über einen Bereich von Verdünnungen
analysiert.
-
Ausführliche Beschreibung des direkten
ELISA-Verfahrens (Beispiel 99153005)
-
- 1. Stelle Antiserum (#825, entwickelt in Schafen)
in Bicarbonatpuffer pH 9,6 mit 1/20000 (5 ml/Platte) her. Beschichte
eine Mikrotiterplatte mit 50 μl
Antiserum pro Vertiefung, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken,
inkubiere über
Nacht bei Raumtemperatur (RT, 22°C).
- 2. Wasche 2 × PBS,
sauge ab.
- 3. Blockiere die Platte mit 1% BSA (300 μl für 1 Stunde bei RT (22°C)).
- 4. Wasche 2 × PBS,
sauge ab und verwende oder gib 200–300 μl PBS zur Lagerung dazu.
Die
Platten können
in diesem Stadium in PBS (bei 4°C)
für bis
zu 7 Tage gelagert werden.
- 5. Gib 50 μl
Probe oder Standard in PBS und 50 μl des Hapten-Enzym-Konjugats
(NH2-ADDA-HRP) 200 ng/ml in einem BSA-Inhibitor
dazu und inkubiere während
3 Stunden bei Raumtemperatur RT (22°C).
Standardkurve: Anfänglich 2000
ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:6 in PBS.
- 6. Wasche 2 × PBST/,
2 × PBS.
Sauge ab.
- 7. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt
10 werden 15 Minuten zum Aufwärmen
benötigt.
- 8. Gib 100 μl
Substrat dazu. Inkubiere während
15 Minuten bei RT (22°C).
- 9. Gib 50 μl
Stopplösung
dazu (2 M H2SO4).
- 10. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion
bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann,
falls das erforderlich ist.
-
Die
Ergebnisse des vorstehend beschriebenen Tests sind in 6 erläutert.
-
Indirekter ELISA unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers #3G10B10 (ASSAY 9910n001)
-
ELISA-Platten
(NUNC MXISORP 1 #439454, Dänemark)
wurden mit OVA-ADDA-HG-Konjugat
in 0,05 M Natriumbicarbonatpuffer pH 9,6 (50 μl, 2,5 μg/ml) über Nacht bei 20°C beschichtet.
Nach einem Waschen mit PBS wurden zusätzliche Bindungsstellen durch
Inkubation mit BSA (1% w/v, 300 μl,
1 h, 20–25°C) blockiert. Die
Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet oder
bei 4°C
für bis
zu 7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard
(50 μl)
zusammen mit dem monoklonalen Antikörper (50 μl) mit der geeigneten Verdünnung (zum
Beispiel #3G10B10 mit 1/750) zu den Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation
bei 20–25°C während 2
Stunden wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20 (PBST)
und zweimal mit PBS gewaschen. Nach Inkubation bei 20–25°C während 2
h wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20
(PBST) und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde der sekundäre Antikörper, Meerrettichperoxidase-konjugierter
Antispezies-Antikörper,
zum Beispiel Silenus DAH Anti-Maus-HRP
(100 μl,
1/2000) zu den Vertiefungen gegeben und während 2 h inkubiert. Dann wurde
die TMB-Substratlösung,
hergestellt durch Zugabe von 110 μl
TMB-Stammlösung (10
ng/ml DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 5,5), der 0,005%
H2O2 enthielt, zugegeben
und anschließend
während
15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 μl, 2 M) gestoppt
und die Extinktion wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer
bei 450 nm bestimmt. Standards wurden für den ELISA durch Verdünnen in
dem Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration von
10% (v/v) hergestellt. Alle Proben wurden mindestens in zweifacher
Ausführung
und über
einen Bereich von Verdünnungen
analysiert.
-
Die
Ergebnisse des vorstehend beschriebenen Tests sind in 7 erläutert.
