DE69630880T2

DE69630880T2 - Wachstumsfaktoren für pflanzenzellen

Info

Publication number: DE69630880T2
Application number: DE69630880T
Authority: DE
Inventors: Youji Sakagami; Yoshikatsu Matsubayashi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 1995-04-12
Filing date: 1996-04-11
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2016-04-12
Also published as: AU701582B2; JP3789134B2; AU5287996A; NZ304985A; DE69630880D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die Eigenschaften eines Wachstumsfaktors für Pflanzenzellen besitzen.
Die folgenden, von Pflanzen abgeleiteten Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen sind bekannt; von Gerstenpflanzen abgeleiteter aus fettlöslicher Fettsäure, die ein Molekulargewicht von 600 oder weniger hat [Journal of Plant Physiology, Vol. 121, S. 181– 191, 1985], der von Kiefern abgeleitete Wachstumsfaktor, der aus Oligosacchariden besteht, die ein Molekulargewicht von 1000 oder weniger haben [Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol. 26, S. 53–59, 1991], der von Möhren abgeleitete, hitzestabile Wachstumsfaktor, der ein Molekulargewicht von ungefähr 700 hat [Plant Science, Vol. 51, S. 83–91, 1987] und der von dem schwarzen, mexikanischen Mais abgeleitete Wachstumsfaktor, der ein Molekulargewicht von 1350 oder weniger hat, der ähnliche Eigenschaften wie Oligosaccharide hat und der weder von einem Anionen-Austausch-Harz noch von einem Kationen-Austausch-Harz in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5 adsorbiert wird [Journal of Plant Physiology, Vol. 132, S. 316–321, 1988].
Es ist schwierig diese bekannten, von Pflanzen abgeleiteten Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen zu isolieren und zu reinigen und ein Verfahren zur Massenherstellung dieser Faktoren ist nicht bekannt. Um einen Wachstumsfaktor für Pflanzenzellen als Wachstumsfaktor für Pflanzenzellen zu verwenden, muss ein Wachstumsfaktor für Pflanzenzellen gefunden werden, der in Massen herstellbarer ist.
Peptide, die Ähnlichkeiten mit denen der vorliegenden Erfindung haben, wurden ebenfalls in einem anderen Kontext gefunden. So enthüllt EP-A-0 448 093 Hirudin-Derivate, die ein A-Thr-Tyr-Thr-Asp als eine N-terminale Sequenz haben, wobei der Rest A ein Ala, Gln, His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp oder Asn O sein kann, welches durch proteolytische oder chemische Spaltung entfernt werden kann. Zur Untersuchung von Interaktionen basierend auf aromatischen Aminosäuren und Peptiden wurde eine Serie von alternierenden Tyrosyl- Pentapeptiden konstruiert (Nature New Biology, Vol. 243, S. 155–157, 1973). WO 94/11018 enthüllt Opioid-Peptide zur selektiven Hemmung der Bindung an Opioid-Rezeptoren. Eine Serie von Pentapeptiden mit der Formel Tyr-Pro-Tyr-X-Val, wobei der Rest X eine Aminosäure ist, wurde zur Untersuchung der Formation von β-Faltung von kleinen linearen Peptiden in wässrigen Lösungen enthüllt (Journal of Molecular Biology, Vol. 201, S. 161– 200, 1988). Ein Verfahren zur Herstellung großer, statistisch verschiedener zufälliger Peptid-Genbanken wurde enthüllt, wobei zwei Pentapeptide der Formeln Tyr-Gly-Tyr-Phe-Phe und Tyr-Gly-Tyr-Trp-Gln identifiziert wurden (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 3, S. 419–424, 1993). Partiell geschützte Peptide, die ähnlich zu denen der vorliegenden Erfindung sind, wurden durch das Testen von neuen Verfahren in der Festphasensynthese erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide der folgenden Formel (I):
wobei einer der Reste R¹ und R² eine SO₃H-Gruppe darstellt und der andere eine SO₃H-Gruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; der Rest X eine α-Aminosäure oder eine Einfachbindung darstellt; die Reste Z¹ und Z² gleich oder verschieden sind und jeweils eine α-Aminosäure darstellen; und der Rest Y eine OH- oder eine NH₂-Gruppe darstellt.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Peptiden der Formel (I):
wobei die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden sind und jeweils eine SO₃H-Gruppe oder ein Wasserstoffatom darstellen; der Rest X eine α-Aminosäure oder eine Einfachbindung darstellt; die Reste Z¹ und Z² gleich oder verschieden sind und jeweils eine α-Aminosäure darstellen; und der Rest Y eine OH- oder eine NH₂-Gruppe darstellt, als Promotoren des Wachstums von Pflanzenzellen.
Verbindungen der Formel (I) werden nachfolgend als Verbindung (I) bezeichnet.
In den Definitionen der Gruppen der Formel (I) bedeutet eine α-Aminosäure eine aliphatische Aminosäure wie z. B. Glycin, Alanin, Valin, Leucin, und Isoleucin; Hydroxyaminosäuren wie z. B. Serin und Threonin; Schwefel enthaltene Aminosäuren wie z. B. Cystein, Cystin und Methionin; saure Aminosäuren wie z. B. Asparaginsäure und Glutaminsäure; Amid-Aminosäuren wie z. B. Asparagin und Glutamin; basische Aminosäuren wie z. B. Lysin, Arginin und Ornithin; aromatische Aminosäuren wie z. B. Phenylalanin und Tyrosin; und heterozyklische Aminosäuren wie z. B. Histidin, Tryptophan, Prolin und Hydroxyprolin. Unter diesen α-Aminosäuren für Rest X werden Amind-Aminosäuren bevorzugt, besonders bevorzugt wird Glutamin. Unter diesen α-Aminosäuren für Rest Z¹ werden aliphatische Aminosäuren bevorzugt, besonders bevorzugt werden Valin und Isoleucin. Unter diesen Aminosäuren für Rest Z² werden Hydroxyaminosäuren bevorzugt.
