SI21257A

SI21257A - Stabilni farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin

Info

Publication number: SI21257A
Application number: SI200200176A
Authority: SI
Inventors: Andreja Vukmirovi�; Tanja Rozman; Jelka Svetek; Alenka Pari�
Original assignee: LEK farmacevtska dru�ba d.d.
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2002-07-17
Publication date: 2004-02-29
Also published as: CA2492470A1; JP2006501193A; WO2004006948A1; EP1536822B1; JP4979191B2; AU2002368075B2; US8648175B2; EP1536822A1; AU2002368075A1; ES2268166T3; AR040600A1; MXPA05000661A; CA2492470C; DE60212728D1; ATE330623T1; DE60212728T2; US20050238720A1; CN1638791A; CN100425283C

Abstract

Izum se nanaša na nov stabilni tekoči farmacevtski pripravek za eritropoietin (EPO), ki stabilizira EPO in ne vsebuje dodatkov živalskega ali/in humanega izvora.ŕ

Description

Naziv izuma

Stabilni farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin

Področje tehnike

Predloženi izum se nanaša na nov stabilni tekoči farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin (EPO).

EPO je glikoproteinski hormon, ki regulira tvorbo eritrocitov v sesalskem organizmu. Deluje kot rastni in/ali diferenciacijski faktor na zarodne celice kostnega mozga in povzroči njihovo diferenciacijo in proliferacijo v eritrocite.

Bistvo predloženega izuma je nov stabilni tekoči farmacevtski pripravek, ki vsebuje EPO, stabilizira EPO in ne vsebuje dodatkov humanega ali živalskega izvora (npr. serumskih proteinov). Farmacevtski pripravek je pripravljen v farmacevtsko sprejemljivem pufrskem sistemu in vsebuje povidon (PVP) kot stabilizator. Opcijsko farmacevtski pripravek dodatno vsebuje eno ali več farmacevtsko sprejemljivih pomožnih snovi. Farmacevstki pripravek, ki je predmet izuma, je farmacevtsko sprejemljiv za parenteralno aplikacijo (npr. za intramuskularno, subkutano in/ali intravenozno aplikacijo) in je primeren za uporabo v medicini.

Stanje tehnike

EPO deluje kot rastni in/ali diferenciacijski faktor na zarodne celice kostnega mozga - povzroči njihovo diferenciacijo v eritroblaste, iz katerih se razvijejo eritrociti (Goldwasser in sod., J. BioL Chem., 249,4202-4211,1974). Njegova sinteza poteka pri odraslih v ledvicah (Shervvood in sod., Endocrinoiogy, 103, 866-870, 1978) pri zarodkih pa v jetrih (Zanjani in sod., J. Lab. Ciin. Med., 89, 640-644, 1977). Z vnosom farmacevtskega pripravka, ki vsebuje EPO, v organizem lahko pospešimo tvorbo novih eritrocitov. Farmacevtski pripravek se največ uporablja pri bolnikih z zmanjšano tvorbo EPO zaradi kroničnega obolenja ledvic, pri AlDS-u in rakavih bolnikih, ki se zdravijo s kemoterapijo in pri zdravljenju drugih vrst anemij (Danna s sod. v Erythropoietin in Clinical Applications - An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker, 301-324, 1990; Eschbach in sod., N. England J. of Med.,

316, 2, 73-78,1987; Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31,3, 177-181, 1983). EPO, ki se uporablja v farmacevtskih preparatih, je rekombinantnega izvora in je produkt izražanja humanega gena za EPO v sesalskih celicah (EP 148605, EP 205564, EP255231). Poznani so tudi EPO analogi in EPO derivati, ki so med drugim opisani v: EP640619, EP 668351, WO 9412650, EP1064951, WO 0232957, WO 9533057, US 5916773, WO 09902710, US 5580853, US 5747446, US 5919758 in US 6107272.

Farmacevtski pripravki, ki vsebujejo humani serumski albumin, so med drugim opisani v patentih: EP 178665, EP 178576, US 5661125, WO 0061169. Humani serumski albumin lahko povzroča alergijske reakcije (Stafford CT in sod. Arin Aflergy, 61(2), 85-88, 1988). Prav tako je njegova uporaba tvegana, kajti kljub testiranju krvi obstaja nevarnost za okužbo z virusi. Zato obstaja potreba po razvoju farmacevtskega pripravka, ki stabilizira EPO in hkrati ne vsebuje humanih proteinov.