-
Ausführliche Beschreibung des ELISA-Verfahrens
unter Verwendung des Antikörpers
#3G10B10
-
Das
Prinzip des verwendeten indirekten kompetitiven Mycrocystin-ELISA
(MC-ELISA) ist in 4 gezeigt.
Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
- 1.
Stelle das Antigen (OVA-ADDA-HG3199) in Bicarbonatpuffer, pH 9,6
mit 2,5 μg/ml
(5 ml/Platte) her.
- 2. Trage das Antigen auf eine Mikrotiterplatte mit 50 μg/Vertiefung
auf, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken, inkubiere über Nacht
bei Raumtemperatur (RT, 22°C)
- 3. Wasche zweimal in PBS, sauge ab.
- 4. Blockiere die Platte mit 1% BSA – (300 μl für 1 Stunde bei RT (22°C)).
- 5. Wasche zweimal in PBS, sauge ab und verwende sofort oder
gib 2–300 μl PBS zur
Lagerung dazu.
Die Platten können in diesem Stadium in PBS
(bei 4°C)
für bis
zu 7 Tage gelagert werden.
- 6. Gib 50 μl
Probe oder Standard in PBS;
und 50 μl des Antikörpers #3G10B10 mit einer Verdünnung von
1:750 in einem BSA-Inhibitor dazu und inkubiere während 2
Stunden bei RT (22°C).
Standardkurve:
Anfänglich
1000 ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:4 (1 + 3) in PBS.
- 7. Wasche zweimal in PBS/Tween, zweimal in PBS.
- 8. Gib 100 μl
des sekundären
Antikörper-Konjugats,
verdünnt
in OVA (Meerrettichperoxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus IgG
(Silenus DAH)), mit einer Endverdünnung von 1/2000 dazu und inkubiere
während
2 Stunden bei RT (22°C).
- 9. Wasche zweimal in PBST, zweimal in PBS, sauge ab.
- 10. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt
13 werden 15 Minuten zum Aufwärmen
benötigt.
- 11. Gib 100 μl
Substrat dazu. Inkubiere während
15 Minuten bei RT (22°C)
bis sich eine Färbung
entwickelt.
- 12. Gib 50 μl
Stopplösung
dazu (2 M H2SO4).
- 13. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion
bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann,
falls das erforderlich ist.
-
Herstellung von Puffern:
-
Bicarbonatpuffer zum Beschichten
-
Löse 0,85
g Na
2CO
3 (oder 2,15
g Na
2CO
3·2H
2O) und 1,47 g NaHCO
3 in
500 ml destilliertem Wasser, stelle den pH-Wert auf 9,6 ein (ergibt
0,05 M Bicarbonat). Phosphatgepufferte
Salzlösung
(PBS) Zur
Herstellung der 10-fachen Stammlösung:
NaH2PO4·2H2O | 2,897
g (oder NaH2PO4 wasserfrei
2,06 g) |
NaH2PO4 wasserfrei | 11,938
g |
NaCl | 87,660
g |
Wiege die Phosphate ab, gib auf 800 ml Wasser
dazu, stelle einen pH-Wert von 7,4 ein, gib dann Salz dazu.
Gib
auf 1 l Wasser dazu und überprüfe den pH-Wert
(er soll 7,2 bis 7,6 betragen). Verdünne auf 1/10 zum Gebrauch:
ergibt 0,01 M wrt Phosphat und 0,15 M NaCl.
Verweisstelle:
Mishell et al. (1980)
-
PBS/Tween
-
- Suspendiere Tween-20 mit 0,05% in PBS (0,5 ml/l);
- Verwende die vorstehend beschriebenen Schritte zum Waschen.
-
OVA-Inhibitorpuffer
-
- Löse
OVA (Sigma A-5503) in PBS mit 1% (2 g/200 ml).
- Verwende dies zum Blockieren der Platten und als Verdünnungsmittel
für Ab
und Ab''.