Verbindung (I) ist ein Wachstumsfaktor für Pflanzenzellen, der durch eine Extraktion von höheren Pflanzen oder durch eine gewöhnliche Peptidsynthese erhalten werden kann.
Pflanzen, aus denen die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung extrahiert werden können, können eine beliebige Monokotyledone sein, eingeschlossen Spargel-, Reis- und Maispflanzen. Die Extraktion kann durch ein Extraktionsverfahren unter Verwendung von wässrigen Medien erreicht werden (Plant Cell Tissue Culture, geschrieben von Harada & Komamine, 1979, veröffentlicht in Rikohgaku-sha, S. 382) oder durch ein Verfahren zur Sammlung der aktiven Fraktionen von Kulturen kultivierter Zellen (Plant Cell Tissue Culture, geschrieben von Harada & Komamine, 1979, veröffentlicht in Rikohgaku-sha, S. 27).
Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen können das Zellwachstum in allen Pflanzenzellen fördern und sind besonders effektiv bei der Förderung des Zellwachstums von Monokotyledonen wie z. B. Spargel-, Reis- und Maispflanzen.
Als ein Verfahren zur Extraktion eines Wachstumsfaktors für Pflanzenzellen von höheren Pflanzen kann das nachfolgende Verfahren verwendet werden; Zellen, die kultiviert werden sollen, werden von höheren Pflanzen durch gewöhnliche Verfahren gesammelt (Plant Cell Tissue Culture, geschrieben von Harada & Komamine, 1979, veröffentlicht in Rikohgaku-sha, S. 27) und die geernteten Zellen werden in ein Medium implantiert, das für die gewöhnliche Kultivierung von Pflanzenzellen verwendet wird (Plant Science, Vol. 65, S. 111–171, 1989), und dort unter Schütteln bei 20 bis 30°C, vorzugsweise bei 24 bis 28°C, für 8 bis 16 Tage, vorzugsweise für 9 bis 11 Tage, kultiviert. Nach der Schüttelkultivierung wird das Kulturmedium von den Zellen durch Zentrifugation, etc., getrennt, um ein konditioniertes Medium (nachfolgend als CM bezeichnet) zu erhalten.
Ein Anionen-Austausch-Harz wie z. B. DEAE Sephadex^® A-25, DEAE Zellulose und DEAE Sepharose^® wird in Puffer (pH-Wert 6,5 bis 8,0) wie z. B. 10 bis 100 mM Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer oder Natriumcarbonat-Kohlensäure-Puffer quellen gelassen. Anschließend werden die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen, die im CM enthalten sind, an das Anionenaustausch-Harz durch ein Säulenverfahren oder durch ein Batch-Verfahren adsorbiert. Als nächstes können die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen durch das Eluieren mit Salzen wie z. B. Kaliumchlorid und Natriumcarbonat gewonnen werden, wobei die Salzkonzentration schrittweise von 10 auf 2000 mM erhöht wird. Die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen werden bei einer Salzkonzentration von 800 bis 2000 mM, vorzugsweise von 1000 bis 1250 mM, eluiert.
Die resultierenden Fraktionen werden anschließend durch Dialyse entsalzt und anschließend auf einer Gelpermeations-Säule, vorzugsweise Bio-Gel^® P2, Bio-Gel^® P4 (beide hergestellt von BioRad) oder Sephadex^® G25 (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen.
Die aktiven Fraktionen, nun entsalzt durch Dialyse und Gelpermeation, werden anschließend unter Verwendung einer hochauflösenden Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie (Reversed-Phase-HPLC) mit Nucleosyl-100-C18^® (hergestellt von Nagel) oder Microsolve^® PR18 (herstellt von Merck) als Träger fraktioniert. Die gereinigten Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen werden von den Fraktionen mit einer Retentionszeit zwischen 8 bis 12 Minuten erhalten, die mit einem Lösungsmittel aus Wasser-Acetonitril, Wasser-Methanol oder Wasser-Ethanol eluiert werden, das Trifluoressigsäure (TFA) enthält.
Außer wie vorstehend beschrieben, kann Verbindung (I) gemäß der Peptid-Synthese wie nachfolgend hergestellt werden, die zum Beispiel in „Peptide Synthesis" in N. Izumiya et al. (veröffentlicht in Maruzen Publishing, 1975) beschrieben ist: Ein Peptidgerüst wird synthetisiert und das Gerüst wird mit einem Enzym wie z. B. Arylsulfotransferase sulfoniert, das Sulfonatgruppen an Seitenketten von Tyrosinresten binden kann, um die gewünschten Peptide zu erhalten.
Verbindung (I) kann als Promoter für Pflanzenwachstum verwendet werden, wie in den nachfolgenden Ausführungsformen gezeigt ist.
(1) Herstellungen einer Flüssigkeit:
Verbindung (I) wird in einer wässrigen Lösung gelöst, die ein Konservierungsmittel und einen den pH-Wert einstellenden Wirkstoff mit einer Konzentration von 0,0001 bis 1% enthält, um einen Promoter des Zellenwachstums von Pflanzen herzustellen. Das Konservierungsmittel schließt Borsäure, Bleichungspulver, Benzoesäure, Salicylsäure, Sorbinsäure, Dehydracetsäure, Propionsäure, Isocyanursäure, chlorige Säure, hypochlorige Säure, p-Hydroxybenzoesäure und ihre Ester, Lauryltrimethylammonium-2,4,5-trichlorocarbanilid, Tribromosalicylanilid, 3,4,4'-Trichlorocarbanilid, Hexachlorophen, Bithionol, Chloramin-T, Chloramin-B und Halazon ein. Unter diesen wird Sorbinsäure bevorzugt. Als pH-Wert einstellender Wirkstoff kann jeder herkömmlich verwendete, den pH-Wert einstellende Wirkstoff wie z. B. Citrate und Phosphate entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Die so erhaltene Flüssigkeitsherstellung wird 100fach bis 10000fach verdünnt, vorzugsweise 1000fach. Pflanzensamen oder Setzlinge wie z. B. Stecklinge werden in die resultierende Lösung eingetaucht oder die Lösung wird zugegeben, um Kulturen mit einer Endkonzentration des Peptids von 0,001 bis 10 ppm zu wässern. In dieser Weise kann Verbindung (I) als Promoter des Pflanzenwachstums verwendet werden.
