DE2847608A1 - Glykopeptide und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Glykopeptide und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der biologischen Wirkstoffe, insbesondere auf Glykopeptide und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Glykopeptide sind eine umfangreiche Klasse organischer Verbindungen, die Stoffe darstellen, welche einen Zucker- und einen Peptidanteil enthalten. Aus den Glykopeptiden sind die Zellwände der Bakterien aufgebaut. Der Zuckeranteil der Glykopeptide enthält einen ungewöhnlichen carboxylhaltigen Aminozucker, 2-Acetamido-3-O-/D-1'carboxyäthyl/-2-desoxy-kleines Beta-D-glykopyranose, die gewöhnlich als N-Acetylmuramsäure (MurNAc) bezeichnet wird und nur in bakteriellen Zellwänden gefunden wurde.
Die Glykopeptide der Zellwände der Bakterien stellen riesige polymere Moleküle dar, die aus reproduzierbaren Gliedern des Disaccharids GlcNAc/1-->4/MurNAc/N-acetylglykosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure/ mit an die Muramsäure angelagerten Peptiden ähnlichen Baus (sogenannte Peptidhauptketten) aufgebaut sind. Die Starrheit der Struktur der Zell-
wand der Bakterien bedingen die Peptidbindungen (oder Peptidbrücken) zwischen den Peptidhauptketten. Mit Hilfe der gesteuerten fermentativen Hydrolyse kann man diese oder jene Bindungen in dem polymeren Molekül der Glykopeptide der Zellwände der Bakterien spalten und Glykopeptidbruchstücke verschiedener Länge und verschiedenen Baus erhalten (1. Ghuysen J.-M., Bact. Rev. 32, Nr. 4, 425, 1968; 2. Schleifer K.H., Kandler O., Bact. Rev. 36, Nr. 4, 407, 1972).
Bis vor kurzem nahm man an, daß die Rolle der Glykopeptide der Zellwände der Bakterien nur in der Gewährleistung der Starrheit der Zellwände zum Schutze der bakteriellen Zelle gegen die Einwirkung der Umwelt besteht. Mit der Entwicklung der Arbeiten zur Untersuchung der Adjuvans-Eigenschaften der mykobakteriellen Zellen (Präparate BCG, vollständiges, Freund-Adjuvans) aber wurde festgestellt, daß viele Glykopeptide, abgetrennt aus den bakteriellen Zellwänden starke Adjuvantia sind (Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E., Bioch. Bioph. Res. Comm. 59, Nr. 4, 1317, 1974).
(Die Adjuvantia sind Stoffe, die nichtspezifische Stimulierung des immunen Systems der Tiere und des Menschen hervorrufen, wodurch die Antikörperbildung verstärkt und die Schutzreaktion des Organismus beispielsweise gegen Infektion erhöht wird. Die Adjuvantia werden in der Medizin und bei der Herstellung von Vakzinen und Seren verwendet).
Es ist eine Synthese einiger Bruchstücke und Analoga der Glykopeptide der Zellwände der Bakterien, und zwar von N-Ace-
tylmuranylpeptiden der allgemeinen Formel
worin R für Reste von Aminosäuren oder Peptiden, beispielsweise für Ala, Gly, Ala-D-Glu, Ala-D-Glu-NH[tief]2,
,
,
D-Ala-D-Glu-NH[tief]2 und andere steht, bekannt.
Die Synthese besteht in der Durchführung der Kondensation der Benzylester entsprechender Aminosäuren oder Peptide mit geschützter N-Acetylmuramsäure (1. Kusumoto S., Tarumi Y., Ikenaka K., Shiba T., Bull. Chem. Soc. (Japan) 49, (2), 533 - 539, 1976; 2. Lefranzier P., Choay J., Derrien M., Lederman J., Int. J. Pept. Protein Res., 9, Nr. 4, 249 - 257, 1977).
