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Herstellung und Gewinnung eines Actinomycin-U-Gemisches Die Erfindung
betrifft die Herstellung und Gewinnung eines Actinomycin-U-Gemisches.
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Als Actinomycine sind rote, kristalline, antibiotisch wirksame Stoffwechselprodukte
aus Streptomyceten bekanntgeworden, z. B. unter anderem Actinomycin A aus Streptomyces
antibioticus (vgl. USA.-Patentschrift 2 378 876), Antinomycin C aus Streptomyces
chrysomallus (vgl. deutsche Patentschrift 912 010) oder Actinomycin H aus Streptomyces
SV 1784 (vgl. deutsche Auslegeschrift 1060 091).
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Actinomycine können auch durch dirigierte Biosynthese aus actinomycinbildenden
Streptomyceten erhalten werden, wenn zum Nährmedium dieser Stämme Aminosäuren oder
Aminosäurederivate zugesetzt werden. Diese durch dirigierte Biosynthese gewonnenen
Actinomycine sind verschieden von den Actinomycinen, die vom gleichen Stamm ohne
Zusatz von Aminosäuren oder Aminosäurederivaten gebildet werden (vgl. deutsche Patentschrift
944 395); z. B. werden durch Zugabe von Sarkosin zur Nährlösung des Actinomycin-C-Bildners
Streptomyces BoP 476, NRRL 2580 die F-Actinomycine erhalten (vgl. deutsche Auslegeschrift
1021 131).
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Als Stoffwechselprodukt des Streptomyces umbrosus NRRL 2791 ist ein
gegen Pilze und Bakterien wirksames »Phyllomycin« genanntes Antibioticum bekanntgeworden,
das aus der Kulturlösung durch Butylacetatextraktion und Gegenstromverteilung gewonnen
werden kann und das aus Methylpropylketon in Form rosettenförmig angeordneter farbloser
Nadeln vom F. 177 bis 178,5° C (unkorrigiert) kristallisiert (deutsche Patentschrift
1061964).
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Zur Gewinnung des Phyllomycins wird Streptomyces umbrosus auf einem
Nährmedium mit 2°/0 Glycerin, 1 °/« Trockenbierhefe, 0,250/, Glykokoll,
0,10/0 Natriumchlorid, 0,10i, sek. Kaliumphosphat, 0,02 °/o Eisen
(11)-sulfat - 7 HZ O und 0,02"/, Magnesiumsulfat - 7 H20 (mit Leitungswasser ad
100°/o aufgefüllt) etwa 72 Stunden bei 29° C kultiviert.
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Es wurde nun gefunden, daß von dem gleichen Stamm unter Verwendung
von Sojamehl als Stickstoffquelle wenig oder gar kein Phyllomycin, sondern vielmehr
ein Actinomycingemisch gebildet wird, das Komponenten enthält, die von allen bisher
bekannten Actinomycinen verschieden sind. Dieses Actinomycingemisch wurde nach der
Stammbezeichnung Streptomyces umbrosus Actinomycin-U-Gemisch benannt.
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Zur Herstellung des Actinomycin-U-Gemisches wird Streptomyces umbrosus
auf einem Nährmedium, welches aus 20/, Sojamehl, 0,4°,i, Trockenbierhefe, 2'/, Glycerin
und 0,15"/, Calciumcarbonat (mit Leitungswasser auf 1000/, aufgefüllt), dem
als Antischaummittel 0,10/, Siliconöl zugesetzt werden kann, gezüchtet. Der pH-Wert
der Nährlösung soll etwa 6,5 bis 7,5 betragen. Bevorzugt wird ein px-Wert von 7,0,
der vor dem Sterilisieren des Nährmediums eingestellt wird.
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Geringe Mengen des Actinomycin-U-Gemisches und Impfmaterial für mengenmäßig
größere Fermentationen lassen sich durch Kultivierung des Streptomyces umbrosus
im Schüttelkolben oder in der Oberflächenkultur erzeugen.
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Zur Herstellung größerer Mengen des Actinomycin-U-Gemisches wird Streptomyces
umbrosus submers unter aeroben Bedingungen in dafür geeigneten Fermentationsanlagen
kultiviert.
