WO2012072611A1 - SYNTHETISCHE LIGANDEN FÜR HUMANE ANTI-Aβ-ANTIKÖRPER - Google Patents

SYNTHETISCHE LIGANDEN FÜR HUMANE ANTI-Aβ-ANTIKÖRPER Download PDF

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WO2012072611A1
WO2012072611A1 PCT/EP2011/071239 EP2011071239W WO2012072611A1 WO 2012072611 A1 WO2012072611 A1 WO 2012072611A1 EP 2011071239 W EP2011071239 W EP 2011071239W WO 2012072611 A1 WO2012072611 A1 WO 2012072611A1
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peptide
stabilization
synthetic ligand
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PCT/EP2011/071239
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Michael Bacher
Karthikeyan Balakrishnan
Richard Dodel
Armin Geyer
M. Andreas Roeder
Björn ECKHARDT
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Philipps-Universität Marburg
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein

Definitions

  • the invention relates to synthetic ligands for human anti-Aß antibodies according to the
  • a ⁇ amyloid beta-peptide
  • APP amyloid precursor protein
  • a ⁇ a cleavage product that results from the degradation of APP (amyloid precursor protein). It is the transmembrane domain of the APP, which is released after extracellular cleavage of the APP with ß- and ⁇ -secretase. It can fragments of different lengths are formed, of which in particular A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 play an important role in the development of Alzheimer's disease.
  • amyloid beta-peptide which is 42 amino acids in length
  • the sequence of the sequence having SEQ ID NO. 1 corresponds, namely SEQ ID no. 1 :
  • a derivative is a substance derived from a ground substance whose structure is similar to that of the ground substance.
  • a ligand is a substance that can non-covalently bind to a target protein.
  • the binding is usually, but not necessarily, reversible and preferably via ionic bonds, hydrogen bonds, Van der Waals forces or the like. conditions.
  • a ligand is not converted by the target molecule. The binding is dependent on the three-dimensional structure of the ligand and the target protein.
  • a peptide is a small protein or a protein fragment. It has arisen from the linking of several proteinogenic amino acids via peptide bonds to form a chain with a defined sequence of different amino acids (sequence) characteristic of the particular peptide.
  • Amino acid compound which has at least one amino group and at least one carboxyl group, wherein the amino group and the carboxyl group are independently of one another at different positions of the molecule (ie terminal or at another position) and at different distances relative to each other (eg in a, ß- or ⁇ -position to each other) can be arranged.
  • These include, in particular, aminoalkanoic acids and diaminoalkanoic acids, the latter having two amino groups and one carboxyl group.
  • an amino acid according to the invention may optionally have one or more further functional groups.
  • One or more CC double or triple CC bonds, or one or more, are conceivable
  • amino acid can be chiral or achiral.
  • the naturally occurring ⁇ -amino acids represent a special embodiment of an amino acid.
  • Proteinogenic amino acid is understood to mean any naturally occurring ⁇ -amino acid which is a building block of the proteins of living organisms. These include, in particular, the naturally occurring enantiomers of: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamine, arginine, tryptophan, histidine, cysteine, methionine, aspartic acid and glutamic acid.
  • Peptide building block A peptide sequence composed of several proteinogenic amino acids, which is part of a molecule. The amino acids of the peptide building block are linked together via peptide bonds.
  • Peptide Derivative A peptide derivative is a peptide that is expressed in one or more parts of it
  • Sequence has a modified amino acid, which may be, for example, a derivative of a proteinogenic amino acid or an enantiomer of a proteinogenic amino acid.
  • a stabilization unit is understood as meaning a molecular unit or molecular residue which stabilizes the conformation of a peptide to which it is bound, and which counteracts fibrillation of the peptide in solution.
  • Sample to be tested is to be understood as meaning biological material of a human, for example a patient suspected of having Alzheimer's disease.
  • the sample to be examined is in particular blood, blood plasma or blood serum, urine, tissue, organ material.
  • Amyloid ⁇ -peptides play an important role in the development of Alzheimer's disease. They are formed by the cleavage of the amyloid precursor protein (APP) and are involved in the formation of so-called plaques. These are spherical, multicellular APP
  • Plaques are characterized by the extracellular accumulation of amyloid-ß- Containing peptides. Many years before the dementia typical for Alzheimer's disease becomes apparent, they can form in the so-called preclinical stage of the disease.
  • a ⁇ peptides circulate to the APP in a certain degree after APP cleavage by the ⁇ - and ⁇ -secretase. Only when the disease breaks out does it accumulate and accumulate in the plaques. Both healthy individuals and diseased patients have natural antibodies in their blood due to the circulating peptides in the blood, which can bind and degrade A ⁇ peptides, especially A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40.
  • the / 'n-Vivo Diagnosis of the disease hitherto usually by a combination of neuropsychological tests, the detection of biomarkers in the cerebrospinal fluid and complex imaging techniques.
  • the neuropsychological tests are usually uncertain and the detection of biomarkers in the CSF is associated with a lumbar puncture which is unpleasant for the patient.
  • the previously known diagnostic options available to the patient provide a reliable result only at the stage of dementia that has already occurred. Diagnoses in the stage of mild cognitive impairment (MCI) are very uncertain, in the preclinical stage with previously known methods with high defectiveness.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the object of the invention is therefore to provide a way to reliable preclinical diagnosis of Alzheimer's disease.
  • a way should be created to detect the formation of plaques early on.
  • a substance is to be provided which is suitable for preventive treatment in order to prevent the onset of Alzheimer's disease and / or which can be used to alleviate the typical symptoms of the disease.
  • the invention provides a synthetic ligand for human anti-Aß antibodies, comprising at least one peptide building block and at least one covalently attached to the peptide building block stabilizing unit, wherein the sequence of each peptide block to the complete sequence or to an at least five-membered subsequence of the sequence of amino acids 20 to 42 of SEQ ID no. 1, preferably to a sequence of amino acids 28 to 42 of SEQ ID NO. 1 and more preferably to the sequence of amino acids 28 to 40 of SEQ ID NO. 1 has a sequence analogy of at least 75%.
  • the synthetic ligand according to the invention has a peptide building block with a structure analogous to the complete sequence or an at least five-membered partial sequence of amino acids 20 to 42 of SEQ ID NO. 1, provides the prerequisite that with the synthetic ligand in solution at all an epitope structure can be formed, which is similar to the typical epitope structure of the toxic peptides Aß1-42 and Aß1-40 or at least so much resembling also recognized by the natural human anti-Aß antibodies. Due to the shortened compared with the natural peptides Aß1-42 and Aß1-40 embodiment, the solubility of the peptide building block can be improved and the manufacturing cost of the synthetic ligand can be reduced.
  • the conformation of the epitope is stabilized by the stabilization building block of the synthetic ligand.
  • This is of great advantage because, due to the extremely stable conformation, a stable and at the same time specific binding to anti-Aß antibodies is ensured even under changeable conditions. It has been shown that this is the case with respect to the sequence length of the peptide building block in a comparatively wide range of external conditions. Only when there is a drastic change in the external conditions (such as temperature, pH or polarity of the surrounding medium) is a conformational change induced with a dissolved synthetic ligand.
  • Synthetic ligands according to the invention therefore usually have a "switchable" conformation, which is otherwise known only from large proteins It is important, above all, that the extraordinarily high degree of tolerance to external conditions allows the desired conformation to be present changing external influences over wide areas can be kept stable.
  • the stabilization module is covalently linked to the peptide building block. This can ensure that the two components do not separate from each other. However, not only does the stabilizer become the natural conformation of the peptide chains but also avoid fibril formation of the peptide building block in solution. The avoidance of fibril formation is important, as unmodified peptides, which wholly or partially the sequence of amino acids 20 to 42 of SEQ ID NO. 1, otherwise usually are not stable in solution, but rather flocculate due to oligomerization. Peptides which show fibril formation are therefore not at all manageable in solution and thus are not suitable per se for providing an agent for the treatment and diagnosis of a disease.
  • the stabilization unit provided according to the invention stabilizes the conformation of the peptide building block so that it can be recognized by a natural anti-Aß antibody. It simultaneously prevents fibrillation and consequent flocculation of the synthetic ligand in solution. Instead, solutions are from
  • Ligands according to the invention are usually stable for several hours to days.
  • a synthetic ligand according to the invention can be handled in solution. It can also bind with high specificity to the natural anti-Aß antibodies.
  • a synthetic ligand can be used as a solid phase-bound antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that can detect the presence of human anti-Aß antibodies in a sample.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • human anti-Aß antibodies are detectable, which also bind the peptides Aß1-42 and Aß1-40.
  • synthetic ligand offers the great advantage that, because of its high binding specificity, it can be used to carry out anti-Aß antibody detection with the aid of
  • a synthetic ligand according to the invention is in principle also suitable for active immunization on account of the abovementioned properties.
  • inventive Synthetic ligands achieve very good results in investigations of neurotoxicity, indicating that the ligands of the invention are not neurotoxic.
  • synthetic ligand has a sequence which corresponds to the complete sequence or to an at least five-membered partial sequence of the sequence of amino acids 20 to 42 of SEQ ID NO. 1, or preferably to the sequence of amino acids 28 to 42 of SEQ ID NO. 1 and more preferably to the sequence of amino acids 28 to 40 of SEQ ID NO. 1, a sequence homology of greater than 75%, in particular greater than 80%, preferably greater than 85%, more preferably greater than 90 and most preferably greater than 95%.
  • the deviations from the sequence of amino acids 20 to 42 or 28 to 42 or 28 to 40 of SEQ ID NO. 1 may be formed by deletion, substitution and / or insertion of a natural or a modified proteinogenic amino acid, wherein a modified proteinogenic amino acid is to be understood in particular a structurally closely related derivative or an enantiomer of the natural amino acid.
  • a synthetic ligand in which the at least one peptide building block has an amino acid sequence which corresponds to the sequence of the amino acids of the sequences of SEQ ID no. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID no. 6, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 8, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 11 has a sequence homology of greater than 75%, in particular greater than 80%, preferably greater than 85%, more preferably greater than 90% and most preferably greater than 95%.
  • the deviations from the sequence of the amino acids of SEQ ID no. 2 to SEQ ID no. 11 may be formed by deletion, substitution and / or insertion of a natural or a modified proteinogenic amino acid, wherein the modified proteinogenic amino acids include in particular structurally closely related derivatives or enantiomers of proteinogenic amino acids.
  • a synthetic ligand in which the sequence of the at least one peptide building block is selected from the group comprising SEQ ID Nos. Is particularly advantageous. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID no. 6, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 8, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 1 1.
  • the at least one peptide building block is preferably connected at its C-terminus and / or its N-terminus to the at least one stabilization building block.
  • a terminal attachment may be advantageous, above all, because it avoids excessive steric interactions between the stabilization unit and the peptide unit, which hinders formation of an epitope for human anti-Aß antibodies. Basically, it is an immediate one
  • Linking of the two building blocks is particularly simple and straightforward; if appropriate, a linker can also be present between the peptide building block and the stabilization building block,
  • a synthetic ligand according to the invention may have one or more peptide building blocks. Especially advantageous are embodiments with 1 to 8, preferably 1 to 6 and particularly preferably 1 to 4 peptide building blocks, the peptide building blocks preferably being present in ⁇ -sheet structure.
  • the synthetic ligand has exactly one peptide building block and one stabilization building block. Depending on whether the stabilization building block is connected to the peptide building block at one or two points, the synthetic ligand has either an open-chain or a cyclic structure.
  • synthetic ligand which has at least two peptide building blocks.
  • the synthetic ligand it is possible for the synthetic ligand to have at least two peptide building blocks which are present in the ⁇ -sheet structure and arranged parallel to one another, and for the synthetic ligand to be at least two
  • the at least two peptide building blocks can each be covalently bonded to one or more stabilization building blocks.
  • stabilization building blocks to a macrocyclic ligand structure suitable.
  • the synthetic ligand has exactly two peptide building blocks and two stabilization building blocks, wherein only one of the two
  • Stabilization blocks is covalently connected to both peptide building blocks and thus connects them together like a clamp.
  • the second stabilization module is connected to only one of the two peptide building blocks.
  • the stabilization building blocks are terminally linked to the peptide building blocks (C-terminus or N-terminus). This applies in particular to the clip-type stabilization module.
  • those ligands are also advantageous in which two peptide building blocks and two stabilization building blocks are provided, with both stabilization building blocks connecting the two peptide building blocks in a clamp-like manner.
  • the synthetic ligand is macrocyclic.
  • each of the two stabilization building blocks is covalently bonded to both peptide building blocks, wherein the covalent connection here too is preferably formed at the respective terminus (C-terminus or N-terminus) of the peptide building blocks.
  • the first peptide building block has a sequence which corresponds to one of the sequences SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID no. 8, SEQ ID no. 9 or SEQ ID NO. 10 corresponds or to one of these sequences a sequence analogy of greater than 75%, in particular greater than 80%, preferably greater than 85%, particularly preferably greater than 90% and very particularly preferably greater than 95%, and if the second peptide building block has a sequence which corresponds to one of the sequences SEQ ID NO. 3, SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID no. 6, SEQ ID no. 7, SEQ ID no.
  • the first and the second peptide building block may have the same sequence or the sequences of the two peptide building blocks may be different from each other.
  • synthetic ligands in which the two peptide building blocks are one of the following
  • Sequence combinations or a corresponding combination of one or two sequence analogue peptide blocks provide, the sequence analogy is greater than 75%, in particular greater than 80%, preferably greater than 85%, more preferably greater than 90% and most preferably greater than 95%: SEQ ID No , 3 in combination with SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 4 in combination with SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 4 in combination with SEQ ID no. 4, SEQ ID NO. 6 in combination with SEQ ID no. 6, SEQ ID no. 6 in combination with SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 7 in combination with SEQ ID no. 8, SEQ ID no. 9 in combination with SEQ ID no. 9 and SEQ ID NO. 10 in combination with SEQ ID no. 10th
  • the synthetic ligand has exactly one stabilization building block and four peptide building blocks. Also advantageous are embodiments with a peptide building block and two or three stabilization building blocks.
  • the peptide chains are also in these cases preferably terminal (C-terminus or N-terminus) connected to the stabilization module. It is also advantageous if the stabilization module is connected to only one of each of the two, three or four provided peptide building blocks.
  • the at least one stabilization unit comprises a molecular skeleton having at least 5 carbon atoms.
  • a stabilization building block with 5 to 80, preferably 5 to 70, more preferably 5 to 50 and most preferably 5 to 40 or 5 to 30 carbon atoms is particularly favorable for stabilizing the conformation of the at least one peptide building block and for providing a soluble synthetic ligand.
  • the at least one stabilization unit also heteroatoms, in particular oxygen, sulfur and / or nitrogen atoms may be provided.
  • the number of heteroatoms influences the polarity and thus the solubility of the ligand.
  • Stabilization building blocks with 1 to 40, preferably 3 to 35 and particularly preferably 6 to 20 heteroatoms are particularly advantageous.
  • the at least one stabilization unit has a molecular weight of 80 g / mol to 1600 g / mol, preferably 100 g / mol to 1300 g / mol and more preferably 130 g / mol to 850 g / mol or 200 g / mol to 600 g / mol.
  • a molecular weight 80 g / mol to 1600 g / mol, preferably 100 g / mol to 1300 g / mol and more preferably 130 g / mol to 850 g / mol or 200 g / mol to 600 g / mol.
  • Stabilization building blocks with comparatively high molecular weights, above all from 500 g / mol, in particular in synthetic ligands having a plurality (for example two, three or four) peptide building blocks, are advantageous.
  • a stabilizer with a molecular weight greater than 500 g / mole usually represents the only stabilizer building block of the synthetic ligand.
  • stabilizers with rather lower molecular weights up to 260 g / mole
  • are preferably multiply contained in the synthetic ligand (preferably double) and also present all in combination with a (preferably 5 to 21-membered) peptide building block or two or three short (preferably 5 to 13) peptide building blocks are provided.
  • the molecular skeleton of the at least one stabilization module can also have a linear or a branched structure. It is also favorable if the molecular skeleton of the
  • Stabilization unit at least one, but preferably comprises one or two cyclic structures and / or a bi- or tricyclic is formed, wherein per cycle preferably 5 or 6 ring atoms are provided, which are formed by at least two carbon atoms and one to 3 heteroatoms ,
  • Stabilization units whose molecular skeleton has at least one cyclic structure is preferably 80 g / mol to 700 g / mol, preferably 100 g / mol to 600 g / mol and more preferably 130 g / mol to 300 g / mol.
  • Linear or branched acylic stabilization units preferably have 5 to 80, preferably 5 to 70, particularly preferably 5 to 50 or 5 to 30 carbon atoms and 3 to 35 preferably 6 to 20 heteroatoms.
  • the stabilization module preferably has at least one attachment group via which it is covalently linked to the at least one peptide building block.
  • the attachment group is preferably a secondary or tertiary amino group or a carboxyl group.
  • another expedient embodiment which provides a stable and easy to provide connection between Peptidbaustein and stabilization module, such as an attachment group which is designed such that it via a click reaction with a corresponding modified group (modified amino acid) of the peptide module can be connected.
  • a particularly advantageous embodiment of the invention provides that the stabilization building block and the peptide building block are linked to one another via a peptide bond. Peptide bonds are extremely stable. A further advantage is that a variety of established methods are known for the construction of peptide bonds, which are particularly inexpensive and efficient feasible. In addition, the individual components of the peptide module are by
  • Linked peptide bonds Therefore, in principle, the same methods and reagents can be used to prepare the at least one peptide building block and to link it to the at least one stabilization building block or a part thereof.
  • a particularly efficient and well-established method that can be used here is solid-phase peptide synthesis. Synthetic ligands, the constituents of which are based on building blocks or groups which are linked together via a peptide bond, can therefore be provided in a particularly simple and cost-effective manner.
  • a stabilization module in which an amino group is provided as an attachment group, it is particularly advantageous if the amino group is connected via a peptide bond with a carboxyl function of the peptide building block, preferably with the C-terminus. Accordingly, in the case of a carboxyl function as an attachment group, it is particularly advantageous if it is connected to an amino group of the peptide building block, preferably the N-terminus.
  • the stabilization unit may also be incorporated into the sequence of the peptide unit, for example as a substitute for an amino acid not contained due to a deletion in the sequence of the unit.
  • the stabilization unit may also be incorporated into the sequence of the peptide unit, for example as a substitute for an amino acid not contained due to a deletion in the sequence of the unit.
  • Stabilization module for this purpose has at least two attachment groups. If a stabilization module contains several attachment groups, these can be designed differently or identically. For example, it has proved to be advantageous if the stabilization unit has several secondary or tertiary amino groups as attachment groups, via which it is in each case connected to a peptide building block. A direct connection to the C-terminus of the respective peptide building block is particularly simple, but it is also possible an indirect linkage or the connection to another site of the peptide building block as the C-terminus. Ligands with a stabilization unit having two, three or four secondary or tertiary amino groups have proven to be particularly suitable as attachment groups in this embodiment. A further advantageous embodiment of a synthetic ligand relates to a
  • Stabilization unit which has at least two different attachment groups, preferably at least one secondary or tertiary amino group and at least one carboxyl group.
  • the amino-attachment group is connected to the C-terminus of a peptide building block and the carboxyl attachment group is connected to the N-terminus of a peptide building block, wherein the C-terminus and the N-terminus form part of or part of two May be peptide building blocks.
  • Stabilization unit one or more other functional groups, such as a free carboxyl function or a derivative thereof, or another primary, secondary or tertiary amino group, or an azide group, an alkyne group, an ether group, a thioether group, a triazole group , or an SH or OH function may be provided.
  • a means can be made available which allows additional constituents to be linked to the synthetic ligand in a simple and uncomplicated manner if required. This can be done by a reaction of the desired additional constituent with the functional group of the stabilization building block or else the desired additional constituent is built up successively on the ligand.
  • an application-specific fine adjustment of the synthetic ligand is made possible.
  • Conceivable for example, is the attachment of a marker (such as a fluorescent label) or a covalent attachment of the synthetic ligand to a solid phase.
  • the functional group when the functional group is a polar group, it also improves the solubility of the ligand.
  • bonds can be provided using various well-established methods and reagents.
  • a free carboxyl group is usually deprotonated under physiological conditions and thus in charged form.
  • a free carboxyl group can therefore be used to increase the polarity of the synthetic ligand and thus improve the solubility in an aqueous medium.
  • Amino acids in general and especially an aminoalkanoic and / or proteinogenic amino acid such as lysine, glycine, valine or isoleucine.
  • the distance between the atom of the attachment group, via which the stabilization unit is covalently linked to a peptide building block, and an optionally provided second attachment group or an additional functional group as defined above, is in the shortest chain preferably 1 to 30 atoms, in particular 1 to 25 atoms.
  • the stabilization block is a kind of bracket, which connects the two peptide building blocks together. In this case, deliver one
  • Stabilization module particularly good results, in which the distance between the atoms of the attachment group via which the stabilization unit is covalently linked to the peptide building block is 3 to 30 atoms, preferably 4 to 30 atoms and more preferably at least 9 atoms, in particular at least 18 atoms.
  • the synthetic ligand may optionally contain further building blocks. It is conceivable, for example, a linker, which is provided between the different components of a synthetic ligand according to the invention. Particularly simple and therefore preferred is that no further constituent is provided in addition to the at least one peptide building block and the at least one stabilization building block, so that the synthetic ligand is formed solely by the at least one peptide building block and the at least one stabilization building block.
  • a stabilization unit comprising at least one structural motif selected from the group comprising an amino acid, in particular an aminoalkanoic acid or a proteinogenic amino acid or a derivative of a proteinogenic amino acid, preferably a triazole derivative or an akine derivative.
  • an aminoalkanoic acid is provided as a structural motif, this preferably comprises 3 to 12 carbon atoms, more preferably 4 to 10 carbon atoms.
  • this preferably comprises 3 to 12 carbon atoms, more preferably 4 to 10 carbon atoms.
  • Diaminoalkan Acid It is particularly advantageous if the carboxyl group and the amino group of the aminoalkanoic acid are arranged terminally, as for example in the case of 6-aminohexanoic acid.
  • a proteinogenic amino acid is provided as a structural motif, it is preferably the (S) -enantiomer, because this corresponds to the naturally occurring form in most organisms and is therefore particularly cost-effective.
  • cysteine is present, it is preferably the (/ 1) enantiomer
  • both structural motifs of proteinogenic amino acids which have a hydrocarbon radical on their ⁇ -C atom or their derivatives, as well as their side chains have a functional group or their Among the proteinogenic amino acids which have a hydrocarbon radical on their ⁇ -C atom, leucine, isoleucine, valine, proline and glycine have proven to be particularly advantageous.
  • proteinogenic amino acids whose side chain has a functional group are mainly Serine, lysine, tyrosine and threonine are preferred.
  • Derivatives of a proteinogenic amino acid include structurally closely related compounds, such as enantiomers, and in the case of leucine these are preferably tert-leucine or norleucine, with serine especially favoring the alkyne ether and triazole derivatives.
  • the structural motif is selected from a group comprising ⁇ -amino-tetraethylene glycol acetylic acid, azidoproline, serine propargyl ether, hydroxythreonine, thiaproline and isoproline, as well as derivatives of ⁇ -amino-tetraethylene glycol acetylic acid, azidoproline, serine propargyl ether, hydroxythreonine, thiaproline and isoproline.
  • the at least one stabilization module comprises at least one of the following structural motifs SB1 to SB12:
  • R '" is a hydrocarbon radical, preferably an alkyl radical, having 1 to 10, preferably 1 to 8 C atoms;
  • R1 to R12 are independently an amino acid, -H, R '"or another of the structural motifs shown SB1 to SB12, and wherein the amino acid part of the
  • one of the radicals R 1 to R 12 and / or R 'or R "of the structural motifs SB 1 to SB 12 is an amino acid of a peptide building block
  • this preferably has a sequence selected from the group comprising the sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID no. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, or the peptide building block has a sequence which corresponds to the sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No.
  • SEQ ID No. 11 has a sequence homology of greater than 80%, particularly preferably greater than 85%, particularly preferably greater than 90% and very particularly preferably greater than 95%.
  • one of the radicals R 1 to R 12 and / or R 'or R is an amino acid, this is preferably via a peptide bond with the
  • the stabilization unit is formed exclusively by one of the structural motifs selected from the group comprising SB1 to SB12, SB1a to SB12a and SB1b to SB12b. Another important embodiment provides that, in addition to the at least one structural motif selected from the group comprising SB1 to SB12, SB1a to SB12a and SB1b to SB12b, the stabilization unit has at least one covalently bound subunit.
  • the structural motif selected from the group comprising SB1 to SB12, SB1 a to SB12a and SB1 b to SB12b forms a base segment of the stabilization unit, which serves primarily to stabilize the conformation of the at least one peptide building block and in the case of several peptide building blocks together. While the interactions occurring in solution between dissolved ligand molecules with one another and with the solvent are primarily influenced by the at least one subunit.
  • the mentioned embodiment thus enables those molecule groups which are mainly used for conformational stabilization, and those
  • Molecule groups intended primarily to prevent fibrillation can be introduced and designed independently of each other.
  • the advantage of such synthetic ligands is therefore in particular their modular structure.
  • the subunit has at least two functional groups which carry a charge under physiological conditions.
  • free carboxyl groups may be provided which are at least partially deprotonated under physiological conditions and therefore present negatively charged.
  • the subunit has at least two primary, secondary or tertiary amino groups. These are at least partially quaternized under physiological conditions and thus positively charged. Particularly suitable are especially primary amino groups.
  • the subunit is provided between the base segment and the peptide building block. It is particularly preferred in this case that the base segment between the Peptidbaustein and the
  • Subunit is arranged. In this way it can be ensured as far as possible that the desired conformation of the peptide building block, namely that which is recognizable for anti-Aß antibodies, is not disturbed by the subunit.
  • a particularly stable connection between the two components of the stabilization module is present when the subunit is connected to the base segment via a peptide bond.
  • a further advantage is that a peptide bond can be knotted easily and effectively.
  • the covalent linkage of the base unit and subunit can be connected in a particularly simple manner with the synthesis of the peptide building block. This reduces the manufacturing costs.
  • an amino function is provided on one of the two groups (base segment and subunit), while the other group has a carboxyl function.
  • oligomer (proteinogenic or non-proteinogenic), a derivative of an amino acid or of a homogeneously or heterogeneously constructed oligomer, especially a di-, tri- or tetramer, built up from one or more amino acids, wherein the individual building blocks of the Oligomers are preferably linked together via a peptide bond, so that the oligomer is an oligopeptide derivative.