-
Sekundärer Antikörper
-
- Er wird hierin ebenfalls als Ab'',
HRP-Konjugat und zweiter Ab bezeichnet. Die Verdünnung hängt von der verwendeten Charge
ab, näherungsweise
Verdünnungen
sind jedoch folgende:
-
ICN HRP-konjugierter Kaninchen-Anti-Schaf-IgG
#55814
-
- Verwende mit einer praktischen Verdünnung von 1/3000. Die Stammlösung wird
mit 1/10 in PBS Thiomersal (0,02%) gelagert.
-
TMB-Substrat
-
Stelle Stammlösungen her
von:
-
- 1) Natriumacetatpuffer 0,1 M, pH 5,5 (1,315
g/200 ml) (prüfe
auf einen Niederschlag vor Gebrauch).
- 2) TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)
mit 10 mg/ml DMSO; [lagere im Dunkeln bei RT (22°C)].
-
Unmittelbar vor Verwendung:
-
- Löse
110 μl TMB-Lösung (2)
in 11 ml Natriumacetatpuffer (1) und gib 165 μl H2O2 dazu (frisch hergestellt durch Verdünnen von
38 μl 30%
H2O2 (handelsübliche Konzentration)
in 2,5 ml destilliertem H2O).
-
ELISA-Platten
-
- Platten mit 96 Vertiefungen waren von NUNC (Maxisorp I Platten,
Katalog #439454).
-
Charakterisierung
des in Schafen entwickelten polyklonalen Anti-ADDA-Antikörpers
-
Die
optimalen Konzentrationen der Assayreagenzien wurden empirisch durch
schachbrettartige Titrationen bestimmt. Assaystandardkurven wurden
unter Verwendung von Microsoft Excel berechnet. Grenzwerte von 20
bis 80% der maximalen Extinktion wurden zur Bestimmung des Arbeitsbereichs
verwendet. Die Kreuzreaktivität
des Assays wurde gegen die Kongenere von MC-LR, -RR, -YR, -LW, -LF,
Desmethyl-MC-LR, Desmethyl-MC-RR und Nodularin bestimmt und aus
der Analogkonzentration berechnet, woraus sich die 50% Inhibierung
(I50) der Bindung an die Protein-ADDA-Festphase,
ausgedrückt
bezüglich
des I50 für freies Mycrocystin-LR, ergab.
Die Berechnung der Kreuzreaktivität zeigt, dass für Probenkonzentrationen
im Bereich zwischen 0,01 und 1 ng/ml die tatsächlichen Toxinkonzentrationen
im schlechtesten Fall um 5% unterschätzt wurden. Bei einer Probenkonzentration
im Bereich zwischen 1 ng/ml und 1 μg/l werden die meisten getesteten
Kongenere mit gleicher Empfindlichkeit nachgewiesen, das heißt, 100%
Kreuzreaktivität
(vergleiche 5), während die Konzentrationen von
MC-RR und Nodularin leicht überschätzt (< 5%) sind. Dies
zeigt, dass Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere zuverlässig über einen
Konzentrationsbereich nachgewiesen werden können, der um das zehnfache
niedriger ist, als der durch die WHO vorgeschlagene sichere Grenzwert.
-
Verweisstellen
-
- Beasley, V. R., Cook, W. O., Dahlem, A. M.,
Hooser, S. B., Lovell, R. A. und Valentine, W. M. (1989) Algae intoxication
in livestock and waterfowl. Veterinary Clinical North American (Food
Anim. Pract.), 5, 345–361.
- Billings, W. H. (1981) Water-associated human illness in Northeast
Pennsylvania and its suspected association with blue-green algae
blooms. In W. W. Carmichael (Hrsg.), The Water Environment – Algal
Toxins and Health. Plenum Press, New York, Seiten 243–255.
- Botes, D. P., Kruger, H. und Viljoen, C. C. (1982a) Isolation
and characterization of four toxins from the blue-green alga Microcystis
aeruginosa. Toxicon, 20, 945–954.