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Die Herstellung des Actinomycin-U-Gemisches ist nicht auf die Verwendung
des Streptomyces umbrosus beschränkt, sondern umfaßt auch Mutationen dieses Stammes,
die durch Einwirkung von Mutationsmitteln, z. B. von Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen
und chemischen Substanzen erhalten werden.
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Das Actinomycin-U-Gemisch ist in der Kulturlösung und im Mycel des
Streptomyces umbrosus enthalten. Aus dem Mycel wird es nach Autolyse durch Extraktion
mit Äthern, Estern oder Alkoholen,
insbesondere mit Essigsäureäthylester
oder Essigsäurebutylester gewonnen. Entsprechend wird das Actinomycin-U-Gemisch
aus der Kulturlösung erhalten. Auch hier sind Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester
die zweckmäßigsten Extraktionsmittel, jedoch können auch chlorierte Kohlenwasserstoffe,
Ketone und Alkohole angewendet werden. Die Extrakte des Mycels und der Kulturlösung
werden vereint und die Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der zähflüssige, hauptsächlich
Öle und Fette enthaltende Rückstand wird in Di-n-butyläther oder in einem entsprechenden
Lösungsmittel gelöst, eine größere Menge eines Kohlenwasserstoffs, z. B. Ligroin,
zugesetzt und dieses Gemisch mit einer wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren Natriums
ausgeschüttelt. Das Actinomycin wird von der wäßrigen Phase aufgenommen, während
alle lipophilen Begleitsubstanzen und das zur Fermentation zugesetzte Antischaummittel
in der Di-n-butyläther-Ligroin-Phase verbleiben. Das Actinomycin-U-Gemisch ist in
Ligroin sehr schwer löslich. Die Verwendung eines Ligroinüberschusses bewirkt die
Verdrängung des Actinomycin-U-Gemisches aus der Di-n-butyläther-Ligroin-Phase. In
Wasser ist das Actinomycin-U-Gemisch ebenfalls sehr schwer löslich. Die Löslichkeit
des Actinomycin-U-Gemisches im Wasser wird jedoch durch das als Lösungsvermittler
wirkende Natrium-m-kresotinat erhöht (vgl. deutsche Patentschriften 930 579 und
934715).
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Mit Essigester oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel wird das
Actinomycin-U-Gemisch aus der wäßrigen Kresotinatphase extrahiert, nachdem vorher
die Wirksamkeit des Lösungsvermittlers durch Verdünnen mit Wasser herabgesetzt worden
ist. Der Essigesterextrakt kann im Vakuum konzentriert und aus ihm das Actinomycin-U-Gemisch
kristallin erhalten werden. Unter Umständen ist es zweckmäßig, das Actinomycin-U-Gemisch
vor der Kristallisation aus benzolischer Lösung über Aluminiumoxyd zu chromatographieren.
Das Actinomycin-U-Gemisch kristallisiert aus Essigester in Gegenwart von Kohlenwasserstoffen,
z. B. von Petroläther, in roten, rechteckig dünnen Plättchen.
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Zur Analyse der Zusammensetzung von Actinomycin-U-Gemischen wird die
Ringverteilungschromatographie auf Papier angewendet. Als Papiere werden faserrichtungsfreie
Rundfilterpapiere, z. B. das Papier 2043b der Firma Schleicher & Schüll, verwendet.
Das Actinomycin-U-Gemisch wird in der Mitte des Papiers als Kreis aufgetragen, das
Papier mit der wäßrigen Phase des Verteilungssystems besprüht und zwischen Unterteil
und Deckel eines großen Exsikkators gelegt. Aus einem Scheidetrichter wird die organische
Phase in die Mitte des Chromatogramms eingetropft. Das eingetropfte Lösungsmittel
wandert über das angefeuchtete Papier zum Rand des Exsikkators. Als Verteilungssystem
können Mischungen aus einem Äther, z. B. Di-n-butyläther oder Di-iso-propyläther,
einem Ester, z. B. Amylacetat, Butylacetat oder Äthylacetat, einem Alkohol, z. B.