  • the proteinogenic amino acids lysine, isoleucine and glutamic acid, as well as their heterogeneous (eg -Lys-Glu-Lys, or -Lys-lle-Lys) or homogeneously constructed oligopeptides (-Lys-Lys-Lys-), are at a stabilization of the peptide building block of the synthetic ligand for protection against fibrillation particularly advantageous. Oligopeptides having 2 to 8 peptide building blocks are preferred subunits, with straight oligopeptides having 2 to 4 peptide building blocks show particularly good results.
  • Non-proteinogenic amino acids include e.g. also aminoalkanoic acids having terminal or otherwise arranged carboxyl or amino groups.
  • An important embodiment also provides at least one stabilization module which has a base segment which is connected to a plurality of, in particular two, three or four subunits.
  • the base segment preferably has one or more of the following structural motifs SB5, SB6 or SB7:
  • ligands are usually very slightly soluble or can not flocculate in solution and thus can be used for several hours to days in liquid form. In addition, they are simple and inexpensive to produce and they show a good binding affinity to anti-Aß antibodies.
  • Such ligands can be used, for example, for the preparation of a pharmaceutical formulation intended to vaccinate a potential patient, or to aid in the degradation of A ⁇ 1-42 peptides in the preclinical stage.
  • a synthetic ligand according to the invention are the ligands SL1 to SL34, each of which has one of the following structures:
  • the invention provides that the method comprises the steps
  • Stabilization module wherein the coupling of the stabilization module can take place in several sub-steps.
  • the preparation of the synthetic compound can take place in several sub-steps.
  • the stabilization module can be prepared beforehand and connected to the peptide building block, or the stabilization building block is first built up successively in the coupling with the peptide building block. In this case, in the coupling in step b) successively individual groups of the stabilization module are connected to the peptide module.
  • the invention also relates to a kit for the detection of anti-Aß autoantibodies in a sample to be examined containing at least one synthetic ligand according to the invention.
  • the invention provides a method for detecting human anti Aß autoantibody in a sample to be tested, wherein at least one synthetic ligand according to claim 1 binds human anti Aß autoantibody and wherein said binding via fluorescence, phosphorescence, radioactivity or another common
  • the invention provides for the use of at least one synthetic ligand according to the invention for the preparation of a vaccine for the prevention and treatment of Alzheimer's disease. Furthermore, the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of neurodegenerative diseases, in which a deposit of Aß peptides is found, in particular pharmaceutical composition for
  • one or more synthetic ligands of the invention may be administered intramuscularly, subcutaneously, intranasally, intraperitoneally, or intravenously, thus stimulating the production of natural human anti-Aß antibodies.
  • the patient vaccinated in this way then already has a high number of corresponding antibodies in the potential preclinical stage of the disease, which can bind and degrade increasingly formed A ⁇ 1-42 peptide.
  • SEQ ID no. 1 The wild-type sequence of the peptide A ⁇ 1-42;
  • Fig. 4a, 4b, 4c, 4d further ELISA studies to characterize the binding of synthetic ligands of the invention to naturally occurring
  • FIGS. 7 and 8 Measurements of the Toxicity of Synthetic Synthetic Monomers According to the Invention
  • sequence corresponding to amino acids 20 to 42 and in particular the sequence corresponding to amino acids 28 to 40 according to SEQ ID no. 1 is crucial for the formation and recognition of the specific A ⁇ 1-42 epitope preferentially bound by natural human anti-Aß antibodies.
  • sequence corresponding to amino acids 20 to 42 and in particular the sequence corresponding to amino acids 28 to 40 according to SEQ ID no. 1 is crucial for the formation and recognition of the specific A ⁇ 1-42 epitope preferentially bound by natural human anti-Aß antibodies.
  • Embodiments of a synthetic ligand according to the invention are described in more detail, each containing at least part of the Aß1-42 epitope, wherein the conformation of the epitope is stabilized by means of each covalently bonded stabilization module and fibrillation in solution is avoided.
  • peptide building blocks having an amino acid sequence according to the sequences SEQ ID no. 2 to SEQ ID no. 11:
  • SL1 is a synthetic ligand for human anti-Aß antibodies. This consists of a stabilization module and two peptide building blocks. The peptide building blocks each have a peptide sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the stabilization unit is a triazolinker. The stabilization unit is linked to the C-terminus of the two peptide units via a peptide bond in each case.
  • the synthetic ligand SL1 has the following structure:
  • the two peptide chains of the peptide building blocks are present in ⁇ -sheet conformation and are arranged parallel to each other.
  • the stabilization unit is formed by a structural motif according to formula SB8, wherein in each case one amino acid, namely the amino acid valine of the peptide unit, to which the unit SB8 is connected via a peptide bond at the group R5 and the group R2.
  • the peptide building blocks are each covalently linked to the one stabilization unit at their C terminus.
  • Another synthetic ligand for human anti-Aß antibodies according to the invention shows SL2
  • the ligand consists of a peptide building block with a peptide sequence corresponding to SEQ ID no. 3 and a stabilization module.
  • the stabilization building block is tert-leucine, which is provided at position 6 of the amino acid sequence of the peptide building block.
  • the entire synthetic ligand has a peptide sequence corresponding to SEQ ID no. 12 on.
  • Another synthetic ligand according to the invention for human anti-Aß antibodies shows SL3
  • the synthetic ligand has a stabilization building block and a peptide building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 2 on.
  • the synthetic ligand SL4 shown here has two peptide building blocks and two stabilization building blocks.
  • the two peptide building blocks have a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the two stabilization blocks are formed by the structure motif according to SB8. They connect the two peptide building blocks in each case like a clip to a macrocycle.
  • Each stabilization unit has two attachment groups to an amino group and a carboxyl function.
  • Embodiment 5 Another synthetic ligand according to the invention for human anti-Aß antibodies shows SL5
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two stabilization building blocks according to the structural motif SB 10. on.
  • One of the peptide building blocks has a sequence according to SEQ ID NO. 4 while the other a sequence according to SEQ ID NO. 5 has.
  • One of the stabilization building blocks is linked to a peptide building block via an attachment group.
  • the other stabilization building block connects both peptide building blocks in the same way.
  • the staple-like stabilization unit has two attachment groups, an amino group and a carboxyl group.
  • the stabilization unit, which is connected to only one peptide building block has, in addition to the structural motif according to SB10, a proteinogenic amino acid, namely glycine.
  • the glycine is covalently bound to a provided in addition to the attachment group amino group of the stabilization block via a peptide bond.
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two
  • One of the peptide building blocks has a sequence according to SEQ ID NO. 6 while the other a sequence according to SEQ ID NO. 7 has.
  • Stabilization building blocks is linked to a peptide building block via an attachment group.
  • the other stabilization building block connects both peptide building blocks in the same way. For this he has two attachment groups, an amino group and a carboxyl group.
  • Stabilization building block which is connected to only one peptide building block, has, in addition to the structural motif according to SB10, two proteinogenic amino acids, namely glycine and valine.
  • the valine is attached to an amino group in addition to the attachment group
  • Stabilization blocks covalently attached via a peptide bond.
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two
  • One of the peptide building blocks has a sequence according to SEQ ID NO. 7 while the other a sequence according to SEQ ID NO. 8 has.
  • Stabilization building blocks is linked to a peptide building block via an attachment group.
  • the other stabilization building block connects both peptide building blocks in the same way. For this he has two attachment groups, an amino group and a carboxyl group.
  • Stabilization unit which is connected to only one peptide building block, has four amino acids besides the structural motif according to SB10, namely a glycine, two valine and an isoleucine.
  • the isoleucine is covalently attached to a provided in addition to the attachment group amino group of the stabilization block via a peptide bond.
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two staple-like stabilization building blocks.
  • the peptide building blocks have a sequence according to SEQ ID NO. 4th
  • Each of the stabilization building blocks has two attachment groups, namely an amino and a carboxyl group.
  • the two bicyclic stabilization building blocks each have further functional groups, namely a thioether group, an amide group and two hydroxy groups.
  • Each of the two stabilization units therefore has a total of 7 heteroatoms.
  • Embodiment 9 Another synthetic human anti-A ⁇ antibody synthetic ligand of the present invention is shown by Formula SL9
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two stabilization building blocks.
  • the peptide building blocks have a sequence according to SEQ ID NO. 6 on.
  • Each of the stabilization building blocks has two attachment groups, namely an amino and a carboxyl group. In addition to the attachment groups, the two have bicyclic
  • Stabilization units in each case via further functional groups, namely a thioether group, an amide group and two hydroxy groups.
  • Each of the two stabilization units therefore has a total of 7 heteroatoms.
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two
  • the peptide building blocks have a sequence according to SEQ ID NO. 6, which is modified at its C-terminus by the amino acid isoleucine.
  • the synthetic ligand has a stabilization building block and a peptide building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 9 on.
  • the stabilization building block has an attachment group, namely a carboxyl group, and in addition via an azide and a secondary amino group.
  • the synthetic ligand shown here has two peptide building blocks and two
  • the peptide building blocks have a sequence according to SEQ ID NO. 9th
  • the synthetic ligand has a stabilization building block and a peptide building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 4 on.
  • the synthetic ligand consists of a peptide building block and a stabilization building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 3 on.
  • the synthetic ligand consists of a peptide building block and a stabilization building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 3 on.
  • the stabilization building stone consists of a structural motif according to SB3 and has an amino group as an attachment group, via which it is covalently linked to the C-terminus of the peptide building block.
  • the synthetic ligand consists of two stabilization building blocks and one peptide building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 3 on.
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL17 shown.
  • the synthetic ligand consists of two different stabilization building blocks and one peptide building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 3 on.
  • a further synthetic ligand for human anti-Aß antibodies according to the invention shows the represented formula SL18
  • the synthetic ligand consists of a clamp-like stabilization building block and a peptide building block.
  • the C-terminus and the N-terminus of the peptide building block are linked to a macrocycle by the stabilization building block.
  • the peptide module has a sequence according to SEQ ID NO. 3 on.
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL19 shown
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • Stabilization module has a two structural motifs according to SB5 and a subunit of a lysine tripeptide, which connects the two 6-aminohexanoic acid groups.
  • the synthetic ligand SL19 has an overall sequence according to SEQ ID No. 13 on.
  • a further synthetic ligand for human anti-Aß antibodies according to the invention shows the represented formula SL20
  • the two peptide building blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID No. 3 on.
  • the two Peptdibausteine are covalent with a
  • the stabilization module has two structural motifs according to SB5 has two subunits from a lysine dipeptide and a structural motif according to SB6.
  • the structural motif according to SB6 forms a staple-like backbone of the stabilization unit, which is connected to each of the two intended aminohexanoic acid groups (structural motifs of the formula SB5) via a lysine dipeptide as a subunit.
  • Aminohexanoic acid groups are connected via their amino groups to the peptide building blocks. Therefore, a total of two peptide derivatives according to SEQ ID no. 19, each comprising a peptide building block as well as an aminohexanoic acid group and a lysine dipeptide of the stabilization building block.
  • a further synthetic ligand according to the invention for human anti-Aß antibodies shows the represented formula SL21 o
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 11, which corresponds to a sequence according to SEQ ID no. 3, which is modified at its C-terminal end by a lysine.
  • the peptide building block is covalently linked to a stabilization building block.
  • the stabilization module has two structural motifs according to SB5 and one
  • the synthetic ligand has a total of a sequence according to SEQ ID NO. 16 on.
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL22 shown.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the two peptide building blocks are covalent with a
  • the stabilization unit has a structural motif according to SB5, a subunit of a lysine tetrapeptide and a structural motif according to SB6.
  • the structural motif according to SB6 forms a staple-like backbone of the stabilization building block, which is connected to each of the two peptide building blocks.
  • the staple-like backbone is linked to the aminohexanoic acid building block via the lysine tetrapeptide.
  • backbone is in addition to the peptide blocks with a sequence according to SEQ ID NO. 28 connected.
  • Another synthetic ligand according to the invention for human anti-Aß antibodies shows the illustrated formula SL23
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the peptide building block is covalently linked to two stabilizing building blocks, each of which has an aminohexanoic acid group, i. includes a structural motif according to SB5.
  • the synthetic ligand has a total of a sequence according to SEQ ID NO. 17 on.
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL24 shown.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the two peptide building blocks are each covalent with three
  • Two stabilization modules have one
  • the staple-like stabilization module connects the two C-termini of the peptide building blocks. At the bracket-like
  • Stabilization module are therefore a total of two peptide derivatives having a sequence according to SEQ ID NO. 21 tethered.
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the peptide building block is covalently linked to two stabilization building blocks.
  • Each of the two stabilization building blocks comprised an aminohexanoic acid group as a structural motif and a subunit of lysines.
  • the synthetic ligand has an overall SEQ ID no. 18 on.
  • Embodiment 26 Another synthetic human anti-A ⁇ antibody synthetic ligand according to the invention is represented by the illustrated formula SL26.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the two peptide building blocks are each with two
  • Covalently linked stabilization units wherein it is a stabilization block is a staple-like stabilization module, which is a kind of backbone of the
  • the structural motif according to SB6 has two NH functions. To each of these two NH functions is attached a peptide derivative which has a sequence according to SEQ ID NO. 14 has.
  • a further synthetic ligand for human anti-Aß antibodies according to the invention shows the illustrated formula SL27
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the peptide building block is covalently linked to a stabilization building block.
  • the stabilization unit has a subunit of a heterogeneous tripeptide (Lys-Glu-Lys).
  • the synthetic ligand has a total of a sequence according to SEQ ID NO. 23 on.
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL28 shown.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • the two peptide building blocks are covalently linked to a clamp-like stabilization module.
  • the staple-type stabilization building block which forms a kind of backbone of the synthetic ligand, comprises two structural motifs according to SB5, one structural motif according to SB6 and two subunits consisting of a heterogeneous Lys-Glu dipeptide.
  • the structural motif according to SB6 has two NH functions. To each of these two NH functions is attached a peptide derivative which has a sequence according to SEQ ID no. 22 has.
  • Exemplary embodiment 29 A further synthetic ligand according to the invention for human anti-Aß antibodies is shown by the illustrated formula SL29
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 10 on.
  • the peptide building block is covalently linked to a stabilization building block.
  • the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 24th Embodiment 30
  • Another synthetic human anti-Aß antibody ligand according to the invention is shown by the formula SL30 shown.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 10 on.
  • the two peptide building blocks are covalent with a
  • the stabilization unit is a staple-type stabilization unit comprising two structural motifs according to SB5, one structural motif according to SB6 and two subunits consisting of two lysines.
  • Structural motif according to SB6 has two NH functions, one amide group and one
  • Another synthetic ligand for human anti-Aß antibodies according to the invention is represented by the formula SL31 shown
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3, which is covalently linked to a stabilization module.
  • the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 15th Embodiment 32
  • Another synthetic anti-Aß antibody synthetic ligand according to the invention is shown by formula SL32.
  • the two peptide blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3, which are covalently linked to a stabilization module.
  • the stabilization module is a staple-type stabilization unit comprising two structural motifs according to SB5, one structural motif according to SB6 and two lysines.
  • the structural motif according to SB6 has two NH functions, one amide group and one
  • a peptide derivative is attached, each comprising a lysine, a structural motif according to SB5 and a peptide block and having a sequence according to SEQ ID NO. 20 has.
  • Embodiment 33 A further synthetic human anti-A ⁇ antibody synthetic ligand according to the invention is shown by formula SL33.
  • the four peptide building blocks contained in the synthetic ligand have a sequence according to SEQ ID no. 3, which are covalently linked to a stabilization module.
  • the stabilization module is a staple-type stabilization module comprising four structural motifs according to SB5, one structural motif according to SB7 and four lysines.
  • the structural motif according to SB6 has four NH functions, three amide groups and one
  • a peptide derivative is attached to the four NH functions, each comprising a lysine, a structural motif according to SB5 and a peptide building block and having a sequence according to SEQ ID NO. 20 has.
  • Embodiment 34 A further synthetic human anti-Aß antibody synthetic ligand of the invention is shown by Formula SL34
  • the peptide component contained in the synthetic ligand has a sequence according to SEQ ID no. 3 on.
  • a stabilization module is provided at the C-terminus.
  • Stabilization module has two 6-Aminohexanklarebausteine and a homogeneous
  • the synthetic ligand has a total sequence according to SEQ ID No.27. II. Synthesis of the synthetic ligands according to the invention
  • Stabilization building blocks which are connected to the peptide building block via a peptide bond can likewise be linked to the at least one associated peptide building block in the context of solid-phase peptide synthesis.
  • the stabilization module consisting of a base segment and one or more possibly provided
  • Stabilization module is itself produced only in the context of peptide synthesis. The latter applies to stabilization building blocks in which the base segment is connected via a peptide bond with one or more subunits possibly provided, as well as for
  • Stabilization building blocks composed of different segments linked by a peptide bond.
  • the appropriate precursors of the segments to be linked which are suitable for a peptide synthesis, are prepared by suitable conventional synthesis methods.
  • the automated solid-phase peptide synthesis can be carried out on an APEX 396 from Advanced Chemtech.
  • the protocol reproduced below may be used, with the first amino acid of the peptide sequence to be prepared in each case already being in protected form on the resin (typically resins having a loading of 0.37-0.57 mmol g " are used): a) 15 min Swelling of the resin in 2.5 mL of DMF b) 5 min deprotection of the amino acid linked to the resin with 2.0 mL of 20% piperidine in DMF; c.
  • all peptide building blocks can be coupled in this way with the synthetic stabilization building blocks according to the invention.
  • the attachment of the stabilization building block can take place by stepwise construction of its individual components (for example one or more of the structural motifs SB1 to SB12, subunits ect.) Or by coupling of a complete (possibly separately prepared) stabilization building block.
  • the resin which is the previously prepared peptide with the respective cleavage solution (4 mL / 200 mg resin) is added and mixed over a period of 30 min by means of a nitrogen gas stream. The solution is filtered off and the resin is washed twice with the cleavage solution (1 ml / 200 mg resin each). The combined organic solutions thus obtained are concentrated under reduced pressure to a volume of about 1 ml. Subsequently, the peptide by dropping in cold DEEa s. (Diethyl ether) like. After centrifuging off the precipitate, this was grown three times with DEE and dried under high vacuum. The residue was taken up in water / MeCN and lyophilized.
  • the composition of the cleavage solution depends on the particular peptide.
  • the following solutions are used as the cleavage solution in particular: TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1); DCM / trifluoroethanol / HOAc (7: 2: 1) or 3) TFA / EDT / water / TI PS (94: 2.5: 2.5: 1).
  • TFA / EDT / water / TI PS 94: 2.5: 2.5: 1).
  • Met reduction by means of dimethyl sulfide is
  • Methionine-containing peptides fall in the above-mentioned solid phase synthesis in oxidized form. If the peptide sequence produced contains a methionine building block, then the thio group must first be reduced to the desired thioether after the solid-phase synthesis.
  • the peptide is dissolved in 2 mL TFA and 2 mL 5 M hydrochloric acid and treated with 150 dimethyl sulfide. After 1.5 hours 150 dimethyl sulfide are added again. Reaction control by means of HPLC shows a complete reduction after 3 h at the latest. The solution is diluted with 50 mL of water and lyophilized. The residue is taken up in 50 mL water and 2 mL MeCN / TFA (1: 1) and lyophilized again to finally give the fully reduced peptide.
  • Structural elements modified to provide the stabilization building blocks of the synthetic ligands
  • Fmoc-Azp-OH preference is given to those described in LL Klein, L. Li, HJ Chen, CB Curty, DA DeGoey, DJ Grampovnik, CL Leone, SA Thomas, CM Yeung, KW Funk, V. Kishore, EO Lundell, D. Wodka, JA Meulbroek, JD Alder, AM Nilius, PA Lartey, JJ Plattner, Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 1677-1696.
  • Boc-Spe-OH (31.8 mmol, 1.0 eq) were dissolved in 20 mL DCM and treated at 0 ° C with 40 mL TFA. After 5 minutes, the ice bath was removed, stirred for 1.5 h at RT and the solvent was condensed off. The residue was coevaporated twice with n-hexane and after drying in a high vacuum, 8.18 g of H-Spe-OH TFA (31.9 mmol, quant.) were obtained as a pale yellow solid.
  • SL2 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. For cleavage from the resin, TFA / TI PS / water (95: 2.5: 2.5) was used. There were obtained 97 mg SL2 (64.8 ⁇ , 65%) in the form of a colorless solid.
  • SL3 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. For cleavage from the resin, TFA / TI PS / water (95: 2.5: 2.5) was used. There were obtained 55 mg of SL3 (64.8 ⁇ , 65%) in the form of a colorless solid.
  • SL11 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.2 millimolar scale. TFA / water (90:10) was used to cleave off the resin. There were obtained 128 mg SL11 (188 ⁇ , 94%) in the form of a colorless solid.
  • SL13 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.2 millimolar scale. TFA / water (90:10) was used to cleave off the resin. 178 mg SL13 (164 ⁇ , 82%) were obtained in the form of a colorless solid.
  • the primary sequence H- [Spe] A ⁇ (27-40) -OH was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. Subsequently, the resin-bound peptide with 220 mg N 3 -PEG 4 (1.00 mmol, 10 eq) in 4 mL DMF / NMP (1: 1) and a solution of 19 mg Cul (0.10 mmol, 1.0 eq) and 23 was 2.6 -Lutidine (0.20 mmol, 2.0 eq) in 4 mL DMF / NMP (1: 1) and mixed for 3.5 d with a stream of nitrogen.
  • SL16 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on a 0.1 millimolar scale. TFA / water (95: 5) was used to cleave off the resin. 88 mg SL16 (47.2 ⁇ , 47%) were obtained in the form of a colorless solid.
  • the hexapeptide with the sequence H-Spe-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-OH was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.2 millimolar scale. Subsequently, the resin-bound peptide with 100 mg of 1-azido- ⁇ -D-ribofuranose (570 ⁇ ⁇ , 2.9 eq), 19 mg Cul (100 ⁇ , 0.5 eq) and 23 ⁇ 2,6-lutidine (200 ⁇ , 1.0 eq ) in 5 mL DMF and mixed for 12 h with a stream of nitrogen.
  • H- [Azp 41 & Spe41B ] A ⁇ (28-41) A -OH, H- [Spe 41 & Azp41A ] A ⁇ (28-41) B -OH TFA (SL1) 40 mg H- [Azp 4 ] A ⁇ (28 -41) -OH TFA (30.0 mol, 1.0 eq) and 40 mg H- [Azp 4 ] A ⁇ (28-41) -OH TFA (30.0 mol, 1.0 eq) were prepared according to the general procedure for solid-phase peptide synthesis described in Section II produced.
  • Lys 8.10 te 3.80 m; 1.70 m; 30.1 yCH 2 1.35 m; 20.7
  • the peptide with the sequence H- [Azp 27 , Spe 4 ] A ⁇ (27-41) -OH was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on a 0.1 millimolar scale. Subsequently, the resin-bound peptide with 5 mL DMF, 100 CuS0 4 -5 H 2 0 (1 M solution in DMF, 100 ⁇ , 1.0 eq), 200 sodium ascorbate (1 M solution in water, 200 ⁇ , 1.0 eq) and 20 ⁇ Added 2,6-lutidine (171 ⁇ , 2.0 eq) and mixed for 40 h with a nitrogen Ström.
  • SL5 The peptide was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. The peptide was treated with DCM / trifluoroethanol / HOAc (7: 2: 1) for 2 h split off from the resin. There were obtained 334 mg SL5 (153 ⁇ , 77%) in the form of a colorless solid.
  • the peptide was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin for 2 h with DCM / trifluoroethanol / HOAc (7: 2: 1). There were obtained 192 mg SL6 (77 ⁇ , 77%) in the form of a colorless solid.
  • the peptide was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin for 2 h with DCM / trifluoroethanol / HOAc (7: 2: 1). There were obtained 209 mg SL7 (72 ⁇ , 72%) in the form of a colorless solid.
  • SL8 The synthesis was carried out starting from SL5 according to the method described in B. Eckhardt, W. Grosse, L.-O. Essen, A. Geyer, Proc. Natt. Acad. Be. USA 2010, 107, 18336-18341. There were obtained 69 mg SL8 (33 ⁇ , 72%) in the form of a solid.
  • the peptide with the sequence H- [Spe, ⁇ ] A ⁇ (27-41) -OH was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. Subsequently, V 5 of the resin-bound peptide (20 ⁇ , 1 .0 eq) with 1 .9 mg Cul (10 ⁇ , 0.5 eq) and 2.3 ⁇ _ 2,6-lutidine (19.7 ⁇ , 2.0 eq) dissolved in 2 ml MeCN / DMSO (4: 1) and mixed for 15 h with a stream of nitrogen.
  • Lys 8.63 to 4.34 m; 52.2 1.70 m; yCH 2 1.34 m; 21.8
  • Val 40 8.02 m 4.21 m; 55.6 2.04 m; YCH S 0.91 m; 18.2
  • the peptide with the sequence H- [Spe 28 , Azp 34 ] A ⁇ (28-34) -OH was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis in 0.3 millimolar scale. Subsequently, the resin-bound peptide with 30 mg CuCl (300 ⁇ , 1.0 eq) and 18 2,6-lutidine (600 mol, 2.0 eq) dissolved in 8 mL DCM / DMF / NMP (1: 1: 1, 1% TritonX100, 2 M ethylene carbonate) and mixed for 7 d with a stream of nitrogen, with all 24 h above reaction mixture was freshly prepared and replaced.
  • SL19 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1) followed by complete reduction of Met 35 .
  • Val 36 8.13 m 4.07 m; 59.6 2.01 m; 30.2 YCH 3 0.89 m; 18.2
  • Val 40 8.13 m 4.09 m; 59.6 to 1.95 m; 29.8 YCH 3 0.89 m; 17.7
  • SL22 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.05 millimolar scale. The peptide was cleaved from the resin with TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1) followed by complete reduction of Met 35 . There were obtained 135 mg of SL22 (32.2 ⁇ , 64%) in the form of a colorless solid.
  • SL23 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1) followed by complete reduction of Met 35 .
  • TFA / TI PS / water / phenol 95: 2: 2: 1
  • SL24 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on a 0.05 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1) followed by complete reduction of Met 35 .
  • TFA / TI PS / water / phenol 95: 2: 2: 1
  • Met 35 131 mg SL24 (24.9 ⁇ , 50%) in the form of a colorless solid.