V EP 306824, EP 607156, EP 528313, EP 528314 so opisani farmacevtski pripravki za EPO, ki kot stabilizator vsebujejo ureo.

V EP306824, EP 178665, GB 2171304, EP 528314, EP 528313 in EP 1002547 so opisani liofilizirani farmacevtski pripravki, ki vsebujejo EPO. Liofilizirani farmacevstki pripravki so v klinični uporabi manj praktični zaradi postopka rekonstitucije pred uporabo. Tak postopek je zamuden, obstaja tveganje za nepravilno uporabo ali nepravilno rekonstitucijo in običajno se liofiliziranim farmacevtskim pripravkom dodajajo dodatni stabilizatorji, ki so potrebni za ohranjanje aktivnosti proteina v postopku liofilizacije.

V US 5376632 je opisan farmacevtski pripravek, ki vsebuje alfa in beta ciklodekstrine.

V EP 607156, EP 528313 in EP178665 so opisani vodni farmacevtski pripravki, ki vsebujejo EPO in konzervanse, kot so benzil alkohol, klorbutanol, parabeni, fenoli in druge. Uporaba takih konzervansov lahko povzroča obarja nje EPO, kar klinično ni sprejemljivo.

V EP 909564, EP 528314, EP 430200 in WO 0061169 je opisana uporaba aminokislin in/ali kombinacija aminokislin in neionskih detergentov kot stabilizatorjev v farmacevtskih pripravkih, ki vsebujejo EPO.

V patentni prijavi W0 0187329 so opisani različni farmacevtski pripravki, ki so namenjeni stabilizaciji pegiliranega EPO analoga. Opisani farmacevtski pripavki temeljijo predvsem na uporabi sulfatnega pufra.

Farmacevtski pripravki za EPO, ki so opisani med drugim v RU 2128517, VV00061169, EP 528313, EP 607156, EP 528314, EP 178665, so pripravljeni v citratnem pufru. Citratni pufer povzroča bolečino na mestu aplikacije, zato je za klinično uporabo bolj primeren fosfatni pufer.

Opis slik

Slika 1: SDS-PAGE vzorcev od FP1 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenih pri 40°C (±2°C) 1 mesec (40). Kot pozitivno kontrolo (PK) za prisotnost EPO dimer smo uporabili EPO substanco v vodi, shranjeno pri 40°C (±2°C) 1 mesec. V vse žepke smo nanesli 0.4 μg substance.

Sestava farmacevtskih pripravkov FP1 do FP8:

FP1: polisorbat 80 (0,03% (masni/volumski (m/v))), glicin (0,5% (m/v)), fosfatni pufer 20 (mmol/l), NaCl (100 mmol/l)

FP2: glicin (0,5% (m/v)), glicerol (1,4% (m/v)), fosfatni pufer (32 mmol/l)

FP3: glicin (0,5% (m/v)), Pluronic F68 (0,1% (m/v)), fosfatni pufer (20 mmol/l), NaCl (90,6 mmol/l)

FP4: sorbitol (4,5% (m/v)), Pluronic F68 (0,1% (m/v)), fosfatni pufer (20 mmol/l)

FP5: dekstran 70 (1% (m/v)), NaCl (123 mmol/l), fosfatni pufer (20 mmol/l)

FP6: glicerol (2% (m/v)), Pluronic F 68 (0,1% (m/v)), NaCl (17.1 mmol/l), fosfatni pufer (20 mmol/l)

FP7: glicerol (2% (m/v)), PVP K12 (0,5% (m/v)), fosfatni pufer (20 mmol/l).

FP8: PVP K12 (0.5% (m/v)), NaCl (123 mmol/l), fosfatni pufer (20 mmol/l)

Legenda:

Steza Vzorec prazna steza

Obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ prazna steza

EPO-BRP (EPO standard Evropske farmakopeje)

FP1 40

FP2 40

FP3 40

FP4 40

FP5 40

FP6 40

FP7 40

FP8 40

ΡΚ prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ

Slika 2: SDS-PAGE vzorcev od FP1 do FP4, z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenih v hladilniku (HL) in shranjenih pri 40°C (±2°C) 1 mesec (40). Kot pozitivno kontrolo (PK) za prisotnost EPO dimer smo uporabili EPO substanco v vodi, shranjeno pri 40°C (±2°C) 1 mesec. V vse žepke smo nanesli 0.4 μ9 substance.