Butanol, Propanol oder i-Propanol, und einer wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren
Natriums verschiedener Konzentrationen verwendet werden. Bevorzugt wird ein Verteilungssystem,
das durch Mischen von 1 Volumteil Amylacetat und 1 Volumteil einer 10°/oigen wäßrigen
Lösung des m-kresotinsauren Natriums erhalten wird. Die Lage der einzelnen Actinomycinzonen
im Chromatogramm wird durch den Re,-Wert angegeben. Der R02-Wert errechnet sich
durch Division der Weglänge der betreffenden Komponente durch die Weglänge des Actinomycins
C2. Actinomycin C2 wird hier als Bezugssubstanz aller chemischen oder biologischen
Daten der Actinomycine verwendet.
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Das Actinomycin-U-Gemisch besteht nach der Analyse im Ringverteilungschromatogramm
aus zwei Hauptkomponenten (Anteil am Gemisch >100/,)
den Actinomycinen U3
und U4 und aus zwei Nebenkomponenten (Anteil am Gemisch > 1 % und < 10
°/o), den Actinomycinen U, und U2 mit den Re2-Werten: Actinomycin U, = 0,32, Actinomycin
U2 = 0,45, Actinomycin U3 = 0,73, Actinomycin U4 = 1,18 (Verteilungssystem:
1 Volumteil Amylacetat und 1 Volumteil einer 10°/oigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren
Natriums [vgl. Abb. 1]). Außer den beiden Hauptkomponenten U3 und U4 und den Nebenkomponenten
U, und U2 sind nach der papierchromatographischen Analyse im Actinomycin-U-Gemisch
noch zwei Spurenkomponenten (Anteil am Gemisch < 1 °/o) mit größeren R"-Werten
als Actinomycin U4 und vier Spurenkomponenten mit kleineren Re2-Werten als Actinomycin
U, enthalten. Die Numerierung der Actinomycinkomponenten erfolgt in der Laufrichtung
des Lösungsmittels. Das kristallisierte Actinomycin-U-Gemisch wird durch Adsorptionschromatographie
an Aluminiumoxyd und Verteilungschromatographie an Zellulosepulver in seine Komponenten
getrennt.
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Zur Chromatographie an Aluminiumoxyd wird das Actinomycin-U-Gemisch
in Benzol gelöst, über eine mit Benzol eingeschlämmte Aluminiumoxydsäule gegeben
und die Säule mit einem Gemisch aus Benzol-Essigester, vorzugsweise im Volumenverhältnis
55:45, nachgewaschen. Dabei entwickeln sich zwei Hauptzonen, die fraktioniert eluiert
werden. Nach Abdampfen der Lösungsmittel im Vakuum wird aus der mit Benzol-Essigester
schneller wandernden Hauptzone das Actinomycin-U-Gemisch-1. Zone, aus der mit Benzol-Essigester
langsamer wandernden Hauptzone das Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone erhalten. Das Actinomycin-U-Gemisch-1.
Zone enthält nach der papierchromatographischen Analyse Actinomycin U4 als Hauptkomponente
und Actinomycin U2 als Nebenkomponente, das Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone Actinomycin
U3 als Hauptkomponente und Actinomycin U, als Nebenkomponente sowie in geringer
Menge Actinomycin U4 (vgl. Abb. 1).
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Die reinen U-Komponenten werden aus dem Actinomycin-U-Gemisch-1. Zone
und dem Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone durch Verteilungschromatographie an Zellulosepulver
hergestellt. Als Verteilungssysteme finden Mischungen aus einem Äther, z. B. Di-n-butyläther,
Di-n-propyläther oder Di-isopropyläther, und/oder einem Ester, z. B. Amylacetat,
Butylacetat oder Äthylacetat, und/oder einem Alkohol, z. B. Butanol, Propanol oder
iso-Propanol, und einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der m-Kresotinsäure, vorzugsweise
eine Mischung aus 3,5 Volumteilen Amylacetat, 0,5 Volumteilen Di-n-butyläther, 1
Volumteil Propanol und 5 Volumteilen einer 12°/oigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren
Natriums Verwendung. Mit der wäßrigen Phase des Verteilungssystems wird das Zellulosepulver,
z. B. Zellulosepulver der Firma Schleicher. & Schüll Nr.123 b, zu einem luftblasenfreien
Brei angerührt, der Brei unter Schütteln und Klopfen in ein Chromatographierohr
eingefüllt
und die organische Phase unter Anwendung eines geringen Überdruckes so lange durch
die Säule filtriert, bis die Erstanteile der organischen Phase aus der Säule tropfen.