  • SL25 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was treated with TFA / TI PS / water / phenol (95: 2: 2: 1) from the resin split off and then Met completely reduced.
  • 115 mg SL25 (38.4 ⁇ , 38%) were obtained in the form of a colorless solid.
  • SL28 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on a 0.05 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). There were obtained 151 mg SL28 (37.1 ⁇ , 74%) in the form of a colorless solid.
  • HPLC: t R 10.18 min (20% 95% MeCN, 20 min).
  • SL29 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). There were obtained 207 mg of SL29 (80.3 ⁇ , 80%) in the form of a colorless solid.
  • SL30 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on a 0.05 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). There were obtained 157 mg of SL30 (33.6 ⁇ , 67%) in the form of a colorless solid.
  • SL31 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. The peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). 173 mg SL31 (80.3 ⁇ , 80%) were obtained in the form of a colorless solid.
  • SL33 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis in 0.025 millimolar scale.
  • the peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). There were obtained 147 mg of SL33 (19.3 ⁇ , 77%) in the form of a colorless solid.
  • SL34 was synthesized according to the general protocol for solid-phase peptide synthesis on 0.1 millimolar scale. The peptide was cleaved from the resin with TFA / EDT / water / TIPS (94: 2.5: 2.5: 1). 141 mg SL34 (68.6 ⁇ , 69%) were obtained in the form of a colorless solid.
  • solubility of the ligands according to the invention in aqueous media can be investigated by means of NMR spectroscopy. For this purpose, a measurement in 10 millimolar is suitable
  • the synthetic ligands SL19 to SL34 can be used to determine a solubility of L> 2.0 mmol / L.
  • a peptide which comprises a sequence of amino acids 28 to 40 of the A ⁇ 1-40 peptide and thus an amino acid sequence according to SEQ ID no. 3, but has no Stabilistationsbaustein invention, so one finds only a solubility of L ⁇ 0.5 ⁇ / ⁇ .
  • the stabilization component provided in the case of a synthetic ligand according to the invention brings about a marked improvement in the solubility in aqueous media.
  • the degree of stabilization of the peptide conformation by the stabilizing components provided according to the invention can be determined by the analytical method of circular dichroism (CD) (measuring instrument: JACSO S-870 spectropolarimeter).
  • CD circular dichroism
  • Stabilization module is induced.
  • Unfolding occurs at pH 5-6.
  • the thermal unfolding takes place at about 40 ° C.
  • all three secondary structural regimes of the proteins can be followed in the order of 1. leaflet, 2. helix, 3. random coil.
  • the antibody binding of synthetic ligands according to the invention can be investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot technique or with surface plasmon resonance (SPR).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • SPR surface plasmon resonance
  • Tween 20 blocked at 4 ° C for 24 h.
  • 100 ⁇ l / well of the primary antibody nAbs-A ⁇ 40 is incubated in a 1: 2 concentration series from 1 ⁇ g / ml to 0, 125 ⁇ g / ml in PBS + 2% Tween 20 at 4 ° C. overnight.
  • a blank value is performed for each synthetic ligand.
  • the secondary antibody anti-human HRP-labeled IgG-antibody is diluted 1: 3000 in PBS + 2% Tween 20 and incubated for 1 h at room temperature on the plates. After the individual antibody incubation steps, 6 washings are carried out with the wash buffer. Subsequently, the substrate TMB
  • FIG. 1 shows by way of example results of ELISA measurements for the synthetic ligands SL1, SL2, SL3, SL4, SL5, SL6, SL7, SL8, SL9, SL10 (x-axis).
  • the y-axis shows the absorption (%) measured at 450 nm.
  • All ligands show good affinities.
  • the ligands SL1, SL2 have a particularly high affinity. A slightly lower affinity is found in the ligand SL6.
  • Fig. 2 shows results of ELISA measurements for the synthetic ligands SL11, SL12, SL13, SL14, SL15, SL16 (x-axis). The absorption (%) measured at 450 nm is shown on the y-axis.
  • the experiments show the different binding properties of the synthetic ligands in the ELISA. All ligands show good affinities. It can be seen that the ligands SL15, SL16 have a particularly high affinity. The ligand SL11 has a slightly lower affinity.
  • Figure 3 shows results of ELISA measurements for the synthetic ligands SL1, SL2, SL4, SL14, SL15, SL16, SL17, SL18 compared to A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 (x-axis). The absorption (%) measured at 450 nm is shown on the y-axis.
  • the experiments show the different binding properties of the synthetic ligands in the ELISA. All ligands show good affinities.
  • the ligand SL4 has a particularly high affinity. A slightly lower affinity has the ligand SL17.
  • Figures 4a to 4d show results of ELISA measurements for the synthetic ligands SL 19 to SL33:
  • each of the four FIGS. 4a to 4d shows four peptides each and SL22 is summarized in a diagram. As a mistake is the
  • the measuring principle is based on the formation of detectable surface plasmons through the interaction of two binding partners on a stable surface.
  • polarized light is conducted via a prism onto a sensor chip coated with gold particles.
  • the light beam is totally reflected by the gold surface and generates so-called surface plasmons with the electrons of the gold layer.
  • These electromagnetic waves cause an electron depletion of the chip surface which results in an energy gap with a certain angle in the reflected light.
  • a resulting shadow in the reflected light can be converted via a detector into a resonance signal.
  • proteins can be immobilized on the chip by covalent bonding of their amino groups (ligand). Subsequently, the respective binding partner (analyte) can be flushed over the chip by a flow channel.
  • the angle change is proportional to the bound mass of the chip matrix.
  • the detector measures the change in mass on the chip (association and dissociation) and the computer program converts it into a sensorgram. In the sensorgram are the
  • Interaction stages plotted as a curve versus time, with signal strength in response units (RU) is converted.
  • 1 RU corresponds to the mass of 1 pg / mm 2 and an angle change of 1x10 "4 .
  • miniamyloids 29: SL20, 31: SL22, 32: SL23, 33: SL24, 35: SL26, 36: SL27, 38: SL29
  • Aß40 were coupled as ligands in monomeric form to a sensor chip (100 ⁇ g / mL peptide in acetate buffer pH 4.5).
  • the antibody nAbs-A ⁇ 40 was rinsed in 5 concentrations (8.6, 2.9, 1, 0, 0.3 and 0.1 ⁇ M) over each ligand, with the different nAbs-A ⁇ 40 dilutions injected simultaneously into each one flow channel , For each flow channel a sensorgram was recorded.
  • Ligands become visible in the sensorgram as an ascending curve that is proportional to the total amount of interacting ligand.
  • the figure shows examples of the original SPR determinations for the miniamyloid
  • Figures 5a and 5b show, by way of example, diagrams of the original SPR determinations.
  • Figure 5a shows a diagram as obtained for the synthetic ligand SL22.
  • Fig. 5b shows a diagram as obtained for A ⁇ 1-40.
  • the x-axis shows the time course in seconds (s).
  • the y-axis is the signal strength in response units (RU), where 1 RU corresponds to the mass of 1 pg / mm 2 .
  • the lines correspond to different nAbs-A ⁇ 40 concentrations, from top to bottom: 1: 2.9 ⁇ , 2 .: 1, 0 ⁇ , 3 .: 0.3 ⁇ , 4 .: 0.1 ⁇ (miniamyloid 31 : SL22).
  • Table 1 KD values as measure of binding affinity determined by SPR.
  • the lyophilized ligands are dissolved in a stock concentration of 150 ⁇ in 10% DMSO and 90% PBS. This is followed by incubation of the peptide solutions at 37 ° C. in the incubator for several days. To check the
  • Thioflavin-T (Basic Yellow 1 or Cl 49005) is a benzothiazole salt (4- (3,6-dimethyl-1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl) -N, N-dimethylanilichloride) obtained by Binding to amyloid fibrils has a characteristic change in its fluorescence spectrum.
  • the ThT molecules can interact specifically with the cross-ß structural motif, so that at low molecular weight
  • Aggregation forms (monomers or small oligomers) no elevated fluorescence signal is detectable.
  • FIG. 6 shows by way of example measurement results for the synthetic ligands SL20, SL22,
  • the ligands form low-molecular-weight aggregation forms. This is an important prerequisite for providing ligands which are soluble for at least a few hours to days and therefore can be used for therapeutic and / or analytical purposes.
  • a stock solution consisting of 5 mg / mL of phosphate buffered saline (PBS) dissolved MTT powder (Sigma-Aldrich® Corporation, St. Louis, USA) is used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the stock solution is pipetted directly into the well at a ratio of 1:10 (10 ⁇ per 100 ⁇ medium) and the cell culture plates are incubated for 1 h in the incubator at 37 ° C. After acceptance of the Cell supernatants are lysed by adding 500 DMSO. The plates are gently shaken in the dark for 15 min at room temperature until the crystals dissolve and thereby the solution turns uniform blue-violet. Subsequently, the
  • Figures 7 and 8 exemplify results of experiments in which the synthetic ligands are treated to preferentially exist as monomers.
  • the Aß The Aß
  • Peptide was treated according to the Kayed protocol for the generation of oligomers.
  • the cell vitality is plotted in% to the medium control (y-axis), which is measured by means of MTT on primary cortical neurons in the presence of the synthetic ligands.
  • FIG. 7 shows by way of example the measurements of the monomer-present ligands SL20, SL22, SL23 SL24.
  • FIG. 8 shows corresponding results for the monomeric ligands SL25, SL26, SL29. It can be seen that synthetic ligands according to the invention hardly influence cell activity. These results exemplify that ligands of the invention are non-toxic and therefore can be used to provide a therapeutic.
  • Figures 9 and 10 exemplify results of experiments in which the synthetic ligands are treated to preferentially exist as higher (soluble) oligomers.
  • the A ⁇ peptide was treated according to the Kayed protocol for the generation of oligomers.
  • the cell vitality in% for the medium control (y-axis) is plotted on the y-axis, which is measured by means of MTT on primary cortical neurons in the presence of the
  • FIG. 9 shows by way of example the measurements of the monomer-present ligands SL20, SL22, SL23, SL24.
  • FIG. 10 shows corresponding results for the monomer-present ligands SL25, SL26, SL29. It can be seen that synthetic ligands according to the invention hardly influence cell activity. These results exemplify that ligands of the invention are non-toxic and therefore can be used to provide a therapeutic.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen synthetischen Liganden für humane anti-Aβ-Antikörper, umfassend wenigstens einen Peptidbaustein und wenigstens einen kovalent an den Peptidbaustein angebundenen Stabilisationsbaustein, wobei die Sequenz jedes Peptidbausteins zur vollständigen Sequenz oder zu einer wenigstens fünf-gliedrigen Teilsequenz der Sequenz der Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ ID No. 1 eine Sequenzanalogie von größer 75% aufweist. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen synthetischen Liganden und ein Arzneimittel enthaltend einen solchen Liganden.

Description

Synthetische Liganden für humane anti-Aß-Antikörper
Die Erfindung betrifft synthetische Liganden für humane anti-Aß-Antikörper gemäß dem
Oberbegriff von Anspruch 1 , die Verwendung eines solchen synthetischen Liganden gemäß der Ansprüche 14, 15, 16 und 18 sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen erfindungsgemäßen synthetischen Liganden gemäß Anspruch 19. Die Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S. Provisional Application No.61/417, 475 mit dem Titel„Synthetic Peptides", die am 29.11.2010 eingereicht wurde und die hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
DEFINITIONEN:
Im Sinne der Erfindung werden die in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendeten Begriffe wie folgt verstanden:
Aß (Amyloid-beta-Peptid), ein Spaltprodukt das beim Abbau von APP (Amyloid-Präkursor Proteins) entsteht. Es handelt sich um die Transmembrandomäne des APP, die nach extrazellulärer Spaltung des APP mit ß- und γ-Sekretase freigesetzt wird. Dabei können unterschiedlich lange Fragmente entstehen, von denen insbesondere Aß1-42 und Aß1-40 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Morbus Alzheimer spielt.
Aß 1-42, Amyloid-beta-Peptid (Aß), das 42 Aminosäuren lang ist, wobei die Sequenz der Sequenz mit der SEQ ID No. 1 entspricht, nämlich SEQ ID No. 1 :
iAsp Ala Glu Phe 5Arg His Asp Ser Gly i0Tyr Glu Val His His 15Gln
Lys Leu Val Phe 20Phe Ala Glu Asp Val 2sGly Ser Asn Lys Gly 3oAla
lle lle Gly Leu 35Met Val Gly Gly Val 40Val lle Ala Aß1-40, Amyloid-beta-Peptid (Aß), das 40 Aminosäuren lang ist, wobei die Sequenz der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 40 der SEQ ID No. 1 entspricht. anti-Aß-Antikörper ein Antikörper, der Amyloid-beta-Peptide erkennt und bindet, insbesondere das Aß1-42 Peptid und dessen trunkierte Homologe, wie das Aß1-40 Peptid, das um 2 C- terminale Aminosäuren kürzer als das Stammpeptid und damit 40 Aminosäuren lang ist. Derivat: Ein Derivat ist ein von einer Grundsubstanz abgeleiteter Stoff, dessen Struktur ähnlich der der Grundsubstanz ist.
Ligand: Ein Ligand ist ein Stoff, der nicht-kovalent an ein Zielprotein binden kann. Die Bindung erfolgt zumeist, aber nicht zwingend, reversibel und kommt bevorzugt über lonenbindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte o.dgl. zustande. Ein Ligand wird vom Zielmolekül nicht umgesetzt. Die Bindung ist von der dreidimensionalen Struktur des Liganden und des Zielproteins abhängig.
Peptid: Ein Peptid ist ein kleines Protein oder ein Proteinfragment. Es ist aus der Verknüpfung mehrerer proteinogener Aminosäuren über Peptidbindungen zu einer Kette mit einer definierten, für das jeweilige Peptid charakteristischen Reihenfolge unterschiedlicher Amino- säuren (Sequenz) entstanden.
Aminosäure: Verbindung, welche wenigstens eine Aminogruppe und wenigstens eine Carboxyl- gruppe aufweist, wobei die Aminogruppe und die Carboxylgruppe unabhängig voneinander an verschiedenen Stellen des Moleküls (d.h. terminal oder an einer anderen Position) und in verschiedenen Abständen relativ zueinander (z.B. in a-, ß- oder ε-Stellung zueinander) angeordnet sein können. Hierzu zählen insbesondere auch Aminoalkansäuren und Diaminoalkansäuren, wobei letztere zwei Aminogruppen und eine Carboxylgruppe aufweisen. Neben der Amino- gruppe und der Carboxylgruppe kann eine Aminosäure im Sinne der Erfindung gegebenenfalls eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen aufweisen. Denkbar sind hierbei unter anderem eine oder mehrere C-C-Doppel- oder C-C-Dreifachbindungen, oder eine oder mehrere
Hydroxy-, Amino-, Thiol-, Carboxyl- oder Arylgruppen. Eine Aminosäure kann chiral oder achiral sein. Die natürlich vorkommenden α-Aminosäuren stellen eine spezielle Ausgestaltung einer Aminosäure dar.
Proteinogene Aminosäure: Unter einer proteinogenen Aminosäure wird jede natürlich vorkommende α-Aminosäure verstanden, die Baustein der Proteine von Lebewesen ist. Hierzu zählen insbesondere die natürlich vorkommenden Enantiomere von: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Thyrosin, Asparagin, Glutamin, Arginin, Tryptophan, Histidin, Cystein, Methionin, Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Peptidbaustein: Eine Peptidsequenz aus mehreren proteinogenen Aminosäuren, die Teil eines Moleküls ist. Die Aminosäuren des Peptidbausteins sind über Peptidbindungen miteinander verknüpft. Peptidderivat: Ein Peptidderivat ist ein Peptid, das an einer oder mehreren Stellen seiner
Sequenz eine modifizierte Aminosäure besitzt, die beispielsweise sein kann ein Derivat einer proteinogenen Aminosäure oder ein Enantiomer einer proteinogenen Aminosäure.
Stabilisationsbaustein: Unter einem Stabilisationsbaustein wird ein molekularer Baustein oder molekularer Rest verstanden, der die Konformation eines Peptides an das er gebunden ist, stabilisiert, und der einer Fibrillierung des Peptides in Lösung entgegenwirkt.
Zu untersuchende Probe: Unter einer zu untersuchende Probe ist biologisches Material eines Menschen, beispielsweise eines Patienten, bei dem der Verdacht auf Morbus Alzheimer besteht zu verstehen. Die zu untersuchende Probe ist insbesondere Blut, Blutplasma oder Blutserum, Urin, Gewebe, Organmaterial.
Amyloid ß-Peptide (Aß) spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung von Morbus Alzheimer. Sie entstehen durch die Spaltung des Amyloidprecursor Proteins (APP) und sind an der Bildung von sogenannten Plaques beteiligt. Dabei handelt es sich um sphärische, multizellulare
Läsionen, die bei Vorliegen einer Alzheimer Erkrankung üblicherweise im limbischen System und im angrenzenden Neocortex in mittlerer bis großer Anzahl nachweisbar sind. Diese
Plaques zeichnen sich dadurch aus, dass sie extrazelluläre Anlagerungen von Amyloid-ß- Peptiden enthalten. Sie können sich bereits viele Jahre bevor die für Morbus Alzheimer typische Demenz erkennbar wird, im sogenannten präklinischen Stadium der Krankheit bilden.
Auch im gesunden Menschen zirkulieren Aß-Peptide nach APP-Spaltung durch die ß- und γ- Sekretase zu einem gewissen Grad in der Blutbahn. Erst wenn die Krankheit ausbricht kommt es aber zu einer starken Häufung und zur Ablagerung in den Plaques. Sowohl im gesunden Menschen als auch im erkrankten Patienten sind aufgrund der im Blut zirkulierenden Peptide natürliche Antikörper im Blut vorhanden, die Aß-Peptide, insbesondere Aß1-42 und Aß1-40, binden und abbauen können.
Die /'n-wVo-Diagnose der Krankheit erfolgt bisher üblicherweise durch eine Kombination von neuropsychologischen Tests, den Nachweis von Biomarkern im Liquor und aufwändige bildgebende Verfahren. Dabei sind die neuropsychologischen Tests zumeist unsicher und der Nachweis von Biomarken im Liquor mit einer für den Patienten unangenehmen Lumbalpunktion verbunden. Zudem liefern die bislang bekannten und dem Patienten zumutbaren Diagnosemöglichkeiten erst im Stadium der bereits eingetretenen Demenz ein zuverlässiges Ergebnis. Diagnosen im Stadium der leichten kognitiven Beeinträchtigung (mild cognitive impairment, MCI) sind sehr unsicher, im präklinischen Stadium mit bisher bekannten Methoden mit hoher Fehlerhaftigkeit.
Darüber hinaus ist bislang auch kein wirksames und zugleich nebenwirkungsarmes Mittel oder eine Methode zur vorbeugenden Behandlung bekannt, mit deren Hilfe das Entstehen bzw. der Ausbruch von Morbus Alzheimer verhindert werden kann. Aufgabe der Erfindung ist es daher eine Möglichkeit zur zuverlässigen präklinischen Diagnose von Morbus Alzheimer zu schaffen. Insbesondere soll eine Möglichkeit geschaffen werden, die Bildung von Plaques frühzeitig zu erkennen. Daneben soll ein Stoff bereitgestellt werden, der zur vorbeugenden Behandlung geeignet ist, um den Ausbruch von Morbus Alzheimer zu verhindern und/oder der eingesetzt werden kann, um die typische Symptomatik der Krankheit zu lindern.
Hauptmerkmale der Erfindung sind im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 , 14, 15, 16, 18 und 19 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 13 und 17. Die Erfindung sieht einen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper vor, umfassend wenigstens einen Peptidbaustein und wenigstens einen kovalent an den Peptidbaustein angebundenen Stabilisationsbaustein, wobei die Sequenz jedes Peptidbausteins zur vollständigen Sequenz oder zu einer wenigstens fünf-gliedrigen Teilsequenz der Sequenz der Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ I D No. 1 , bevorzugt zu einer Sequenz der Aminosäuren 28 bis 42 der SEQ ID No. 1 und besonders bevorzugt zur Sequenz der Aminosäuren 28 bis 40 der SEQ ID No. 1 eine Sequenzanalogie von wenigstens 75% aufweist.
Die Tatsache, dass der erfindungsgemäße synthetische Ligand einen Peptidbaustein mit einem Aufbau analog zur vollständigen Sequenz oder einer wenigstens fünf-gliedrigen Teilsequenz der Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ ID No. 1 aufweist, schafft die Voraussetzung dafür, dass mit dem synthetischen Liganden in Lösung überhaupt eine Epitop-Struktur gebildet werden kann, die der typischen Epitop-Struktur der toxischen Peptide Aß1-42 und Aß1-40 gleicht oder dieser zumindest so stark ähnelt, dass sie ebenfalls von den natürlichen humanen anti-Aß- Antikörpern erkannt wird. Aufgrund der im Vergleich mit den natürlichen Peptiden Aß1-42 und Aß1-40 verkürzten Ausgestaltung können die Löslichkeit des Peptidbausteins verbessert und die Herstellkosten des synthetischen Liganden reduziert werden.
Die Konformation des Epitops wird von dem Stabilisationsbaustein des synthetischen Liganden stabilisiert. Dies ist von großem Vorteil, weil aufgrund der äußerst stabilen Konformation auch bei veränderlichen Bedingungen eine gleichbleibende robuste und zugleich spezifische Bindung an anti-Aß-Antikörper sichergestellt ist. Es hat sich gezeigt, dass dies gemessen an der Sequenzlänge des Peptidbausteins bei einem vergleichsweise breiten Spektrum äußerer Bedingungen der Fall ist. Erst bei einer drastischen Veränderung der äußeren Bedingungen (wie z.B. Temperatur, pH oder Polarität des umgebenden Mediums) wird bei einem gelösten synthetischen Liganden ein Konformationswechsel induziert. Erfindungsgemäße synthetische Liganden weisen daher üblicherweise eine„schaltbare" Konformation auf, wie sie ansonsten nur von großen Proteinen bekannt ist. Wichtig ist dabei vor allem, dass das außerordentlich hohe Maß an Toleranz gegenüber äußeren Bedingungen, es ermöglicht, dass die gewünschte Konformation auch bei sich verändernden äußeren Einflüssen über weite Bereiche stabil gehalten werden kann.
Der Stabilisationsbaustein ist mit dem Peptidbaustein kovalent verbunden. Dadurch kann sichergestellt werden, dass sich die beiden Komponenten nicht voneinander lösen. Durch den Stabilisationsbaustein wird jedoch nicht nur die natürliche Konformation der Peptidketten erhalten, sondern auch eine Fibrillenbildung des Peptidbausteins in Lösung vermieden. Die Vermeidung von Fibrillenbildung ist wichtig, da unmodifizierte Peptide, die ganz oder teilweise die Sequenz der Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ ID No. 1 aufweisen, ansonsten üblicherweise in Lösung gar nicht stabil sind, sondern vielmehr aufgrund von Oligomerisierung ausflocken. Peptide, die eine Fibrillenbildung zeigen, sind in Lösung daher gar nicht handhabbar und somit per se nicht zur Bereitstellung eines Mittels zur Behandlung und Diagnose einer Krankheit geeignet. Der erfindungsgemäß vorgesehene Stabilisationsbaustein stabilisiert hingegen die Konformation des Peptidbausteins, so dass dieser von einem natürlichen anti-Aß-Antikörper erkannt werden kann. Er verhindert gleichzeitig eine Fibrillierung und eine damit verbundene Ausflockung des synthetischen Liganden in Lösung. Stattdessen sind Lösungen von
erfindungsgemäßen Liganden üblicherweise für mehrere Stunden bis Tage stabil.
Aufgrund dieser Eigenschaften ist ein erfindungsgemäßer synthetischer Ligand in Lösung handhabbar. Er kann außerdem mit hoher Spezifität an die natürlichen anti-Aß-Antikörper binden. Ein synthetischer Ligand kann daher beispielsweise als Festphasen gebundenes Antigen in einem ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) eingesetzt werden, mit dessen Hilfe das Vorhandensein von humanen anti-Aß-Antikörpern in einer Probe nachgewiesen werden kann. Dabei sind insbesondere humane anti-Aß-Antikörper nachweisbar, die auch die Peptide Aß1-42 und Aß1-40 binden. Sobald die Peptide Aß1-42 und Aß1-40 in höherem Maß als üblich in einem Patienten freigesetzt werden und damit die Gefahr besteht, dass es sich in entsprechenden Plaques ablagert und damit die oben genannte Symptomatik hervorruft, wird bei dem Patienten häufig auch eine verstärkte Ausbildung von anti-Aß-Antikörper beobachtet. Es gibt außerdem Hinweise darauf, dass auch ein ungewöhnlich geringes Maß an anti-Aß-Antikörpern einen negativen Einfluss im Hinblick auf Morbus Alzheimer haben kann. Ein atypischer Level an humanen anti-Aß-Antikörpern kann somit bereits im präklinischen Stadium der Erkrankung einen wichtigen Hinweis für eine geeignete Therapie geben. Der erfindungsgemäße
synthetische Ligand bietet dabei insgesamt den großen Vorteil, dass er aufgrund seiner hohen Bindungsspezifität die Durchführung von anti-Aß-Antikörper-Nachweisen mit Hilfe von
Standardmethoden ermöglicht, die für den Patienten einerseits schonend sind, und bei denen andererseits falsch-positive, aber auch falsch-negative Ergebnisse mit relativ großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden können.
Außerdem ist ein erfindungsgemäßer synthetischer Ligand aufgrund der genannten Eigenschaften prinzipiell auch zur aktiven Immunisierung geeignet. Im Hinblick auf einen
therapeutischen Einsatz ist es wichtig, dass gezeigt werden konnte, dass erfindungsgemäße synthetische Liganden bei Untersuchungen zur Neurotoxizität sehr gute Resultate erzielen, die darauf hinweisen, dass die erfindungsgemäßen Liganden nicht neurotoxisch sind.
