DE3149161C2

DE3149161C2 - Tripeptide und diese Verbindungen enthaltende antifungische Mittel

Info

Publication number: DE3149161C2
Application number: DE3149161A
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Dr.med. 8900 Augsburg Meyer-Glauner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-12-08
Filing date: 1981-12-08
Publication date: 1984-09-06
Also published as: JPS58109459A; DE3149161A1; JPS626720B2

Abstract

Strukturanaloge des Typs L-Arg-X-L-Phe, bei denen X eine atypische Aminosäure mit einem gegebenenfalls substituierten Phenylrest ist, weisen hohe spezifische Wirksamkeit insbesondere gegen den Problemkeim candida ablicans auf.

Description

ίο 2. Antifungische Mittel, insbesondere mit Wirksamkeit gegen Candida albicans. enthaltend Tripeptide nach

Anspruch 1.

Es ist bekannt, daß es auf dem Gebiet der niederen Oligopeptide Antimetabolite geben kann. So wurde festgestellt, daß das durch Keratinophyton terreum gebildete L-Arginyl-D-allothreonyl-L-phenylalanin eine antifungische Wirksamkeit besitzt (Synthese, biologische Aktivität und medizinische Bedeutung von Peptiden der Sequenz L-Arg-X-L-phe. Universität Tübingen, Dissertation 1975). Im Hinblick auf die ungewöhnliche D-Konfiguration des mittelständigen Aminosäurerestes sind Tripeptide synthetisiert worden, die in der Mittelstellung Ν-Λ-Methyl oder D-Aminosäurereste aufweisen. Es wurde hierbei gefunden, daß von den untersuchten Tripeptiden L-Arginyl-D-phenylalanyl-L-phenylalanin und L-Arginyl-N-.t-methyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanin bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit der oben genannten natürlich vorkommenden Verbindung am nächsten kommen. Diese Peptide zeigen jedoch gegenüber Problemkeimen wie insbesondere Candida albicans keinerlei oder nur eine sehr schwache wachstumshemmende Aktivität.

Gemäß Experientia 31,1975,764—765 sind weiterhin die folgenden Peptide bekannt:

L-Arg-D-Ala-L-Phe, L-Arg-D-Tyr-L-Phe, L-Arg-D-Phe-L-Phe,
L-Arg-D-Leu-L-Phe.L-Arg-D-Val-L-Phe.

Es ist hier angegeben, daß diese Tripeptide neben Paecilomyces varioti (einem Ascomyceten) und Mucor miehei (einem Zygomyceten) auch die vor allem klinisch und von der Pathogenität her wichtigen Deuteromyceten Candida albicans, Candida pseudotropicalis, Gastricum candidum, Nematospora corglii und Tomlopsis glasrate hemmen. Es sind allerdings keinerlei minimale Hemmkonzentrationen angegeben, was bei einer so wichtigen

J5 Befunderhebung absolut notwendig ist und sind auch späterhin nicht von dem Verfasser nachveröffentlicht worden.

Die eigenen Untersuchungen mit diesen fünf Tripeptiden, hergestellt nach der Merrifield-Festkörper-Methode und nach der von dem Verfasser benutzten Testmethodik (Filterrondellen-Test auf homogener Keimschicht) zeigten, daß gegenüber den angegebenen Testorganismen bei Konzentrationen bis zu 10 mg/ml keinerlei Wachstumshemmungen in Form von Hemmzonen um die mit den Peptiden getränkten Filterrondellen festgestellt wurden.

Die weiteren Untersuchungen dieser fünf Tripeptide gegenüber Candida albicans und Candida pseudotropicalis in »yeast nitrogen base«-Medium mil einer Zellzahl von I OVml zu Testbeginn führten zu dem Ergebnis, daß diese Tripeptide keinerlei Wachstumshemmung zeigen. Die Tripeptide werden dabei bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml Testmedium beurteilt. Bei den Tripeptiden L-Arg-D-Val-L-Phe und L-Arg-D-Ala-L-Phe werden im Gegenteil sogar Wachstumsförderung von Candida albicans festgestellt.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, durch weitere molekulare Veränderungen des mittelständigen Bausteins, im nachfolgenden X genannt, der eingangs genannten Verbindung L-Arginyl-X-L-phenylalanin, Verbindungen herzustellen, die bestimmte zweckmäßige physiologische Eigenschaften aufweisen.

so Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die folgenden Tripeptide

A) L-Arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyl)-L-phenylalanin,

B) L-Arginyl-DL-(m-fluortyrosyl)-L-phenylalanin,

C) N '-Acetyl-L-aiginyl-DL-ip-fluorphenylalanylJ-L-phenylalanin und
D) L-Arginyl-DL-(p-fIuorphenylalanyl)-L-phenylalaninamid

geschaffen werden.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Verbindungen A und B nicht nur eine vergleichbare biologische Aktivität wie die eingangs genannte, natürlich vorkommende Verbindung L-Arg-D-allothre-L-phe ho besitzen, sondern darüber hinaus auch sehr gute Wirksamkeit gegen insbesondere Candida albicans aufweisen.

Der Erfindungsgegenstand wird nachfolgend beispielsweise erläutert.

