KR20150092638A

KR20150092638A - p15 단백질 변이체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150092638A
Application number: KR1020140013239A
Authority: KR
Inventors: 이정훈; 이재일; 강은지; 이정민
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2015-08-13
Also published as: US20150218243A1; US9512193B2

Abstract

p15 변이체, 상기 p15 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 p15 변이체의 제조 방법, 및 상기 p15 변이체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

Description

p15 단백질 변이체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{p15 protein variant and composition for preventing or treating a cancer containing the same}

p15 단백질 변이체, 상기 p15 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 p15 단백질 변이체의 제조 방법, 및 상기 p15 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

p15^INK4b　(이하, 'p15'으로 명명) 단백질은 정상 세포 및 암 세포 분열을 주관하는 세포 주기(cell cycle)에서의 주요한 체크 포인트(major checkpoint; restriction point)인 G₁→S을 조절하는 단백질로서, 사이클린-의존 카이네이즈 4/6(cyclin-dependent kinase 4/6; Cdk4/6)에 결합하여 세포 분열을 조절한다 (도 1 참조).

p15 단백질이 Cdk4/6에 결합하면 세포 주기가 G₁기에서　S기로 진행되는 것(G₁→S)이 억제되므로, S기에서 DNA가 합성되고 이후 무한대로 세포분열이 일어나 암세포로 발전하게 되는 것을 막을 수 있다. 이처럼 p15 단백질은 종양 억제자(tumor suppressor)로서 유용하게 사용될 수 있다.

p15 단백질을 암 치료 목적으로 암세포 내부에 전달하기 위해서 세포막 투과성 등의 물성이 우수한 재조합 단백질 (recombinant p15)의 생산이 전제될 것이 요구된다. 그러나, 인간 p15 단백질을 대장균에서 발현시킬 경우, insoluble 형태로 발현되어　생산이 어려울 뿐 아니라, 이미 낮은 가용성 및 높은 유연성(high flexibility) 등의 문제점들이 보고된 바가 있다 (Yuan, C., et. al., 2000 Protein Science 1120-1128).

따라서, p15 단백질의 Cdk4/6에 대한 결합력은 유지하면서 가용성을 향상시켜, 암 치료에 보다 유리하게 사용될 수 있도록 하는 기술의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 예는 p15 단백질 변이체를 제공한다. 상기 p15 단백질 변이체는 Cdk4/6에 대한 결합력은 유지하면서 가용성이 증진된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 p15 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또 다른 예는 상기 p15 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기한 문제점을 해결하기 위하여 인간 p15 의 3차원 입체구조와 가장 유사하면서 대장균에서의 발현량이 높고, 가용성 등의 물성이 우수한 단백질들을 스크리닝하여 인간 p15 과 비교 및 분석함으로써, Cdk4/6 에 대한 결합력은 유지하면서 단백질 가용성(solubility)이 향상된 인간 p15 변이체를 설계하였다.

p15 단백질의 3차원 구조 중 외부(예컨대, 수성 환경)에 노출되거나, 및/또는 Cdk4/6와의 결합 부위와 무관한 위치의 아미노산 잔기를 선택하여 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 Cdk4/6에 대한 결합력은 유지하면서 가용성이 향상된 p15 단백질 변이체를 제작할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 예는 p15 단백질 변이체를 제공한다. 상기 p15 단백질 변이체는 단백질의 3차 구조에 있어서 외부(예컨대, 수성 환경)에 노출되어 있으면서 Cdk4/6와의 결합 부위와 무관한 위치의 아미노산 잔기들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환됨으로써, Cdk4/6에 대한 결합력은 유지하면서 가용성이 증진된 것을 특징으로 한다. 예컨대, 일 예는 p15 단백질의 3차 구조의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 친수성 아미노산으로 치환된 p15 단백질 변이체를 제공한다.

p15 단백질은 사이클린-의존 카이네이즈(CDK) 억제제로서, 레티노블라스토마 단백질(Rb)을 인산화시키는 CDKs를 불활성화시킴으로써 세포 주기의 진행을 둔화시키는 역할을 한다. p15 단백질의 이러한 역할에 의하여 세포가 무한대로 분열하여 암세포로 발전하는 것이 억제되므로, p15 단백질은 종양 억제자 (tumor suppressor)로서 유용하다.