Das zu trennende Actinomycin-U-Gemisch wird in einer möglichst geringen Menge der
organischen Phase des Verteilungssystems gelöst, die Lösung auf die Säule aufgetragen
und durch Nachgeben der organischen Phase entwickelt.
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Nach Trennung der Komponenten wird die Zellulosepulversäule aus dem
Chromatographierohr herausgedrückt, entsprechend der Fraktionierung in einzelne
Zonen zerschnitten, die Zonen aus dem Zellulosepulverbrei mit Essigester oder einem
anderen geeigneten Lösungsmittel extrahiert, der Extrakt filtriert und im Vakuum
zur Trockne destilliert. Aus den Zonen des Actinomycin-U-Gemisches-l. Zone werden
die reinen Komponenten U4 und U2, aus den Zonen des Actinomycin-U-Gemisches-2. Zone
die reinen Komponenten U3 und Ui gewonnen, die aus Essigester nach Zusatz von Petroläther
kristallisiert werden. Der Anteil der nach vorstehendem Verfahren hergestellten
einzelnen Komponenten beträgt: 55,5°/o Actinomycin U3, 40,50/0 Actinomycin U4, 2,00/0
Actinomycin U1 und 2,00/0 Actinomycin U2. Die Actinomycine U3 und U4 kristallisieren
aus Essigester-Petroläther in roten dünnen rechteckigen Plättchen. Die Elementaranalyse
der im Hochvakuum bei 50°C getrockneten Präparate ergab für Actinomycin U3: 56,35
0/0 C, 7,310/0 H, 13,00 0/0 N, 23,48 0/0 O (e = 100,32°/o; 0,0°/o Verbrennungsrückstand),
für Actinomycin U4: 57,04 °/" C, 6,75 0/0 H, 13,03 0/0 N, 23,480/, O (E =
100,3001,; 0,00/, Verbrennungsrückstand).
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Die Ultraviolettspektren der beiden Actinomycine U3 und U4 (vgl. Abb.
2) sowie das Ultrarotspektrum des Actinomycins U3 (vgl. Abb. 3) und das Ultrarotspektrum
des Actinomycins U4 (vgl. Abb.4) sind typische Actinomycinspektren. Für den spezifischen
Extinktionskoeffizienten x (= Extinktion für c = 1 g pro Liter und d = 1 cm) in
Benzol bei 2 = 452,5 mi, wird für Actinomycin U3 A = 19,20, für Actinomycin U4 x
= 19,63, für den spezifischen Extinktionskoeffizienten in Äthanol bei = 446 m#t
für Actinomycin U3 = 18,8 und für Actinomycin U4 = 18,7 gemessen. Actinomycin U3
absorbiert im ultraroten Bereich bei folgenden Wellenlängen (KBr-Preßling; die Werte
in Klammern geben die prozentuale Durchlässigkeit an) : 2,95 bis 3,00 (42,0 0/0),
3,07 (42,10/0), 3,37 (50,2°/0), 5,73 (31,3°/0), 6,10 (12,0°/0), 6,34 (16,80/0),
6,63 bis 6,70 (23,80/0) 6,75 (2Ö,90/0), 7,15 (44,00/0), 7,42 (46,70/0), 7,64 (41,00/0),
7,75 (40,80/0), 7,87 bis 7,94 (44,70/0), 8,06 (52,30/,), 8,44 (30,00/,) und 9,17#L
(49,80/0). Actinomycin U4 absorbiert im ultraroten Bereich bei: 2,93 bis 3,00 (44,90/0),
3,07 (46,30/,), 3,39 (50,0 0/0), 5,73 (32,90/,), 6,03 bis 6,10 (14,40/0), 6,32 (17,2°/0)
6,65 (26,0°/0) 6,77 (23,7°/0) 7,16 (45,10/,), 7,40 (44,80/,), 7,63 (42,20/,),
7,73 (41,50/0), 7,85 bis 7,93 (45,70/0), 8,44 (29,90/0) und 9,17 #t (48,10/0).