- Botes, D. P., Viljoen, C. C., Kruger, H., Wessels, P. L. und
Williams, D. H. (1982b) Configuration assignments of the amino acid
residues and the presence N-methyldehydroalanine
in toxins from the blue-green alga, Microcystis aeruginosa. Toxicon,
20, 1037–1042.
- Botes, D. P., Tuinman, A. A., Wessels, P. L., Viljoen, C. C.,
Kruger, H. Williams, D. H., Santikarn, S., Smith, R. J. und Hammond,
S. J. (1984) The structure of cyanoginosin-LA, a cyclic heptapeptide toxin from
the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Journal of Chemical Society,
Perkin Transactions, 1, 2311–2318.
- Botes, D. P., Wessels, P. L., Kruger, H., Runnegar, M. T. C.,
Santikarn, S., Smith, R. J., Barna, J. C. J. und Williams, D. H.
(1985) Structural studies on cyanoginosins-LR, -YR, -YA, and -YM,
peptide toxins from Microcystis aeruginosa. J. Chem. Soc. Perkin
Trans., 1, 2727–2748.
- Carmichael, W. W., Mahmod, N. A. und Hyde, E. G. (1990) Natural
toxins from cyanobacteria. In S. Hall und G. Strichartz (Hrsg.),
Marine Toxins, Origin, Structure, and Molecular Pharmacology. ACS,
American Chemical Society, Washington, DC, Seiten 87–106.
- Carmichael, W. W. (1994) The toxins of cyanobacteria. Scientific
American, 270, 64–72.
- Cousins, I. T., Bealing, D. J., James, H. A. und Sutton, A.
(1996) Biodegradation of microcystin-LR by indigenous mixed bacterial
populations. Water Research, 30, 481–485.
- Eriksson, J. E., Toivola, D., Meriluoto, J. A. O., Karaki, H.,
Han, Y.-G. und Hartshorne, D. (1990) Hepatocyte deformation induced
by cyanobacterial toxins reflects inhibition of protein phosphatases.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 173, 1347–1353.
- Falconer, I. R., Jackson, A. R. B., Langley, J. und Runnegar,
M. T. C. (1981) Liver pathology in mice in poisoning by the blue-green
alga Microcystis aeruginosa. Australian Journal of Biological Sciences,
34, 179–187.
- Falconer, I. R., Beresford, A. M. und Runnegar, M. T. C. (1983)
Evidence of liver damage by toxin from a bloom of the blue-green
alga, Microcystis aeruginosa. Medical Journal of Australia, 1, 511–514.
- Falconer, I. R., (1991) Tumor promotion and liver injury caused
by oral consumption of cyanobacteria. Environmental Toxicology and
Water Quality, 6, 177–184.
- Falconer, I. R., Choice, A. und Hosja, W. (1992) Toxicity of
edible mussels (Mytilus edulis) growing naturally in an estuary
during a water bloom of the blue-green alga Nodularia spumigena.
Environmental Toxicology and Water Quality, 7, 119–123.
- Francis, G. (1878) Poisonous Australian lake. Nature, 18, 11–12.
- Honkanen, R. E., Zwiller, J., Moore, R. E., Daily, S. L., Khatra,
B. S., Dukelow, M. und Boynton, A. L. (1990) Characterization of
microcystin-LR, a potent inhibitor of type 1 and type 2A protein
phosphatases. Journal of Biological Chemistry, 265, 19401–4.
- Hooser, S. B., Kuhlenschmidt, M. S., Beasley, V. R., Carmichael,
W. W. und Haschek, W. M. (1990) Microcystin-LR uptake and localization
in rat liver and hepatocyte suspensions (abstract). Toxicologist,
10, 294.
- Humphrey, J. M., Aggen, J. und Chamberlin, A. R. J. Am. Chem.
Soc. 1996, 118, 11759–11770. „Synthesis
of the Serine-threonine Phosphatase Inhibitor Microcystin LA."
- Jackson, A. R. B., McInnes, A., Falconer, I. R. und Runnegar,
M. T. C. (1984) Clinical and pathological changes in sheep experimentally
poisoned by the blue-green alga Microcystis aeruginosa. Veterinary
Pathology, 21, 102–113.