(2) Herstellungen einer Paste:
Ein Peptid der Verbindung (I) wird mit einer Pastenbasis in einer Konzentration von 0,1 bis 10 ppm verknetet, um einen Promoter des Zellwachstums von Pflanzen herzustellen. Die Pastenbasis schließt Fette, fette Öle, Lanolin, Vaseline, Paraffin, Wachs, Harze, Kunststoffe, Glykol, höhere Alkohole und Glycerin ein. Unter diesen werden Vaseline und Lanolin bevorzugt.
Die so erhaltene Pastenherstellung wird bei den gepfropften Anteilen von Pfropfen angewendet oder bei Stielen von Früchten oder an den geschnittenen Oberflächen von Stecklingen. In dieser Weise kann Verbindung (I) als Promoter des Pflanzenwachstums verwendet werden.
Ausführungsformen der Verbindung (I) sind nachfolgend gezeigt.
1 zeigt den Einfluss der CM-Konzentration auf die Frequenz der Koloniebildung für Spargelpflanzen abgeleitete, inkubierte Zellen.
Jedes Symbol in 1 hat die nachfolgende Bedeutung:
---☐---: CM 25,0%;
--♢--: CM 12,5%;
--O--: CM 6,3%;
--Δ--: CM 3,1%;
––∎––: CM 1,6%; und
--♦--: Kontrolle.
2 zeigt den Einfluss der Konzentrationen von Verbindung (I-1), Verbindung (I-2), Verbindung (I-3), Verbindung (I-6), Verbindung (I-7) und Verbindung (I-8) auf die Frequenz der Koloniebildung für Spargelpflanzen abgeleitete, inkubierte Zellen.
Jedes Symbol in 2 hat die nachfolgende Bedeutung:
---☐---: Verbindung (I-1);
--♢--: Verbindung (I-2);
--O--: Verbindung (I-3);
--Δ--: Verbindung (I-6);
--∎--: Verbindung (I-7); und
--♦--: Verbindung (I-8).
3-a zeigt das Elutionsmuster von Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen in einer DEAE Sephadex A-25 Ionenaustausch-Chromatographie; 3-b zeigt das Elutionsmuster von Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen in einer Bio-Gel P-2 besonders hoch auflösenden Chromatographie; und 3-c zeigt das Elutionsmuster von Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen in einer Develosil ODS-HG-S Reverse-Phase HPLC.
In den Figuren zeigen die Säulen die Frequenz der Koloniebildung an und die Linien zeigen die Absorption (bei 220 nm) an.
Die Wachstumsaktivität für Pflanzenzellen der vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wird in den nachfolgenden Testbeispielen gezeigt.
Testbeispiel 1:
Freie Zellen von Spargelpflanzen, die gemäß dem Verfahren von Beispiel (2) erhalten wurden, wurden in das Medium implantiert, das durch das Verfahren von Beispiel (3) hergestellt wurde, und wurden bei Anwesenheit des Wachstumsfaktors für Pflanzenzellen im Medium inkubiert. Der Einfluss des Wachstumsfaktors für Pflanzenzellen auf das Zellwachstum der inkubierten Zellen von Spargelpflanzen wurde durch Messung der Veränderung der Frequenz der Koloniebildung in jedem Medium bestimmt.
(i) Inkubation der Zellen:
Die Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen (IWAKI 3820-024) inkubiert. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurden 250 μl einer Suspension von freien, isolierten Zellen von Spargelpflanzen gegeben, die mit einer 2fachen Zelldichte der gewünschten endgültigen Zelldichte hergestellt wurde, 125 μl des flüssigen Mediums, das eine 4fache Konzentration der gewünschten Endkonzentration hatte, und 125 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser oder 125 μl des CM, das in Beispiel (4) erhalten wurde [dieses CM wurde durch Filtration (ADVANTEC DISMIC-13cp, 0,20 μm) sterilisiert und kurz vor der Verwendung verdünnt], und vollständig gemischt. Anschließend wurden die Platten mit Vinylklebeband versiegelt, um Verdunstung zu verhindern; in diesen wurden die Zellen in der Dunkelheit bei 28°C unter Schütteln bei 120 rpm (TAITEC BR-300L) inkubiert wurden,.
(ii) Beobachtung der Zellen:
Unter Verwendung eines Inversionsmikroskops (100fache Vergrößerung, OLYMPUS CK2) wurde die Anzahl der lebenden Zellen (einschließlich der Kolonie bildenden Zellen), die Anzahl der toten Zellen und die Anzahl der Kolonie bildenden Zellen, die im Sichtfeld beobachtet wurden, für jede Vertiefung bestimmt. Auf der Grundlage der Daten, die auf dieser Weise für drei oder mehr Vertiefungen erhalten wurden, wurde die Frequenz der Koloniebildung und die Zellviabilität gemäß der nachfolgenden Gleichung berechnet. C(%) = a/b × 100C: Frequenz der Koloniebildung
a: Anzahl der Kolonie bildenden Zellen
b: Anzahl lebender Zellen L(%) =[b/(b + d)] × 100L: Zellviabilität
b: Anzahl lebender Zellen
d: Anzahl toter Zellen
(iii) Effekt von CM auf die Koloniebildung
CM wurde zu den Kulturen von freien Zellen von Spargelpflanzen mit 5,0 × 10⁴ Zellen/ml und 2,5 × 10⁴ Zellen/ml mit einer CM-Endkonzentration von 25,0%, 12,5%, 6,3%, 3,1% oder 1,6% zugegeben und die Zellen wurden inkubiert. Die Frequenz der Koloniebildung der Zellen von Spargelpflanzen wurde für jede CM-Konzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Nachstehend wird das vorstehend beschriebene Verfahren als Bioanalyse von Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen bezeichnet.