본 발명에서 사용되는 p15 단백질은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래한 것일 수 있으며, 예컨대 인간 p15 단백질(서열번호 1: Accession No. P42772), 마우스 p15 단백질 (서열번호 4; Accession No. P55271), 래트 p15 단백질 (서열번호 5; Accession No. P55272) 등일 수 있다.

본 발명에 따른 p15 단백질 변이체는 상기한 p15 단백질의 아미노산 서열 중 단백질의 3차 구조의 용매(예컨대, 수성 용매)에 접하는 외부에 노출된 소수성 잔기로서 CDKs (예컨대, Cdk4/6)와의 결합부위와는 무관한 부위에 위치하는 아미노산 잔기들 중 하나 이상에서 변이가 일어난 것일 수 있다. 상기 변이는 상기 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산(예컨대, 친수성 아미노산)으로 치환된 것을 의미하는 것일 수 있다.

p15 단백질, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 p15 단백질에 있어서, 상기 치환이 일어날 수 있는 아미노산 잔기는 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열 내의 치환이 일어날 아미노산 잔기의 위치는 다음과 같다:

Wild-Type Human p15 (서열번호 1; Accession No. P42772)

MREENKGMPS GGGSDEGLAS AAARGLVEKV RQLLEAGADP NGVNRFGRRA

IQVMMMGSAR VAELLL L HGA EPN C ADPAT L TRPVHDAARE GFLDTLVVLH

RAGARLD V RD AWGR L PVDLA EERGHRDVAG YLRTATGD

(치환이 일어날 아미노산 잔기는 굵은 글씨로 표시함)

즉, 인간 P16 단백질의 치환이 일어날 아미노산은 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

이들 아미노산은 p15 단백질의 3차원 구조상 외부에 노출된 소수성 잔기들로서, 친수성 아미노산, 예컨대 음전하 또는 양전하를 띠거나 극성인 아미노산으로 치환될 수 있다.

예컨대, 본 발명에 따른 p15 단백질 변이체는 상기 아미노산 잔기들, 즉 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115) 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 등으로 치환된 것일 수 있다.

보다 구체적으로, p15 단백질 변이체는 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

67번째 위치의 류신(L67)의 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환,

74번째 위치의 시스테인(C74)의 세린(S)으로의 치환,

80번째 위치의 류신(L80)의 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환,

108번째 위치의 발린(V108)의 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 및

115번째 위치의 류신(L115)의 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환.

구체예에서, 상기 상기 p15 단백질 변이체는 서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67)의 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환, 74번째 위치의 시스테인(C74)의 세린(S)으로의 치환, 80번째 위치의 류신(L80)의 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 108번째 위치의 발린(V108)의 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 및 115번째 위치의 류신(L115)의 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환을 모두 갖는 것일 수 있다 (예컨대, 서열번호 2).

Human p15 variant (서열번호 2)

MREENKGMPS GGGSDEGLAS AAARGLVEKV RQLLEAGADP NGVNRFGRRA

IQVMMMGSAR VAELLL K HGA EPN S ADPAT S TRPVHDAARE GFLDTLVVLH

RAGARLD A RD AWGR T PVDLA EERGHRDVAG YLRTATGD

(치환이 일어난 아미노산 잔기는 굵은 글씨로 표시함)