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Die Actinomycine U3 und U4 enthalten als Chromopeptide neben einem
Phenoxanzonring als chromophoren Teil je zwei Peptid-Lactonseitenketten. Zur Bestimmung
der qualitativen Animosäurezusammensetzung der Peptid-Lactonseitenketten werden
die Actinomycine U3 und U4 mit konzentrierter Salzsäure 24 Stunden bei 110°C im
Einschlußrohr hydrolysiert und das Hydrolysat in verschiedenen Lösungsmittelsystemen
papierchromatographisch untersucht. Zur Erkennung der Aminosäuren auf dem Papierchromatogramm
wird dieses mit Ninhydrin oder mit spezifischen Reagenzien, z. B. mit Isatin, zur
Erkennung von Prolin oder Hydroxyprolin besprüht. Im Hydrolysat des Actinomycins
U3 werden Threonin, Sarkosin, Valin, N-Methylvalin und eine noch unbekannte Aminosäure,
im Hydrolysat des Actinomycins U4 Threonin, Sarkosin, Prolin, Valin und N-Methylvalin
gefunden. Beide Actinomycine enthalten unter anderem weder Isoleucin noch N-Methylalanin.
Actinomycin U3 unterscheidet sich von den Actinomycinen Cl, C2, C3, 1, X0, Xi, X2,
F2, F4, Ei, EZ durch das Fehlen von Prolin. Prolinfreie Actinomycine werden durch
dirigierte Biosynthese erhalten, z.B. die Actinomycine F1 und F3 durch dirigierte
Biosynthese des Streptomyces BoP 476, NRRL 2580 auf Nährböden mit Sarkosin als Stickstoffquelle
(vgl. deutsche Auslegeschrift 1021 131), oder z. B. Actinomycin H durch Kultivierung
des Streptomyces SV 1784, NRRL (vgl. deutsche Auslegeschrift 1060 091) Actinomycin
F1 enthält die Aminosäuren Threonin, Sarkosin, Valin, Isoleucin und N-Methylvalilin,
Actinomycin F3 die Aminosäuren Threonin, Sarkosin, Isoleucin und N-Methylvalin,
Actinomycin H die Aminosäuren Threonin, Sarkosin, Valin, N-Methylalanin und N-Methylvalin.
Actinomycin U3 unterscheidet sich von den Actinomycinen F1 und F3 durch das Fehlen
von Isoleucin im Actinomycin U3 und vom Actinomycin H durch das Fehlen von N-Methylalanin
im Actinomycin U3. Actinomycin U4 unterscheidet sich von den Actinomycinen C2, C3,
F1, F2, F3, F4, El und EZ durch das Fehlen von Isoleucin im Actinomycin U4.
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Actinomycin U3 und Actinomycin U4 sind antibiotisch wirksam.
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Im Vergleich zum Aetinomycin C2 (= 1000/0) beträgt die Hemmwirkung
der Actinomycine U3 und U4 im Piattenlochtest gegen Bacillus subtilis ATCC 6633
= 1300/0. Die Hemmkurven (= log Konzentration gegen Hemmhofdurchmesser) beider Actinomycine
verlaufen parallel zur Hemmkurve des Actinomycins C2. Die Actinomycine U3 und U4
hemmen auch in hohen Verdünnungen das Wachstum unter anderem von Staphylococcus
aureus SG 511, Staphylococcus aureus Ddf.2512 (Penicillin-Streptomycin Tetracyclin
resistent), Staphylococcus aureus Ddf. 939 (Penicillin resistent), Staphylococcus
aureus 5763 (Streptomycin-Chloromycetin resistent), Enterococcus O Ddf., Streptococcus
faecalis ATCC 9790, Bacillus cereus ATCC 10 876, Sarcina lutea ATCC 9341 und Xanthomonas
mal vacearum ATCC 9924.
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Die Actinomycine U3 und U4 zeigen im Tierversuch bei experimentellen
Tumoren eine Hemmung des Tumorwachstums, z. B. hemmen beide Actinomycine unter anderem
das Wachstum des Sarkoms 37 der Maus, des Walker-Carcinoms und des Yoshida-Sarkoms
der Ratte. In den Tabellen 1, 2 und 3 sind die Ergebnisse dieser Tumorhemmung zusammengestellt.