Es ist bevorzugt, dass der wenigstens eine Peptidbaustein des erfindungsgemäßen
synthetischen Liganden eine Sequenz aufweist, die zur vollständigen Sequenz oder zu einer wenigstens fünf-gliedrigen Teilsequenz der Sequenz der Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ ID No. 1 , oder bevorzugt zur Sequenz der Aminosäuren 28 bis 42 der SEQ ID No. 1 und besonders bevorzugt zur Sequenz der Aminosäuren 28 bis 40 der SEQ ID No. 1 , eine Sequenzhomologie von größer 75%, insbesondere größer 80%, bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90 und ganz besonders bevorzugt von größer 95% aufweist. Die Abweichungen von der Sequenz der Aminosäuren 20 bis 42 bzw. 28 bis 42 oder 28 bis 40 der SEQ ID No. 1 können dabei durch Deletion, Substitution und/oder Insertion einer natürlichen oder einer modifizierten proteinogenen Aminosäure entstanden sein, wobei unter einer modifizierten proteinogenen Aminosäure insbesondere ein strukturell eng verwandtes Derivat oder ein Enantiomer der natürlichen Aminosäure zu verstehen ist.
Besonders geeignet ist ein synthetischer Ligand, bei dem der wenigstens eine Peptidbaustein eine Aminosäuresequenz aufweist, die zur Sequenz der Aminosäuren der nachfolgend dargestellten Sequenzen der SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 oder SEQ ID No. 11 eine Sequenzhomologie von größer 75%, insbesondere größer 80%, bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90% und ganz besonders bevorzugt von größer 95% aufweist. Die Abweichungen von der Sequenz der Aminosäuren der SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 11 können dabei durch Deletion, Substitution und/oder Insertion einer natürlichen oder einer modifizierten proteinogenen Aminosäure entstanden sein, wobei zu den modifizierten proteinogenen Aminosäuren insbesondere strukturell eng verwandte Derivate oder Enantiomere der proteinogenen Aminosäuren zählen.
SEQ ID No. 2:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 3:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 4:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly
SEQ ID No. 5:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly SEQ ID No. 6:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val
SEQ ID No. 7:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly
SEQ ID No. 8:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle
SEQ ID No. 9:
Gly Ala lle lle Gly
SEQ ID No. 10:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle Ala
SEQ ID No. 11 :
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Lys Vorteilhaft ist insbesondere ein synthetischer Ligand, bei dem die Sequenz des wenigstens einen Peptidbausteins ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 1 1. Der wenigstens eine Peptidbaustein ist bevorzugt an seinem C- Terminus und/oder seinem N- Terminus mit dem wenigstens einen Stabilisationsbaustein verbunden. Bei einem sterisch anspruchsvollen Stabilisationsbaustein kann eine terminale Anbindung vor allem deshalb vorteilhaft sein, weil so zu starke und im Hinblick auf die Ausbildung eines Epitops für humane anti-Aß-Antikörper hinderliche sterische Wechselwirkungen zwischen dem Stabilisations- baustein und dem Peptidbaustein vermieden werden. Grundsätzlich ist eine unmittelbare
Verknüpfung der beiden Bausteine besonders einfach und unkompliziert, gegebenenfalls kann zwischen dem Peptidbaustein und dem Stabilisationsbaustein aber auch ein Linker,
beispielsweise in Form einer zur Anknüpfung in geeigneter weise funktionalisierten Alkylkette vorgesehen sein.
Ein erfindungsgemäßer synthetischer Ligand kann einen oder mehrere Peptidbausteine aufweisen. Vorteilhaft sind vor allem Ausführungsformen mit 1 bis 8, bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 Peptidbausteinen, wobei die Peptidbausteine bevorzugt in ß-Faltblatt- struktur vorliegen. In einer einfachen und kostengünstigen Variante weist der synthetische Ligand genau einen Peptidbaustein und einen Stabilisationsbaustein auf. Je nachdem, ob der Stabilisationsbaustein an einer oder an zwei Stellen mit dem Peptidbaustein verbunden ist, weist der synthetische Ligand entweder eine offenkettige, oder aber eine cyclische Struktur auf.
Vorteilhaft ist außerdem ein synthetischer Ligand, der wenigstens zwei Peptidbausteine besitzt. Bei einer solchen Ausführungsform ist es sowohl möglich, dass der synthetische Ligand wenigstens zwei Peptidbausteine aufweist, die in ß-Faltblattstruktur vorliegen und parallel zueinander angeordnet sind, als auch, dass der synthetische Ligand wenigstens zwei
Peptidbausteine aufweist, die in ß-Faltblattstruktur vorliegen und antiparallel zueinander angeordnet sind. Die wenigstens zwei Peptidbausteine können jeweils mit einem oder mehreren Stabilisationsbausteinen kovalent verbunden sein. Hierbei ist sowohl eine
Verknüpfung der vorgesehenen Peptid- und der Stabilisationsbausteine zu einem Liganden mit einer offenkettigen Struktur, als auch eine Verknüpfung der beiden Peptid- und der
vorgesehenen Stabilisationsbausteine zu einer makrocyclischen Ligandenstruktur geeignet.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist der synthetische Ligand genau zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine auf, wobei lediglich einer der beiden
Stabilisationsbausteine mit beiden Peptidbausteinen kovalent verbunden ist und diese so klammerartig miteinander verbindet. Der zweite Stabilisationsbaustein ist nur mit einem der beiden Peptidbausteine verbunden. Hierbei ist es üblicherweise von Vorteil, wenn der die Stabilisationsbausteine mit den Peptidbausteinen terminal verknüpft sind (C-Terminus oder N- Terminus). Dies gilt insbesondere für den klammerartigen Stabilisationsbaustein. Daneben sind aber auch solche Liganden von Vorteil, bei denen zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine vorgesehen sind, wobei beide Stabilisationsbausteine die beiden Peptidbausteine klammerartige verbinden. Bei dieser Ausführungsform ist der synthetische Ligand makrozyklisch. Außerdem ist jeder der beiden Stabilisationsbausteine mit beiden Peptidbausteinen kovalent verbunden, wobei die kovalente Verbindung hier ebenfalls bevorzugt an den jeweiligen Terminus (C-Terminus oder N-Terminus) der Peptidbausteine ausgebildet ist.
Bei einem synthetischen Ligand, der zwei Peptidbausteine aufweist, ist es zudem günstig, wenn der erste Peptidbaustein eine Sequenz aufweist, die einer der Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 oder SEQ ID No. 10 entspricht oder die zu einer dieser Sequenzen eine Sequenzanalogie von größer 75%, insbesondere größer 80%, bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90% und ganz besonders bevorzugt von größer 95% aufweist und wenn der zweite Peptidbaustein eine Sequenz aufweist, die einer der Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10 entspricht oder die zu einer dieser Sequenzen eine Sequenzanalogie von größer 75%, insbesondere größer 80%, bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90% und ganz besonders bevorzugt von größer 95% aufweist. Dabei können der erste und der zweite Peptidbaustein die gleiche Sequenz besitzen oder die Sequenzen der beiden Peptidbausteine können voneinander verschieden sein. Besonders bevorzugt sind hierbei vor allem synthetische Liganden, bei denen die beiden Peptidbausteine eine der folgenden
Sequenz-Kombinationen oder eine entsprechende Kombination von einem oder zwei Sequenzanalogen Peptidbausteinen bereitstellen, wobei die Sequenzanalogie größer 75%, insbesondere größer 80%, bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90% und ganz besonders bevorzugt von größer 95% beträgt: SEQ ID No. 3 in Kombination mit SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 in Kombination mit SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 4 in Kombination mit SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 in Kombination mit SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 6 in Kombination mit SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 7 in Kombination mit SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 in Kombination mit SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10 in Kombination mit SEQ ID No. 10.
In einer weiteren wichtigen Ausgestaltung der Erfindung weist der synthetische Ligand genau einen Stabilisationsbaustein und vier Peptidbausteine auf. Günstig sind auch Ausführungsformen mit einem Peptidbaustein und zwei oder drei Stabilisationsbausteinen. Die Peptidketten sind auch in diesen Fällen bevorzugt jeweils terminal (C-Terminus oder N-Terminus) mit dem Stabilisationsbaustein verbunden. Vorteilhaft ist außerdem, wenn der Stabilisationsbaustein jeweils nur an einer Stelle mit jedem der zwei, drei oder vier vorgesehenen Peptidbausteine verbunden ist.
Es hat sich prinzipiell als vorteilhaft erwiesen, wenn der wenigstens eine Stabilisationsbaustein ein Molekülgerüst mit wenigstens 5 Kohlenstoffatomen umfasst. Ein Stabilisationsbaustein mit 5 bis 80, bevorzugt 5 bis 70, besonders bevorzugt 5 bis 50 und ganz besonders bevorzugt 5 bis 40 oder 5 bis 30 Kohlenstoffatomen ist zur Stabilisierung der Konformation des wenigstens einen Peptidbausteins und zur Bereitstellung eines löslichen synthetischen Liganden besonders günstig.
Neben den wenigstens 5, 5 bis 80, bevorzugt 5 bis 70, besonders bevorzugt 5 bis 50 und ganz besonders bevorzugt 5 bis 40 oder 5 bis 30 Kohlenstoffatomen können in dem Molekülgerüst des wenigstens einen Stabilisationsbausteins auch Heteroatome, insbesondere Sauerstoff, Schwefel- und/oder Stickstoff-Atome vorgesehen sein. Die Anzahl der Heteroatome beeinflusst die Polarität und damit die Löslichkeit des Liganden. Stabilisationsbausteine mit 1 bis 40, bevorzugt 3 bis 35 und besonders bevorzugt 6 bis 20 Heteroatomen sind besonders vorteilhaft.
Es ist außerdem vorteilhaft, wenn der wenigstens eine Stabilisationsbaustein ein Molekulargewicht von 80 g/mol bis 1600 g/mol, bevorzugt 100 g/mol bis 1300 g/mol und besonders bevorzugt 130 g/mol bis 850 g/mol oder 200 g/mol bis 600 g/mol aufweist. Dabei sind die
Stabilisationsbausteine mit vergleichsweise hohen Molmassen vor allem ab 500 g/mol ins- besondere in synthetischen Liganden mit mehreren (z.B. zwei, drei oder vier) Peptidbausteinen vorteilhaft. Außerdem stellt ein Stabilisationsbaustein mit einer Molmasse von über 500 g/mol üblicherweise den einzigen Stabilisationsbaustein des synthetischen Liganden dar. Während Stabilisationsbauseine mit eher niedrigeren Molmassen (bis 260 g/mol) bevorzugt mehrfach in dem synthetischen Liganden enthalten sind (vorzugsweise doppelt) und zudem vor allem in Kombination mit einen (bevorzugt 5 bis 21 gliedrigen) Peptidbaustein oder zwei oder drei kurzen (bevorzugt 5 bis 13) Peptidbausteine vorgesehen sind.
Das Molekülgerüst des wenigstens einen Stabilisationsbausteins kann zudem eine lineare oder eine verzweigte Struktur aufweisen. Günstig ist auch, wenn das Molekülgerüst des
Stabilisationsbausteins wenigstens einen, bevorzugt jedoch ein oder zwei cyclische Strukturen und/oder einen Bi- oder einen Tricyclus umfasst oder von diesem gebildet wird, wobei pro Cyclus bevorzugt 5 oder 6 Ringatome vorgesehen sind, die von wenigstens zwei Kohlenstoffatomen und einem bis 3 Heteroatomen gebildet sind. Das Molekulargewicht eines
Stabilisationsbausteins, dessen Molekülgerüst wenigstens eine cyclische Struktur (Mono-, Di-, oder Tricyclus) aufweist, beträgt vorzugsweise 80 g/mol bis 700 g/mol, bevorzugt 100 g/mol bis 600 g/mol und besonders bevorzugt 130 g/mol bis 300 g/mol. Lineare oder verzweigte acylische Stabilisationsbausteine weisen bevorzugt 5 bis 80, bevorzugt 5 bis 70, besonders bevorzugt 5 bis 50 oder 5 bis 30 Kohlenstoffatome und 3 bis 35 bevorzugt 6 bis 20 Heteroatome auf. Der Stabilisationsbaustein weist bevorzugt wenigstens eine Attachmentgruppe auf, über die er kovalent mit dem wenigstens einen Peptidbaustein verknüpft ist. Die Attachmentgruppe ist vorzugsweise eine sekundäre oder tertiäre Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe. Denkbar ist aber auch eine andere zweckmäßige Ausgestaltung, die eine stabile und einfach bereitzustellende Verbindung zwischen Peptidbaustein und Stabilisationsbaustein bietet, wie beispiels- weise eine Attachmentgruppe die derart ausgestaltet ist , dass sie über eine Click-Reaktion mit einer entsprechend modifizierten Gruppe (modifizierte Aminosäure) des Peptidbausteins verbunden werden kann.
Eine besonders vorteilhafte Ausführung der Erfindung sieht vor, dass der Stabilisationsbaustein und der Peptidbaustein über eine Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Peptidbindungen sind äußerst stabil. Vorteilhaft ist weiterhin, dass zum Aufbau von Peptidbindungen eine Vielzahl etablierter Methoden bekannt sind, die besonders kostengünstig und effizient durchführbar sind. Außerdem sind auch die einzelnen Bausteine des Peptidbausteins durch
Peptidbindungen miteinander verknüpft. Zur Darstellung des wenigstens einen Peptidbausteins und zu dessen Verknüpfung mit dem wenigstens einen Stabilisationsbaustein oder einem Teil hiervon können daher prinzipiell die gleichen Methoden und Reagenzien verwendet werden. Ein besonders effizientes und gut etabliertes Verfahren, das hierbei eingesetzt werden kann, ist die Festphasenpeptidsynthese. Synthetische Liganden, deren Bestandteile ausgehend von Bausteinen oder Gruppen, die über eine Peptidbindung miteinander verbunden sind, können daher besonders einfach und kostengünstig bereitgestellt werden.
Bei einem Stabilisationsbaustein, bei dem eine Aminogruppe als Attachmentgruppe vorgesehen ist, ist es besonders vorteilhaft wenn die Aminogruppe über eine Peptidbindung mit einer Carboxylfunktion des Peptidbausteins, bevorzugt mit dem C-Terminus verbunden ist. Dem- entsprechend ist es bei einer Carboxylfunktion als Attachmentgruppe besonders vorteilhaft, wenn diese mit einer Aminogruppe des Peptidbausteins, bevorzugt dem N-Terminus, verbunden ist.
Alternativ zur terminalen Anbindung kann der Stabilisationsbaustein aber auch in die Sequenz des Peptidbausteins eingebaut sein, beispielweise als Ersatz für eine aufgrund einer Deletion in der Sequenz des Peptidbausteins nicht-enthaltene Aminosäure. In diesem Fall ist der
Stabilisationsbaustein an zwei Stellen mit dem Peptidbaustein verknüpft, weshalb der
Stabilisationsbaustein hierzu wenigstens zwei Attachmentgruppen aufweist. Enthält ein Stabilisationsbaustein mehrere Attachmentgruppen, so können diese unterschiedlich oder gleichartig ausgebildet sein. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Stabilisationsbaustein mehrere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen als Attachmentgruppen aufweist, über die er jeweils mit einem Peptidbaustein verbunden ist. Eine direkte Anbindung an den C-Terminus des jeweiligen Peptidbausteins ist dabei besonders einfach, möglich ist aber auch eine indirekte Verknüpfung oder die Anbindung an eine andere Stelle des Peptidbausteins als den C-Terminus. Bei dieser Ausgestaltung haben sich insbesondere Liganden mit einem Stabilisationsbaustein mit zwei, drei oder vier sekundären oder tertiären Aminogruppen als Attachmentgruppen bewährt. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform eines synthetischen Liganden betrifft einen
Stabilisationsbaustein, der wenigstens zwei unterschiedliche Attachmentgruppen, bevorzugt wenigstens eine sekundäre oder tertiäre Aminogruppe und wenigstens eine Carboxylgruppe aufweist. Hierbei ist es wiederum besonders vorteilhaft, wenn die Amino-Attachmentgruppe mit dem C-Terminus eines Peptidbausteins und die Carboxyl-Attachmentgruppe mit dem N- Terminus eines Peptidbausteins verbunden ist, wobei der C-Terminus und der N-Terminus Teil eines oder aber Teil zweier Peptidbausteine sein können.
Zusätzlich zur wenigstens einen Attachmentgruppe können an dem Molekülgerüst des
Stabilisationsbausteins eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen, wie beispielsweise eine freie Carboxylfunktion oder ein Derivat hiervon, oder eine weitere primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe, oder eine Azid-Gruppe, eine Alkin-Gruppe, eine Ethergruppe, eine Thioether-Gruppe, eine-Triazolgruppe, oder eine SH- oder eine OH-Funktion vorgesehen sein. Vorteilhaft hierbei ist insbesondere, dass mit Hilfe einer oder mehrerer zusätzlicher funktioneller Gruppen ein Mittel zur Verfügung gestellt werden kann, das es erlaubt, dass bei Bedarf auf einfache und unkomplizierte Weise zusätzliche Bestandteile mit dem synthetischen Liganden verknüpft werden können. Dies kann durch eine Reaktion des gewünschten zusätzlichen Bestandteils mit der funktionellen Gruppe des Stabilisationsbausteins geschehen oder aber der gewünschte zusätzliche Bestandteil wird sukzessive an dem Liganden aufgebaut. Bei einer Ausgestaltung mit weiteren funktionellen Gruppen wird eine anwendungsspezifische Fein- justierung des synthetischen Liganden ermöglicht. Denkbar ist beispielsweise das Anknüpfen eines Markers (wie z.B. eines Fluoreszenzlabels) oder eine kovalente Anknüpfung des synthetischen Liganden an eine Festphase. Handelt es sich bei der funktionellen Gruppe um eine polare Gruppe, so bewirkt diese außerdem auch eine Verbesserung der Löslichkeit des Liganden. Vorteilhaft ist weiterhin, dass die zusätzliche funktionelle Gruppe auch zur Ver- besserung der Löslichkeit des synthetischen Liganden durch Beeinflussung der Polarität und/oder durch Beeinflussung der sterischen Wechselwirkung mehrerer gelöster synthetischer Liganden untereinander beiträgt. Ist eine C=0-Gruppe als zusätzliche funktionelle Gruppe vorgesehen, so ist diese vorzugsweise Teil einer Ester- oder Amidbindung. Esterbindungen und Amidbindungen sind vergleichsweise stabil. Zudem können diese Bindungen unter Zuhilfenahme verschiedener gut etablierter Methoden und Reagenzien bereitgestellt werden. Eine freie Carboxylgruppe liegt unter physiologischen Bedingungen zumeist deprotoniert und damit in geladener Form vor. Bei einem Stabilisationsbaustein kann eine freie Carboxylgruppe deshalb dazu genutzt werden, die Polarität des synthetischen Liganden zu erhöhen und so die Löslichkeit in einem wässrigen Medium zu verbessern. Ein Stabilisationsbaustein mit einer derivatisierten Carboxylgruppe C=0-Gruppe ist ebenfalls vorteilhaft, weil eine derartige Gruppe ebenfalls die Polarität des synthetischen Liganden erhöhen kann und weil die C=0-Gruppe ein einfaches und robustes Mittel zur Anknüpfung einer oder mehrerer polaren Gruppen, wie einer oder mehrerer
Aminosäuren allgemein und vor allem einer Aminoalkansäure und/oder proteinogen Aminosäure wie Lysin, Glycin, Valin oder Isoleucin darstellt. Der Abstand zwischen dem Atom der Attachmentgruppe, über das der Stabilisationsbaustein kovalent mit einem Peptidbaustein verbunden ist, und einer gegebenenfalls vorgesehenen zweiten Attachmentgruppe oder einer zusätzlichen funktionellen Gruppe gemäß obiger Definition, beträgt in kürzester Kette bevorzugt 1 bis 30 Atome, insbesondere 1 bis 25 Atome. Bei einem synthetischen Liganden, bei dem ein Stabilisationsbaustein mit zwei
Peptidbausteinen verknüpft ist, stellt der Stabilisationsbaustein eine Art Klammer dar, welche die beiden Peptidbausteine miteinander verbindet. In diesem Fall liefert ein
Stabilisationsbaustein besonders gute Resultate, bei dem der Abstand zwischen den Atomen der Attachmentgruppe über das der Stabilisationsbaustein kovalent mit dem Peptidbaustein verbunden ist 3 bis 30 Atome, bevorzugt 4 bis 30 Atome und besonders bevorzugt wenigstens 9 Atome, insbesondere wenigstens 18 Atome beträgt.
Neben dem wenigstens einen Peptidbaustein und dem wenigstens einen Stabilisationsbaustein kann der synthetische Ligand gegebenenfalls weitere Bausteine enthalten. Denkbar ist bei- spielsweise ein Linker, der zwischen den unterschiedlichen Komponenten eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden vorgesehen ist. Besonders einfach und daher bevorzugt ist jedoch, dass kein weiterer Bestandteil zusätzlich zu dem wenigstens einen Peptidbaustein und dem wenigstens einen Stabilisationsbaustein vorgesehen ist, so dass der synthetische Ligand allein von dem wenigstens einen Peptidbaustein und dem wenigstens einen Stabilisations- baustein gebildet ist. Besonders vorteilhafte synthetische Liganden werden erhalten mit einem Stabilisationsbaustein umfassend wenigstens ein Strukturmotiv ausgewählt aus der Gruppe enthaltend eine Aminosäure, insbesondere eine Aminoalkansäure oder eine proteinogene Aminosäure oder ein Derivat einer proteinogenen Aminosäure, bevorzugt ein Triazolderivat oder ein Akinderivat.
Ist eine Aminoalkansäure als Strukturmotiv vorgesehen, umfasst diese vorzugsweise 3 bis 12 Kohlenstoffatome besonders bevorzugt 4 bis 10 Kohlenstoffatome. Günstig sind auch
Diaminoalkansäuren. Ganz besonders vorteilhaft ist es, wenn die Carboxylgruppe und die Aminogruppe der Aminoalkansäure terminal angeordnet sind, wie beispielsweise bei 6-Amino- hexansäure.
Ist eine proteinogene Aminosäure als Strukturmotiv vorgesehen, so handelt es sich vorzugsweise um das (S)-Enantiomer, weil dieses der in den meisten Organismen natürlich vorkommenden Form entspricht und daher besonders kostengünstig ist. Ist Cystein enthalten so handelt es sich entsprechend bevorzugt um das (/^-Enantiomer. Prinzipiell sind sowohl Strukturmotive von proteinogenen Aminosäuren, die an ihrem α-C-Atom einen Kohlenwasserstoffrest aufweisen oder deren Derivate, als auch deren Seitenketten eine funktionelle Gruppe aufweisen oder deren Derivate vorteilhaft. Unter den proteinogenen Aminosäuren, die an ihrem α-C-Atom einen Kohlenwasserstoffrest aufweisen, haben sich insbesondere Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin und Glycin als vorteilhaft erwiesen. Unter den proteinogenen Aminosäuren deren Seitenkette eine funktionelle Gruppe aufweist, sind vor allem Serin, Lysin, Thyrosin und Threonin bevorzugt. Zu den Derivaten einer proteinogenen Aminosäure zählen strukturell eng verwandte Verbindungen, wie z.B. Enantiomere. Bei Leucin ist dies bevorzugt tert-Leucin oder Norleucin. Bei Serin sind vor allem die Alkinether- und Triazol- Derivate vorteilhaft.
Vorteilhaft ist zudem, wenn das Strukturmotiv ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend ω- Amino-tetraethylenglycolacetylsäure, Azidoprolin, Serinpropargylether, Hydroxythreonin, Thiaprolin und Isoprolin, sowie Derivate von ω-Amino-tetraethylenglycolacetylsäure, Azido- prolin, Serinpropargylether, Hydroxythreonin, Thiaprolin und Isoprolin.
Besonders bevorzugt ist es, wenn der wenigstens eine Stabilisationsbaustein wenigstens eines der folgenden Strukturmotive SB1 bis SB12 umfasst:
Figure imgf000018_0001
SB12 wobei: R', R" unabhängig voneinander -OH, OR'" oder eine Aminosäure sind, und wobei die Aminosäure Teil des Stabilisationsbaustein selbst, oder Teil eines mit dem Stabilisationsbaustein verbundenen Peptidbausteins sein kann, wobei es sich bei der Aminosäure um eine proteinogene Aminosäure oder um ein Derivat hiervon oder um eine nicht-proteinogene Aminosäure, wie z.B. eine Aminoalkansäure handeln kann;
R'" ein Kohlenwasserstoffrest, bevorzugt ein Alkylrest, mit 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8 C-Atomen ist;
R1 bis R12 unabhängig voneinander eine Aminosäure, -H, R'" oder ein weiteres der gezeigten Stukturmotive SB1 bis SB12 sind, und wobei die Aminosäure Teil des
Stabilisationsbaustein selbst, oder Teil eines mit dem Stabilisationsbaustein verbundenen Peptidbausteins sein kann, wobei es sich bei der Aminosäure um eine proteinogene Aminosäure oder um ein Derivat hiervon oder um eine nichtproteinogene Aminosäure, wie z.B. eine Aminoalkansäure handeln kann; und k, n, m, und o unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8 und besonders bevorzugt 4 oder 5 sind. Ganz besonders bevorzugt sind k, n, m und o = 4 und p = 5.
Ist einer der Reste R1 bis R12 und/oder R' oder R" der Strukturmotive SB1 bis SB12 eine Aminosäure eines Peptidbausteins, so weist dieser bevorzugt eine Sequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Sequenzen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 , oder der Peptidbaustein weist eine Sequenz auf, die zu den Sequenzen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 1 1 eine Sequenzhomologie von größer 80%, besonders bevorzugt größer 85%, besonders bevorzugt größer 90% und ganz besonders bevorzugt von größer 95% aufweist. Außerdem ist sofern es sich bei einem der Reste R1 bis R12 und/oder R' oder R" um eine Aminosäure handelt diese bevorzugt über eine Peptidbindung mit dem
Strukturmotiv verbunden.
Dabei sind vor allem folgende Ausgestaltungen der Strukturmotive von Vorteil:
Figure imgf000020_0001
SB 12a wobei insbesondere folgende Ausführungsformen bevorzugt sind:
Figure imgf000021_0001
SB12b Bei den Strukturmotiven SB1a bis SB12a und SB1 b bis SB12b handelt es sich um spezielle Varianten der allgemeineren Strukturmotive SB1 bis SB12. Für die Reste R1 bis R12, R', R" und R'" und die Variablen k, n, m, o und p es gelten daher ebenfalls die oben genannten Definitionen.