Beispiel Ί

κ* Die Herstellung der Verbindungen erfolgte aus den drei Komponenten vermittels des Merrifield-Verfahrens. Hierbei erfolgt zunächst eine Chlormethylierung eines C'opolvmeren aus 98% Styrol und 2% Divinylhen/ol, sodann Veresterung der N-t-BOC-Aminosäure mit dem Trägerharz in Form des genannten Copolymer, Anwenden von DCCI als Kupplungsreagens und sodann Ablosen des fertigen, geschützten Peplids als freie Säure mit

Bromwasserstoffsäure und Trifluoressigsäure oder Eisessig oder mit Bor. Die Acetylierung des N-terminalen L-Argininrestes mit Acetanhydrid/Pyridin wird vermittels des Verfahrens von Merrifield ausgeführt. Die ar-Carboxamidbildung an dem C-terminalen L-Phenylalanin wird vermittels eines Verfahrens durchgeführt, bei dem ein Benzhydrylamin-Harz angewandt wird. Nach der Fluorwasserstoffabspaltung werden die Peptide vermittels Säulenchromatographie mit Silikage! gereinigt. Die Peptide werden bei 4°C mit n-Butanol: H₂O : Essigsäure in einem Verhältnis von 4:2:1 eluiert Die bei den antifungischen Untersuchungen angewandten Tripeptide erwiesen sich als homogen vermittels Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Anwenden von drei Lösungsmittelsystemen. Die relativen Aminosäure-Zusammensetzungen werden unter Anwenden eines Beckman 121 Aminosäureanalysators bestätigt.

10 Beispiel 2

Die antifungischen Wirksamkeiten werden gegenüber Testisolaten von Paecilomyces varioti und Mucor miehei, Candida albicans, Candida tropicales, Candida pseudotropicales, Candida krusei, Aspergillus fumatus, Aspergillus niger und weiteren auf einem komplexen Medium und Malzextrakt-Agar untersucht.

In der beigefügten Tabelle sind die kleinsten inhibierenden Konzentrationen der beiden beispielsweisen erfindungsgemäßen Tripeptide denjenigen eier freien Antimetaboliten gegenübergestellt anhand des Beispiels Candidi: albicans. Die Untersuchungen wurden in einem »yeast nitrogen base«-Medium mit einem Glukosegehalt von 2% und einem p_H-Wert von 7,2 durchgeführt. Die Zellzahl zu Versuchsbeginn beläuft sich auf 10⁴/ml. Die Tests werden in Mikrotiterschalen durchgeführt, und es wird 24 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Der n-terminal acetylierte Abkömmling des Peptids 1, die Verbindung 3 und der C-terminal amidierte Abkömmling des Peptids 1, die Verbindung 4, besitzen eine auf etwa 50% reduzierte Aktivität des Peptids 1, zeichnen sich aber dadurch aus, daß sie durch Carboxypeptidasen schwerer spaltbar sind.

Keines der vier Peptide zeigt antibakterielle Wirksamkeiten gegenüber Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae und Bacillus subtilis. Auch hier ist es wiederum von Interesse festzustellen, daß die Aminosäure-Antagonisten DL-p-Fluorpheny!alanin und /?-2-DL-Thienylalanin,die gegenüber einigen Bakterien Wirksamkeit zeigen, dieselbe dann verlieren, wenn sie in Tripeptiden der angegebenen Formeln vorliegen.

Physikalisch-chemische Daten

L-Arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyl)-L-phenylalanin F 220°C(unter Zersetzung), Rfa = 0,44,
L-Arginyl-DL-(m-fluortyrosy!)-L-phenylalanin F 170—174°C(unter Zersetzung), Rfa = 0,39,
N*-Acetyl-L-arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyi)-L-phenylalanin F 158—160⁰C (unter Zersetzung), Rfa = 0,51, L-Arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyl)-L-phenylalaninamid F 164°C(unter Zersetzung), Rfa = 0,45.

Bei der Bestimmung der chromatographischen Rf-Werte ist in jedem Fall A = n-Butanol: Eisessig : Wasser mit einem Verhälntis von 3 : 1 :1.

Tabelle

Minimale Hemmkonzentrationen bei Candida albicans

a) Anzahl der inhibierten Isolate

b) minimale inhibierende Konzentration = μg/ml (Mole/l)

L-Arg-DL-p-F-Phe-L-Phe DL-p-F-Phe L-Arg-DL-m-F-Tyr-L-Phe DL-m-F-Tyr

Candida a) 8 a) 0 a) 2 a) 0

albicans(lO) b) <31,2(6,5 ■ ΙΟ-⁵) b) <250(l,4 · ΙΟ-³) b) < 125(2,5 · IO"⁴) b) <250(l,3 · \0~ⁱ)

a) 2

b) < 125 (2,6 · 10-")

ψ Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich gegenüber den vorbekannten Verbindungen insbeson-

|i dere dadurch aus, daß ein breiterer Wirkungsbereich gegenüber pathogenen Pilzen gegeben ist. Während

DL-p-F-Phenylalanin gegenüber Candida albicans nicht wirksam ist, zeigt sich eine ausgeprägte Wirksamkeit, wenn diese Verbindung als X in dem eingangs genannten Tripeptid vorliegt. So werden alle überprüften Candida albicans Isolate durch weniger als 128 μg/ml des Peptids 1 inhibiert, während der freie Aminosäureantagonist keine Inhibierung bei einer Konzentration bis zu 256 ^g/ml zeigt. Auf der molaren Grundlage weist dieses Tripeptid somit eine mehr als 20fach größere Wirksamkeit gegenüber 80% der überprüften Isolate auf. Candida krusei, es werden 10 Isolate überprüft, und Cryptococcus neoformans, es werden 4 Isolate überprüft, werden durch keine der erfindungsgemäßen Verbindungen inhibiert.

Claims

Patentansprüche:

1. Die Tripeptide

A) L-Arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyl)-L-phenylaianin.

B) L-Arginyl-DL-(m-fluortyrosyI)-L-phenylalanin.

C) N'-Acetyl-L-arginyl-DL-fp-fluorphenylalanyty-L-phenylalanin und

D) L-Arginyl-DL-(p-fluorphenylalanyl)-L-phenylalaninamid.