In der zweiten Spalte der Tabellen wird die sechsmal an sechs aufeinanderfolgenden
Tagen gegebene Dosis in y/kg Körpergewicht, in der dritten Spalte die Sterblichkeit
(Zahl der verendeten Tiere/Zahl der Versuchstiere) und in der vierten Spalte die
durchschnittliche Tumorhemmung (durchschnittliches Tumorgewicht von sieben behandelten
Tieren in g/durchschnittliches Tumorgewicht von sieben Kontrolltieren in g) angegeben.
| Tabelle 1 |
| Sarkom 37 (Maus) |
| y/kg Sterblichkeit Durchschnittliche |
| Tumorhemmung |
| 50 4/5 -/2,9 |
| U 25 5/5 -/2,9 |
| 3 l2,5 1/5 0,4/2,9 |
| 6,5 0/5 0,8/2,9 |
| 50 0/5 0,4/2,9 |
| U 25 1/5 0,5/2,9 |
| 4 12,5 0/5 0,3/2,9 |
| 6,25 0/5 1,1/2,9 |
| Tabelle 2 |
| Walker-Ca (Ratte) |
| y/kg Sterblichkeit Durchschnittliche |
| Tumorhemmung |
| U3 ( 20 2/7 11,8/14,5 |
| ( 10 0/7 9,4/14,5 |
| 20 2/7 5,7/l4,5 |
| U4 10 0/7 7,4/14,5 |
| 5 1/7 9,9/14,5 |
| Tabelle 3 |
| Yoshida-Sarkom (Ratte) |
| y/kg Sterblichkeit |
| Durchschnittliche |
| Tumorhemmung |
| 20 7/7 -/7,4 |
| U3 10 7/7 -/7,4 |
| 5 2/7 2,4/7,4 |
| 2,5 0/7 1,6/7,4 |
| 20 7/7 -/7,4 |
| U4 10 2/7 l,2/7,4 |
| 5 0/7 2,4/7,4 |
| 2,5 0/7 |
| 4,7/7,4 |
Die Toxizität der Actinomycine U3 und Actinomycine U4 unter standardisierten Versuchsbedingungen
beträgt 0,2 mg/kg Maus i. v. Beide Actinomycine sind im Vergleich zum Actinomycin
C2 viermal toxischer. Die toxische Dosis für Actinomycin C2 unter gleichen Versuchsbedingungen
liegt bei 0,8 mg/kg Maus i.v.
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Nach der papierchromatographischen Analyse des Actinomycin-U-Gemisches,
das im Vergleich zum Actinomycin-C-Gemisch (Gemisch der Actinomycine C,, C2 und
C3), zum Actinomycin-X-Gemisch (Gemisch der Actinomycine XQ, X1 und X2), zum Actinomycin-F-Gemisch
(Gemisch der Actinomycine F1, F2, F3 und F4) und zu den Actinomycinen H und I in
dem Verteilungssystem: 1 Volumteil Amylacetat - 1 Volumteil lOQ/Qiges wäßriges Natrium-m-kresotinat,
geprüft wurden ist Actinomycin U3 verschieden von den Actinomycinen C,, C., C3,
I, XQ, XI, X2, F,, F3, F4 und H, Actinomycin U4 verschieden von den Actinomycinen
Cl, C2, C3, I, XQ, XI, X2, Fl, F2, F3 (vgl. Abb. 5). Nach der papierchromatographischen
Analyse der Actinomycine U3 und U4, im Vergleich zum Actinomycin-C-Gemisch und Actinomycin-F-Gemisch
in dem Verteilungssystem: 3 Volumteile Din-butyläther - 2 Volumteile Butanol - 5
Volumteile 8,5Q/Qiges wäßriges Natrium-m-kresotinat, ist Actinomycin U3 verschieden
von den Actinomycinen C,., C2, C3, F1, F., F3 und F4, Actinomycin U4 verschieden
von den Actinomycinen C2, C3, F2, F3 und F4 (vgl. Abb. 6).