- James, H. A., James, C. P. und Hart, J. (1994) The analysis
of microcystin-LR in water: Application in water treatment studies.
In G. A. Codd, T. M. Jefferies, C. W. Keevil und E. Potter (Hrsg.),
Detection methods forcyanobacterial toxins. The Royal Society of
Chemistry, Cambridge, Seiten 51–58.
- Keleti, G., Sykora, J. L., Maiolie, L. A., Doerfler, D. L.,
und Campbell, I. M. (1981) Isolation and characterization of endotoxin
from cyanobacteria (blue-green algae). In W. W. Carmichael (Hrsg.),
The Water Environment, Algal Toxins and Health. Plenum Press, New
York, Seiten 447–464.
- Kenefick, S. L., Hrudey, S. E., Peterson, H. G. und Prepas,
E. E. (1993) Toxin release from Microcystis aeruginosa after chemical
treatment. Water Science and Technology, 27, 443–440.
- Kondo. F., Ikai, Y., Oka, H., Okumura, M., Ishikawa, N., Harada,
K.-I., Matsuura, K., Murata, H. und Suzuki, M. (1992) Formation,
characterization, and Toxicity of the glutathione and cysteine conjugates
of toxic heptapeptide microcystins. Chemical Research and Toxicology,
5, 591–596.
- Lawton, L. A., Edwards, C. und Codd, G. A. (1994) Extraction
and high-performance liquid-chromatographic method fort he determination
of microcystins in raw and treated waters. Analyst, 119, 1525–1530.
- MacKintosh, C., Beattie, K. A., Klumpp, S., Cohen, P. und Codd,
G. A. (1990) Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific
inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and
higher plants. FEBS Letters, 264, 187–92.
- MacKintosh, R. W., Dalby, K. N., Campbell, D. G., Cohen, P.
T., Cohen, P. und MacKintosh, C. (1995) The cyanobacterial toxin
microcystin binds covalently to cysteine-273 on protein phosphatase 1. FEBS Letters,
371, 236–240.
- Mahmood, N. A., Carmichael, W. W. und Pfahler, D. (1988) Anticholinesterase
poisonings in dogs from a cyanobacterial (blue-green algae) bloom
dominated by Anabaena flos-aquae. American Journal of Veterinary Research,
49, 500–503.
- Mishell, B. und Shiigi, S. M. (1980) Selected Methods in Cellular
Immunology. Freeman & Co,
San Francisco, Seite 458.
- Matsushima, R., Yoshizawa, S., Watanabe, M. F., Harada, K.,
Furusawa, M., Carmichael, W. W. und Fujiki, H. (1990) In vitro and
in vivo effects of protein phosphatase inhibitors, microcystins
and nodularin, on mouse skin and fibroblasts. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 171, 867–74.
- Nishiwaki-Matsushima, R., Ohta, T., Nishiwaki, S., Suganuma,
M., Kohyama, K., Ishikawa, T., Carmichael, W. W. und Fujiki, H.
(1992) Liver tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide
toxin microcystin-LR. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,
118, 420–424.
- Rinehart, K. L., Harada, K.-I., Namikoshi, M., Chen, C., Harvis,
C. A., Munro, M. H. G., Blunt, J. W., Mulligan, P. E., Beasley,
B. R., Dahlem, A. M. und Carmichael, W. W. (1988) Nodularin, Microcystin,
and the Configuration of ADDA. Journal of the American Chemical
Society, 110, 8557–8558.
- Runnegar, M. T. C., Gerdes, R. G. und Falconer, I. R. (1991)
The uptake of the cyanobacterial hepatotoxin microcystin by isolated
rat hepatocytes. Toxicon, 29, 43–51.
- Runnegar, M., Berndt, N., Kong, S., Lee, E. Y. C. und Zhang,
L. (1996) In vivo and in vitro binding of microcystin to protein
phosphatases 1 and 2A (abstract). Toxicologist, 30, 330.