Dieses bekannte Verfahren zur Herstellung der oben genannten Glykopeptide ist dadurch begrenzt, daß man in der Kondensationsreaktion nur eine geschützte N-Acetylmuramsäure (Benzyl-2-acetamido-4,6-benzyliden-3-O-/D-1'-carboxyäthyl/-2-desoxy-kleines Alpha-D-glukopyranosid) verwendet, die man vorher in drei Stufen aus N-Acetylglukosamin in einer Ausbeute von 17 bis 22 % nach dem folgenden Schema synthetisiert:
(Flowers H.M., Jeanloz R.W., J. Org. Chem. 28, 2983, 1963). Einige der oben genannten synthetischen N-Acetylmuramylpeptide sind starke Adjuvantia (Kotani S., Watanabe Y., Kinoshita F., Shimono T., Morisaki I., Shiba T., Kusumoto S., Tarumi X., Ikenaka K., Biken J. 18, 105, 1975).
In einer gemeinsamen Arbeit von bulgarischen und sowjetischen Wissenschaftlern wurde gezeigt, daß das aus den Zellwänden von Lactobacillus bulgaricus abgetrennte Gemisch von Glykopeptiden eine ungewöhnliche antitumorale Aktivität besitzt.
Die neutralen Glykopeptide aus Lactobacillus bulgaricus rufen Nekrose des Tumorgewebes bei Mäusen mit Sarkom S-180 hervor. Die Synthese dieser Glykopeptide ist unbekannt (Bogdanov I.G., Dalew P.G., Gurevich A.I., Kolosov M.N., Malkova V.P., Plemyannikova L.A., Sorokina I.B., Febs letters 57, Nr. 3, 259, 1975).
Die Feststellung der biologischen Aktivität (die Adjuvans-Eigenschaften und die Fähigkeit, das Tumorgewebe zu nekrotisieren) bei den Glykopeptiden der Zellwände der Bakterien hat das Interesse für die Herstellung auf synthetischem Wege verschiedener Bruchstücke der Naturglykopeptide und ihrer Analoga vorausbestimmt, die für eine detaillierte Untersuchung der biologischen Aktivität dieser Verbindungen notwendig sind.
Die Analyse der Bruchstücke der Glykopeptide, die aus den Zellwänden verschiedener Mikroorganismen abgetrennt wurden und die Adjuvans-Aktivität zeigten, sowie die Analy-
se der Glykopeptide aus Lactobacillus bulgaricus, die eine ungewöhnliche antitumorale Aktivität zeigten, ergab, daß in dem Zuckeranteil der Moleküle der Glykopeptide sowohl die N-Acetylmuramsäure als auch das N-Acetylglukosamin enthalten ist. Die Synthese der Glykopeptide aber, welche neben der N-Acetylmuramsäure das N-Acetylglukosamin enthalten, d.h. die Synthese der N-Acetylglukosaminyl-N-acetylmuramylpeptide ist bis zum heutigen Tage nicht beschrieben. Das bekannte Verfahren zur Synthese der genannten Muramylpeptide macht es möglich, nur N-Acetylmuramylpeptide zu erhalten. Das dabei angewandte mehrstufige Schema der Synthese ist prinzipiell ungeeignet für die Verknüpfung des Restes von N-Acetylglukosamin durch die Bindung 1-->4 mit der N-Acetylmuramsäure (durch die Bindung 1-->4 sind miteinander alle Reste der Aminozucker in beliebigem Glykopeptid der Zellwände der Bakterien verknüpft). Somit ist es unmöglich, das bekannte Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmuramylpeptiden für die Synthese von N-Acetylglukosaminyl-/1-->4/-N-acetylmuramylpeptiden anzuwenden. Dies bestimmte auch das Interesse für die Suche nach einem neuen Verfahren zur Herstellung verschiedener Bruchstücke und Analoga der Naturglykopeptide der Zellwände der Bakterien.
Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, neue biologisch aktive synthetische Glykopeptide, die in dem Zuckeranteil des Moleküls verschiedene Bruchstücke der Aminozucker der Zellwand der Bakterien enthalten, zu entwickeln sowie ein neues Verfahren zur Herstellung der genannten Glykopeptide zu schaffen.
Nach der vorliegenden Erfindung werden Glykopeptide der allgemeinen Formel I
worin n = 1 oder 2, R für den Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht, vorgeschlagen.