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Beispiel 150 ccm einer Nährlösung der Zusammensetzung: 2"/,
entöltes Sojamehl, 0,4°/o Trockenbierhefe, 2 °/Q Glycerin, 0,15 Q/0 Calciumcarbonat,
0,10/, Siliconöl (mit Leitungswasser auf 1000/, aufgefüllt), werden in 1
1 Erlenmeyerkolben abgefüllt, die Kolben 20 Minuten bei 120°C sterilisiert, nach
dem Abkühlen mit einer Sporenaufschwemmung des Streptomyces umbrosus beimpft und
auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 240 Umdr./Min. 48 Stunden bei 28 bis 29'C
kultiviert.
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Mit der auf Erlenmeyerkolben gezüchteten Vorkultur wird ein 1000-1-Fermenter,
mit 7001 Nährlösung der Zusammensetzung: 2Q/0 entöltes Sojamehl, 0,4°/Q Trockenbierhefe,
2 °/Q Glycerin, O,15% Calciumcarbonat, 0,10/, Siliconöl (mit Leitungswasser auf
1000/, aufgefüllt), beschickt und an zwei aufeinanderfolgenden Tagen je 20 Minuten
bei 120°C sterilisiert, beimpft und bei einem Luftdurchtritt von 3501 pro Minute
90 Stunden bei 28 bis 29°C kräftig gerührt.
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Die so erhaltene Kulturlösung wird auf einer Zentrifuge vom Mycel
befreit. Das Kulturfiltrat wird mit Butylacetat im Volumenverhältnis 2: 1 extrahiert
und der schmutzig gelb gefärbte Butylacetatextrakt im Vakuum bei 50°C auf etwa 3
bis 41 konzentriert. Das abgeschleuderte Mycel wird mit wenig Alkohol durchgeknetet,
etwa die halbe Menge an getrocknetem Natriumsulfat hinzugegeben und das mit Natriumsulfat
vermengte Mycel mit einer ausreichenden Menge Butylacetat überschichtet. Nach längerem
Stehen des Mycel-Natriumsulfat-Gemisches wird das überstehende gelbgefärbte Butylacetat
abgesaugt und im Vakuum bei 50°C eingeengt. Beide Butylacetatkonzentrate werden
vereinigt und die restlichen Lösungsmittelmengen im Vakuum entfernt.
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Zu 1 Volumteil der vereinigten Konzentrate werden in der angegebenen
Reihenfolge in einem großen Scheidetrichter 1 Volumteil Di-n-butyläther, 2 Volumteile
Ligroin und 4 Volumteile einer 12,5Q/Qigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren
Natriums gegeben. Die so erhaltenen zwei Lösungsmittelphasen werden längere Zeit
geschüttelt, die wäßrige Phase abgetrennt und die organische Phase nochmals mit
2 Volumteilen einer 12,5Q/Qigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren Natriums durchgeschüttelt.
Die beiden wäßrigen Extrakte werden vereinigt. Zu 1 Volumteil des wäßrigen Extraktes
werden 3 Volumteile Wasser und 1,5 bis 2,0 Volumteile Essigester gegeben und abermals
durchgeschüttelt. Nach Trennung beider Phasen wird die wäßrige Phase noch zweimal
mit je 1 Volumteil Essigester ausgeschüttelt, die drei Essigesterphasen vereinigt,
die vereinigten Essigesterextrakte zweimal
mit Wasser durchgeschüttelt
und der Essigester im Vakuum bei 40°C abdestilliert. Der verbleibende dunkelrote
Rückstand wird in warmem Benzol gelöst und nach dem Abkühlen an eine mit Benzol
eingeschlämmte Aluminiumoxydsäule absorbiert. Durch Waschen der Säule mit Essigester
wird das Actinomycin-U-Gemisch eluiert und nach Entfernung der Hauptmenge des Essigesters
im Vakuum durch Zugabe eines Ligroinüberschusses gefällt. Das Actinomycin-U-Gemisch
enthält als Hauptkomponenten die Actinomycine U3 und U4, als Nebenkomponenten die
Actinomycine U1 und UZ (vgl. Abb. 1).