- Sherlock, I. R., Furey, A., James, K. J., Caudwell, F. B. und
MacKintosh, C. (1998) New methods for the detection and identification
of cyanobacterial toxins and their application to Irish freshwater.
In: Reguera, B., Blanco, J., Fernandez, M. L., Wyatt, T. Harmful
Algae, VIII International Conference, Vigo, Spanien, 529–532.
- Sivonen, K., Namikoshi, M., Evans, W. R., Carmichael, W. W.,
Sun, F., Rouhiainen, L., Luukkainen, R. und Rinehart, K. L. (1992a)
Isolation and characterization of a variety of microcystins from
seven strains of the cyanobacterial genus Anabaena. Applied Environmental
Microbiology, 58, 2495–500.
- Sivonen, K., Namikoshi, M., Evans, W. R., Gromov, B. V., Carmichael,
W. W. und Rinehart, K. L. (1992b) Isolation and structures of five
microcystins from a Russian Microcystis aeruginos strain CALU 972.
Toxicon, 30, 1481–5.
- Sivonen, K., Skulberg, O. M., Namikoshi, M., Evans, W. R., Carmichael,
W. W. und Rinehart, K. L. (1992c) Two methyl ester derivatives of
microcystins, cyclic heptapeptide hepatotoxins, isolated from Anabaena
flos-aquae strain CYA 83/1. Toxicon, 30, 1465–71.
- Skulberg, O. M., Codd, G. A. und Carmichael, W. W. (1984) Toxic
blue-green algal blooms in Europe: A growing problem, Ambio, 13,
244–247.
- Tencalla, F. G., Dietrich, D. R. und Schlaffer, C. (1994) Toxicity
of Microcystis aeruginosa peptide toxin to yearling rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology, 30, 215–224.
- Tencalla, F. (1995) Toxicity of cyanobacterial peptide toxins
to fish. Ph. D. Thesis, ETH Zürich.
- Theiss, W. C., Carmichael, W. W., Wyman, J. und Bruner, R. (1988)
Blood pressure and hepatocallular effects of the cyclic heptapeptide
toxin produced by the freshwater cyanobacterium (blue-green alga)
Microcystis aeruginosa strain PCC-7820. Toxicon, 26, 603–613.
- Tisdale, E. S. (1931) Epidemic of intestinal disorders in Charleston,
W. VA., occurring simultaneously with umprecedented water supply
conditions. American Journal of Public Health, 21, 298–200.
- Tsuji, K., Naito, S., Kondo, F., Ishikawa, N., Watanabe, M.
F., Suzuki, M. und Harada, K.-I. (1994) Stability of microcystins
from cyanobacteria: Effect of light on decomposition and isomerization.
Environmental Science and Technology, 28, 173–177.
- Watanabe, M. M., Kaya, K. und Takamura, N. (1992a) Fate of the
toxic cyclic heptapeptides, the microcystins, from blooms of Microcystis
(cyanobacteria) in a hypertrophic lake. Journal of Phycology, 28,
761–767.
- Watanabe, M. F., Tsuji, K., Watanabe, Y., Harada, K.-I. und
Suzuki, M. (1992b) Release of heptapeptide toxin (microcystin) during
the decomposition process of Microcystis aeruginosa. Natural Toxins,
1, 48–53.
- Wicks, R. J. und Thiel, P. G. (1990) Environmental factors affecting
the production of peptide toxins in floating scums of the cyanobacterium
Microcystis aeruginosa in a hypertrophic African reservoir. Environmental
Science and Technology, 24, 1413–1418.
- Yoshizawa, S., Matsushima, R., Watanabe, M. F., Harada, K.-I.,
Ichihara, A., Carmichael, W. W. und Fujiki, H. (1990) Inhibition
of protein phosphatases by microcystin and nodularin associated
with hepatotoxicity. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,
116, 609–614.