In einer wichtigen Ausführungsform eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden wird der Stabilisationsbaustein ausschließlich von einem der gezeigten Strukturmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SB1 bis SB12, SB1 a bis SB12a und SB1 b bis SB12b gebildet. Eine andere wichtige Ausführungsform sieht vor, dass der Stabilisationsbaustein zusätzlich zu dem wenigstens einen Strukturmotiv, ausgewählt aus der Gruppe umfassend SB1 bis SB12, SB1 a bis SB12a und SB1 b bis SB12b, wenigstens eine kovalent angebundenen Untereinheit aufweist. In diesem Fall bildet das Strukturmotiv, ausgewählt aus der Gruppe umfassend SB1 bis SB12, SB1 a bis SB12a und SB1 b bis SB12b, ein Basissegment des Stabilisationsbausteins, welches hauptsächlich dazu dient, die Konformation des wenigstens einen Peptidbausteins zu stabilisieren und im Falle mehrerer Peptidbausteine diese zusammenzuhalten. Während die in Lösung auftretenden Wechselwirkungen zwischen gelösten Liganden-Molekülen untereinander und mit dem Solvens vor allem durch die wenigstens eine Untereinheit beeinflusst werden. Die genannte Ausführungsform ermöglicht folglich, dass diejenigen Molekülgruppen, die hauptsächlich zur konformationellen Stabilisierung eingesetzt werden, und diejenigen
Molekülgruppen die hauptsächlich zur Verhinderung einer Fibrillierung vorgesehen sind, unabhängig voneinander eingeführt und gestaltet werden können. Der Vorteil solcher synthetischer Liganden besteht daher insbesondere in ihrem modularen Aufbau.
Dabei hat sich gezeigt, dass es besonders günstig ist, wenn die Untereinheit wenigstens zwei funktionelle Gruppen aufweist, die unter physiologischen Bedingungen eine Ladung tragen. Dazu können beispielsweise freie Carboxylgruppen vorgesehen sein, die unter physiologischen Bedingungen zumindest teilweise deprotoniert und daher negativ geladen vorliegen. Besonders günstig ist es jedoch, wenn die Untereinheit wenigstens zwei primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen aufweist. Diese liegen unter physiologischen Bedingungen zumindest teilweise quarterniert und damit positive geladen vor. Besonders geeignet sind vor allem primäre Aminogruppen. In einer möglichen Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden ist die Untereinheit zwischen dem Basissegment und dem Peptidbaustein vorgesehen. Besonders bevorzugt ist hierbei, dass das Basissegment zwischen dem Peptidbaustein und der
Untereinheit angeordnet ist. Auf diese Weise kann weitestgehend sichergestellt werden, dass die gewünschte Konformation des Peptidbausteins, nämlich die, die für anti-Aß-Antikörper erkennbar ist, nicht durch die Untereinheit gestört wird.
Eine besonders stabile Verknüpfung zwischen den beiden Komponenten des Stabilisations- bausteins liegt vor, wenn die Untereinheit über eine Peptidbindung mit dem Basissegment ver- bunden ist. Vorteilhaft ist weiterhin, dass eine Peptidbindung einfach und effektiv geknüpft werden kann. Außerdem kann die kovalente Verknüpfung von Basiseinheit und Untereinheit im Falle einer Peptidbindung herstellungstechnisch besonders einfach mit der Synthese des Peptidbausteins verbunden werden. Dies reduziert die Herstell kosten. Zur Verknüpfung über eine Peptidbindung ist an einer der beiden Gruppen (Basissegement und Untereinheit) eine Aminofunktion vorgesehen, während die andere Gruppe eine Carboxylfunktion aufweist.
Eine wichtige Ausführungsform sieht vor, dass die Untereinheit von einer Aminosäure
(proteinogen oder nicht-proteinogen), einem Derivat einer Aminosäure oder von einem homogen- oder heterogen-aufgebauten Oligomer, vor allem einem Di-, Tri- oder Tetramer, auf- gebaut aus einer oder mehreren Aminosäuren gebildet ist, wobei die einzelnen Bausteine der Oligomere bevorzugt über eine Peptidbindung miteinander verknüpft sind, so dass das Oligomere ein Oligopeptidderivat ist. Die proteinogenen Aminosäuren Lysin, Isoleucin und Glutaminsäure, sowie deren heterogen- (z.B. -Lys-Glu-Lys-, oder -Lys-lle-Lys) oder homogenaufgebaute Oligopeptide (-Lys-Lys-Lys-), sind bei einer Stabilisierung des Peptidbausteins des synthetischen Liganden zum Schutz vor Fibrillierung besonders vorteilhaft. Oligopeptide mit 2 bis 8 Peptidbausteinen sind bevorzugte Untereinheiten, wobei gerade Oligopeptide mit 2 bis 4 Peptidbausteinen besonders gute Resultate zeigen. Zu den nicht-proteinogenen Aminosäuren zählen z.B. auch Aminoalkansäuren, die terminale oder in sonstiger Weise angeordnete Carboxyl- bzw. Amino-Gruppen aufweisen.
Eine wichtige Ausführungsform sieht außerdem wenigstens einen Stabilisationsbaustein vor, der ein Basissegment aufweist, das mit mehreren, insbesondere zwei, drei oder vier Untereinheiten verbunden ist. Das Basissegment weist dabei bevorzugt eines oder mehrere der folgenden Strukturmotive SB5, SB6 oder SB7 auf:
Figure imgf000024_0001
wobei die Ausführungsformen SB5a, SB6a, SB7a
Figure imgf000024_0002
und insbesondere die Ausführungsformen SB5b, SB6b, SB7b besonders bevorzugt sind:
SB5b R
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0001
Ein Vorteil dieser Liganden liegt darin, dass diese üblicherweise besonders leicht löslich sind bzw. in Lösung nicht ausflocken und somit für mehrere Stunden bis Tage in flüssiger Form verwendet werden können. Außerdem sind sie einfach und kostengünstig herstellbar und sie zeigen eine gute Bindungsaffinität gegenüber anti-Aß-Antikörpern. Derartige Liganden können beispielsweise zur Herstellung einer Arzneimittelformulierung verwendet werden, mit deren Hilfe ein potentieller Patient geimpft werden soll, oder mit deren Hilfe im präklinischen Stadium der Abbau von Aß1-42 Peptiden unterstützt werden soll.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen eines erfindungsgmäßen synthetischen Liganden sind die Liganden SL1 bis SL34, die jeweils eine der folgenden Strukturen aufweisen:
SL1 :
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
SL4:
Figure imgf000026_0003
Figure imgf000026_0004
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0003
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
HO ^lle "Gly Val 'Leu \ "Ala
Figure imgf000028_0003
Figure imgf000028_0004
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
SL15:
Figure imgf000029_0003
Figure imgf000029_0004
Figure imgf000029_0005
SL18:
Figure imgf000030_0001
SL19:
Figure imgf000030_0002
SL20:
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000030_0004
SL22:
Figure imgf000030_0005
Figure imgf000031_0001
SL24:
Figure imgf000031_0002
SL25:
Figure imgf000031_0003
SL26:
Figure imgf000031_0004
SL27:
Figure imgf000031_0005
SL28:
„Lys „Ala ✓lle „Leu ✓Val „Gly -Val H "Gly "lle "Gly Tvlet "Gly Val "N
H
H. „Gly ✓lle „Gly „Met -Gly ✓Val .N Lys "Ala "lle "Leu 'Val "Gly 'Val SL29:
Figure imgf000032_0001
SL30:
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000032_0004
Figure imgf000033_0001
SL34:
Figure imgf000033_0002
Bei einem Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden sieht die Erfindung vor, dass das Verfahren die Schritte umfasst
a) Synthese des wenigstens einen Peptidbausteines, und
b) Kopplung des wenigstens einen Peptidbausteins mit dem wenigstens einen
Stabilisationsbaustein, wobei die Kopplung des Stabilisationsbausteins in mehreren Teilschritten erfolgen kann. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung erfolgt die Herstellung des synthetischen
Liganden über eine Festphasenpeptidsynthese. Dabei kann der Stabilisationsbaustein vorab hergestellt und mit dem Peptidbaustein verbunden werden, oder der Stabilisationsbaustein wird bei der Kopplung mit dem Peptidbaustein erst sukzessive aufgebaut. In diesem Fall werden bei der Kopplung in Schritt b) nacheinander einzelne Gruppen des Stabilisationsbausteins mit dem Peptidbaustein verbunden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit zum Nachweis von anti Aß-Autoantikörpern in einer zu untersuchenden Probe enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen synthetischen Liganden. Außerdem sieht die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von humanem anti Aß- Autoantikörper in einer zu untersuchenden Probe vor, wobei wenigstens ein synthetischer Ligand gemäß Anspruch 1 humanen anti Aß-Autoantikörper bindet und wobei diese Bindung über Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Radioaktivität oder eine andere gebräuchliche
Tracermethode nachgewiesen wird.
Des Weiteren sieht die Erfindung die Verwendung wenigstens eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden zur Herstellung eines Impfstoffes zur Vorbeugung und Behandlung von Morbus Alzheimer vor. Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen eine Ablagerung von Aß Peptiden gefunden wird, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzung zur
Behandlung von von Morbus Alzheimer, wenigstens einen erfindungsgemäßen synthetischen Liganden enthält. Die erfindungsgemäßen synthetischen Liganden zeichnen sich dabei insbesondere dadurch aus, dass sie einerseits eine ausreichende Konformationsstabilität aufweisen und andererseits das Risiko von Nebenwirkungen, beispielsweise das Auftreten von Entzündungen des Gehirns, deutlich senken, wie bereits in ersten Tierversuchen deutlich erkennbar ist. Ein oder mehrere erfindungsgemäße synthetische Liganden können daher beispielsweise intramuskulär, subkutan, intranasal, intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden und so die Bildung von natürlichen humanen anti-Aß-Antikörpern anregen. Der auf diese Weise geimpfte Patient verfügt dann bereits im potentiellen präklinischen Stadium der Krankheit über eine hohe Anzahl entsprechender Antikörper, die vermehrt gebildetes Aß1-42-Peptid binden und abbauen können. Es ist daher vorstellbar, dass die Bildung von neuritischen Plaques auf diese Weise verhindert oder zumindest verlangsamt werden kann. Auch wenn die Krankheit bereits ausgebrochen ist, ist es denkbar, die erfindungsgemäßen synthetischen Liganden zu verwenden, um eine entsprechende Immunantwort in den Patienten hervorzurufen.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 Die wildtypische Sequenz des Peptides Aß 1-42;
SEQ ID No. 2 bis 11 Peptidsequenzen der in den erfindungsgemäßen synthetischen Liganden verwendeten Peptidbausteine; SEQ ID No. 12 bis 28Sequenzen von Peptidderivaten, die in den erfindungsgemäßen
synthetischen Liganden SL1 bis SL34 enthalten sind;
Fig. 1 , 2, 3 ELISA-Untersuchungen zur Charakterisierung der Bindung von
erfindungsgemäßen synthetischen Liganden an natürlich vorkommende
Antikörper gegen ß-Amyloid;
Fig. 4a, 4b, 4c, 4d weitere ELISA-Untersuchungen zur Charakterisierung der Bindung von erfindungsgemäßen synthetischen Liganden an natürlich vorkommende
Antikörper gegen ß-Amyloid
Fig. 5a Ergebnisse von SPR-Untersuchungen zur Charakterisierung der Bindung von erfindungsgemäßen synthetischen Liganden an natürlich
vorkommende Antikörper gegen ß-Amyloid;
Fig. 5b zum Vergleich Ergebnisse von SPR-Untersuchungen zur
Charakterisierung der Bindung von Aß1-40 an natürlich vorkommende
Antikörper gegen ß-Amyloid;
Fig. 6 Ergebnisse eines Thioflavin-Essays zur Untersuchung der
Aggregationsneigung erfindungsgemäßer synthetischer Liganden Fig. 7 und 8 Messungen zur Toxizität monomerer erfindungsgemäßer synthetischer
Liganden gegenüber primären Neuronen; und
Fig. 9 und 10 Messungen zur Toxizität löslicher, oligomerer erfindungsgemäßer
synthetischer Liganden gegenüber primären Neuronen.
Bei einem erfindungsgemäßen synthetischen Liganden ist die Sequenz entsprechend den Aminosäuren 20 bis 42 und insbesondere die Sequenz entsprechend der Aminosäuren 28 bis 40 gemäß SEQ ID No. 1 ausschlaggebend für die Bildung und Erkennung des spezifischen Aß1-42-Epitops, das bevorzugt durch natürliche humane anti-Aß-Antikörper gebunden wird. In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen werden beispielhaft verschiedene
Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden näher beschrieben, die jeweils zumindest einen Teil des Aß1-42-Epitops enthalten, wobei mit Hilfe des jeweils kovalent gebundenen Stabilisationsbausteins die Konformation des Epitops stabilisiert ist und eine Fibrillierung in Lösung vermieden wird. I. Ausführungsbeispiele
Besonders geeignet sind Peptidbausteine mit einer Aminosäuresequenz gemäß der nachfolgend dargestellten Sequenzen SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 11 :
SEQ ID No. 2:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 3:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 4:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly SEQ ID No. 5:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly
SEQ ID No. 6:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val
SEQ ID No. 7:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly
SEQ ID No. 8:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle
SEQ ID No. 9:
Gly Ala lle lle Gly SEQ ID No. 10:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle Ala
SEQ ID No. 11 :
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Lys In den nachfolgend dargestellten Ausführungsbeispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:
AcOH Essigsäure
DCM Dichlormethan
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Diemthylsulfoxid
DEE Diethylether
EE Essigsäureethylester
H BT U 2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)-1 , 1 ,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat
HOBT Hydroxybenztriazol
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-
DIPEA Diisopropylethylamin
HR hochaufgelöst (high resolution)
ESI Elektronensprayionisierung
TFA Trifluoressigsäure
MeCN Aceton itril
PBS Phosphate buffered saline
Ausführungsbeispiel 1
SL1 ist ein synthetischer Ligand für humane anti-Aß-Antikörper. Dieser besteht aus einem Stabilisationsbaustein und zwei Peptidbausteinen. Die Peptidbausteine weisen jeweils eine Peptidsequenz gemäß der SEQ ID No. 3 auf. Der Stabilisationsbaustein ist ein Triazollinker. Der Stabilisationsbaustein ist mit jeweils über eine Peptidbindung mit dem C-Terminus der beiden Peptidbausteine verknüpft. Der synthetische Ligand SL1 weist folgende Struktur auf:
Figure imgf000038_0001
Die beiden Peptidketten der Peptidbausteine liegen hierbei in ß-Faltblatt Konformation vor und sind parallel zueinander angeordnet. Der Stabilisationsbaustein ist von einem Strukturmotiv gemäß Formel SB8 gebildet, wobei an der Rest R5 und der Rest R2 jeweils eine Aminosäure, nämlich die Aminosäure Valin des Peptidbausteins darstellt, mit der der Baustein SB8 jeweils über eine Peptidbindung verbunden ist. Die Peptidbausteine sind jeweils an ihrem C-Terminus kovalent mit dem einen Stabilisationsbaustein verknüpft.
Ausführungsbeispiel 2
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt SL2
Figure imgf000038_0002
Der Ligand besteht aus einem Peptidbaustein mit einer Peptidsequenz entsprechend der SEQ ID No. 3 und einem Stabilisationsbaustein. Bei dem Stabilisationsbaustein handelt es sich um tert-Leucin, das an Position 6 der Aminosäuresequenz des Peptidbausteins vorgesehen ist. Der gesamte synthetische Ligand weist eine Peptidsequenz entsprechend der SEQ ID No. 12 auf. Ausführungsbeispiel 3
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt SL3
Figure imgf000039_0001
SL3
Der synthetische Ligand weist einen Stabilisationsbaustein und einen Peptidbaustein auf. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 2 auf. Der Stabilisationsbaustein ist von einem Strukturmotiv gemäß SB1 gebildet, wobei R' = -OH und R1 die C-terminale
Aminosäure des Peptidbauteins ist.
Ausführungsbeispiel 4
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt SL4
Figure imgf000039_0002
Der hier gezeigte synthetische Ligand SL4 weist zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine auf. Die beiden Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Die beiden Stabilisationsbausteine sind von dem Strukturmotiv gemäß SB8 gebildet. Sie verbinden die beiden Peptidbausteine jeweils klammerartig zu einem Makrozyklus. Jeder Stabilisationsbaustein weist dazu zwei Attachmentgruppen eine Aminogruppe und eine Carboxylfunktion auf.
Ausführungsbeispiel 5 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt SL5
Figure imgf000040_0001
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine gemäß dem Strukturmotiv SB 10 auf. auf. Einer der Peptidbausteine besitzt eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 4 während der andere eine Sequenz gemäß SEQ I D NO. 5 aufweist. Einer der Stabilisationsbausteine ist mit einem Peptidbaustein über eine Attachmentgruppe verbunden. Der andere Stabilisationsbaustein verbindet beide Peptidbausteine klammerartig. Hierzu weist der klammerartige Stabilisationsbaustein zwei Attachmentgruppen auf, eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe. Der Stabilisationsbaustein, der nur mit einem Peptidbaustein verbunden ist weist neben dem Strukturmotiv gemäß SB10 eine proteinogene Aminosäure, nämlich Glycin auf. Das Glycin ist an eine zusätzlich zur Attachmentgruppe vorgesehene Aminogruppe des Stabilisationsbausteins über eine Peptidbindung kovalent angebunden.
Ausführungsbeispiel 6
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt SL6
Figure imgf000041_0001
SL6
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei
Stabilisationsbausteine auf. Einer der Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 6 während der andere eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 7 aufweist. Einer der
Stabilisationsbausteine ist mit einem Peptidbaustein über eine Attachmentgruppe verbunden. Der andere Stabilisationsbaustein verbindet beide Peptidbausteine klammerartig. Hierzu weist er zwei Attachmentgruppen auf, eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe. Der
Stabilisationsbaustein, der nur mit einem Peptidbaustein verbunden ist weist neben dem Strukturmotiv gemäß SB10 zwei proteinogene Aminosäure, nämlich Glycin und Valin auf. Das Valin ist an eine zusätzlich zur Attachmentgruppe vorgesehene Aminogruppe des
Stabilisationsbausteins über eine Peptidbindung kovalent angebunden.
Ausführungsbeispiel 7
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL7
Figure imgf000042_0001
SL7
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei
Stabilisationsbausteine auf. Einer der Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 7 während der andere eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 8 aufweist. Einer der
Stabilisationsbausteine ist mit einem Peptidbaustein über eine Attachmentgruppe verbunden. Der andere Stabilisationsbaustein verbindet beide Peptidbausteine klammerartig. Hierzu weist er zwei Attachmentgruppen auf, eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe. Der
Stabilisationsbaustein, der nur mit einem Peptidbaustein verbunden ist weist neben dem Strukturmotiv gemäß SB10 vier Aminosäuren, nämlich ein Glycin, zwei Valin und ein Isoleucin auf. Das Isoleucin ist an eine zusätzlich zur Attachmentgruppe vorgesehene Aminogruppe des Stabilisationsbausteins über eine Peptidbindung kovalent angebunden.
Ausführungsbeispiel 8
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL8
Figure imgf000042_0002
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei klammerartige Stabilisationsbausteine auf. Die Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 4. Jeder der Stabilisationsbausteine weist zwei Attachmentgruppen, namentlich eine Amino- und eine Carboxylgruppe auf. Neben den Attachmentgruppen verfügen die beiden bicyclischen Stabilisationsbausteine jeweils über weitere funktionelle Gruppen, nämlich eine Thioether- gruppe, eine Amidgruppe und zwei Hydroxygruppen. Jeder der beiden Stabilisationsbausteine weist daher insgesamt 7 Heteroatome auf.
Ausführungsbeispiel 9 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL9
Figure imgf000043_0001
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine auf. Die Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ I D NO. 6 auf. Jeder der Stabilisationsbausteine weist zwei Attachmentgruppen, namentlich eine Amino- und eine Carboxylgruppe auf. Neben den Attachmentgruppen verfügen die beiden bicyclischen
Stabilisationsbausteine jeweils über weitere funktionelle Gruppen, nämlich eine Thioether- gruppe, eine Amidgruppe und zwei Hydroxygruppen. Jeder der beiden Stabilisationsbausteine weist daher insgesamt 7 Heteroatome auf.
Ausführungsbeispiel 10
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL10
Figure imgf000044_0001
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei
Stabilisationsbausteine auf. Die Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 6 auf, die jeweils an ihrem C-Terminus durch die Aminosäure Isoleucin modifiziert ist.
Ausführungsbeispiel 11
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL11
Figure imgf000044_0002
Der synthetische Ligand weist eine Stabilisationsbaustein und einen Peptidbaustein auf. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 9 auf. Der Stabilisationsbaustein verfügt über eine Attachmentgruppe, nämlich eine Carboxylgruppe, und zusätzlich dazu über eine Azid und eine sekundäre Aminogruppe.
Ausführungsbeispiel 12
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL12
Figure imgf000045_0001
Der hier gezeigte synthetische Ligand weist zwei Peptidbausteine und zwei
Stabilisationsbausteine auf. Die Peptidbausteine besitzen eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 9.
Ausführungsbeispiel 13
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL13
Figure imgf000045_0002
Der synthetische Ligand weist eine Stabilisationsbaustein und einen Peptidbaustein auf. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 4 auf.
Ausführungsbeispiel 14
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL14
Figure imgf000046_0001
Der synthetische Ligand besteht aus einem Peptidbaustein und einem Stabilisationsbaustein. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 3 auf.
Ausführungsbeispiel 15
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel
Figure imgf000046_0002
Der synthetische Ligand besteht aus einem Peptidbaustein und einem Stabilisationsbaustein. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 3 auf. Der Stabilsationsbautstein besteht aus einem Strukturmotiv gemäß SB3 und weist als Attachmentgruppe eine Aminogruppe auf, über die er kovalent mit dem C-Terminus des Peptidbausteins verknüpft ist.
Ausführungsbeispiel 16
Ein weiterer synthetischer Ligand für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL16
H
^GIy „lle ,Gly ,Met .Gly „Val .N .OH
Lys ~Ala "lle "Leu 'Val 'Gly 'Val
SL16 Der synthetische Ligand besteht aus zwei Stabilisationsbausteinen und einem Peptidbaustein. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 3 auf.
Ausführungsbeispiel 17
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL17.
Figure imgf000047_0001
Der synthetische Ligand besteht aus zwei unterschiedlichen Stabilisationsbausteinen und einem Peptidbaustein. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 3 auf.
Ausführungsbeispiel 18
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL18
Figure imgf000047_0002
L18 Der synthetische Ligand besteht aus einem klammerartigen Stabilisationsbaustein und einem Peptidbaustein. Der C-Terminus und der N-Terminus des Peptidbausteins sind durch den Stabilisationsbaustein zu einem Makrocyclus verknüpft. Der Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß der SEQ I D No. 3 auf.
Ausführungsbeispiel 19
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL19
Figure imgf000048_0001
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Stabilisationsbaustein weist ein zwei Strukturmotive gemäß SB5 und eine Untereinheit aus einem Lysin-Tripeptid auf, welches die beiden 6-Aminohexansäure-Gruppen miteinander verbindet. Der synthetische Ligand SL19 weist insgesamt eine Sequenz gemäß SEQ I D No. 13 auf.
Ausführungsbeispiel 20
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL20
Figure imgf000048_0002
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ I D No. 3 auf. Die beiden Peptdibausteine sind kovalent mit einem
Stabilisationsbaustein verknüpft. Der Stabilisationsbaustein weist zwei Strukturmotive gemäß SB5 zwei Untereinheiten aus einem Lysin-Dipeptid und ein Strukturmotiv gemäß SB6 auf. Das Strukturmotiv gemäß SB6 bildet ein klammerartiges Rückgrat des Stabilisationsbausteins, das mit jeder der beiden vorgesehenen Aminohexansäuregruppen (Strukturmotive der FormelSB5) jeweils über ein Lysin-Dipeptid als Untereinheit verbunden ist. Die beiden
Aminohexansäuregruppen sind über ihre Aminogruppen mit den Peptidbausteinen verbunden. An das klammerartige Rückgrat sind daher insgesamt zwei Peptidderivate gemäß der SEQ ID No. 19 gebunden, die jeweils einen Peptidbaustein sowie eine Aminohexansäuregruppe und ein Lysin-Dipeptid des Stabilisationsbausteins umfassen.
Ausführungsbeispiel 21
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL21 o
^Lys ,Ala ^lle Leu ^Val „Gly Λ/al ^NL ^- . „Lys ^Lys /\ ^- . ^\ .OH
H X3ly "He Gly "Met -Gly Val lys ^ — v Lys lys 'N v — Tl
O
SL21
Der in dem synthetischen Ligand enthaltene Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 11 auf, die einer Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 entspricht, die an ihrem C-terminalen Ende durch ein Lysin modifiziert ist. Der Peptidbaustein ist kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft. Der Stabilisationsbaustein weist zwei Strukturmotive gemäß SB5 und eine
Untereinheit aus einem Lysin-Tetrapeptid auf, welches die beiden 6-Aminohexansäure-Gruppen miteinander verbindet. Der synthetische Ligand weist insgesamt eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 16 auf.
Ausführungsbeispiel 22
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL22.
Figure imgf000050_0001
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Die beiden Peptidbausteine sind kovalent mit einem
Stabilisationsbaustein verknüpft. Der Stabilisationsbaustein weist ein Strukturmotiv gemäß SB5, eine Untereinheit aus einem Lysin-Tetrapeptid und ein Strukturmotiv gemäß SB6 auf. Das Strukturmotiv gemäß SB6 bildet ein klammerartiges Rückgrat des Stabilisationsbausteins, das mit jedem der beiden Peptidbausteine verbunden ist. Das klammerartige Rückgrat ist mit dem Aminohexansäure-Baustein über das Lysin-Tetrapeptid verbunden. Das klammerartige
Rückgrat ist daher neben den Peptidbausteinen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No. 28 verbunden.
Ausführungsbeispiel 23
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL23
Figure imgf000050_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Der Peptidbaustein ist mit zwei Stabilisationsbausteinen kovalent verknüpft, von denen jeder eine Aminohexansäuregruppe, d.h. ein Strukturmotiv gemäß SB5 umfasst. Der synthetische Ligand weist insgesamt eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 17 auf.
Ausführungsbeispiel 24
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL24.
Figure imgf000051_0001
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Die beiden Peptidbausteine sind jeweils kovalent mit drei
Stabilisationsbausteinen verknüpft. Zwei Stabilisationsbausteine verfügen über eine
Aminohexansäure als Stukrurmotiv sowie über ein Lysin-Tetrapeptid als Untereinheit. Diese beiden Stabilisationsbausteine sind an jeweils mit einem der Peptidbausteine über dessen N- Terminus verknüpft. Daneben ist ein klammerartiger Stabilisationsbaustein mit einem
Strukturmotiv gemäß SB6 vorgesehen. Der klammerartige Stabilisationsbaustein verbindet jeweils die beiden C-Termini der Peptidbausteine. An den klammerartigen
Stabilisationsbaustein sind daher insgesamt zwei Peptidderivate mit einer Sequenz gemäß der SEQ ID No. 21 angebunden.