Legenda:

Steza Vzorec prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ prazna steza

EPO-BRP (EPO standard Evropske farmakopeje)

FP1 HL

FP2HL

FP3 HL

FP4 HL

FP1 40

FP2 40

FP3 40

FP4 40

PK prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ

Slika 3: SDS-PAGE vzorcev od FP5 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenih v hladilniku (HL) in shranjenih pri 40°C (±2°C) 1 mesec (40). Kot pozitivno kontrolo (PK) za prisotnost EPO dimer smo uporabili EPO substanco v vodi, shranjeno pri 40°C (±2°C) 1 mesec. V vse žepke smo nanesli 0.4 pg substance.

Legenda:

EPO-BRP (EPO standard Evropske farmakopeje)

FP5 HL

FP6 HL

FP7 HL

FP8 HL

FP5 40

FP6 40

FP7 40

FP8 40

PK prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ

Slika 4: SDS-PAGE vzorcev od FP1 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenih v hladilniku (HL) 10 tednov. Kot pozitivno kontrolo (PK) za prisotnost EPO dimer smo uporabili EPO substanco v vodi, shranjeno pri 40°C (±2°C) 1 mesec. V vse žepke smo nanesli 0.4 pg substance.

Legenda:

EPO-BRP (EPO standard Evropske farmakopeje)

FP1 HL

FP2 HL

FP3 HL

FP4 HL

FP5 HL

FP6HL

FP7 HL

FP8HL

PK prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ

Slika 5: SDS-PAGE vzorcev od FP1 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenih pri 25°C (±2°C) 10 tednov (25). Kot pozitivno kontrolo (PK) za prisotnost EPO dimer smo uporabili EPO substanco v vodi, shranjeno pri 40°C (±2°C) 1 mesec. V vse žepke smo nanesli 0.4 pg substance.

Legenda:

EPO-BRP (EPO standard Evropske farmakopeje)

FP1 25

FP2 25

FP3 25

FP4 25

FP5 25

FP6 25 FP7 25 FP8 25 ΡΚ prazna steza obarvani standardi SDS-PAGE, Bio-Rad, nanos 4 μΙ

Slika 6: Relativni odziv EPO-ELISA (v %) vzorcev od FP1 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 IU/ml, shranjenih pri 40°C (±2°C) 1 mesec (40) glede na vzorce od FP1 do FP8, shranjene v hladilniku 1 mesec (HL)

Slika 7: Relativni odziv EPO-ELISA (v %) vzorcev od FP1 do FP8, z vsebnostjo EPO 10000 IU/ml, shranjenih pri 25°C (±2°C) 10 tednov (25) glede na vzorce od FP1 do FP8, shranjene v hladilniku 1 mesec (HL)

Opis izuma

V smislu izuma smo presenetljivo ugotovili, da tekoči farmacevtski pripravek, ki vsebuje PVP in ne vsebuje dodatkov živalskega ali humanega izvora, stabilizira EPO.

Farmacevtski pripravek, kije predmet izuma, vsebuje naslednje komponente:

a. terapevtsko učinkovito količino EPO,

b. farmacevtsko sprejemljiv pufrski sistem in

c. PVP kot stabilizator in ne vsebuje dodatkov živalskega ali/in humanega izvora.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, opcijsko dodatno vsebuje:

d. sredstvo za izotonizacijo in/ali

e. eno ali več drugih farmacevtsko sprejemljivih pomožnih snovi.

Z izrazom eritropoietin (EPO) je mišljen protein, ki ima in vivo biološko aktivnost, da povzroči diferenciacijo ίη/ali proliferacijo zarodnih celic kostnega mozga do eritrocitov.

8·

Z izrazom 'terapevtsko učinkovita količina EPO' je mišljena tista količina EPO, ki omogoča terapevtski učinek EPO.

Z izrazom 'stabilizator' je mišljena farmacevtsko sprejemljiva pomožna snov, ki stabilizira EPO.

Z izrazom ' stabilnost EPO' je mišljeno tako ohranjanje vsebnosti EPO kot tudi ohranjanje biološke aktivnosti EPO. K zmanjšanju stabilnosti EPO prispevajo med drugim naslednji procesi: adsorpcija EPO na stene ovojnine, denaturacija ali razgradnja EPO in tvorba agregatov, npr. EPO dimer in/ali EPO multimer in/ali sorodnih molekul z večjo molekulsko maso. Ti procesi so lahko posledica različnih dejavnikov, med drugim povišane temperature, neprimerne ovojnine, uporabe neprimernih stabilizatorjev EPO, sončne svetlobe, neprimernega postopka izdelave in/ali neprimernega postopka shranjevanja.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, stabilizira EPO pri temperaturah, ki so višje od temperature hladilnika (2-8°C), posebno pri sobni temperaturi, pa tudi pri višjih temperaturah (na primer okoli 40°C).