1 zeigt an, dass die Frequenz der Koloniebildung in Abhängigkeit von der CM-Konzentration deutlich steigt. Daher ist es deutlich, dass das CM die Aktivität besitzt, das Wachstum von Pflanzenzellen zu fördern.
Testbeispiel 2:
Die das Zellwachstum fördernde Aktivität wurde durch das gleiche Verfahren wie in Testbeispiel (1) gemessen mit der Ausnahme, dass Verbindung (I-1), Verbindung (I-2), Verbindung (I-3), Verbindung (I-6), Verbindung (I-7) oder Verbindung (I-8) hierin verwendet wurden, die wie in Beispiel (7) (von 10^–9 M bis 10^–5 M) erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Beispiele:
A. [Extraktion von CM und die physikalisch-chemischen Eigenschaften davon]
(1) Pflanzenmaterial:
Samen von Spargelpflanzen Asparagus officinales L. cv. Mary Washington 500 W; Takii Seeds and Seedlings) wurden in Setzlingstöpfe (Durchmesser 9 cm) gesät, die mit Kureha-Kulturerde (Kureha Chemical Industry) gefüllt waren, und in einem klimatisierten Raum (Koito Industry) kultiviert. In dem klimatisierten Raum betrug die Beleuchtungsintensität 20.999 Lux auf der Oberfläche der Blätter und die Beleuchtungszeit betrug 16 Stunden/Tag als Lichtzeitraum und 8 Stunden/Tag als Dunkelzeitraum. Die Temperatur betrug tagsüber 22°C und nachts 18°C und die Luftfeuchtigkeit betrug ungefähr 80%. Die Samen keimten normalerweise ungefähr 3 Wochen nach der Aussaat und trieben ungefähr 3 Knospen innerhalb von 6 Wochen nach der Aussaat aus. Anschließend wurden die Setzlinge, die in den Töpfen gewachsen waren, in Pflanzschalen mit einem Durchmesser von 21 cm, wie benötigt, umgesetzt. Die Phyllokladien, die von den Setzlingen geerntet wurden, die für 9 Wochen nach der Aussaat kultiviert wurden, wurden in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
(2) Herstellung von Mesophyllzellen:
Eine Phyllokladie einer Spargelpflanze, die eine Länge von ungefähr 10 cm hatte, wurde für die Bioanalyse verwendet und zur Herstellung von CM wurden vier solcher Phyllokladien pro 200 ml des CM verwendet. Die geernteten Phyllokladien wurden für 30 Sekunden in 70% Ethanol eingetaucht, anschließend für 10 Minuten in einer Lösung von 10fach verdünntem Antiformin sterilisiert, das Tween 20 (2 Tropfen/100 ml) enthielt, und danach dreimal mit sterilisiertem, destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Phyllokladien unter Verwendung eines Glas-Homogenisators (22 × 167 mm, Iwaki Glass) in sterilisierten, destillierten Wasser unter einer Sterilbank homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenisat durch ein 37 μm, rostfreies Netz (Iida Manufactoring) filtriert und das Filtrat wurde zentrifugiert (100 × g, 3 min; Kubota KS-5000), um die freien Einzelzellen zu präzipitieren. Die präzipitierten, freien Einzelzellen wurden erneut in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei Verunreinigungen vollständig von den Zellen entfernt wurden.
(3) Herstellung des Mediums:
Die Zusammensetzung des Mediums, das hierin verwendet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 – Zusammensetzung des Kulturmediums
Kurz vor der Verwendung wurde das Flüssigmedium, das die in Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung hatte, mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine 4fache Konzentration der gewünschten Konzentration zu erhalten, der pH-Wert wurde auf 5,8 mit 1,0 N KOH eingestellt und anschließend wurde es durch Filterung durch einen sterilen Filter (ADVANTEC DISMIC-25cs, 0,20 μm) sterilisiert.
(4) Ernte des CM
Die freie Einzelzellsuspension, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, wurde konditioniert, um eine Zellkonzentration von ungefähr 5,0 × 10⁵ Zellen/ml zu haben, wobei eine Bürker-Türk-Zählkammer (Nippon Rinsho Kikai Kogyo) verwendet wurde. In einen 300-ml Erlenmeyerkolben wurde 50 ml der Suspension gegeben und 50 ml des Flüssigmediums, das 2fach konzentriert war, (Gesamtvolumen: 100 ml), und dieser wurde mit einem Silikonstöpsel verschlossen. Die Zellen wurden in der Dunkelheit bei 28°C unter Schütteln bei 120 rpm (TB-25R; Takasaki Kagaku Kikai) inkubiert. Am 10. Tag nach Beginn der Inkubation war das Wachstum der Zellen am höchsten, das CM wurde von der Kultur durch Saugfiltration (ADVANTEC Nr. 2) geerntet, anschließend tiefgefroren und bei –30°C gelagert.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des so erhaltenen CM werden im Detail beschrieben.
(a) thermische Stabilität:
1,5 ml des CM wurden am 10. Tag nach Beginn der Inkubation geerntet (das gleiche CM wurde hierin nachfolgend verwendet), es wurde 2fach mit 1,5 ml destilliertem Wasser verdünnt, anschließend in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt und daraufhin sofort gekühlt. In gleicher Weise wurden 1,5 ml CM 2fach mit destilliertem Wasser verdünnt und bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert.
Diese zwei Proben wurden in der Bioanalyse untersucht.
CM, das in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten gekocht wurde, behielt zu 70% seine Zellwachstum fördernde Aktivität, während CM, das bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert wurde, vollständig deaktiviert wurde.
(b) pH-Stabilität:
1,0 ml des CM wurde mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 4,0 ml verdünnt und es erfolgte eine Einstellung auf einen pH-Wert von 3,0; einen pH-Wert von 5,0; einen pH-Wert von 7,0; einen pH-Wert von 9,0 und einen pH-Wert von 11,0 mit 0,1 N HNO₃ oder 0,1 N KOH. Anschließend wurden die Proben bei 4°C für 24 Stunden aufgehoben. Anschließend wurden die Proben auf einen pH-Wert von 5,8 mit 0,1 N KOH oder 0,1 N HNO₃ eingestellt und anschließend auf ein Volumen von 2,0 ml konzentriert. Diese Proben wurden anschließend in der Bioanalyse untersucht. Der ursprüngliche pH-Wert von CM betrug ungefähr 5,0.
Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen waren fast vollständig stabil bei einem pH-Wert von 3,0; einen pH-Wert von 5,0; einen pH-Wert von 7,0 und einen pH-Wert von 9,0. Bei einem pH-Wert von 11,0 war ihre Aktivität auf ungefähr 60% reduziert.
(c) Lösungsmittelfraktionierung des CM:
2,0 ml des CM wurden auf ein Volumen von 10 ml mit destilliertem Wasser verdünnt, anschließend wurde ein pH-Wert von 3,0 mit 0,1 N HNO₃ eingestellt und eine dreifache Extraktion mit 5,0 ml Ethylacetat durchgeführt. Die resultierende, wässrige Schicht wurde mit 0,1 N KOH auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt und anschließend auf ein Volumen von 4,0 ml konzentriert. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet, anschließend zur vollständigen Trockenheit eingedampft und in 4 ml destilliertes Wasser gelöst. In gleicher Weise wurden 2,0 ml des CM auf ein Volumen von 10 ml mit destilliertem Wasser verdünnt, anschließend wurde ein pH-Wert von 11,0 mit 0,1 N KOH eingestellt und eine dreifache Extraktion mit 5,0 ml Diethylether durchgeführt. Die resultierende, wässrige Schicht wurde mit 0,1 N HNO₃ auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt und anschließend auf ein Volumen von 4,0 ml konzentriert. Die Ether-Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet, anschließend zur vollständigen Trockenheit eingedampft und in 4 ml destilliertes Wasser gelöst. Diese vier Proben wurden in der Bioanalyse untersucht.
Sowohl unter der sauren Bedingung als auch unter der basischen Bedingung behielten die wässrigen Schichten ihre das Zellwachstum fördernde Aktivität.
(d) Adsorptions- und Desorptionstest für Reverse-Phase-Träger:
Cosmosil^® 75C₁₈-OPN (10 g) (Nacalai Tesque) wurde in Methanol suspendiert, im Vakuum entgast und in eine Säule (1,7 × 8 cm; 18 ml) gefüllt. Nachdem der Träger vollständig gefüllt war, wurde das Laufmittel in der Säule durch destilliertes Wasser ausgetauscht und die Säule wurde mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden 5,0 ml des CM auf die Säule aufgetragen und mit 100 ml destilliertem Wasser, 100 ml 30% CH₃CN und 100 ml 60% CH₃CN (Flussrate: 60 ml/Stunde) in dieser Reihenfolge eluiert. Die resultierenden Fraktionen wurden unter Verwendung eines Evaporators zur vollständigen Trockenheit evaporiert, in 10 ml destilliertes Wasser gelöst und in der Bioanalyse untersucht. In der gleichen Weise wurden 10 g Diaion^® HP-20 (Mitsubishi Chemical) in Methanol suspendiert, im Vakuum entgast und in eine Säule gefüllt. Um ein Aufschwemmen des Trägermaterials zu verhindern, wurde das Trägematerial in der Säule mit Seesand B in einer Dicke von 5 mm überschichtet. Das Laufmittel in der Säule wurde durch destilliertes Wasser ersetzt und die Säule wurde mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden 5,0 ml des CM auf die Säule aufgetragen und mit 100 ml destilliertem Wasser, mit 100 ml 30% CH₃CN und mit 100 ml 60% CH₃CN (Flussrate: 60 ml/Stunde) in dieser Reihenfolge eluiert. Die resultierenden Fraktionen wurden unter Verwendung eines Evaporators zur vollständigen Trockenheit eingedampft, in 10 ml destilliertes Wasser gelöst und in der Bioanalyse untersucht.
Die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wurden nicht durch Cosmosil^® 75C₁₈-OPN und Diaion^® HP-20 zurückgehalten, sondern wurden aus der Säule mit dem destillierten Wasser eluiert. Es ist daher deutlich, dass die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen eine relativ hohe Polarität haben.
(e) Adsorptions- und Desorptionstest für aktivierte Kohle (Aktivkohle):
Aktivkohle (5,0 g) (Wako Pure Chemical Industry) wurde in 100 ml 15% Essigsäure für 30 Minuten auf 100°C erhitzt, um auf diese Weise Verunreinigungen daraus zu entfernen, mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertes Wasser suspendiert. Die resultierende Suspension wurde in eine Säule gefüllt (1,7 × 11 cm; 25 ml). Anschließend wurde 5,0 ml des CM auf die Säule aufgetragen und anschließend mit 100 ml destilliertem Wasser, mit 100 ml 15% Ethanol, mit 100 ml 30% Ethanol und mit 100 ml Aceton in dieser Reihenfolge eluiert (Flussrate: 60 ml/Stunde). Die resultierenden Fraktionen wurden unter Verwendung eines Evaporators zur vollständigen Trockenheit eingedampft, in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und in der Bioanalyse untersucht.
Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wurden sehr stark von der Aktivkohle adsorbiert und wurden nicht mit 15% Ethanol, 30% Ethanol oder Aceton eluliert, wobei es im Allgemeinen bekannt ist, dass unter diesen Konditionen neutrale Oligosaccharide und einige saure Saccharide eluiert werden.