Die Glykopeptide der genannten Formel sind neue chemische Verbindungen. Es wurde von uns gefunden, daß die genannten Stoffe biologisch wirksame Verbindungen sind und für die Medizin von Interesse sein können. Die Synthese und die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Glykopeptide ist in der Literatur nicht beschrieben.
Es wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Synthese von Glykopeptiden der allgemeinen Formel I vorgeschlagen, welches in der Kondensation ungeschützter muramylhaltiger N-Acetylaminozucker der allgemeinen Formel II
worin n = 1 oder 2, mit geschützten Aminosäuren oder Peptiden durch Aktivierung der Carboxylgruppe der genannten Aminozucker besteht.
Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet große Möglichkeiten für die Herstellung einer Reihe von Naturglykopeptiden
und ihrer Analoga auf synthetischem Wege.
Weitere Ziele und Vorteile werden aus der nachstehend angeführten ausführlichen Beschreibung verständlich sein.
Wie oben hingewiesen, besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung synthetischer Glykopeptide der allgemeinen Formel I in der Kondensation der Zuckerkomponente mit geschützten Aminosäuren oder Peptiden. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß man als Zuckerkomponente in der Kondensationsreaktion ungeschützte muramylhaltige N-Acetylaminozucker der Formel II verwendet.
Die Kondensation wird im Medium eines inerten Lösungsmittels, meistenteils in Gegenwart eines Kondensationsmittels, beispielsweise des Woodward-Reagens K (N-Äthyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat), bei einer Temperatur von 0 bis 25°C in einer Stufe durchgeführt.
Die anschließende Entfernung der Schutzgruppen bei dem Aminosäurerest oder dem Peptidrest in den erhaltenen Glykopeptiden wird nach bekannten Methoden durchgeführt.
Die für die Synthese als Ausgangsstoffe dienenden Aminozucker der allgemeinen Formel II trennt man aus der Biomasse von Micrococcus lysodeikticus ab, weil die Synthese solcher muramylhaltiger N-Acetylaminozucker unbekannt ist.
Das für die Abtrennung der Aminozucker der Formel II aus der Biomasse angewandte Verfahren ist beschrieben und besteht in der fermentativen Hydrolyse der Biomasse von Micrococcus lysodeikticus mit Hilfe von Lysozym und der nachfolgenden zweistufigen Reinigung auf Kolonnen mit Dowex 50 x 8 (H[hoch]+-
Form) 200 bis 400 Maschen und Dowex 1 x 8 (CH[tief]3COO[hoch]--Form) 200 bis 400 Maschen (1. Hoshino O., Zenavi U., Sinay P., Leanloz R.W., J. Biol. Chem. 247, Nr. 2, 381, 1972; 2. Sharon N., Osawa T., Flowers H.M., Jeanloz R.W., J. Biol. Chem. 241, 223, 1977).
Analytische Angaben für die Aminozucker der Formel II:
GlcNAc/1-->4/MurNAc: Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl, 2 und 24 Stunden, 100°), Mur:GleNH[tief]2 1,0:1,0 (2 Stunden), 1,00:1,03 (24 Stunden unter Berücksichtigung der Zersetzung), Aminosäuren fehlen,
[kleines Alpha][hoch]18°[tief]D + 16,8° --> + 12,0° (Konzentration 0,5; H[tief]2O)
[kleines Alpha][hoch]16°[tief]D + 15,2° --> + 10,2° (Konzentration 0,5; H[tief]2O; 24 Stunden).
Gefunden, %: C 43,88; H 6,70; N 5,00.
Berechnet für C[tief]19H[tief]32N[tief]2O[tief]13.1,5 H[tief]2O, %:
C 43,59; H 6,74; N 5,30.
GlcNAc/1-->4/MurNAc/1-->4/GlcNAc/1-->4/MurNAc:
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl, 100°, 16 und 24 Stunden), Mur:GleNH[tief]2 1,0:1,0 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 16 Stunden) und 1,00:1,04 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 24 Stunden), Aminosäuren fehlen
[kleines Alpha][hoch]18°[tief]D - 10,4° --> -13,1° (Konzentration 0,5; H[tief]2O; 24 Stunden).