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, vsebuje za stabilizacijo EPO le eno farmacevtsko sprejemljivo pomožno snov, PVP. Uporaba PVP tako nadomesti kombinacije različnih stabilizatorjev, ki so bili do sedaj uporabljeni v drugih farmacevtskih pripravkih, ki vsebujejo EPO. V primerjavi z uporabo dveh ali večih stabilizatorjev je uporaba enega stabilizatorja boljša v smislu ekonomičnosti priprave, manjših stroškov, pa tudi v smislu lažje in manj zamudne priprave farmacevtskega pripravka, pa tudi za bolnika v smislu vnosa manj dodatnih snovi v organizem.

V nekaterih znanih farmacevtskih pripravkih, ki vsebujejo EPO, se kot stabilizatorji uporabljajo neionski detergenti polisorbati (polisorbat 20, polisorbat 80...). V primerjavi s polisorbati, PVP omogoča uporabo gelske filtracije kot analizne metode za ugotavljanje vsebnosti EPO dimer, EPO multimer in drugih sorodnih molekul z višjo molekulsko maso, ki nastanejo kot posledica agregacije molekul EPO. Pri gelski kromatografiji se namreč polisorbati s podobno molsko maso eluirajo na istem mestu kot EPO. S tem v farmacevtskih pripravkih EPO, v katerih se kot stabilizatorji uporabljajo takšni polisorbati, za dokazovanje deleža EPO dimer ni mogoče uporabiti gelske kromatografije. Uporaba PVP tako prispeva k lažji dokazljivosti (analizi) stabilnosti EPO, k večji varnosti in lažji kontroli kvalitete farmacevtskega pripravka, ki vsebuje EPO.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, je tekoči farmacevtski pripravek in omogoča parenteralno aplikacijo in sicer subkutano, intravenozno ali intramuskularno aplikacijo, brez rekonstitucije, redčenja ali dodatnih predpriprav, ki bi lahko prispevale k zmanjšanju aktivnosti EPO kot tudi k dodatnim tehničnim težavam pri uporabi. Uporaba tekočega farmacevtskega pripravka je torej bolj praktična kot je uporaba liofiliziranih pripravkov, ki jih je potrebno pred uporabo rekonstituirati. Postopek liofiiizacije večinoma zahteva prisotnost dodatnih stabilizatorjev, je energetsko zelo potraten in poveča stroške proizvodnje.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, ne vsebuje humanih serumskih proteinov, pri katerih je mogoča okužba z virusi. Prav tako je s tem zmanjšana verjetnost za pojav raznih alergijskih reakcij, ki bi bile lahko posledica uporabe humanih serumskih albuminov. Pripravljen je v izotonični raztopini, ki je farmacevtsko sprejemljiva in ne povzroči stranskih učinkov.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, se lahko uporablja za vse vrste EPO, med drugim za EPO alfa, EPO beta, EPO omega in različne druge profile EPO izoform, kot tudi za posamezne EPO izoforme, EPO analoge, izbrane iz skupine, ki obsega EPO dimere, NESP (hiperglikoziliran analog rekombinantnega humanega EPO), gensko-aktiviran EPO, pegiliran EPO, fuzijske proteine (oiigomere in multimere) z EPO, hibridne molekule z EPO, fragmente EPO, homologe EPO, muteine EPO, EPO s spremenjenimi glikozilacijskimi profili. EPO je lahko pridobljen s tehnikami rekombinantne DNA tehnologije, npr. iz cDNA, genomske DNA ali sintetične DNA, lahko je naravnega izvora, pridobljen z izolacijskimi metodami, ali pa pridobljen z gensko aktivacijo, transgenimi metodami ali drugimi znanimi metodami.

V farmacevtskem pripravku, ki je predmet izuma, je terapevtsko učinkovita količina EPO izbrana v območju med 500 in 100000 lU/dozo ali več (1 IU ustreza približno 10 ng EPO), prednostno med 1000 in 40000 lU/dozo. V splošnem je sprejeto, da je učinkovita količina EPO od 1 do 500 lU/kg telesne teže, prednostno med 50 in 300 lU/kg telesne teže. Polnjen v farmacevtsko ovojnino, izbrano iz

-1010 skupine, ki zajema ampule, injekcijske brizge in viale. Te farmacevtske ovojnine omogočajo aplikacijo v območju volumna med 0,2 ml in 20 ml (doza).