(f) Adsorptions- und Desorptionstest für Ionen-Austausch-Harze:
DEAE Sephadex A-25 (0,8 g) (Pharmacia LKB Biotechnology) wurde in 50 ml 500 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) bei Raumtemperatur für 24 Stunden gequollen und in eine Säule (1,2 × 3,5 cm; 4,0 ml) gefüllt. Anschließend wurden 10 ml des CM lyophylisiert und das resultierende Lyophylisat wurde in 10 ml des gleichen Puffers gelöst. Anschließend wurde die Lösung auf die Säule aufgetragen und mit 20 ml des gleichen Puffers, mit 20 ml des gleichen Puffers, der 250 mM KCl enthielt, mit 20 ml des gleichen Puffers, der 500 mM KCl enthielt, und mit 20 ml des gleichen Puffers, der 1000 mM KCl enthielt, in dieser Reihenfolge eluiert (Flussrate 15 ml/Stunde). Anschließend wurde jede Eluatfraktion auf ein Volumen von 10 ml konzentriert und in einen Dialyseschlauch (Spectra/Por 7 MWCO: 1000) injiziert, dessen beide Enden mit Verschlussklammern verschlossen wurden. Diese Schläuche wurden in 3000 ml destilliertes Wasser bei 4°C für 24 Stunden zur Dialyse gegeben, um die Fraktionen zu entsalzen. Jedes Dialysat wurde auf ein Volumen von 10 ml konzentriert und anschließend in der Bioanalyse untersucht.
In gleicher Weise ließ man 0,8 g des CM Sephadex C-25 in 50 ml 500 mM KHP₂O₄-KOH-Puffer (pH-Wert 6,0) bei Raumtemperatur für 24 Stunden quellen, anschließend wurde es in 20 mM des gleichen Puffers suspendiert und in eine Säule (1,2 × 3,5 cm; 4,0 ml) gefüllt. Anschließend wurden 10 ml des CM lyophylisiert und das resultierende Lyophylisat wurde in 10 ml des gleichen Puffers gelöst. Die Lösung wurde auf die Säule aufgetragen und mit 20 ml des gleichen Puffers und mit 20 ml des gleichen Puffers, der 250 mM KCl enthielt, in dieser Reihenfolge eluiert (Flussrate 15 ml/Stunde). Jede Eluatfraktion wurde durch Dialyse entsalzt und in der Bioanalyse untersucht.
Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wurden sehr stark von Sephadex A-25 adsorbiert und wurden mit 1000 mM KCl eluiert. Andererseits wurden sie nicht von CM Sephadex C-25 adsorbiert. Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wurden mit 20 mM KHP₂O₄-KOH-Puffer eluiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen saure Substanzen sind.
(g) Deaktivierungstest aktiver Substanzen mit verschiedenen Hydrolasen:
Eine nicht spezifische Peptidase, Pronase^® E (3,0 mg) (Sigma) wurde in 3,0 ml 20 mM KHP₂O₄-KOH-Puffer (pH-Wert 7,5) gelöst. Die Präzipitate wurden durch Filtration durch einen Celluloseacetat-Filter (ADVANTEC DISMIC-13cp, 0,20 μm) entfernt, um eine Enzymlösung herzustellen. Ein Anteil (1,0 ml) der Enzymlösung wurde in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt, um eine deaktivierte Enzymlösung herzustellen. In die Testgefäße wurden 0,9 ml des selben Puffers, 1,0 ml CM oder destilliertes Wasser und 100 μl der Enzymlösung oder der deaktivierten Enzymlösung oder des gleichen Puffers gegeben und in einem heizbaren Schüttler (TAITEC, Personal-11) bei 37°C mit 170 rpm für 3 Stunden geschüttelt. Nach der Enzymreaktion wurden die Reaktionsflüssigkeiten auf einen pH-Wert von 5,8 mit 0,1 N HNO₃ eingestellt, anschließend in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt und daraufhin sofort auf Eis abgekühlt, wobei das Enzym deaktiviert wurde. Nach der Deaktivierung wurden diese Proben in der Bioanalyse untersucht.
In gleicher Weise wurden 3,0 mg Glycosidases-„Mixed" (Seikakago Kogyo), welches ein Gemisch von verschiedenen Glykosidasen ist, in 3,0 ml 20 mM Glutaminsäure-KOH-Puffer (pH-Wert 4,0) gelöst und durch einen Cellulosenitrat-Filter gefiltert, um Verunreinigungen daraus zu entfernen, um eine Enzymlösung herzustellen. Ein Anteil (1,0 ml) der Enzymlösung wurde in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt, um eine deaktivierte Enzymlösung herzustellen. In die Testgefäße wurden 0,9 ml des selben Puffers, 1,0 ml CM oder destilliertes Wasser und 100 μl der Enzymlösung oder der deaktivierten Enzymlösung oder des gleichen Puffers gegeben und in einem heizbaren Schüttler bei 37°C mit 170 rpm für 3 Stunden geschüttelt. Nach der Enzymreaktion wurden die Reaktionsflüssigkeiten auf einen pH-Wert von 5,8 mit 0,1 N KOH eingestellt, anschließend in einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt und daraufhin sofort auf Eis abgekühlt, wobei das Enzym deaktiviert wurde. Nach der Deaktivierung wurden diese Proben in der Bioanalyse untersucht.
Die vorliegenden Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen wurden vollständig deaktiviert, wenn sie mit der Peptidase, Pronase E, behandelt wurden. Dementsprechend ist es deutlich, dass diese Faktoren eine Peptidstruktur in ihrem Molekül haben und dass diese Peptidstruktureinheit wichtig für die Faktoren ist, um ihre Aktivität auszuüben.
Andererseits behielten die Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen ihre Aktivität, auch nachdem sie mit dem Glykosidase-Gemisch, Glycosidases-„Mixed", behandelt wurden.
Die vorstehend erwähnten physikalisch-chemischen Eigenschaften des CM sind nachfolgend zusammengefasst.

1. Löslichkeit: Das CM ist leicht in Wasser löslich, aber es ist schwer löslich in Ethanol und Aceton.
2. Differenzierung in saure, neutrale oder basische Eigenschaften: Das CM ist sauer.
3. Thermische Stabilität: Das CM behält 70% seiner Aktivität nach der Erhitzung auf 100°C für 10 Minuten. Nach dem Autoklavieren bei 121°C für 20 Minuten ist es deaktiviert.
4. Polarität: Das CM ist eine polare Substanz, da es in Reverse-Phase-Säulen mit Cosmosil 75C₁₈-OPN und Diaion HP-20 nicht zurückgehalten wird.