Gefunden, %: C 44,50; H 5,63; N 5,00.
Berechnet für C[tief]38H[tief]62N[tief]4O[tief]25.3H[tief]2O, %:
C 44,35; H 6,66; N 5,45.
Die für die Synthese verwendeten geschützten Ausgangsaminosäuren oder Peptide erhält man nach bekannten Methoden
der Peptidchemie. Dabei verwendet man in der Regel Benzylester zum Schutze der C-endständigen Carboxylgruppen und tert. Butyloxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen zum Schutze der freien Aminogruppen.
Es werden erfindungsgemäß Glykopeptide der allgemeinen Formel I vorgeschlagen, darunter
I. GlcNAc/1-->4/MurNAc-Ala
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanin
II. GlcNAc/1-->4/MurNAc-Ala-D-Glu-NH[tief]2
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanin-D-iso-glutamin
III. GlcNAc/1-->4/MurNAc-Ala-D-Glu
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanil-D-glutaminsäure
IV. GlcNAc/1-->
Amid des N[hoch]kleines Epsilon-[N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-glutamyl-D-iso-asparaginyl]-lysyl-D-alanins
V. GlcNAc/1-->
-->4/GlcNAc/1-->
-->4/-Bis-[N-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-iso-glutamin]
Die genannten Stoffe sind lyophil getrocknete weiße hygroskopische Pulver, die in Wasser, physiologischer Lösung, Methanol, 50%-igem Äthanol löslich und in Äther, Benzol, Petroläther und Chloroform unlöslich sind. Die genannten Verbindungen zeigen biologische Aktivität. Nach dem Charakter
der biologischen Aktivität unterscheiden sich diese Glykopeptide grundsätzlich von den antitumoralen Stoffen, die gegenwärtig in der onkologischen Praxis verwendet werden. Die verwendeten Präparate bewirken in der Regel eine Hemmung des Tumorwachstums, wobei diese Eigenschaft in größerem Maße in frühen Stufen der Entwicklung der bösartigen Neubildung in Erscheinung tritt, d.h. die verwendeten Präparate sind bei der Behandlung früherer Stufen der Erkrankung wirksam. Sie sind praktisch alle zytotoxisch auch für die Zellen normaler Gewebe, besitzen häufig immuno-depressive Eigenschaften und unterdrücken die Hämopoese. Zum Unterschied davon tritt die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen synthetischen Glykopeptide in rascher selektiver Nekrotisierung des stark entwickelten Tumors und in der weiteren Hemmung des Tumorwachstums bereits nach einmaliger Injektion in Erscheinung. Die normalen Gewebe werden dabei nicht geschädigt. Alle erfindungsgemäßen Glykopeptide sind wenig toxisch und bewirken keine Unterdrückung der Hämopoese.
Die biologischen Prüfungen wurden an Mäusen mit achttägigem Sarkom S-180 durchgeführt: intravenöse Injektion (Dosis 50 bis 100 mg/kg), Auswertung der Nekrose nach 24 Stunden (4 bis 6 nach einer von 0 bis 6 reichenden Skala) und Messung des Volumens (oder des Gewichtes) der Geschwulst nach 4 bis 5 Tagen (Hemmung des Wachstums bis 70 %). So beobachtet man beispielsweise bei einmaliger intravenöser Verabreichung des N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramylalanyl-D-iso-glutamins (Verbindung II) an Mäusen mit achttä-
gigem Sarkom S-180 (stark entwickelte Geschwulst) in einer Dosis von 100 mg/kg bei vier von fünf Versuchstieren 24 Stunden nach der Applikation eine selektive Nekrose des Geschwulstgewebes, die praktisch die ganze Geschwulst umfaßt, während nach 5 Tagen eine Hemmung des Wachstums der bösartigen Neubildung um 70 % gegenüber den Kontrolltieren beobachtet wird. Dabei wird keine toxische Wirkung beobachtet, die Hämopoese ist nicht gestört und die Leukozytenzahl ist bedeutend vergrößert.