Terapevstko učinkovita količina EPO nadalje zavisi od vrste in velikosti zdravljenega osebka, oblike in resnosti bolezenskega stanja in načina aplikacije.

Prednostno območje pH je med okoli 6 in okoli 8, bolj prednostno med 6.8 in

7.5 in najbolj prednostno okoli 7.0. Med pufrskimi sistemi se lahko uporablja vsak znani farmacevtsko sprejemljiv pufer, ki omogoča vzdrževanje pH v območju med okoli 6 in okoli 8, prednostno se uporablja fosfatni pufrski sistem, najbolj prednostno pufrski sistem: natrijev monobazični fosfat dihidrat/natrijev dibazični fosfat dihidrat (NaH₂P04x2H2O/Na₂HPO4 x2H₂O). Koncentracija fosfatnih soli je odvisna od pH in je izbrana v območju med 10 in 50 mM, prednostno med 15 in 35 mM, najbolj prednostno okoli 20 mM. Po potrebi pH uravnavamo s HCI, NaOH, citronsko kislino ali Na citratom.

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, vsebuje PVP kot stabilizator. Prednostna je uporaba nizkomolekularnega PVP (PVP K12 do K18), najbolj prednostna je uporaba PVP K12. Koncentracija PVP zajema območje med 0.01% in 1 %, bolj prednostno med 0.1 in 1.0%, najbolj prednostna je koncentracija 0.5% (m/v).

Farmacevtski pripravek, ki je predmet izuma, opcijsko dodatno vsebuje farmacevtsko sprejemljivo pomožno snov za vzdrževanje izotoničnosti raztopine. Ta pomožna snov je prednostno izbrana iz skupine anorganskih soli, prednostno CaCI₂in NaCl, najbolj prednostno NaCl. Izbrana koncentracija izotoničnega sredstva je taka, da omogoča izotoničnost končnega tekočega farmacevtskega pripravka.

Farmacevtski pripravek opcijsko dodatno vsebuje enega ali več stabilizatorjev EPO, izbranih iz skupine, ki zajema površinsko aktivne snovi, kot so: glikol in glicerol estri, makrogol estri in etri, sorbitan derivati oz. polisorbati (polisorbat 20, polisorbat 80), poloksameri (Pluronic F68). Prednostno se uporablja Pluronic F68 v koncentraciji do 1%, najbolj prednostno Pluronic v koncentraciji 0.1%.

Za analizo farmacevtskega pripravka, ki je predmet izuma, smo uporabili naslednje metode: denaturirajočo analizo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo

-1111 (SDS-PAGE) z imunodetekcijo, gelsko kromatografijo (SEC), EPO-ELISO ter in vivo testiranje na miškah.

SDS-PAGE z imunodetekcijo: Vzorci za nanos so bili pripravljeni v vzorčnem pufru brez reducenta. Uporabili smo vertikalno SDS-PAGE, gel NuPAGE Bis-Tris 12%, 8x8 cm, debeline 1.0 mm, 15 žepkov (Invitrogen) in MOPS SDS pufer za elektroforezo (Invitrogen). Elektroforezo je tekla 1 uro pri konstantni napetosti 200 V. Po elektro-prenosu proteinov iz gela na nitrocelulozno membrano je imuno-detekcija eritropoietina na membrani potekala v dveh stopnjah z uporabo primarnih protiteles (anti-huEpo, mišja, monoklonska) v prvi stopnji in sekundarnih protiteles (anti-mišja IgG, zajčja, poiiklonska) konjugirana s hrenovo peroksidazo v drugi. Dodatek substrata za peroksidazo (4-kloro-1-naftol) sproži barvno encimsko reakcijo, katere netopen produkt tvori sivo-modre lise na mestih na membrani, kjer je vezan EPO.

SDS-PAGE z imunodetekcijo pokaže, da pri farmacevtskem pripravku, ki je predmet izuma (FP8), pri sobni temperaturi (slike 1-5) ne nastanejo EPO agregati, kot so npr. EPO dimere ali sorodne molekule z višjo molekulsko maso, pri povišani temperaturi pa nastajajo v manjši meri. Primerjava farmacevtskega pripravka, ki je predmet izuma, s farmacevtskim pripravkom FP1, ki vsebuje kot stabilizator kombinacijo polisorbatov in aminokisline glicina pri povišani temperaturi (1 mesec 40 °C) kaže (slike 1,2,3), da pri FP1 nastanejo EPO dimere. Nastanek EPO dimer je eden ključnih dejavnikov za zmanjšano stabilnost EPO. Prav tako je možno, da EPO agregati, npr. EPO dimere in sorodne molekule z večjo molekulsko maso, povzročijo neželjene stranske učinke po aplikaciji in s tem nelagodnosti pacienta, ki tak farmacevtski pripravek prejema. Možno je tudi, da taki agregati povzročijo imunski odziv organizma, kar prepreči nadaljnjo terapijo z EPO.