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Zur Reindarstellung der Actinomycin-U-Komponenten wird das Actinomycin-U-Gemisch
in Benzol-Essigester (Volumenverhältnis 55: 45) gelöst und über eine mit
Benzol eingeschlämmte Aluminiumoxydsäule gegeben. Beim Nachwaschen mit Benzol-Essigester
(Volumenverhältnis 55: 45) werden zwei Hauptzonen erhalten, die fraktioniert aufgefangen
werden. Nach Abdampfen des Lösungsmittelgemisches im Vakuum werden aus der ersten,
schneller wandernden Zone 5,3 g Actinomycin-U-Gemisch-1. Zone und aus der zweiten,
langsamer wandernden Zone 6,95 g Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone erhalten.
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Das Actinomycin-U-Gemisch-l. Zone enthält als Hauptkomponente Actinomycin
U4, als Nebenkomponente U2, das Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone als Hauptkomponente
U3, als Nebenkomponente Actinomycin U1 (vgl. Abb. 1). In untergeordneter Menge ist
in der zweiten Zone noch Actinomycin U4 nachweisbar. Die reinen Actinomycine werden
aus dem Actinomycin-U-Gemisch-1. Zone und aus dem Actinomycin-U-Gemisch-2. ZonedurchVerteilungschromatographie
an Zellulosepulver hergestellt. Als Verteilungssystem wird ein Gemisch aus 3,5 Volumteilen
Amylacetat, 0,5 Volumteilen Di-n-butyläther, 1,0 Volumteilen Propylalkohol und 5,0
Volumteile einer 12°/oigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren Natriums verwendet.
Mit der wäßrigen Phase dieses Systems wird Zellulosepulver (Schleicher & Schüll
Nr. 123 b) zu einem luftblasenfreien Brei angerührt und unter Schütteln in ein Chromatographierohr
eingefüllt. Unter Anwendung eines geringen Überdruckes wird die organische Phase
so lange durch die Säule filtriert, bis die ersten Anteile der organischen Phase
aus der Säule tropfen. Das Actinomycin-U-Gemisch-l. Zone wird in einer möglichst
geringen Menge der organischen Phase des obengenannten Systems gelöst und auf die
Säule aufgetragen. Entsprechend wird mit dem Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone verfahren.
Beim weiteren Durchlauf der organischen Phase trennt sich das Actinomycin-U-Gemischl.
Zone sowie das Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone in zwei Zonen, die aus der Säule herausgeschnitten
und mit Essigester herausgelöst werden. Nach Abdampfen des Essigesters im Vakuum,
Aufnehmen in Benzol, Adsorption an eine kleine Aluminiumoxydsäule und Elution mit
Essigester werden beim Konzentrieren des Essigesterextraktes die reinen Komponenten
des Actinomycin-U-Gemisches, 3,8 g Actinomycin U4 und 0,18 g Actinomycin U2, aus
dem Actinomycin-U-Gemisch-1. Zone und 5,2 g Actinomycin U3 und 0,27 g Actinomycin
U1 aus dem Actinomycin-U-Gemisch-2. Zone erhalten. Die vier Actinomycinkomponenten
sind nach der papierchromatographischen Analyse einheitlich. Ihre R"-Werte in dem
Verteilungssystem: 1 Volumteil Amylacetat und 1 Volumteil eines wäßrigen Natrium-m-kresotinats
betragen: Actinomycin U4 = 1,18, Actinomycin UZ = 0,45, Actinomycin U3 =
0,73 und Actinomycin U1 = 0,32.
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Die beiden Hauptkomponenten, das Actinomycin U3 und Actinomycin U4,
kristallisieren aus Essigester in Gegenwart von Petroläther in roten dünnen rechteckigen
Plättchen. Nach der Elementaranalyse des im Hochvakuum bei 50°C getrockneten Präparates
enthält Actinomycin U,: 56,53 % C, 7,31 "/o H, 13,00 % N und
23,48 % O (s = 103,2; 0,0 % Verbrennungsrückstand), Actinomycin U4
= 57,04 % C, 6,75 % H, 13,03 % N und 23,48 % O (E =
100,30 °/o; 0,0 % Verbrennungsrückstand). Der spezifische Extinktionskoeffizient
a (= Extinktion für c = 1 g pro Liter und d = 1 cm) für Actinomycin U3 in Benzol
bei = 452,5 mg beträgt a = 19,20, in Äthanol bei A = 446 mg a = 18,8, für
Actinomycin U4 in Benzol bei 2 = 452,5 mg a = 19,63, in Äthanol bei A= 446
mg a = 18,7.