Es wurde diesseits gezeigt, daß die Bestandteile der oben genannten Glykopeptide: N-Acetylglukosamin (VI), N-Acetylmuramsäure (VII), N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure (VIII), N-Acetylglukosaminyl (1-->4),N-acetylmuramyl/1-->4/N-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure (IX) sowie die bei der Synthese der Verbindungen I bis V verwendeten Peptide:
Ala-D-Glu-NH[tief]2 (X), Ala-D-Glu (XI) und
(XII)
keine Nekrose hervorrufen.
Alle diese Angaben sind in der nachstehend angeführten Tabelle dargestellt.
Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend folgende Beispiele für die Herstellung der Glykopeptide angeführt.
Die Schmelzpunkte wurden im Kofler-Block bestimmt (die Temperaturen sind korrigiert). Die Aminosäure- und Aminozuckeranalyse wurde auf dem automatischen Aminosäureanalysator
Liquimat der Firma Labotron durchgeführt. Die Drehwinkel wurden auf dem Polarimeter Perkin-Elmer 141 bestimmt. Als Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie dienten: (A) n-Butanol/Äthanol/Wasser (3:6:1), (B) n-Butanol/Eisessig/Wasser (3:1:1), (C) n-Butanol/Eisessig/Wasser (2:1:1).
Beispiel 1
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanin (I)
a) Einer Lösung von 160 mg (0,33 mMol) N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure in 8 ml Dimethylformamid gibt man bei einer Temperatur von 0° 0,05 ml Triäthylamin und 150 mg (0,45 mMol) Woodward-Reagens K zu, rührt während 1 Stunde bei einer Temperatur von 0° und dann während 1 Stunde bei einer Temperatur von 20° bis zur vollständigen Auflösung. Man tropft unter Rühren während 15 Minuten eine Lösung von 90 mg (0,3 mMol) Alaninnitrobenzylesterhydrobromid und 0,05 ml Triäthylamin in 4 ml Dimethylformamid zu und rührt während 20 Stunden bei Zimmertemperatur. Den nach dem Eindampfen im Vakuum erhaltenen Rückstand löst man in 1 ml 50%-igem wässerigem Äthanol auf und leitet durch eine Säule (10 ml) mit Dowex 50 x 8 (H[hoch]+-Form) und dann durch eine Säule (10 ml) mit Dowex 1 x 8 (CH[tief]3COO[hoch]--Form) durch, indem man in beiden Fällen mit 50%-igem wässerigem Äthanol eluiert. Den nach dem Eindampfen des Eluates erhaltenen Rückstand fällt man aus Methanol mit Äther um. Man erhält 80 mg (33,0 %) Nitrobenzylester von N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramylalanin. 50 mg desselben löst man in 75%-iger wässeriger Essigsäure auf und hydriert über Pd-Schwarz während 6 Stunden. Den Katalysator filtriert man ab und fällt den nach dem Eindampfen erhaltenen
Rückstand aus Methanol mit Äther um. Man erhält 30 mg (80 %) Produkt (I).
Gefunden, %: C 44,41; H 6,78; N 7,06.
Berechnet, % für C[tief]22H[tief]37N[tief]3O[tief]14.1,5 H[tief]2O:
C 44,44; H 6,78; N 7,07.
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl, 100°, 16 Stunden) Ala:Mur:GlcNH[tief]2 1:1,08:1,1 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 16 Stunden Hydrolyse).
[kleines Alpha][hoch]18°[tief]D - 3,5° (Konzentration 0,5) . H[tief]2O), Schmelzpunkt 150° (Zersetzung). Dünnschichtchromatographie: R[tief]f = 0,45, Laufmittel A.
b) Einer Lösung von 0,16 g (0,33 mMol) N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure und 0,045 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid gibt man unter Rühren bei einer Temperatur von -15° 0,045 ml (0,33 mMol) Isobutylchlorformiat zu. Nach 2 Minuten gibt man eine auf eine Temperatur von -15° abgekühlte Lösung von 0,07 g (0,22 mMol) Alaninnitrobenzylesterhydrobromid und 0,036 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zu. Die Lösung hält man unter Rühren bei einer Temperatur von -15° während 3 Stunden. Den nach dem Eindampfen im Vakuum erhaltenen Rückstand unterwirft man einer Reinigung analog zu dem in Beispiel 1a beschriebenen und erhält 24 mg (32 %) Nitrobenzylester von N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramylalanin. Nach der Entfernung der Schutzgruppe analog zu dem in Beispiel 1a beschriebenen erhält man 17 mg (80 %) Produkt I.