EPO-ELISA: Sistem EPO-ELISA Ouantikine IVD, R&D Systems, za določanje koncentracije EPO temelji na uporabi dveh vrst protiteles (sendvič-metoda). Epo iz vzorca se veže na mišja monoklonska protitelesa, ki so imobilizirana na mikrotitrski ploščici in ki specifično prepoznajo humani eritropoietin. V drugi stopnji se na tako ujet EPO vežejo še zajčja poiiklonska anti-EPO-protitelesa, ki so konjugirana s hrenovo peroksidazo. Dodatek kromogena (substrata za peroksidazo) sproži encimsko reakcijo, katere produkt je modro obarvan topen kompleks. Intenzivnost barve (spektrofotometrična meritev absorpcije) je premo-sorazmerna množini

-1212 konjugata vezanega na kompleks EPO-protitelo, ki je hkrati premo-sorazmerna vsebnosti EPO v preiskovanem vzorcu.

Primerjava farmacevtskega pripravka, ki je predmet izuma (FP8), z drugimi farmacevtskimi pripravki (FP1-FP7) (slika 6) kaže, da je pri FP8 adsorpcija EPO na stene vial pri povišani temperaturi (40°C 1 mesec) manjša ali enaka, pri sobni temperaturi pa primerljiva z drugimi pripravki (slika 7). Povečana adsorpcija na stene ovojnin prispeva k zmanjšanju stabilnosti EPO in s tem k nižji celokupni biološki aktivnosti EPO.

V nekaterih do sedaj znanih farmacevtskih pripravkih, ki vsebujejo EPO (glej stanje tehnike) so uporabljene aminokisline kot stabilizatorji. Vendar aminokisline ne delujejo vedno kot stabilizatorji EPO. Iz slik 6 in 7 je razvidno, da je stabilnost EPO v farmacevtskih pripravkih FP2 in FP3 (vsebujeta glicin) tako pri sobni kot pri povišani temperaturi (40°C 1 mesec) manjša v primerjavi z farmacevtskimi pripravki FP4, FP6 in FP8, ki ne vsebujejo glicina, pa tudi manjša od FP1, ki vsebuje glicin. Za doseganje ohranjanja stabilnosti farmacevtskega pripravka, ki vsebuje EPO, je torej potrebna pravilna kombinacija raznih stabilizatorjev, eksperimentalno je pa potrebno preveriti, katera kombinacija stabilizatorjev bo najbolj stabilizirala EPO. V predloženem izumu smo presenetljivo ugotovili, da PVP stabilizira EPO. Ugotovili smo tudi, da PVP v kombinaciji z glicerolom pri povišani temperaturi (40°C 1 mesec) ne stabilizira EPO (slika 6), medtem ko glicerol v kombinaciji s Pluronic F68 (sliki 6 in 7) stabilizira EPO tako pri sobni kot pri povišani temperaturi (40°C 1 mesec). EPO stabilizirajo le določene kombinacije farmacevtsko pomožnih snovi, ki pa niso predvidljive.

SEC: S SEC smo merili delež EPO dimer oz. sorodnih molekul z večjo molekulsko maso na vzorcih od FP1 do FP8 z vsebnostjo EPO 2000 lU/ml in 10000 lU/ml. Pri izvedbi smo uporabili limitni test po zahtevah Evropske farmakopeje (European Pharmacopeia 2002, 4. izdaja, Erythropoietin concentrated solution). Delež EPO dimer smo primerjali z redčeno raztopino vzorca (2%).