Ausführungsbeispiel 25
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die Formel SL25
Figure imgf000051_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Der Peptidbaustein ist mit zwei Stabilisationsbausteinen kovalent verknüpft. Jeder der beiden Stabilisationsbausteine umfasste eine Aminohexansäure-Gruppe als Strukturmotiv und einen Untereinheit aus Lysinen. Der synthetische Ligand weist insgesamt eine SEQ ID No. 18 auf.
Ausführungsbeispiel 26 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL26.
Figure imgf000052_0001
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Die beiden Peptidbausteine sind jeweils mit zwei
Stabilisationsbausteinen kovalent verknüpft, wobei es sich bei dem einen Stabilisationsbaustein um einen klammerartigen Stabilisationsbaustein handelt, der eine Art Rückgrat des
synthetischen Liganden bildet, umfasst zwei Strukturmotiv gemäß SB5, ein Strukturmotiv gemäß SB6 und zwei Untereinheiten bestehend aus zwei Lysinen. Das Strukturmotiv gemäß SB6 weist zwei NH-Funktionen auf. An diese beiden NH-Funktionen ist jeweils ein Peptidderivat angebunden, das eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 14 aufweist.
Ausführungsbeispiel 27
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL27
Figure imgf000052_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Der Peptidbaustein ist kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft. Der Stabilisationsbaustein weist eine Untereinheit aus einem heterogenen Tripeptid (Lys-Glu-Lys) auf. Der synthetische Ligand weist insgesamt eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 23 auf. Ausführungsbeispiel 28
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL28.
Figure imgf000053_0001
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Die beiden Peptidbausteine sind kovalent mit einem klammerartigen Stabilisationsbaustein verknüpft. Der klammerartigen Stabilisationsbaustein, der eine Art Rückgrat des synthetischen Liganden bildet, umfasst zwei Strukturmotive gemäß SB5, ein Strukturmotiv gemäß SB6 und zwei Untereinheiten, bestehend aus einem heterogenen Lys- Glu-Dipeptid. Das Strukturmotiv gemäß SB6 weist zwei NH-Funktionen auf. An diese beiden beiden NH-Funktionen ist jeweils ein Peptidderivat angebunden, das eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 22 aufweist.
Ausführungsbeispiel 29 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL29
Figure imgf000053_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 10 auf. Der Peptidbaustein ist kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft. Insgesamt besitzt der synthetische Ligand eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 24. Ausführungsbeispiel 30
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL30.
Figure imgf000054_0001
SL30
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 10 auf. Die beiden Peptidbausteine sind kovalent mit einem
Stabilisationsbaustein verknüpft. Bei dem Stabilisationsbaustein handelt es sich um einen klammerartigen Stabilisationsbaustein umfassend zwei Strukturmotive gemäß SB5, ein Strukturmotiv gemäß SB6 und zwei Untereinheiten bestehend aus zwei Lysinen. Das
Strukturmotiv gemäß SB6 weist zwei NH-Funktionen, eine Amidgruppe und eine
Carboxylgruppe auf. An die beiden NH-Funktionen ist jeweils ein Peptidderivat angebunden, das jeweils eine Untereinheit, ein Strukturmotiv gemäß SB5 und einen Peptidbaustein umfasst und das eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 26 aufweist.
Ausführungsbeispiel 31
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt die dargestellte Formel SL31
Figure imgf000054_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf, die kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft ist. Insgesamt besitzt der synthetische Ligand eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 15. Ausführungsbeispiel 32
Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt dargestellte Formel SL32.
Figure imgf000055_0001
Die zwei in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf, die kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft sind. Bei dem Stabilisationsbaustein handelt es sich um einen klammerartigen Stabilisationsbaustein umfassend zwei Strukturmotive gemäß SB5, ein Strukturmotiv gemäß SB6 und zwei Lysine. Das Strukturmotiv gemäß SB6 weist zwei NH-Funktionen, eine Amidgruppe und eine
Carboxylgruppe auf. An die beiden NH-Funktionen ist jeweils ein Peptidderivat angebunden, das jeweils ein Lysin, ein Strukturmotiv gemäß SB5 und einen Peptidbaustein umfasst und das eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 20 aufweist.
Ausführungsbeispiel 33 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt dargestellte Formel SL33.
Figure imgf000056_0001
Die vier in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbausteine weisen eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf, die kovalent mit einem Stabilisationsbaustein verknüpft sind. Bei dem Stabilisationsbaustein handelt es sich um einen klammerartigen Stabilisationsbaustein umfassend vier Strukturmotive gemäß SB5, ein Strukturmotiv gemäß SB7 und vier Lysine. Das Strukturmotiv gemäß SB6 weist vier NH-Funktionen, drei Amidgruppen und eine
Carboxylgruppe auf. An die vier NH-Funktionen ist jeweils ein Peptidderivat angebunden, das jeweils ein Lysin, ein Strukturmotiv gemäß SB5 und einen Peptidbaustein umfasst und das eine Sequenz gemäß der SEQ ID No. 20 aufweist.
Ausführungsbeispiel 34 Einen weiteren erfindungsgemäßen synthetischen Liganden für humane anti-Aß-Antikörper zeigt Formel SL34
Figure imgf000056_0002
Der in dem synthetischen Ligand enthaltenen Peptidbaustein weist eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf. Am C-Terminus, ist ein Stabilisationsbaustein vorgesehen. Der
Stabilisationsbaustein weist zwei 6-Aminohexansäurebausteine und eine homogen
zusammengesetzte Untereinheit aus insgesamt drei Glutaminsäuren auf. Der synthetische Ligand besitzt insgesamt eine Sequenz gemäß der SEQ ID No.27. II. Synthese der erfindungsgemäßen synthetischen Liganden
Zur Herstellung des Peptidbausteins eines erfindungsgemäßen synthetischen Liganden wird zweckmäßigerweise eine automatisierte Festphasenpeptidsynthese verwendet.
Stabilisationsbausteine, die über eine Peptidbindung mit dem Peptidbaustein verbunden sind können ebenfalls im Rahmen der Festphasenpeptidsynthese mit dem wenigstens einen zugehörigen Peptidbaustein verknüpft werden. Hierzu kann der Stabilisationsbaustein bestehend aus einem Basissegment und einer oder mehrerer eventuell vorgesehener
Untereinheiten eingesetzt und mit dem Peptidbaustein verknüpft werden, oder aber der
Stabilisationsbaustein wird selbst erst im Rahmen der Peptidsynthese hergestellt. Letzteres gilt für Stabilisationsbausteine, bei denen das Basissegment über eine Peptidbindung mit einer oder mehreren eventuell vorgesehenen Untereinheiten verbunden ist, sowie für
Stabilisationsbausteine, die aus verschiedenen über eine Peptidbindung miteinander verknüpften Segmenten aufgebaut sind. Dabei werden zunächst die entsprechenden, für eine Peptidsynthese geeigneten Precursor der zu verknüpfenden Segmente über geeignete konventionelle Syntheseverfahren hergestellt.
Es ist jedoch ebenfalls möglich die synthetischen Liganden und/oder deren Stabilisationsbausteine vollständig oder teilweise über geeignete konventionelle Syntheseverfahren herzustellen.
Auf diese Weise können sämtliche erfindungsgemäßen synthetischen Liganden bereitgestellt werden. Insbesondere sind damit folgende Liganden herstellbar: Automatisierte Festphasenpeptidsynthese:
Die automatisierte Festphasenpeptidsynthese kann an einem APEX 396 der Firma Advanced Chemtech durchgeführt werden. Dabei kann insbesondere das im Folgenden wiedergegebenen Protokoll verwendet werden, wobei sich jeweils die erste Aminosäure der herzustellenden Peptidsequenz in geschützter Form jeweils bereits am Harz befindet (typischer Weise werden Harze mit einer Beladung von 0.37-0.57 mmol g" eingesetzt): a. 15 min Quellen des Harzes in 2.5 mL DMF; b. 5 min Entschützung der mit dem Harz verknüpften Aminosäure mit 2.0 mL 20% Piperidin in DMF; c. 10 min Entschützung mit 2.0 ml_ 20% Piperidin in DMF; d Dreimal Waschen der Festphase mit 2.0 ml_ DMF; e Zweimal Waschen der Festphase mit 2.0 ml_ DCM; f. Zweimal Waschen der Festphase mit 2.0 ml_ DMF; g 5 min Quellen der Festphase in 2.5 ml_ DMF; h. 60 min Kuppeln mit 3.0 äq HBTU/HOBt/Fmoc-Xaa-OH, 6.0 äq DIPEA; i. Zweimal Waschen der Festphase mit 1.5 ml_ DMF; j. 60 min Kuppeln mit 1.0 äq HBTU/HOBt/Fmoc-Xaa-OH, 3.0 äq DIPEA; k. Zweimal Waschen der Festphase mit 1.5 ml_ DMF.
Die Schritte b.-k. wurden mit den entsprechenden weiteren Aminosäuren der herzustellenden Sequenz wiederholt, so dass schlussendlich das A/-terminal entschützte, Seitenketten geschützte harzgebundene Peptid erhalten wird.
Auf diese Weise lassen sich sämtliche der in den erfindungsgemäßen Liganden vorgesehen Peptidbausteine herstellen. Hierzu zählen beispielsweise:
SEQ ID No. 2:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 3:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
SEQ ID No. 4:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly
SEQ ID No. 5:
Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly
SEQ ID No. 6:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val
SEQ ID No. 7:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly
SEQ ID No. 8:
Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle
SEQ ID No. 9: Gly Ala lle Ne Gly
SEQ ID No. 10:
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle Ala
SEQ ID No. 11 :
Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Lys sowie Aminosäuresequenzen die zu den genannten Sequenzen eine Sequenzanalogie von größer 75% aufweisen. Außerdem können sämtliche Peptidbausteine auf diese Weise mit den erfindungsgemäßen synthetischen Stabilisationsbausteinen gekoppelt werden. Wobei die Anbindung des Stabilisationsbaustein durch schrittweise Aufbau seiner einzelnen Bestandteile (z.B. eines oder meherer der Strukturmotive SB1 bis SB12, Untereinheiten ect.) oder durch Kopplung eines kompletten (gegebenenfalls separat hergestellten) Stabilisationsbausteins erfolgen kann.
Abspaltung vom Harz:
Nach abgeschlossener Festphasensynthese wird das Harz, welches das zuvor hergestellte Peptid wird mit der jeweiligen Abspaltlösung (4 mL/200 mg Harz) versetzt und über einen Zeitraum von 30 min mittels eines Stickstoffgasstroms durchmischt. Die Lösung wird abfiltriert und das Harz zweimal mit der Abspaltlösung (jeweils 1 ml_/200 mg Harz) gewaschen. Die so erhaltenen vereinigten organischen Lösungen werden unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ca. 1 mL eingeengt. Anschließend wird das Peptid durch Eintropfen in kalten DEEa s. (Dieethylether) gefällt. Nach Abzentrifugieren des Niederschlags wurde dieser dreimal mit DEE gewachsen und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser/MeCN aufgenommen und lyophilisiert.
Die Zusammensetzung der Abspaltslösung ist vom jeweiligen Peptid abhängig. Als Abspaltlösung werden insbesondere folgende Lösungen verwendet: TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2: 1); DCM/Trifluorethanol/HOAc (7:2: 1) oder 3) TFA/EDT/Wasser/TI PS (94:2.5:2.5: 1). Daneben können aber auch andere geeignete Lösungen eingesetzt werden. Met-Reduktion mittels Dimethylsulfid:
Methionin-haltige Peptide werden fallen bei der oben genannten Festphasensynthese in oxidierter Form an. Enthält die hergestellte Peptidsequenz einen Methionin-Baustein, so muss die Thiogruppe nach der Festphasensynthese daher zunächst zum gewünschten Thioether reduziert werden.
Hierzu wird das Peptid in 2 mL TFA und 2 mL 5 M Salzsäure gelöst und mit 150 Dimethylsulfid versetzt. Nach 1.5 h werden erneut 150 Dimethylsulfid zugegeben. Reaktionskontrolle mittels HPLC zeigt spätestens nach 3 h eine vollständige Reduktion an. Die Lösung wird mit 50 mL Wasser verdünnt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 50 mL Wasser und 2 mL MeCN/TFA (1 : 1) aufgenommen und erneut lyophilisiert, wobei schließlich das vollständig reduzierte Peptid erhalten wird. Beispiele zur Synthese von modifizierten Strukturbausteinen für die Darstellung von erfindungsgemäßen synthetischen Liganden durch Festphasenpeptidsynthese:
Zur Bereitstellung der Stabilisationsbausteine der synthetischen Liganden modifizierte Strukturbausteine
Zur Synthese von Fmoc-Ata-OH wird bevorzugt die in A. W. Schwabacher, J. W. Lane, M. W. Schiesher, K. M. Leigh, C. W. Johnson, J. Org. Chem. 1998, 63, 1727-1729; N. Khiar, M. P. Leal, R. Baati, C. Ruhlmann, C. Mioskowski, P. Schultz, I. Fernandez, Chem. Commun. 2009, 4121-4123; und N. D. Bogdan, M. Matache, V. M. Meier, C. Dobrotä, I. Dumitru, G. D. Roiban, D. P. Funeriu, Chem. Eur. J. 2010, 16, 2170-2180 offenbarte Methode verwendet.
Zur Synthese von Fmoc-Azp-OH wird bevorzugt die in L. L. Klein, L. Li, H. J. Chen, C. B. Curty, D. A. DeGoey, D. J. Grampovnik, C. L. Leone, S. A. Thomas, C. M. Yeung, K. W. Funk, V. Kishore, E. O. Lundell, D. Wodka, J. A. Meulbroek, J. D. Alder, A. M. Nilius, P. A. Lartey, J. J. Plattner, Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 1677-1696 offenbarte Methode verwendet.
Zur Synthese von Fmoc-Hot=Tap'p-OH wird bevorzugt die in B. Eckhardt, W. Grosse, L.-O. Essen, A. Geyer, Proc. Natt. Acad. Sei. USA 2010, 107, 18336-18341 offenbarte Methode verwendet. Synthese von Fmoc-Spe-OH:
Zur Synthese des modifizierten Bausteins erfolgt bevorzugt gemäß der nachfolgend dargestellten Syntheseschritte a) bis c): a) (2S)-2-(ieri-Butoxycarbonylamino)-3-Propargyletherpropansäure
(Boc-Spe-OH)
Bei 0 °C wurden unter Stickstoffatmosphäre 50 mL DMF langsam mit 3.36 g NaH (60% Dispersion in Mineralöl, 84.0 mmol, 2.3 äq) versetzt und für 15 min gerührt. Die erhaltene Suspension wurde langsam mit 7.40 g Boc-Ser-OH (36.1 mmol, 1.0 äq) gelöst in 50 mL DMF versetzt und weitere 15 min gerührt. Anschließend wurden über 15 min 4.48 mL Propargylbromid (80% in Toluol, 40.2 mol, 1.1 äq) zugegeben und über Nacht auf RT erwärmt. Nach 14.5 h wurde mit 30 mL Eis versetzt, für weitere 15 min gerührt und das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurde mit 1 M Salzsäure angesäuert (pH 2) und dreimal mit EE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Säulenchromatographische Reinigung (n-Pentan/EE/AcOH, 5: 1 :0.1 —► 2:2:0.1) lieferte 7.96 g (32.7 mmol, 91 %) Boc-Spe-OH in Form eines hellbraunen Öls.
MS: (ESI); m/z = 266 [M+Na]+; HR: gef.: 266.0997, ber.: 266.0999. H-NMR: (500 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 1.38 (s, 9 H, Boc-CH3), 3.45 (t,
Figure imgf000061_0001
=
2.4 Hz, 1 H, ζ-CH), 3.64-67 (m, 2 H, ß-CH2), 4.10-16 (m, 1 H, a-CH), 4.14 (d, Δ.Η/Ζ-Η = 2.4 Hz, 2 H, 5-CH2), 6.92 (d, 3JNH/A-H = 8.1 Hz, 1 H, NH), 12.72 (bs,
1 H, COOH).
3C-NMR: (125 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 28.1 (Boc-CH3), 53.5 (a-CH), 57.6 (5-CH2),
68.7 (ß-CH2), 77.4 (ζ-CH), 79.9 (£-Cq ), 78.2 (Boc-Cq ), 155.3 (NCOO), 171.7 (COO). b) (1 S)-1 -Methoxycarbonyl-2-propyletherethylamonium-trifluoracetat (H-Spe-OH TFA)
7.74 g Boc-Spe-OH (31.8 mmol, 1.0 äq) wurden in 20 mL DCM gelöst und bei 0 °C mit 40 mL TFA versetzt. Nach 5 min wurde das Eisbad entfernt, für 1.5 h bei RT gerührt und das Lösungsmittel abkondensiert. Der Rückstand wurde zweimal mit n-Hexan koevaporiert und nach Trocknung im Hochvakuum wurden 8.18 g H-Spe-OH TFA (31.9 mmol, quant.) als hellgelber Feststoff erhalten.
MS: (ESI); mlz = 166 [M+Na]+; HR: gef.: 166.0474, ber.: 166.0475. H-NMR: (500 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 3.54 (t, HIVH = 2.4 Hz, 1 H, ζ-CH), 3.79
(dd, 2JP.HVH = 10.4 Hz, 3JP.HVH = 3.1 Hz, 2 H, ß-CHh), 3.88 (dd, .H^.H h = 10.4 Hz, P-H'Ü-H = 4.5 Hz 2 H, ß-CHl), 4.19-23 (m, 1 H, a-CH), 4.16-25 (m, 2 H, ö-CHz), 8.34 (bs, 3 H, NH3). 3C-NMR: (125 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 52.2 (a-CH), 58.0 (5-CH2), 67.1 (ß-CH2),
78.1 (ζ-CH), 79.3 (£-Cq ), 168.8 (COO). c) (2S)-2-(Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-Propargyletherpropansäure (Fmoc- Spe-OH)
3.78 g H-Spe-OH TFA (15.7 mmol, 1.0 äq) wurden in 30 mL 1 ,4-Dioxan/Wasser (1 :1) gelöst und bei 0 °C mit 10.8 mL DIPEA (62.8 mmol, 4.0 äq) und einer Lösung von 4.48 g Fmoc-Cl (17.3 mmol, 1.1 äq) in 20 mL 1 ,4-Dioxan versetzt. Nach 10 min wurde das Eisbad entfernt und für 16 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das erhaltene Öl mit 50 mL Wasser und 50 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Iösung aufgenommen. Die Lösung wurde einmal mit 50 mL Diethylether gewaschen, die wässrige Phase mit 1 M Salzsäure angesäuert (pH 2) und viermal mit EE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 5.67 g Fmoc-Spe-OH (15.5 mmol, 99%) als farbloser Feststoff erhalten.
MS: (ESI); m/z = 388 [M+Na]+; HR: gef.: 388.1 148, ber.: 388.1155. H-NMR: (500 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 3.46 (t, HIVH = 2.3 Hz, 1 H, ζ-CH), 3.71
(d, 3Jß.H/a-H = 5.5 Hz, 2 H, ß-CH2), 4.16 (d,
Figure imgf000062_0001
= 2.4 Hz, 2 H, 5-CH2), 4.21- 25 (m, 2 H, Fmoc-CH und a-H), 4.26-29 (m, 2 H, Fmoc-CH2), 7.33 (t, 2 H, 3JH/H = 7.4 Hz, Fmoc-CHarom ), 7.42 (t, 2 H, 3JH/H = 7.3 Hz, Fmoc-CHarom ), 7.67 (d, 3JNH/a-H = 8.2 Hz, 1 H, NH), 7.74 (d, 2 H, 3JH/H = 7.5 Hz, Fmoc-Cr ), 7.89 (d, 2 H, 3JH/H = 7.5 Hz, Fmoc-CHar0m.), 12.82 (bs, 1 H, COOH).
13 C, -NMR: (125 MHz, 300 K, DMSO-d6); δ = 46.6 (Fmoc-CH), 53.9 (a-CH), 57.5 (δ- CH2), 65.8 (Fmoc-CH2), 68.6 (ß-CH2), 77.5 (ζ-CH), 79.8 (£-Cq ), 120.1 (Fmoc- CHarom ), 125.3 (Fmoc-CHarom ), 127.0 (Fmoc-CHarom ), 127.6 (Fmoc-CHarom ), 140.7 (Fmoc-Cq., arom ), 143.8 (Fmoc-Cq., arom ), 156.0 (NCOO), 171.4 (COO).
Bespiele zur Synthese erfindungsgemäßer synthetischer Liganden
H-[Tle33]Aß(28-40)-Azp-OH TFA (SL2)
SL2 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/TI PS/Wasser (95:2.5:2.5) verwendet. Es wurden 97 mg SL2 (64.8 μηιοΙ, 65%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 12.08 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); mlz = 1269 [M+H]+; HR: gef.: 1269.7968, ber.: 1269.7963. H-Aß(29-40)-Azp-OH TFA (SL3)
SL3 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/TI PS/Wasser (95:2.5:2.5) verwendet. Es wurden 55 mg SL3 (64.8 μηιοΙ, 65%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
MS: (ESI); mlz = 1223 [M+H]+; HR: gef.: 1223.6932, ber.: 1223.6929.
H-Azp-Aß(29-33)-OH TFA (SL11)
SL11 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.2 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/Wasser (90: 10) verwendet. Es wurden 128 mg SL11 (188 μηιοΙ, 94%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 7.61 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); m/z = 568 [M+H]+; HR: gef.: 568.3197, ber.: 568.3202. H-Azp-Aß(30-38)-OH TFA (SL13)
SL13 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.2 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/Wasser (90: 10) verwendet. Es wurden 178 mg SL13 (164 μηιοΙ, 82%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 11.98 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); m/z = 968 [M+H]+; HR: gef.: 968.5346, ber.: 968.5346. H-[Spe27&N3PEG4]Aß(27-40)-OH TFA (SL14)
Die Primärsequenz H-[Spe ]Aß(27-40)-OH wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Anschließend wurde das harzgebundene Peptid mit 220 mg N3-PEG4 (1.00 mmol, 10 äq) in 4 mL DMF/NMP (1 : 1) und einer Lösung von 19 mg Cul (0.10 mmol, 1.0 äq) und 23 2,6-Lutidin (0.20 mmol, 2.0 äq) in 4 mL DMF/NMP (1 : 1) versetzt und für 3.5 d mit einem Stickstoffstrom durchmischt. Die Lösung wurde abgezogen und das Harz zweimal mit DMF, zweimal mit Natnumdiethyldithiocarbamat (50 mM Lösung in NMP), dreimal mit DMF und dreimal mit DCM gewaschen. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit TFA/Wasser (95:5). Es wurden 177 mg SL14 (100 μηιοΙ, quant.) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 11.38 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); m/z = 779 [M+2 H]2+; HR: gef.: 779.4562, ber.: 779.4553. H-, 3C-NMR: (600 bzw. 150 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH H- opplungskonstanten in Hz angegeben.
Amino- N H/COR aCH ßCH andere
saure
Spe ,'27 7.95 bs 3.81 m; 3.70 m, 5CH2 4.60 m; 63.6
68.5
Figure imgf000064_0001
59.9/ 3.49 m; 69.3/
3.53 m; 69.3 Lys28 8.63 d (7.8) 4.33 m; 1.54 m, yCH2 1.33 m; 21 .9
52.3 1.69 m; 5CH2 1.52 m; 26.2
31 .2 £CH2 2.75 m; 38.1
εΝΗ3 + 7.71 bs
Gly29 8.20 t (5.7) 3.72 m;
41.4
Ala30 8.02 m 4.37 m; 1.17 cf (6.9);
47.8 18.2
lle3 7.97 m 4.08 m; 1.74 m; yCH2 1.07 m, 1.43 m; 23.8
57.0 35.6 YCH3 0.82 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.6
lle32 7.72 d (8.5) 4.17 m; 1.71 m; YCH2 1.07 m, 1.43 m; 23.8
56.6 36.4 YCH3 0.82 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.6
Gly33 8.10 t (5.5) 3.74 m;
41.5
Leu34 7.88 cf (8.6) 4.33 m; 1.43 m; YCH 1.57 m; 23.7
50.5 40.8 5CH3 0.83 m; 21 .3
0.86 m; 22.7
Met35 8.17 d (8.0) 4.36 m; 1.80 m, YCH2 2.45 m, 2.39 m; 29.3
51.6 1.91 m; £CH2 2.02 m; 14.4
31 .0
Val36 7.63 bs (8.5) 4.15 m; 1.96 m; YCH3 0.85 m; 18.8
57.2 30.3 0.87 m; 18.8
Gly37 8.20 ί (5.7) 3.69 m;
41.4
Gly38 8.02 m 3.79 m;
41.5
Val39 7.79 cf (8.9) 4.33 m; 1.96 m; YCHS 0.82 m; 17.6
56.7 30.3 0.87 m; 18.8
Val40 8.02 m 4.06 m; 2.04 m; YCHS
51.9 29.2
H-Aß(28-40)-Ata-OH TFA (SL15) SL15 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/Wasser (95:5) verwendet. Es wurden 88 mg SL15 (52.5 μηιοΙ, 53%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 11.01 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); mlz = 1448 [M+H]+; HR: gef.: 1446.8615, ber.: 1446.8600. H-Spe-Aß(28-40)-Ata-OH TFA (SL16)
SL16 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Zur Abspaltung vom Harz wurde TFA/Wasser (95:5) verwendet. Es wurden 88 mg SL16 (47.2 μηιοΙ, 47%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 11.01 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (ESI); mlz = 1572 [M+H]+; HR: gef.: 1571.9089, ber.: 1571.9077.