Beispiel 2
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-iso-glutamin (II)
Die Kondensation führt man analog zu Beispiel 1a, ausgehend von 130 mg (0,3 mMol) Benzylester von Alanyl-D-iso-glutamintrifluoracetat, durch. Das Reaktionsgemisch dampft man auf ein kleines Volumen (etwa 1 ml) ein, filtriert den mit n-Butanol ausgefällten Niederschlag ab und löst in 1 ml 50%-igem wässerigem Äthanol auf, führt dann die Reinigung analog zu Beispiel 1 durch und erhält 75 mg (31 %) Benzylester von N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-iso-glutamin.
Die Hydrogenolyse führt man über Pd-Schwarz analog zu Beispiel 1 durch, ausgehend von 50 mg des genannten Benzylesters. Man erhält 36 mg (81 %) Produkt (II).
Gefunden, %: C 39,64; H 7,11; N 8,41.
Berechnet für C[tief]27H[tief]45N[tief]5O[tief]16.7H[tief]2O, %:
C 39,22; H 7,23; N 8,51.
Molekulargewicht 695, 697.
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl, 100°, 16 Stunden) Ala:Glu:Mur:GlcNH[tief]2 1:0,81:1,01:1,02; (6n-HCl, 100°, 24 Stunden) 1:0,96:1,2 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 16 Stunden bzw. 24 Stunden)
[kleines Alpha][hoch]20°[tief]D + 2,8° (Konzentration 0,5; H[tief]2O; nach 5 Minuten), 0° (Konzentration 0,5; H[tief]2O; nach 22 Stunden), Schmelzpunkt 170° (Zersetzung), Dünnschichtchromatographie: R[tief]f = 0,3 (Laufmit-
tel A), R[tief]f = 0,45 (Laufmittel C).
Beispiel 3
N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-glutaminsäure (III).
Die Kondensation und die Behandlung des Reaktionsgemisches führt man analog zu Beispiel 1a durch, ausgehend von 310 mg (0,6 mMol) Dibenzylester des Alanyl-D-glutaminsäure-trifluoracetats. Man erhält 200 mg (38 %) Dibenzylester der N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-glutaminsäure, und erhält nach der Entfernung der Benzylschutzgruppen durch Hydrogenolyse über Pd-Schwarz aus 100 mg des genannten Dibenzylesters 64 mg (80 %) Produkt (III).
Gefunden, %: C 43,00; H 6,71; N 7,30.
Berechnet, % für C[tief]27H[tief]44N[tief]4O[tief]17.3H[tief]2O:
C 43,19; H 6,71; N 7,46.
Molekulargewicht 696, 681.
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl, 100°, 24 Stunden) Ala:Glu:Mur:GlcNH[tief]2 1,04:1,00:0,96:1,00 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 24 Stunden).
[kleines Alpha][hoch]18°[tief]D - 4,2° (Konzentration 0,5; H[tief]2O), Schmelzpunkt 170° (Zersetzung), Dünnschichtchromatographie: R[tief]f = 0,2 (Laufmittel A).