-1313

Vzorec	Ocena deleža dimer (približne vrednosti)
	40°C 1 mesec	25°C 10 tednov
FP1 (2000 lU/ml)	*	*
FP1 (10000 lU/ml)	★	*
FP2 (2000 lU/ml)	<2% (pribl.1.3%)	/
FP2 (10000 lU/ml)	>2% (pribl. 2,2%)	z
FP3 (2000 lU/ml)	>2% (pribl. 3.7%)	i
FP3 (10000 lU/ml)	>2% (pribl. 4.3%)	/
FP4 (2000 lU/ml)	<2% (pribl, 0.3%)	/
FP4 (10000 lU/ml)	<2% (pribl. 1.2%)	/
FP5 (2000 lU/ml)	*	i
FP5 (10000 lU/ml)	>2% (pribl. 3.2%)	z
FP6 (2000 lU/ml)	<2% (pribl. 0,9%)	/
FP6 (10000 lU/ml)	>2% (pribl. 2,3%)	/
FP7(2000 IU/ml)	<2% (pribl. 0.4% )	/
FP7 (10000 IU/ml)	<2% (pribl. 1.5%)	/
FP8 (2000 lU/ml)	<2% (pribl. 0.2%)	z
FP8 (10000 lU/ml)	<2% (pribl. 1.6%)	/

*: deleža dimer ni biio mogoče izračunati, ker komponente placeba motijo določitev /: delež dimer je pod mejo detekcije

In vivo biološka aktivnost:

In vivo biološko aktivnost smo merili na vzorcu FP8 z vsebnostjo EPO 10000 lU/ml, shranjenem pri 25°C 10 tednov in v hladilniku 4 mesece. Biološko aktivnost smo merili s pomočjo in vivo metode na hipoksičnih miškah po postopkih iz Evropske farmakopeje. Izračun ocene biološke aktivnosti je bil prav tako izveden po priporočljivih postopkih iz Evropske farmakopeje (Eur. Pharmacopeia - 1997; Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests; The parallel-line model). Po Evropski farmakopeji ocenjena vrednost biološke aktivnosti ne sme biti

-1414 manjša od 80% in ne večja od 120% označene aktivnosti. Cilj meritev biološke aktivnosti je torej doseganje območja med 80 in 120% vrednosti glede na začetno vrednost tnjeciranega EPO (10000 lU/ml) in dobljeni rezultat predstavlja oceno biološke aktivnosti in ne njene natančne vrednosti. Meja zaupanja ocenjene aktivnosti ne sme biti manjša od 64% in ne večja od 156% označene aktivnosti. Dobljeni rezultati so predstavljeni v tabeli:

Vzorec	Ocena biološke aktivnosti (80-120%)	Meja zaupanja (64-156%)
FP8 (25°C, 10ted.)	9095 lU/ml (91%)	69-143%
FP8 (HL, 4 mes.)	9917 lU/ml (99%)	76-129%

Rezultati kažejo, da je ocenjena vrednost biološke aktivnosti znotraj zahtevanih meja in ustreza farmakopejskim zahtevam. Prav tako je meja zaupanja v zahtevanem območju.

Pogoji testiranja stabilnosti farmacevtskih pripravkov, ki vsebujejo EPO

HL-referenca 2 do 8 °C, hladilnik

40 °C ± 2°C, 75% rel.vl. ± 5%, klima komora

25 °C ± 2°C, 60% rel.vl. ± 5%, klimatiziran prostor

Predloženi izum prikazujejo, vendar v ničemer ne omejujejo naslednji primeri.

-1515

Primeri

Primera 1-2:Sestava farmacevtskih pripravkov (FP8), ki vsebujeta EPO

Opis pripravka	Aktivna učinkovina	Neaktivna dodana snov
FP8 (2000)
	2000 IU EPO Lek
		NaH₂P0₄x2H₂O 1,164 mg
		Na₂HPO₄ x2H₂O 2,225 mg
		NaCI 7,200 mg
		PVP K12 5,000 mg
		NaOH za uravnavo pH (pH: 7.0-7.1)
		Voda do 1 ml

Opis pripravka	Aktivna učinkovina	Neaktivna dodana snov
FP8 (10000)
	10000 IU EPO Lek
		NaH₂P0₄ x2H₂O 1,164 mg
		Na₂HPO₄ x2H₂O 2,225 mg
		NaCI 7,200 mg
		PVP K12 5,000 mg
		NaOH za uravnavo pH (pH: 7.0 - 7.1)
		Voda do 1 ml

Kvalitete substanc:

Epoetin Lek kvalitete, ki jo določa Evropska farmakopeja (Ph Eur. kvaliteta),

Povidon K12 (poli[1-(2-okso-1-pirolidil)etilen], polividon, PVP) Ph Eur kvalitete, ki ustreza farmakopeji ZDA (USP kvalitete), dobavljen pri BASF, Ludvvigshafen, Nemčija,

NaCI, Na2HPO₄ x2H₂O, NaH₂P04 x2H₂O, NaOH, voda za injekcije so bile Ph. Eur. kvalitete.