5. pH-Stabilität Das CM ist stabil bei einem pH-Wert von 3 bis 9. Bei einem pH-Wert von 11 ist seine Aktivität auf 60% reduziert.
6. Wirkung von Enzymen: Das CM wird durch Pronase E deaktiviert, behält aber seine Aktivität auch, nachdem es mit Glycosidases-„Mixed" behandelt wurde.
7. Wirkung von Ionenaustausch-Harzen: Das CM wird stark an DEAE Sephadex A-25 adsorbiert (und mit 1000 mM KCl eluiert), aber es wird nicht an CM Sephadex C-25 adsorbiert.

(B) [Extraktion, Synthese und Sequenzierung der Verbindung (I)]
(1) Man ließ DEAE Sephadex A-25 (3,0 g) in 50 ml 500 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) bei Raumtemperatur für 24 Stunden quellen, suspendierte es in 20 mM des gleichen Puffers und füllte es in eine Säule (1,7 × 8,0 cm; 18 ml). Anschließend wurden 100 ml des CM auf ein Volumen von 50 ml unter Verwendung eines Evaporators konzentriert und Tris wurde hierzu bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,4 mit 6 N HCl eingestellt. Anschließend wurde das CM auf die Säule aufgetragen und mit 30 ml des gleichen Puffers, mit 30 ml des gleichen Puffers, der 250 mM KCl enthielt, mit 30 ml des gleichen Puffers, der 500 mM KCl enthielt, mit 30 ml des gleichen Puffers, der 750 mM KCl enthielt, mit 30 ml des gleichen Puffers, der 1000 mM KCl enthielt, mit 30 ml des gleichen Puffers, der 1250 mM KCl enthielt, und mit 30 ml des gleichen Puffers, der 1500 mM KCl enthielt, in dieser Reihenfolge eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden durch ihre UV-Adsorption bei 220 nm bestimmt.
Fraktionen mit einer das Wachstum von Pflanzenzellen fördernder Aktivität wurden mit 1000 mM und 1250 mM KCl (3-a) eluiert. Nur die Fraktion, die mit 1250 mM KCl eluiert wurde, wurde lyophylisiert. Das Gewicht betrug 9,02 mg.
Jede Eluatfraktion wurde durch Dialyse (Spectra/Por MWCO: 1000) entsalzt und anschließend auf ein Volumen von 50 ml konzentriert.
(2) Gelpermeationssäule:
Die entsalzten Eluate, die von der DEAE Sephadex^®-Säule (Fraktionen, die mit 1000 mM KCl und 1250 mM KCl eluiert wurden) erhalten wurden, wurden lyophylisiert und in 1,0 ml eines 20 mM KHP₂O₄-KOH-Puffers (pH-Wert 5,8) gelöst. Anschließend wurde die resultierende Lösung auf eine Bio-Gel^® P-2 Säule mit besonders hoher Auflösung (1,7 × 37 cm) aufgetragen, die zuvor mit dem selben Puffer, der für die vorhergehende Lösung verwendet wurde, equilibriert worden war. Während die UV-Absorption bei 220 nm überprüft wurde, wurde der selbe Puffer auf die Säule mit einer Flussrate von 15 ml/Stunde (3-b) aufgetragen.
Fraktionen von jeweils 5 ml wurden gesammelt und die Aktivität jeder Fraktion wurde durch die Bioanalyse bestimmt.
(3) Reverse-Phase-HPLC-Säule:
Die aktive, eluierte Fraktion, die von der Bio-Gel^® Säule erhalten wurde, wurde lyophylisiert und anschließend in 10 μl 10% Acetonitril gelöst, das 0,1% TFA enthielt. Die resultierende Lösung wurde auf eine Develosil^® ODS-HG-S-Säule (4,6 × 250 nm, hergestellt von Nomura Chemical) aufgetragen und gemäß der isokratischen Elution mit 10% Acetonitril, das 0,1% TFA enthält, mit eine Flussrate von 1,0 ml/min chromatographiert, während die UV-Absorption bei 220 nm überprüft wurde. Fraktionen von 2 ml wurden gesammelt und ihre Aktivität wurde mittels der Bioanalyse bestimmt (3-c). Zwei aktive Fraktionen wurden gesammelt. Die Ausbeuten von 600 ml CM betrugen 2 μg der Verbindung (I-1) und 10 μg der Verbindung (I-2). Eine l0⁷fache Reinigung vom CM wurde erreicht und die Wiedergewinnung der Aktivität betrug 10%.
Die Fraktionen, die, wie vorstehend beschrieben, eluiert wurden, wurden, wie nachfolgend gezeigt, auf ihre Aminosäurezusammensetzung untersucht.
(4) Aminosäuresequenz:
Als ein Ergebnis der Analyse der Aminosäuren von Verbindung (I-1), wobei ein Gasphasen-Aminosäuren-Sequenzierer verwendet wurde, wurde ermittelt, dass Verbindung (I-1) Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln war. Das Molekulargewicht von Verbindung (I-1), das durch FAB-MS-Analyse bestimmt wurde, betrug 846, welches um 160 größer ist als das von Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln.
Zusätzlich wurden pseudomolekulare Ionen, die [M – 2H + K]^– entsprechen, bei m/z 883 beobachtet; und Fragmentionen, die [M – H + 80]^– entsprechen, wurden bei m/z 765 beobachtet.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aminosäuren, welche die Verbindung (I-1) bilden, chemisch modifiziert waren und dass die Modifikation leicht unter den Konditionen der Aminosäuresequenzierung der Verbindung entfernt werden konnten.