H-[ Spe28&1 -Azido-ß-D-Rib]-Aß(28-33)-OH (SL17)
Das Hexapeptid mit der Sequenz H-Spe-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-OH wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.2 millimolarem Maßstab synthetisiert. Anschließend wurde das harzgebundene Peptid mit 100 mg 1-Azido-ß-D-Ribofuranose (570 μι ιοΙ, 2.9 äq), 19 mg Cul (100 μηιοΙ, 0.5 äq) und 23 μί 2,6-Lutidin (200 μηιοΙ, 1.0 äq) in 5 mL DMF versetzt und für 12 h mit einem Stickstoffstrom durchmischt. Die Lösung wurde abgezogen und das Harz zweimal mit DMF, zweimal mit Natnumdiethyldithiocarbamat (50 mM Lösung in NMP), dreimal mit DMF und dreimal mit DCM gewaschen. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit TFA/Wasser (95:5). Aufreinigung mittels präparativer HPLC (10% -»■ 90% MeCN, 30 min) und anschließender Lyophilisation der Produktfraktionen lieferte 12 mg SL17 (16.4 μηιοΙ, 8%) in Form eines farblosen Feststoffs.
HPLC: tR = 20.80 min (10% 28% MeCN, 30 min).
MS: (ESI); m/z = 730 [M+H]+; HR: gef.: 730.3728, ber.: 730.3730. H-, 3C-NMR: (500 bzw. 125 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH/H- opplungskonstanten in Hz angegeben. AminoN H/COR aCH ßCH andere
säure
Spe28 8.19 bsl 4.08 m; 3.73 m, 5CH2 4.62 s; 63.5
166.4 52.0 3.81 m; £Cq., arom. -; 143.2
68.1 ζ0Η3Γ0ηη 8.33 s; 122.7
Gly29 8.66 d (5.6)/ 3.75 m;
166.7 41.5
Ala30 8.14 d {1.4)1 4.39 m; 1.18 d {8.8);
171.1 41.1 18.1
lle31 7.97 d (8.8)/ 4.17 m; 1.73 m; yCH2 1.06 m, 1.43
170.2 56.6 35.8 m; 23.8
YCH3 0.83 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.7 lle32 7.66 d (8.8)/ 4.22 m; 1.72 m; yCH2 1.06 m, 1.43
171.0 55.9 36.5 m; 23.8
YCH3 0.83 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.7
Gly33 8.23 d (5.9)/ 3.84 m;
12.48 bs; 166.5 40.3
Ribose 1 2 3 4 5
CH 5.94 d {4.1); 4.37 m; 4.12 m; 3.98 q (4.3, 4.3); 3.51 m,
91.7/ 74.7/ 70.0/ 85.6/ 3.61 m;
61.0/
OH 5.55 d (6.3) 5.26 d (5.2) 4.94 f (5.51)
H-[Azp41&Spe41B]Aß(28-41)A-OH,H-[Spe41&Azp41A]Aß(28-41)B-OH TFA (SL1 ) 40 mg H-[Azp4 ]Aß(28-41)-OH TFA (30.0 mol, 1.0 äq) und 40 mg H-[Azp4 ]Aß(28-41)-OH TFA (30.0 mol, 1.0 äq) wurden gemäß dem in Punkt II. dargestellten allgemeinen Verfahren zur Festphasenpeptidsynthese hergestellt. in 6 mL DMF/Wasser (1 :1) gelöst mit 30 μΙ_ Natriumascorbat (1 M Lösung in Wasser, 30.0 mol, 1.0 äq), 7 2,6-Lutidin (60.0 mol, 2.0 äq) und 12 mg CuS04-5 H20 (45.0 mol, 1.5 äq) versetzt. Die Lösung wurde für 7 d bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand in TFA/Wasser (90:10) aufgenommen und mit kalten DEEabS. gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert zweimal mit DEE gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 48 mg SL1 (17.8 Mmol, 59%) in Form eines hellbraunen Feststoffs erhalten. MS: (ESI); mlz = 1346 [M+2 H]2+; HR: gef.: 1345.7949, ber.: 1345.7863. H-, 3C-NM R: (600 bzw. 150 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH/H-Kopplungskonstanten in Hz angegeben. Die Werte der beiden Aß(28-40)-Stränge sind identisch und daher nur einmal angegeben.
AminoaCH ßCH andere
säure
28
Lys: 8.10 te 3.80 m; 1.70 m; 30.1 yCH2 1.35 m; 20.7
51.7 5CH2 1.52 m; 26.2
£CH2 2.75 m; 38.1
εΝΗ3 + 7.72 bs
,29
Gly: 8.65 t (5.6) 3.83 m;
41.4
30
Ala 8.17 m 4.38 m; 1.18 cf (7.0);
47.7 18.2
.31
7.99 cf (8.7) 4.15 m; 1.74 m; 35.6 1.07 m, 1.43 m; 23.8
57.3 0.82 m; 15.0
0.80 m; 10.6
m; 23.8
Figure imgf000068_0001
33
Gly 8.10 m 3.73 m;
41.4
34
Leu 7.91 cf (7.9) 4.33 m; 1.43 m; 40.8 yCH 1.57 m; 23.7
50.4 5CH3 0.83 m; 21 .4
0.86 m; 22.7
Met ,35 8.19 cf (7.2) 4.36 m; 1.80 m, 1.91 m; yCH2 2.45 m, 2.39 m; 29.3
51.7 31 .0 £CH2 2.02 m; 14.4
Val36 7.63 cf (6.1) 4.16 m; 1.96 m; 30.3 YCH3 0.85 m; 18.8
56.6 0.87 m; 18.8
Gly37 8.22 m 3.74 m;
41.4
Gly38 8.06 m 3.77 m;
41.5
Val39 7.86 cf (9.0) 4.33 m; 1.96 m; 30.3 YCH3 0.82 m; 17.7
56.7 0.87 m; 18.8
40
Val 8.05 m 4.08 m; 2.04 m; 29.2 YCH3 0.91 m; 18.4 57.0
Azp4 A - 4.40 m; 2.43 m, 2.90 m; vCH 5.29 m; 57.2
58.5 33.5 5CH2 3.86 m, 4.14 m; 51.1
Spe4 B 7.85 d (8.7) 4.41 m; 3.64 m, 3.72 m; 5CH2 4.53 m; 63.4
52 69 CHarom. 8.27 s; 123.3
H-[Azp27&Spe41^Spe41&Azp27B^
OH TFA (SL4)
Das Peptid mit der Sequenz H-[Azp27,Spe4 ]Aß(27-41)-OH wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Anschließend wurde das harzgebundene Peptid mit 5 mL DMF, 100 CuS04-5 H20 (1 M Lösung in DMF, 100 μηιοΙ, 1.0 äq), 200 Natriumascorbat (1 M Lösung in Wasser, 200 μηιοΙ, 1.0 äq) und 20 μί 2,6-Lutidin (171 μηιοΙ, 2.0 äq) versetzt und für 40 h mit einem Stickstoff ström durchmischt. Die Lösung wurde abgezogen und das Harz dreimal mit DMF, dreimal mit DCM, dreimal mit EDTA/NH4CI (gesättigte Lösung in MeOH) und dreimal mit DCM gewaschen. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit TFA/Wasser (90: 10). Nach Waschen des gefällten Peptids mit DEE wurde dieses mit EDTA/NH4CI (halbkonzentrierte Lösung in Wasser) und zweimal mit Wasser gewaschen. Trocknung im Hochvakuum lieferte 77 mg SL4 (26.0 μηιοΙ, 26%) in Form eines beigen Feststoffs.
MS: (ESI); m/z = 986 [M+3 H]3+; HR: gef.: 985.2253, ber.: 985.2269. H-, 3C-NMR: (600 bzw. 150 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH/H- opplungskonstanten in Hz angegeben. Die Werte der beiden Aß-Stränge sind identisch und daher nur einmal angegeben. Mit einem Stern * gekennzeichnete Gruppen konnten auf Grund von Signalüberlappung und/oder starker Signalverbreiterung nicht bestimmt werden.
Amino- N H/COR ÖCH ßChi andere
säure
Azp27 9.07 6s, 4.26 m; -* yCH 5.46 qi (7.0); -*
9.99 6s 57.2 5CH2 -*
Lys28 8.77 d (7.6) 4.32 m; 1.70 m; yCH2 1.31 m; 21.8
52.1 30.1 5CH2 1.52 m; 26.2 εΟΗ2 2.76 m; 38.4
εΝΗ3 + 7.71 bs
Gly29 8.20 m 3.81 m;
41.5
Ala30 8.18 d (7.9) 4.35 m; 1.17 d (7.4);
47.7 18.2
lle3 7.98 m m; 23.8
Figure imgf000070_0001
lle 2 7.73 m 4.17 m; 1 .71 m; yCH2 1.07 m, 1 .43 m; 23.8
56.6 36.4 YCH3 0.82 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.6
Gly33 8.10 m 3.72 m;
41.6
Leu34 7.88 m 4.34 m; 1.43 m; yCH 1.57 m; 23.7
50.6 40.8 5CH3 0.83 m; 21.4
0.86 m; 22.7
Met35 8.16 cf (7.9) 4.36 m; 1.80 m, 1.91 yCH2 2.45 m, 2.39 m; 29.3
51.6 m; 31.0 eCH2 2.02 m; 14.4
Val36 7.64 d (8.3) 4.26 m; 1.96 m; yCH3 0.85 m; 18.8
57.2 30.3 0.89 m; 17.8
Gly37 8.25 m 3.74 m;
41.5
Gly38 8.00 m 3.67 m;
41.6
Val39 7.73 m 4.26 m; 1.96 m; yCH3 0.82 m; 17.7
57.2 30.3 0.87 m; 18.8
Val40 8.03 m 4.26 m; 2.04 m; yCH3 0.90 m; 17.8
57.2 29.2
Ser4 7.84 m 4.42 m; 3.65 m, 3.73 5CH2 4.52 m; 63.5
50 m; 69.0 CHar0m. 8.16; s 123.3
SL5 Das Peptid wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit DCM/Trifluorethanol/HOAc (7:2:1) für 2 h vom Harz abgespalten. Es wurden 334 mg SL5 (153 μηιοΙ, 77%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
SL6
Das Peptid wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit DCM/Trifluorethanol/HOAc (7:2: 1) für 2 h vom Harz abgespalten. Es wurden 192 mg SL6 (77 μηιοΙ, 77%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
SL7
Das Peptid wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit DCM/Trifluorethanol/HOAc (7:2: 1) für 2 h vom Harz abgespalten. Es wurden 209 mg SL7 (72 μηιοΙ, 72%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
SL8 Die Synthese erfolgte ausgehend von SL5 nach der in B. Eckhardt, W. Grosse, L.-O. Essen, A. Geyer, Proc. Natt. Acad. Sei. USA 2010, 107, 18336-18341 offenbarte Methode. Es wurden 69 mg SL8 (33 μηιοΙ, 72%) in Form eines Feststoffs erhalten.
SL9
Die Synthese erfolgte ausgehend von SL6 nach der in B. Eckhardt, W. Grosse, L.-O. Essen, A. Geyer, Proc. Natt. Acad. Sei. USA 2010, 107, 18336-18341 offenbarte Methode. Es wurden 40 mg SL9 (16 μηιοΙ, 42%) in Form eines Feststoffs erhalten. SL10
Die Synthese erfolgte ausgehend von SL7 nach der in B. Eckhardt, W. Grosse, L.-O. Essen, A. Geyer, Proc. Natt. Acad. Sei. USA 2010, 107, 18336-18341 offenbarte Methode. Es wurden 51 mg SL10 (19 μηιοΙ, 57%) in Form eines Feststoffs erhalten. » 1
H-[Spe27&Azp41]Aß(27-41 )-OH TFA (SL18)
Das Peptid mit der Sequenz H-[Spe ,Αζρ ]Aß(27-41)-OH wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Anschließend wurde V5 des harzgebundenen Peptids (20 μηιοΙ, 1 .0 äq) mit 1 .9 mg Cul (10 μηιοΙ, 0.5 äq) und 2.3 μΙ_ 2,6-Lutidin (19.7 μηιοΙ, 2.0 äq) gelöst in 2 ml_ MeCN/DMSO (4: 1 ) versetzt und für 15 h mit einem Stickstoffstrom durchmischt. Die Lösung wurde abgezogen und das Harz dreimal mit DMF, dreimal mit DCM, fünfmal mit Natriumdiethyldithiocarbamat (50 mM Lösung in NMP), dreimal mit DCM und einmal mit MeOH gewaschen. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit TFA/Wasser (95:5). Es wurden 20 mg SL18 (13.5 μηιοΙ, 68%) in Form eines beigen Feststoffs erhalten.
MS: (ESI); m/z = 1476 [M+H] +; HR: gef. : 1476.8436, ber. : 1476.8355. H-, 3C-NM R: (600 bzw. 150 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH/H- opplungskonstanten in Hz angegeben.
Amino- NH/COR aCH ßCH andere
säure
Spe27 8.29 bs 4.41 m; 3.70 m, 5CH2 4.61 s; 63.6
52.0 3.81 m; 8.30 s; 123.3
68.0
28
Lys: 8.63 bs 4.34 m; 52.2 1.70 m; yCH2 1.34 m; 21.8
30.1 5CH2 1.52 m; 26.2
£CH2 2.75 m; 38.1
εΝΗ3 + 7.72 bs
,29
Gly 8.04 m 3.75 m; 41.4
Ala30 8.00 m 4.38 m; AI.5 1.18 cf (7.0);
18.2
.31
7.97 d 4.16 m; 57.0 1.74 m; yCH2 1.07 m, 1 .43 m; 23.8
(8.3) 35.6 YCH3 0.82 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.6
.32
7.70 m 4.18 m; 56.6 1.71 m; yCH2 1.07 m, 1 .43 m; 23.8
36.4 YCH3 0.82 m; 15.0
5CH3 0.80 m; 10.6
33
Gly 8.17 m 3.79 m; 41.4 Leu 4 7.88 6s 4.33 m; 50.5 1.43 m; yCH 1.57 m; 23.7
40.8 5CH3 0.83 m; 21.4
0.86 m; 22.7
Met ,35 8.16 m 4.36 m; 51.6 1.80 m, yCH2 2.45 m, 2.39 m; 29.3
1.91 m; £CH2 2.02 m; 14.4
31.0
Val 36 7.64 d 4.15 m; 56.9 1.96 m; YCH3 0.85 m; 18.8
(8.1) 30.3 0.87 m; 18.8
Gly37 8.22 m 3.72 m; 41.5
Gly38 8.08 m 3.68 m; 41.4
Val39 7.77 d 4.26 m; 58.7 1.96 m; YCH3 0.82 m; 17.7
(9.2) 30.3 0.87 m; 18.8
Val 40 8.02 m 4.21 m; 55.6 2.04 m; YCHS 0.91 m; 18.2
29.2 0.95 m; 18.4
Azp4 4.40 m; 58.6 2.48 m, YCH 5.23 m; 56.8
2.92 m; 5CH2 3.81 m, 4.15 m; 50.9
33.3
H-[Spe28&Azp34B,Azp34&Spe28B]Aß(28-34)A-OH,H-[Spe28&Azp34A,Azp34&Spe28A]Aß(28-34)B- OH TFA (SL12)
Das Peptid mit der Sequenz H-[Spe28,Azp34]Aß(28-34)-OH wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.3 millimolarem Maßstab synthetisiert. Anschließend wurde das harzgebundene Peptid mit 30 mg CuCI (300 μηιοΙ, 1.0 äq) und 18 2,6-Lutidin (600 mol, 2.0 äq) gelöst in 8 mL DCM/DMF/NMP (1 : 1 : 1 , 1 % TritonX100, 2 M Ethylencarbonat) versetzt und für 7 d mit einem Stickstoffstrom durchmischt, wobei alle 24 h oben stehende Reaktionsmischung frisch angesetzt und ausgetauscht wurde. Nach Abziehen der Lösung wurde das Harz einmal mit DCM, einmal mit DMF, zweimal mit Natriumdiethyldithio- carbamat (50 mM Lösung in NMP), dreimal mit NMP und dreimal mit DCM gewaschen. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit TFA/Wasser (90: 10). Es wurden 69 mg SL12 (49.8 mol, 17%) in Form eines beigen Feststoffs erhalten.
HRMS: (ESI); m/z = 693 [M+2 H]2+; HR: gef.: 693.3682, ber.: 693.3678. H-, 3C-NMR: (500 bzw. 125 MHz, 300 K, DMSO-d6) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm angegeben. Kopplungskonstanten bzw. Multiplizitäten konnten auf Grund der starken Signalverbreiterung nicht bestimmt werden. Die Werte der beiden Aß(29-33)-Stränge sind identisch und daher nur einmal angegeben.
AminoN H/COR aCH ßCH andere
säure
Spe28 8.06 4.07; 52.2 3.71 , 3.79; 67.9 5CH2 4.60; 63.6
ζΰΗ 8.27; 123.5
Gly29 8.68 3.79; 41.1
Ala30 8.16 4.39; 48.0 1.18; 18.4
lle31 8.02 4.18; 56.7 1.73; 36.3 yCH2 1.07, 1.43; 24.1
YCH3 0.82; 15.1
5CH3 0.79; 10.8
lle32 7.80 4.26; 56.4 1.73; 36.3 YCH2 1.07, 1.43; 24.1
YCH3 0.82; 15.1
5CH3 0.79; 10.8
Gly33 8.07 3.82; 41.5
Azp34 - 4.40; 56.6 2.45, 2.89; 34.4 YCH 5.29; 57.2
5CH2 3.86, 4.28; 50.3
H-Aß(28-40)-Ahx-Lys3-Ahx-OH TFA (SL19)
SL19 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2: 1 ) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 176 mg SL19 (73.5 μηιοΙ, 74%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 8.96 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 1823.975, ber. : 1824.187. H-, 3C-NM R: (600 bzw. 150 MHz, 300 K, 10 mM KH2P04-Puffer pH 7/D20 5: 1 ) Chemische Verschiebungen δ sind in ppm und 3JH/H-Kopplungskonstanten in Hz angegeben. Mit einem Stern * gekennzeichnete Gruppen konnten auf Grund von starkem chemischem Austausch nicht bestimmt werden.
AminoN H/COR aCH ßCH andere
säure
Lys28 * 3.98 m; 53.3 1.80 m; 35.9 yCH2 1.49 m; 25.3
5CH2 1.63 m; 26.4
£CH2 2.75 m; 38.1
*
εΝΗ3 +
Gly29 8.51 f (5.5) 3.96 m; 42.1
Ala30 8.27 d (5.8) 4.29 m; 49.6 1.31 d (7.2);
16.7
lle31 8.16 m 4.09 m; 59.6 1.87 m; 30.4 yCH2 1.15 m, 1.44 m; 24.6
YCH3 0.83 m; 14.8
5CH3 0.81 m; 10.0
lle32 8.16 m 4.12 m; 58.3 1.87 m; 30.4 YCH2 1.15 m, 1.44 m; 24.6
YCH3 0.87 m; 14.6
5CH3 0.81 m; 10.0
Gly33 8.37 t (5.6) 3.85 m; 42.5
Leu34 7.97 d (6.8) 4.29 m; 52.5 1.55 m; 39.9 YCH 1.49 m; 25.3
5CH3 0.82 m; 21 .0
0.87 m; 22.0
Met35 8.36 d (7.2) 4.50 m; 52.6 1.96 m; 29.9 YCH2 2.45 m; 2.52 m; 29.3
£CH3 2.03 m; 14.2
Val36 8.13 m 4.07 m; 59.6 2.01 m; 30.2 YCH3 0.89 m; 18.2
Gly37 8.20 m 3.89 m; 42.4
Gly38 8.18 m 3.92 m; 42.4
Val39 7.92 cf (7.9) 4.07 m; 59.6 2.01 m; 30.2 YCH3 0.86 m; 18.3
Val40 8.13 m 4.09 m; 59.6 1.95 m; 29.8 YCH3 0.89 m; 17.7
Ahx4 8.06 t (5.9) 2.23 f (8.2); 1.53 m; 24.9 YCH2 1 .24 m; 25.7
35.1 5CH2 1 .46 m; 28.0
£CH2 3.12 m; 39.2
Lys42 8.14 m 4.20 m; 53.6 1.71 m; 30.5 YCH2 1.49 m; 25.3
5CH2 1.63 m; 26.4 εΟΗ2 2.95 m; 39.4
εΝΗ3 + -*
Lys 43 8.29 d (7.2) 4.24 m; 53.5 1.71 m; 30.5 yCH2 1.49 m; 25.3
5CH2 1.63 m; 26.4
£CH2 2.95 m; 39.4
εΝΗ3 + -*
Lys 44 8.28 cf (7.1) 4.14 m; 54.2 1.71 m; 30.5 yCH2 1.49 m; 25.3
5CH2 1.63 m; 26.4
£CH2 2.95 m; 39.4
£Nhk+ -*
Ahx .'45 8.01 ί (6.1) 2.13 f (7.7); 1.44 m; 24.6 yCH2 1.24 m; 25.7
37.3 5CH2 1.46 m; 28.0
£CH2 3.17 m; 39.1
{H-Aß(28-40)-Ahx-Lys2- Va, H-Aß(28-40)-Ahx-Lys2-Af}-Lys-Ahx-OH-TFA (SL20) SL20 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/ Phenol (95:2:2:1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 136 mg SL20 (31.6 μιτιοΙ, 63%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 9.76 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3387.600, ber.: 3388.177.
H-Aß(28-40)-Ahx-Lys-Ahx-Lys4-Ahx-OH TFA (SL21) SL21 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2:1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 110 mg SL21 (38.2 μηιοΙ, 38%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 9.71 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 2080.023, ber.: 2080.377.
{Η-Αβ(28-40)-Λ/", H-Aß(28-40)-A -Lys-Ahx-Lys4-Ahx-OH-TFA (SL22) SL22 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2: 1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 135 mg SL22 (32.2 μηιοΙ, 64%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.71 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3274.536, ber.: 3275.089. H-Lys4-Ahx-Aß(28-40)-Lys-Ahx-OH TFA (SL23)
SL23 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2:1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 117 mg SL23 (40.6 μηιοΙ, 41 %) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.04 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 2080.097, ber.: 2080.377. {H-Lys4-Ahx-Aß(28-40)-A/a, H-Lys4-Ahx-Aß(28-40)-A -Lys-Ahx-OH-TFA (SL24)
SL24 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2: 1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 131 mg SL24 (24.9 μηιοΙ, 50%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.63 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3901.932, ber.: 3901.556. H-Lys2-Ahx-Aß(28-40)-Ahx-Lys3-Ahx-OH TFA (SL25)
SL25 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2:1) vom Harz abgespalten und anschließend Met vollständig reduziert. Es wurden 115 mg SL25 (38.4 μηιοΙ, 38%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 8.50 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 2193.122, ber.: 2193.461.
{H-Lys2-Ahx-Aß(28-40)-Ahx-Lys2-A/a, H-Lys2-Ahx-Aß(28-40)-Ahx-Lys2- VE}-Lys-Ahx-OH TFA (SL26) SL26 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/TI PS/Wasser/Phenol (95:2:2: 1) vom Harz abgespalten und anschließend Met35 vollständig reduziert. Es wurden 173 mg SL26 (31.5 μηιοΙ, 63%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 9.04 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 4127.914, ber.: 4127.728.
H-Aß(28-40)-Ahx-Lys-Glu-Lys-Ahx-OH TFA (SL27) SL27 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5:1) vom Harz abgespalten. Es wurden 193 mg SL27 (84.6 μηιοΙ, 85%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 9.47 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 1824.802, ber.: 1825.130.
{H-Aß(28-40)-Ahx-Lys-Glu- Va, H-Aß(28-40)-Ahx-Lys-Glu-A -Lys-Ahx-OH-TFA (SL28)
SL28 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5: 1) vom Harz abgespalten. Es wurden 151 mg SL28 (37.1 μηιοΙ, 74%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. HPLC: tR = 10.18 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3389.279, ber.: 3390.068.
H-Aß(28-42)-Ahx-Lys3-Ahx-OH TFA (SL29)
SL29 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5:1) vom Harz abgespalten. Es wurden 207 mg SL29 (80.3 μηιοΙ, 80%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.47 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 2007.900, ber.: 2009.312.
{H-Aß(28-42)-Ahx-Lys2- Va, H-Aß(28-42)-Ahx-Lys2-A/E}-Lys-Ahx-OH TFA (SL30)
SL30 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5: 1) vom Harz abgespalten. Es wurden 157 mg SL30 (33.6 μηιοΙ, 67%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.81 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3755.782, ber.: 3756.415.
H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys2-Ahx-OH TFA (SL31)
SL31 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5:1) vom Harz abgespalten. Es wurden 173 mg SL31 (80.3 μηιοΙ, 80%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.38 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 1695.760, ber.: 1696.092.
{H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys- Va, H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys-A -Lys-Ahx-OH-TFA (SL32) SL32 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.05 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5: 1) vom Harz abgespalten. Es wurden 142 mg SL32 (37.2 μηιοΙ, 74%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten. tR = 10.21 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 3131.426, ber.: 3131.987.
{(H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys- Va, H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys- VE)-Lys- Va, (H-Lys-Aß(28-40)- Ahx-Lys-A/", H-Lys-Aß(28-40)-Ahx-Lys-A/E)-Lys- VE}-Lys-Ahx-OH TFA (SL33)
SL33 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.025 milli- molarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5: 1) vom Harz abgespalten. Es wurden 147 mg SL33 (19.3 μηιοΙ, 77%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 9.87 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 6263.652, ber.: 6263.980.
H-Aß(28-40)-Ahx-Glu3-Ahx-OH TFA (SL34)
SL34 wurde nach dem allgemeinen Protokoll zur Festphasenpeptidsynthese in 0.1 millimolarem Maßstab synthetisiert. Das Peptid wurde mit TFA/EDT/Wasser/TIPS (94:2.5:2.5:1) vom Harz abgespalten. Es wurden 141 mg SL34 (68.6 μηιοΙ, 69%) in Form eines farblosen Feststoffs erhalten.
HPLC: tR = 10.60 min (20% 95% MeCN, 20 min).
MS: (MALDI-TOF); m/z für [M+H]+; gef.: 1826.790, ber.: 1827.030.
III. Untersuchungen zur Löslichkeit der synthetischen Liganden
1. Löslichkeit Die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Liganden in wässrigen Medien kann mittels NMR- Spektroskopie untersucht werden. Hierzu eignet sich eine Messung in 10 millimolarem
Kaliumdihydrogenphosphatpuffer pH 7.0 bei 300 K, 600 MHz; interner Standard para- Hydrochinon c = 1.683 mmol/L (NMR-Gerät: Bruker DRX 600-Spektrometer ( H: 600.13 MHz, 3C: 150.90 MHz).