-1616

Priprava farmacevtskih pripravkov, ki vsebujeta EPO

Placebo raztopino s PVP K12 smo pripravili tako, da smo v vodi za inj. pri sobni temperaturi raztopili med mešanjem na magnetnem mešalu najprej pufer (Na₂HPO₄ x2H₂O, NaH₂P0₄ x2H₂O), nato NaCl in stabilizator PVP K12. pH vrednost raztopine smo dvignili z 1M NaOH na 7,0 - 7,1. Dobili smo bistro brezbarvno raztopino.

Raztopino EPO Lek smo pripravili tako, da smo odtajano količino EPO Lek koncentrirane raztopine (preračunane na aktivnosti) pri sobni temperaturi dodali v placebo raztopino potem, ko smo iz iste raztopine enak volumen placebo raztopine odvzeli. Raztopino smo na magnetnem mešalu pri nizkih obratih premešali. Dobili smo bistro, brezbarvno raztopino.

Raztopine farmacevtskih pripravkov, ki vsebujejo EPO Lek v obeh koncentracijah, smo nato v aseptičnih pogojih v kvaliteti zraka klasa 100 sterilno filtrirali čez membranski filter s PVDF (Polyvinylidenfluorid) membrano z velikostjo por 0,2 μπτι in filtrirano raztopino napolnili po 0,8 ml v 2 ml-ske viale iz brezbarvnega cevnega stekla L hidrolitske skupine, oprane in sterilizirane in jih zaprli s čepi iz brombutil kaučuka in z aluminijastimi zaporkami.

LEK farmacevtskčKfružba d.d.

Claims

Patentni zahtevki

1. Stabilni farmacevtski pripravek, označen s tem, da vsebuje naslednje komponente:

a. terapevtsko učinkovito količino EPO

b. farmacevtsko sprejemljiv pufrski sistem

c. PVP in opcijsko dodatno vsebuje

d. sredstvo za izotonizacijo in/ali

e. eno ali več farmacevtsko sprejemljivih pomožnih snovi in ne vsebuje dodatkov živalskega in/ali humanega izvora.
2. Farmacevtski pripravek po zahtevku 1, označen s tem, da je farmacevtski pripravek tekoči.
3. Farmacevtski pripravek po zahtevku 2, označen s tem, da je količina EPO izbrana v območju med 500 in 100000 IU EPO na dozo.
4. Farmacevtski pripravek po zahtevku 3, označen s tem, da je količina EPO izbrana iz skupine, ki obsega: okoli 1000 lU/dozo, 2000 lU/dozo, okoli 3000 lU/dozo, okoli 4000 lU/dozo, okoli 10000 lU/dozo, okoli 20000 lU/dozo, okoli 25000 lU/dozo ali okoli 40000 lU/dozo.
5. Farmacevtski pripravek po zahtevkih od 1 do 4, označen s tem, da je pH raztopine izbran v območju med okoli 6 in okoli 8.
6. Farmacevtski pripravek po zahtevku 5, označen s tem, da je pH raztopine izbran v območju med 6.8 in 7.5.
7. Farmacevtski pripravek po zahtevku 6, označen s tem, da je izbran pH raztopine okoli 7.
8. Farmacevtski pripravek po zahtevkih od 1 do 7, označen s tem, da je izbrani pufrski sistem fosfatni pufer.
9. Farmacevtski pripravek po zahtevkih od 1 do 8, označen s tem, da je koncentracija PVP izbrana v območju med 0.01% in 1%.
10. Farmacevtski pripravek po zahtevku 9, označen s tem, da je koncentracija PVP izbrana v območju med 0.1% in 1%.

-1818
11. Farmacevtski pripravek po zahtevku 10, označen s tem, da je izbrana koncentracija PVP okoli 0.5%.
12. Farmacevtski pripravek po zahtevkih od 1 do 11, označen s tem, da je sredstvo za izotonizacijo izbrano iz skupine anorganskih soli.
13. Farmacevtski pripravek po zahtevku 12, označen s tem, da je izbrano sredstvo za izotonizacijo NaCl.
14. Postopek za pripravo farmacevtskega pripravka po zahtevkih od 1 do 13.
15. Uporaba farmacevtskega pripravka po zahtevkih od 1 do 14 za pripravo zdravil za zdravljenje bolezni, ki so indicirane za EPO.