Die Beobachtung der Fragmentionen [M – H + 80]^– in den FAB-MS-Experimenten deuteten daraufhin, dass Verbindung (I-1) eine Sulfatverbindung war [Rogers et al.; Carbohydr Res, Vol 179, S. 7–19, 1988], und es wurde vermutet, dass die zusätzlichen 160 Masseneinheiten der Verbindung (I-1), um die das Molekulargewicht von Verbindung (I-1), wie es durch die FAB-MS-Analyse gemessen wurde, größer war als das geschätzte Molekulargewicht der Verbindung, wie es aufgrund der Aminosäurestruktur berechnet wurde, Sulfonatgruppen waren, mit denen die OH-Gruppen der zwei Tyrosinreste substituiert waren. Da die mit Sulfonatgruppen substituierten Tyrosine von DEAE-Sephadex adsorbiert werden und die Sulfonsäureeinheiten unter den Bedingungen der Aminosäuresequenzierung entfernt werden, wurde die Struktur von Verbindung (I-1) bestimmt.
Um die Struktur zu bestätigen, wurde die Verbindung (I-1) synthetisiert. Das keine Sulfatgruppen enthaltende Peptid wurde unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers synthetisiert und Sulfatgruppen wurden in das Peptid durch Arylsulfotranspeptidase [Muramatsu et al.; European Journal of Biochemistry, Vol 223, S 243–248, 1994] eingebaut. Das resultierende Peptid wurde in der Reverse-Phase HPLC bei der gleichen Retentionszeit wie Verbindung (I-1) eluiert und zeigte in der FAB-MS-Analyse ein Massenspektrum, dass charakteristisch für Verbindung (I-1) ist. Des weiteren zeigte das resultierende Peptid die biologische Aktivität in den gleichen Konzentrationen wie Verbindung (I-1).
Dementsprechend wurde die Struktur von Verbindung (I-1) durch ihre Synthese auch als H-Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln-OH identifiziert. Zusätzlich wurde ein Amid-Derivat von Verbindung (I-1) als Verbindung (I-3) synthetisiert, in dem die C-terminale Carbonsäure amidiert wurde.
Als Ergebnis des gleichen Tests, wie vorstehend beschrieben wurde, wurde die Struktur von Verbindung (I-2) als H-Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-OH.
Des weiteren wurden die folgenden Verbindungen gemäß der vorstehend beschriebenen Peptidsynthese synthetisiert: Verbindung (I-4) [SEQ ID NO: 4], welche die Struktur H-Tyr(SO₃H)-Val-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln-OH hat, die sich von Verbindung (I-1) dadurch unterscheidet, in dem sie ein Valin anstelle des Isoleucins (FAB-MS m/z 831 (M – H)^–) hat; Verbindung (I-5) [SEQ ID NO: 5], welche die Struktur H-Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Ser-Gln-OH hat, die sich von Verbindung (I-1) dadurch unterscheidet, dass sie ein Serin anstelle des Threonins (FAB-MS m/z 831 (M – H)^–) hat; Verbindung (I-6) [SEQ ID NO: 6], welche die Struktur H-Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr-Thr-Gln-OH hat, die sich von Verbindung (I-1) dadurch unterscheidet, dass eines der beiden sulfonierten Tyrosine in der letzteren durch ein Tyrosin (FAB-MS m/z 765 (M – H)^–) ersetzt wurde; und Verbindung (I-7) [SEQ ID NO 7], welche die Struktur H-Tyr-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln-OH hat, die sich von Verbindung (I-1) dadurch unterscheidet, dass eines der beiden sulfonierten Tyrosine in der letzteren durch ein Tyrosin (FAB-MS m/z 765 (M – H)^–) ersetzt wurde. Außerdem wurde Verbindung (I-8) [SEQ ID NO: 8] synthetisiert, welche die Struktur H-Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln-OH hat, die sich von Verbindung (I-1) dadurch unterscheidet, dass die zwei sulfonierten Tyrosine in der letzteren durch Tyrosine ersetzt wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Wachstumsfaktoren für Pflanzenzellen, die als Promotoren des Zellwachstums von Pflanzen verwendet werden können.
Sequenzprotokoll

Claims

Peptid der Formel:
wobei einer der Reste R¹ und R² eine SO₃H-Gruppe und der andere eine SO₃H-Gruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; der Rest X eine α-Aminosäure oder eine Einfachbindung darstellt; die Reste Z¹ und Z² gleich oder verschieden sind und jeweils eine α-Aminosäure darstellen; und der Rest Y eine OH- oder NH₂-Gruppe darstellt.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die mit X dargestellte α-Aminosäure Glutamin ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die mit Z¹ dargestellte α-Aminosäure Valin oder Isoleucin ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die mit Z² dargestellte α-Aminosäure Serin oder Threonin ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Reste R¹ und R² eine So₃H-Gruppe sind, der Rest Z¹ Ile, der Rest Z² Thr, der Rest X Gln und der Rest Y eine OH-Gruppe ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Reste R¹ und R² eine SO₃H-Gruppe sind, der Rest Z¹ Ile, der Rest Z² Thr, der Rest X Gln und der Rest Y eine NH₂-Gruppe ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Reste R¹ und R² eine SO₃H-Gruppe sind, der Rest Z¹ Ile, der Rest Z² Thr, der Rest X eine Einfachbindung und der Rest Y eine OH-Gruppe ist.
Verfahren zur Synthese des Peptids nach Anspruch 1, umfassend: a) Synthese eines Peptidgerüsts der Formel: H-Tyr-Z¹-Tyr-Z²-X-Y wobei der Rest X eine α-Aminosäure oder eine Einfachbindung darstellt; die Reste Z¹ und Z² gleich oder verschieden sind und jeweils eine α-Aminosäure darstellen; und der Rest Y eine OH- oder NH₂-Gruppe darstellt, und b) Sulfatieren des Peptidgerüsts mit einem Enzym, das eine Sulfatgruppe an die Seitenkette eines Tyrosinrests binden kann.
Verwendung eines Peptids der Formel:
wobei die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden sind und jeweils eine SO₃H-Gruppe oder ein Wasserstoffatom darstellen; der Rest X eine α-Aminosäure oder eine Einfachbindung darstellt; die Reste Z¹ und Z² gleich oder verschieden sind und jeweils eine α-Aminosäure darstellen, und der Rest Y eine OH- oder NH₂-Gruppe darstellt, als Pflanzenwachstumsverstärker.