Beispiel 4
Amid von N[hoch]kleines Epsilon-[N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-glutamyl-D-iso-asparaginyl]-lysyl-D-alanin (IV)
Die Kondensation wird analog zu Beispiel 1a durchgeführt, ausgehend von 300 mg (0,34 mMol) Trifluoracetat von N[hoch]kleines Alpha-
Carbobenzoxy-N[hoch]kleines Epsilon-[alanyl-/kleines Gamma-benzyl/-D-glutamyl-D-iso-asparaginyl]-lysyl-D-alaninamid. Das Reaktionsgemisch dampft man auf ein Volumen von etwa 1 ml ein, fällt das Kondensationsprodukt mit Wasser aus, wäscht mit Wasser, Methanol und Äther. Man erhält 136 mg (27 %) Amid von N[hoch]kleines Alpha-Carbobenzoxy-N[hoch]kleines Epsilon-[N-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-(kleines Gamma-benzyl)-D-glutamyl-D-iso-asparaginyl]-lysyl-D-alanin, entfernt die Benzyloxycarbonyl- und die Benzylschutzgruppe durch Hydrogenolyse über Pd-Schwarz und erhält danach aus 50 mg 35 mg (83 %) Produkt (IV).
Gefunden, %: C 52,32; H 6,55; N 11,00.
Berechnet für C[tief]55H[tief]80N[tief]10O[tief]22.1,5H[tief]2O, %:
C 52,41; H 6,63; N 11,11.
Molekulargewicht 1233, 32.
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl; 100°; 16 Stunden) Asp:Lys:Glu:Ala:Mur:GlcNH[tief]2 1,00:0,96:1,04:2,20:1,00:0,80 (unter Berücksichtigung der Zersetzung für 16 Stunden). Dünnschichtchromatographie: R[tief]f = 0,3 Laufmittel B).
Beispiel 5
/1-->4/-Bis-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-D-iso-glutamin (V)
Die Kondensation wird analog zu Beispiel 1a durchgeführt, ausgehend von 243 mg (0,25 mMol) N-Acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl/1-->4/N-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramsäure und 210 mg (0,5 mMol) Trifluoracetat von Benzylester des Alanyl-D-iso-glutamins. Das Reaktionsgemisch dampft man auf ein Volumen von etwa 1 ml ein, gibt 80 % Was-
ser zu, filtriert und leitet hintereinander durch eine Säule mit Dowex 50 x 8 (H[hoch]+-Form) und eine Säule mit Dowex 1 x 8 (CH[tief]3COO[hoch]--Form) durch. Das erhaltene ungereinigte Kondensationsprodukt in einer Menge von 50 mg trennt man auf präparativen Platten "Merck" im Laufmittel n-Butanol/Äthanol/Wasser (3:6:1). Man erhält 18 mg /1-->4/-Bis-[N-acetylglukosaminyl/1-->4/N-acetylmuramyl-alanyl-/kleines Gamma-benzyl/D-iso-glutamin], entfernt die Benzylschutzgruppen und erhält danach 10 mg Produkt V.
Gefunden, %: C 44,01; H 6,74; N 9,44.
Berechnet für C[tief]53H[tief]86N[tief]10O[tief]29.6H[tief]2O, %:
C 44,34; H 6,88; N 9,76.
Molekulargewicht 1327, 351.
Aminosäure- und Aminozuckeranalyse (6n-HCl; 100°; 16 Stunden) Ala:Glu:Mur:GlcNH[tief]2 1,00:1,01:1,00:1,05. Dünnschichtchromatographie: R[tief]f = 0,1 (Laufmittel C).
Tabelle
| Tabelle (Fortsetzung) |
Claims (7)
1. Glykopeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie die allgemeine Formel I
worin n = 1 oder 2, R für den Rest einer Aminosäure oder eines Peptids steht, aufweisen.
2. Glykopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in diesem n = 1, R für Ala steht.
3. Glykopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in diesem n = 1, R für Ala-D-Glu-NH[tief]2 steht.
4. Glykopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in diesem n = 1, R für Ala-D-Glu steht.
5. Glykopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in diesem n = 1, R für
steht.
6. Glykopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in diesem n = 2, R für Ala-D-Glu-NH[tief]2 steht.
7. Verfahren zur Herstellung der Glykopeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kondensationsreaktion ungeschützter muramylhaltiger N-Acetylaminozucker der allgemeinen Formel II
worin n = 1 oder 2, mit geschützten Aminosäuren oder Peptiden durch Aktivierung der Carboxylgruppe der genannten Aminozucker der Formel II durchführt.
Applications Claiming Priority (1)
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