Untersucht man auf diese Weise z.B. die synthetischen Liganden SL19 bis SL34 so kann eine Löslichkeit von L > 2.0 mmol/L ermittelt werden. Untersucht man unter identischen Bedingungen ein Peptid, das eine Sequenz der Aminosäuren 28 bis 40 des Aß1-40 Peptides und damit eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 3 aufweist, aber keinen erfindungsgemäßen Stabilistationsbaustein aufweist, so findet man lediglich eine Löslichkeit von L < 0.5 μηιοΙ/ί. Dies zeigt deutlich, dass der bei einem erfindungsgemäßen synthetisen Liganden vorgesehene Stabilisationsbaustein eine deutliche Verbesserung der Löslichkeit in wässigen Medien bewirkt.
2. Konformationsanalyse Der Grad der Stabilisierung der Peptidkonformation durch die erfindungsgemäß vorgesehenen Stabilisierungsbausteine kann über die analytische Methode des Circulardichroismus (CD) bestimmt werden (Messgerät: JACSO S-870-Spektropolarimeter). Ein Minimum bei 218 nm der in 10 millimolarem Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (pH 7.0) gelösten synthetischen Liganden (c = 0.123 mmol/L, T = 4 °C) identifiziert die Aß-Faltblattstruktur, welche durch den
Stabilisierungsbaustein induziert wird.
Eine quantitative Aussage ist durch eine Entfaltungstitration mit Hexafluoroisopropanol (HFIP), sowie durch Änderung des pH-Wertes oder der Temperatur möglich. Die pH-induzierte
Entfaltung findet bei pH 5-6 statt. Dabei zeigt der synthetische Ligand SL22 beispielweise einen Umschlagpunkt von pH 5.6 (c = 0.123 mmol/L, T = 4°C). Die thermische Entfaltung findet bei ca. 40 °C statt. Bei schrittweiser Zugabe des HFIP können alle drei Sekundärstrukturregime der Proteine in der Reihenfolge 1. Faltblatt, 2. Helix, 3. random coil durchschritten werden.
Intermediär können nahezu quantitative Gehalte an Faltblatt erreicht werden (SL22, Puffer: 73% Faltblatt, 30% HFIP: 73% Helix, 100% HFIP; 89% random coil). Auch können
ungewöhnlich hohe Entfaltungsenthalpien von über fünf kcal/mol beobachtet werden (SL22). Beide Daten werden durch Dekonvolution der während der HFIP-Titration (oder Temperaturänderung, oder pH-Änderung) gemessenen CD-Kurven in die Einzelspektren von Faltblatt, Helix und random coil der Abeta-Struktur ermittelt (Faltblatt: Minimum 218 nm; Helix: Minimum 205 + 220 nm, Maximum 195 nm; Random coil: Minimum 200).
Der Gehalt an Faltblatt der Peptide (c = 0.123 mmol/L) bestimmt bei 4 °C in 10 millimolarem Kaliumdihydrogenphosphatpuffer pH 7.0 beträgt beispielsweise bei SL20 56%; bei SL22 73%; bei SL23 76%; bei SL24 95%; bei SL28 77%; bei SL30 94%; bei SL32 77% und bei SL23 98%. 3. Charakterisierung der Bindung von Mini-Amyloiden an natürlich vorkommende Antikörper gegen ß-Amyloid
Die Antikörperbindung von erfindungsgemäßen synthetischen Liganden kann mit Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA), Dot-Blot Technik bzw. mit Surface-Plasmon Resonance (SPR) untersucht werden.
3.1. ELISA-Messungen
Für den ELISA werden Immulon® 2 HB, U bottom Microtiter Platten mit je 50 ng Peptid pro well (100 pro well in 0,05 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9,6) beschichtet und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Platten werden sechsmal mit PBS + 0,05% Tween 20 im Plate washer
gewaschen (300 pro well) und unspezifischer Bindestellen wurden mittels PBS + 2%
Tween 20 bei 4°C für 24 h abgeblockt. Je 100 uL/well des Primärantikörpers nAbs-Aß40 wird in einer 1 :2 Konzentrationsserie von 1 μg/mL bis 0, 125 μg/mL in PBS + 2% Tween 20 bei 4°C über Nacht inkubiert. Zur Kontrolle von unspezifischer Bindung des Sekundärantikörpers wird für jeden synthetischen Liganden ein Leerwert zur durchgeführt. Der Sekundärantikörper anti- human HRP-Iinked IgG-antibody wird 1 :3000 in PBS + 2% Tween 20 verdünnt und für 1 h bei Raumtemperatur auf den Platten inkubiert. Nach den einzelnen Antikörper-Inkubationsschritten erfolgen je 6 Waschschritte mit dem Waschpuffer. Anschließend wird das Substrat TMB
(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) hinzugegeben, welches die HRP (horseradish peroxidase) des Sekundärantikörpers umsetzt. TMB ist ein chromogenes Substrat das durch die HRP zu einem blauen Farbstoff oxidiert wird. Durch Zugabe von Phosphor- oder Schwefelsäure kommt es zu einem gelben Farbumschlag mit einem Absorptionsmaximum von 450 nm. Nach 15 min wird die Reaktion mittels 5%iger Schwefelsäure (H2S04) abgestoppt, wodurch sich die Lösung gelb färbt und bei 450 nm im TECAN Infinite® 200-Plattenleser gelesen werden kann. Auf diese Weise lassen sich zur Bindung erfindungsgemäßer synthetischer Liganden an natürlich vorkommende Antikörper folgende Werte ermitteln:
Fig. 1 zeigt bespielhaft Ergebnisse von ELISA-Messungen für die synthetischen Liganden SL1 , SL2, SL3, SL4, SL5, SL6, SL7, SL8, SL9, SL10 ( x-Achse). Auf der y-Achse ist die Absorption (%) gemessen bei 450 nm dargestellt. In den Versuchen erkennt man die unterschiedlichen Bindungseigenschaften der synthetischen Liganden im ELISA. Alle Liganden zeigen gute Affinitäten. Eine besonders hohe Affinität besitzen die Liganden SL1 , SL2. Eine etwas niedrigere Affinität besitzt der Ligand SL6.
Fig. 2 zeigt Ergebnisse von ELISA-Messungen für die synthetischen Liganden SL11 , SL12, SL13, SL14, SL15, SL16 ( x-Achse). Auf der y-Achse ist die Absorption (%) gemessen bei 450 nm dargestellt In den Versuchen erkennt man die unterschiedlichen Bindungseigenschaften der synthetischen Liganden im ELISA. Alle Liganden zeigen gute Affinitäten. Man erkennt, dass die Liganden SL15, SL16 eine besonders hohe Affinität besitzen. Eine etwas niedrigere Affinität besitzt der Ligand SL11. Fig. 3 zeigt Ergebnisse von ELISA-Messungen für die synthetischen Liganden SL1 , SL2, SL4, SL14, SL15, SL16, SL17, SL18 im Vergleich zu Aß1-40 und Aß 1 -42 ( x-Achse). Auf der y- Achse ist die Absorption (%) gemessen bei 450 nm dargestellt In den Versuchen erkennt man die unterschiedlichen Bindungseigenschaften der synthetischen Liganden im ELISA. Alle Liganden zeigen gute Affinitäten. Eine besonders hohe Affinität besitzt der Ligand SL4. Eine etwas geringere Affinität besitzt der Ligand SL17.
Die Figuren 4a bis 4d zeigen Ergebnisse von ELISA-Messungen für die synthetischen Liganden SL 19 bis SL33: Die x-Achse zeigt jeweils die nAbs-Aß40 Konzentration. 1 = 0, 125 μg/mL; 2 = 0,25 μg/mL; 3 = 0,5 μg/mL und 4 = 1 μg/mL. Auf der y-Achse ist jeweils die Absorption (%) gemessen bei 450 nm relativ zu SL22 dargestellt (SL22; nAbs-Aß40 1 μg/mL Messwert =
100%). Wobei gilt: 28: SL19; 29: SL20; 30: SL21 ; 31 : SL22; 32: SL23; 33: SL24; 34: SL25; 35: SL26; 36: SL27; 41 : SL32; 42: SL33).
Zur übersichtlicheren Darstellung der Bindungskurven zeigt jede der vier Fig. 4a bis Fig. 4d je vier Peptide und SL22 in ein Diagramm zusammengefasst. Als Fehler ist die
Standardabweichung des Mittelwerts (± SD) angegeben. Man erkennt die unterschiedlichen Bindungseigenschaften der Liganden im ELISA. Alle Liganden zeigen gute Affinitäten, wobei die Liganden SL24, SL26 eine besonders hohe Affinität besitzen. Eine sehr niedrige Affinität besitzt der eingesetzte Dummy, bei dem es sich um Trimeres Peptid mit folgender Struktur handelt:
Figure imgf000084_0001
Dummy
3.2 SPR-Untersuchungen
Messprinzip eines SPR-Geräts:
Das Messprinzip beruht auf der Bildung detektierbarer Oberflächenplasmonen durch die Wechselwirkung zweier Bindungspartner an einer stabilen Oberfläche. Mittels einer Lichtquelle wird polarisiertes Licht über ein Prisma auf einen mit Goldpartikeln beschichteten Sensor-Chip geleitet. Hier wird der Lichtstrahl durch die Goldoberfläche total reflektiert und erzeugt mit den Elektronen der Goldschicht so genannte Oberflächenplasmonen. Diese elektromagnetischen Wellen verursachen einen Elektronenentzug der Chip-Oberflache, der zu einer Energielücke mit einem bestimmten Wnkel im reflektierten Licht führt. Ein daraus resultierender Schatten im reflektierten Licht kann über einen Detektor in ein Resonanzsignal umgewandelt werden.
Zur Charakterisierung von Bindungen zweier Moleküle können auf den Chip Proteine durch kovalente Bindung ihrer Aminogruppen immobilisiert werden (Ligand). Anschließend kann der jeweilige Bindungspartner (Analyt) durch einen Flusskanal über den Chip gespült werden.
Kommt es zur Dichteänderung am Sensor-Chip durch Interaktion zwischen Peptid und Analyt, Ändert sich der Reflexionswinkel des polarisierten Lichts und somit auch der detektierbare Schatten. Die Winkeländerung ist dabei proportional zur gebundenen Masse der Chip-Matrix. Der Detektor misst die Veränderung der Masse am Chip (Assoziation und Dissoziation) und das Computer-Programm wandelt sie in ein Sensorgramm um. Im Sensorgramm sind die
Interaktions-Stadien als Kurvenverlauf gegen die Zeit aufgetragen, wobei die Signalstärke in response units (RU) umgewandelt wird. 1 RU entspricht der Masse von 1 pg/mm2 und einer Winkeländerung von 1x10"4.
Mittels SPR Spektroskopie können Interaktionen zwischen einzelnen Miniamyloiden und nAbs- Aß40 in Echtzeit gemessen werden. Hierfür wurden beispielhaft die Miniamyloide (29: SL20; 31 : SL22; 32: SL23; 33: SL24; 35: SL26; 36: SL27; 38: SL29) sowie Aß40 als Liganden in monomerer Form an einen Sensor-Chip gekoppelt (100 μg/mL Peptid in Acetat-Puffer pH 4,5). Der Antikörper nAbs-Aß40 wurde in 5 Konzentrationen (8,6; 2,9; 1 ,0; 0,3 und 0, 1 μΜ) über jeden Liganden gespült, wobei die unterschiedlichen nAbs-Aß40 Verdünnungen zeitgleich in je einen Flusskanal injiziert wurden. Für jeden Flusskanal wurde ein Sensorgramm aufgezeichnet.
Der zeitliche Verlauf der Interaktion zwischen Peptid und Antikörper ist anhand von
Sensorgrammen abgebildet. Die Signalerhöhung durch Bindung des nAbs-Aß40 an die
Liganden wird im Sensorgramm als aufsteigende Kurve sichtbar, die sich proportional zur Gesamtmenge des interagierenden Liganden verhält. Die abgebildeten Messkurven wurden bereits um das Hintergrundsignal (Referenzkanal 6, kein Antikörper) korrigiert. Zum Zeitpunkt t = 0 wurden die unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen appliziert.
In der Abbildung sind beispielhaft die Original SPR-Bestimmungen für das Miniamyloid
31 (SL22) und für das Aß dargestellt.
Die Fig. 5a und 5b zeigen beispielhaft Diagramme der Original SPR-Bestimmungen. Fig. 5a zeigt ein Diagramm wie es für den synthetischen Liganden SL22 erhalten wird. Als Vergleich hierzu zeigt Fig. 5b ein Diagramm, wie es für Aß1-40 erhalten wird. Die x-Achse zeigt den zeitlichen Verlauf in Sekunden (s). Die y-Achse die Signalstärke in Response Units (RU), wobei 1 RU der Masse von 1 pg/mm2 entspricht. Die Linien entsprechen unterschiedlichen nAbs-Aß40 Konzentrationen, wobei von oben nach unten gilt: 1.: 2,9 μΜ, 2.: 1 ,0 μΜ, 3.: 0,3 μΜ, 4.: 0,1 μΜ (Miniamyloid 31 : SL22).
In Tabelle 1 sind beispielhaft weitere Resultate für verschiedene erfindungsgemäße
synthetische Liganden dargestellt. Die Werte wurden mittels SPR bestimmt und die
entsprechenden KD-Werte untersucht, um die Bindungsaffinität zu bestimmen. Es gilt: 29:
SL20; 31 : SL22; 32: SL23; 33: SL24; 35: SL26; 36: SL27; 38: SL29.
Tabelle 1 : KD-Werte als Maß für die Bindungsaffinität bestimmt mittels SPR.
Tabellarische Darstellung der Messwerte für Assoziationskonstante ka, Dissoziationskonstante kd sowie die errechneten KD-Werte als Maß für die Bindungsaffinität (KD =— ); beginnend mit höchster Affinität.
Figure imgf000086_0001
Die in Punkt 3.1 und Punkt 3.2 dargestellten Methoden zeigen, dass erfindungsgemäße synthetische Liganden aufgrund ihrer Fähigkeit anti Aß-Autoantikörpern zu binden in besonders vorteilhafter Weise zum Nachweis von anti Aß-Autoantikörpern verwendet werden können. Die Liganden können dabei zur Herstellung eines entsprechenden Nachweisreagenzes und/oder eines Kits zum Nachweis verwendet werden. 3.3 Toxizität an primären Neuronen von Miniamyloiden in vitro
Thioflavin-T-Assay
Zur Herstellung von Oligomeren werden die lyophilisierten Liganden in einer Stock- Konzentration von 150 μΜ in 10 % DMSO und 90 % PBS gelöst. Es folgt eine Inkubation der Peptidlösungen bei 37°C im Brutschrank über mehrere Tage. Zur Überprüfung des
Oligomerisierungsgrades der einzelnen synthetischen Liganden wird nach 72 Stunden ein Thioflavin-T-Assay durchgeführt. Thioflavin-T (Basic Yellow 1 oder Cl 49005) ist ein Benzothiazol-Salz (4-(3,6-dimethyl-1 ,3- benzothiazol-3-ium-2-yl)-N,N-dimethylanilichlorid), das durch Bindung an Amyloid-Fibrillen eine charakteristische Änderung seines Fluoreszenzspektrums aufweist. Die ThT-Moleküle können spezifisch mit dem cross-ß Strukturmotiv interagieren, sodass bei niedermolekularen
Aggregationsformen (Monomere oder kleine Oligomere) kein erhöhtes Fluoreszenzsignal detektierbar ist.
10 des jeweiligen Fibrillationsansatzes (siehe oben) werden mit 80 50 mM Glycinpuffer pH 9,2 und 2 μΜ Thioflavin-T Lösung zu einem Endvolumen von 100 μΙ_ verdünnt und in eine lichtundurchlässige 96-well Microplatte pipettiert. Anschließend erfolgt die Fluoreszenzmessung bei einer Absorptionswellenlänge von 450 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm am TECAN Infinite® 200-Plattenleser. Als Leerwert diente PBS, welches auch bei 37°C inkubiert wurde. Alle Proben wurden als Doppelbestimmung vermessen.
In Fig. 6 sind beispielhaft Meßergebnisse für die synthetischen Liganden SL20, SL22,
SL23.SL24, SL25, SL26, SL29, sowie für das AßPeptid dargestellt. Man erkennt, dass die Liganden im Unterschied zum Aß Peptid niedermolekkulare Agtgregationsformen bilden. Dies ist eine wichtige Voraussetzung dafür, dass Liganden bereitgestellt werden können, die zumindest einige Stunden bis Tage löslich sind und die daher zu therapeutischen und/oder analytischen Zwecken eingesetzt werden können.
Untersuchungen zur Toxizität von ynthetischen Liganden und Aß40 in vitro
Primäre corticale Neurone werden mit synthetischen Liganden behandelt und nach 48 Stunden einem Toxizitätstest unterzogen. Für die Zellbehandlung werden die synthetischen Liganden so gelöst, dass sie als Monomere und als höhere (lösliche) Oligomere vorlagen. Die verwendeten Protokolle sind bereits für Aß etabliert. Monomere werden auf eine Stockkonzentration von 150 μΜ gebracht, indem sie in 10 % DMSO (AppliChem GmbH, Darmstadt) und 90 % ddH20 gelöst und anschließend 5 min im Ultraschallbad behandelt werden. Zur Herstellung der höheren Oligomere werden die synthetischen Liganden als Monomere gelöst (siehe oben). Es folgt eine Inkubation der Peptidlösungen bei 37°C im Brutschrank über 72 h. Vor Behandlung der Zellen werden synthetischen Liganden und Aß40 durch Verdünnung mit Neurobasal® A Medium (GIBCO®, Invitrogen™ Life Technologies GmbH, Carlsbad, USA) mit 2% B-27®
Supplement, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin auf eine Konzentration von 5 μΜ gebracht. Nach 48 Stunden Inkubation erfolgt die Toxizitätsbestimmung mittels MJJ-Assay. Die Behandlung mit Aß-Oligomeren dient als Positivkontrolle für die Zytotoxizität. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.
MTT-Test
Für die MTT-Tests wird eine Stocklösung verwendet, die aus 5 mg/mL in PBS (phosphate buffered saline) gelöstem MTT-Pulver (Sigma-Aldrich® Corporation, St. Louis, USA) besteht. Für den Test wird die Stocklösung im Verhältnis 1 : 10 (10 μί pro 100 μί Medium) direkt ins well pipettiert und die Zellkultur-Platten für 1 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Nach Abnahme der Zellüberstände erfolgt die Lyse mittels Zugabe von 500 DMSO. Die Platten werden vorsichtig im Dunkeln für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bis sich die Kristalle lösen und sich dadurch die Lösung gleichmäßig blau-violett färbt. Anschließend werden die
Extinktionen bei einer Wellenlänge von 570 nm als Messfilter und 800 nm als Referenzfilter bestimmt. Alle Proben wurden als Doppelbestimmung gemessen.
Die Zellvitalität wurde mittels Überleben in % angegeben:
Abs. behandelte Zellen (Probe)
x 100 = Oberleben [%]
Abs. unbehandelte Zellen (Mediumkontrolle)
Kayed R, Head E, Thompson JL, Mclntire TM, Milton SC, Cotman CW, Glabe CG (2003) Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis Science 300:486-489.
Die Ergebnisse der Messungen sind in den Fig. 7, 8, 9 und 10 dargestellt.
Fig. 7 und Fig. 8 zeigen beispielhaft Ergebnisse von Versuchen, bei denen die synthetischen Liganden so behandelt werden, dass sie sie präferentiell als Monomere vorliegen. Das Aß
Peptid wurde nach dem Kayed-Protokoll zur Generierung von Oligomeren behandelt. Auf der y- Achse ist jeweils die Zellvitalität in % zur Mediumkontrolle (y-Achse) aufgetragen, die mittels MTT an primären cortikalen Neuronen in Anwesenheit der synthetischen Liganden gemessen wird.
In Fig. 7 sind beispielhaft die Messungen zu den Monomer-vorliegenden Liganden SL20, SL22, SL23 SL24 dargestellt. Fig. 8 zeigt entsprechende Ergebnisse zu den Monomer-vorliegenden Liganden SL25, SL26, SL29. Man erkennt, dass erfindungsgemäße synthetische Liganden die Zellaktivität kaum beeinflussen. Diese Resultate zeigen beispielhaft, dass erfindungsgemäße Liganden nicht toxisch sind und daher zur Bereitstellung eines Therapeutikums verwendet werden können.
Fig. 9 und Fig. 10 zeigen beispielhaft Ergebnisse von Versuchen, bei denen die synthetischen Liganden so behandelt werden, dass sie sie präferentiell als höhere (lösliche) Oligomere vorliegen. Das Aß Peptid wurde nach dem Kayed-Protokoll zur Generierung von Oligomeren behandelt. Auf der y-Achse ist jeweils die Zellvitalität in % zur Mediumkontrolle (y-Achse) aufgetragen, die mittels MTT an primären cortikalen Neuronen in Anwesenheit der
synthetischen Liganden gemessen wird. In Fig. 9 sind beispielhaft die Messungen zu den Monomer-vorliegenden Liganden SL20, SL22, SL23, SL24 dargestellt. Fig. 10 zeigt entsprechende Ergebnisse zu den Monomer-vorliegenden Liganden SL25, SL26, SL29. Man erkennt, dass erfindungsgemäße synthetische Liganden die Zellaktivität kaum beeinflussen. Diese Resultate zeigen beispielhaft, dass erfindungsgemäße Liganden nicht toxisch sind und daher zur Bereitstellung eines Therapeutikums verwendet werden können.
Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden
Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.

Claims

Patentansp rüche
1 . Synthetischer Ligand für humane anti-Aß-Antikörper, umfassend wenigstens einen
Peptidbaustein und wenigstens einen kovalent an den Peptidbaustein angebundenen Stabilisationsbaustein, wobei die Sequenz jedes Peptidbausteins zur vollständigen Sequenz oder zu einer wenigstens fünf-gliedrigen Teilsequenz der Sequenz der
Aminosäuren 20 bis 42 der SEQ ID No. 1 eine Sequenzanalogie von größer 75% aufweist.
2. Synthetischer Ligand nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des wenigstens einen Peptidbausteins zur Sequenz der Aminosäuren der SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 1 1 eine Sequenzhomologie von größer 75% aufweist.
3. Synthetischer Ligand einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisationsbaustein über wenigstens eine Attachmentgruppe mit dem Peptidbaustein kovalent verknüpft ist, wobei zur kovalenten Verknüpfung bevorzugt eine Peptidbindung vorgesehen ist.
4. Synthetischer Ligand nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
Attachmentgruppe eine Carboxylfunktion oder eine sekundäre oder tertiäre Aminogruppe ist.
5. Synthetischer Ligand einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Stabilisationsbaustein wenigstens ein Strukturmotiv umfassend, das ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend eine Aminosäure, insbesondere eine Amino- alkansäure oder eine proteinogene Aminosäure oder ein Derivat einer proteinogenen Aminosäure, bevorzugt ein Triazolderivat oder ein Akinderivat.
6. Synthetischer Ligand nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Stabilisationsbaustein wenigstens eines der folgenden Strukturmotive SB1 bis SB12 umfasst
Figure imgf000091_0001
SB12 wobei: R', R" unabhängig voneinander -OH, OR'" oder eine Aminosäure sind, und wobei die Aminosäure Teil des Stabilisationsbaustein selbst, oder Teil eines mit dem Stabilisationsbaustein verbundenen Peptidbausteins ist, wobei es sich bei der Aminosäure um eine proteinogene Aminosäure oder um ein Derivat hiervon oder um eine nicht-proteinogene Aminosäure handelt;
R'" ein Kohlenwasserstoff rest, bevorzugt ein Alkylrest, mit 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8 C-Atomen ist;
R1 bis R12 unabhängig voneinander eine Aminosäure, -H, R'" oder ein weiteres der gezeigten Stukturmotive SB1 bis SB12 sind, und wobei die Aminosäure Teil des Stabilisationsbaustein selbst, oder Teil eines mit dem Stabilisationsbaustein verbundenen Peptidbausteins ist, wobei es sich bei der Aminosäure um eine proteinogene Aminosäure oder um ein Derivat hiervon oder um eine nichtproteinogene Aminosäure handelt; und
k, n, m, und o unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8 und besonders bevorzugt 4 oder 5 sind. Ganz besonders bevorzugt sind k, n, m und o = 4 und p = 5.
7. Synthetischer Ligand nach der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der synthetische Ligand wenigstens zwei Peptidbausteine aufweist, die in ß-Faltblattstruktur vorliegen und die parallel oder antiparallel zueinander angeordnet sind.
8. Synthetischer Ligand nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der synthetische Ligand wenigstens zwei Peptidbausteine aufweist, wobei der erste Peptidbaustein ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 1 1 , SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30 und SEQ ID No. 32 und dass der zweite Peptidbaustein ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 1 1 , SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31 und SEQ ID No. 32.
9. Synthetischer Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand einen Peptidbaustein und zwei Stabilisationsbausteine aufweist.
10. Synthetischer Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand zwei Peptidbausteine und einen Stabilisationsbaustein aufweist.
1 1 . Synthetischer Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand zwei Peptidbausteine und zwei Stabilisationsbausteine aufweist.
12. Synthetischer Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand zwei Peptidbausteine und drei Stabilisationsbausteine aufweist.
13. Synthetischer Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand vier Peptidbausteine und einen Stabilisationsbausteine aufweist.
14. Kit zum Nachweis von anti Aß-Autoantikörpern in einer zu untersuchenden Probe
enthaltend wenigstens einen synthetischen Ligand gemäß Anspruch 1 .
15. Verfahren zum Nachweis von humanem anti Aß-Autoantikörper in einer zu untersuchenden Probe, wobei wenigstens ein synthetischer Ligand gemäß Anspruch 1 humanen anti Aß- Autoantikörper bindet und wobei diese Bindung über Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Radioaktivität oder eine andere gebräuchliche Tracermethode nachgewiesen wird.
16. Verwendung wenigstens eines synthetischen Liganden entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Nachweisreagenz zum Nachweis von anti Aß- Autoantikörpern in einer zu untersuchenden Probe.
17. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis mit Hilfe eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) durchgeführt wird, wobei der synthetische Ligand den nachzuweisenden anti-Aß-Autoantikörper bindet.
18. Verwendung wenigstens eines synthetischen Liganden entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Impfstoffes zur Vorbeugung und Behandlung von
neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen eine Ablagerung von Aß-Peptiden gefunden wird, insbesondere zur Vorbeugung und Behandlung von Morbus Alzheimer.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung zur Behandlung von
neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen eine Ablagerung von Aß-Peptiden gefunden wird, enthaltend wenigstens einen synthetischen Liganden entsprechend wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 13.
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