다른 예에서, 상기 p15 단백질 변이체는 마우스 p15 (서열번호 4) 또는 래트 p15(서열번호 5)의 59번째 위치의 류신(L59)(서열번호 1의 L67에 해당), 66번째 위치의 시스테인(C66)(서열번호 1의 C74에 해당), 72번째 위치의 류신(L72)(서열번호 1의 L80에 해당), 100번째 위치의 발린(V100)(서열번호 1의 V108에 해당), 및 107번째 위치의 류신(L107) (서열번호 1의 L115에 해당)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R)으로 치환된 변이를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 상기 p15 단백질 변이체는 마우스 p15 (서열번호 4) 또는 래트 p15(서열번호 5)의 59번째 위치의 류신(L59)의 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환, 66번째 위치의 시스테인(C66)의 세린(S)으로의 치환, 72번째 위치의 류신(L72)의 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 100번째 위치의 발린(V100)의 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 및 107번째 위치의 류신(L107)의 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 갖는 것일 수 있다. 도 9에 인간 p15의 아미노산 서열과 마우스 p15 및 래트 p15의 아미노산 서열을 서로 비교하여 나타내었다. 도 9에서, 인간 p15의 변이 위치에 해당하는 마우스 p15 및 래트 p15의 아미노산 잔기를 확인할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 p15 단백질 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다.

상기 p15 단백질 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화 하는 것일 수 있으며, 예컨대 서열번호 3 (417 bp; GC content: 69%)의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL^λ프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환(재조합 벡터 도입)된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 배양함으로써 제조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.

상기 p15 단백질 변이체에서 변이가 일어나는 아미노산 잔기들은 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 잔기들 중에서 소수성 잔기로서, 수성 환경에서 용매와 접촉하여 단백질의 가용성에 영향을 주는 잔기들이다. 상기 p15 단백질 변이체는 상기 외부 노출 소수성 잔기들 중에서 하나 이상이, 예컨대, 전하를 띠는 아미노산 또는 극성 아미노산과 같은 친수성 아미노산으로 변이됨으로써, 단백질의 가용성이 증진된 것이다. 이와 같이 단백질의 가용성의 증진됨에 의하여, 상기 p15 단백질 변이체는 단백질의 발현 및 정제시의 침전 현상이 방지되어 단백질 발현량 (또는 단백질의 세포 외부로의 분비량)이 증가될 수 있으며, 제제화 및/또는 보관시의 안정성이 향상되어, 체내 투여시 유효 전달량이 높은 수준으로 유지될 수 있다. 이와 동시에, 상기 변이가 일어나는 아미노산 잔기들은 Cdk4/6와의 결합에 영향을 미치지 않는 부위에 위치하는 것이므로, 상기 p15 단백질 변이체는 Cdk4/6과 같은 CDKs와의 결합력은 야생형 p15 단백질과 동등 정도로 유지하여, 세포 주기 조절 기능을 유지할 수 있다. 이와 같이, 상기 p15 단백질 변이체는 숙주세포에서의 발현량이 증진되어 대량 생산에 유리하고, 안정성이 증진되어 체내 투여시 체내에 전달되는 유효량이 증가되는 한편, CDKs와의 결합력은 유지되어 세포 주기 조절 및 이를 통한 무한대 세포 분열로 인한 암세포화 억제 효과를 발휘함으로써, 효율적이고 효과가 우수한 항암제로서 제공될 수 있다.

이에, 다른 예는 상기 p15 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 p15 단백질 변이체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 예는 상기 p15 단백질 변이체의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 제공한다. 또 다른 예는 상기 p15 단백질 변이체의 암의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.

상기 p15 단백질 변이체를 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 유효성분인 p15 단백질 변이체의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분을 기준으로 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에서 약학적 유효량은 유효성분이 목적하는 약학적 활성을 나타낼 수 있는 p15 단백질 변이체의 양을 의미하는 것으로, 상기한 투여량 범위일 수 있다.

또한 상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 선택된 환자 또는 상기 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있으며, 암을 앓고 있거나 암을 앓을 위험이 있는 환자 또는 상기 환자로부터 분리된 세포 또는 조직, 예컨대 암세포 또는 암조직일 수 있다.

상기 암은 p15 단백질의 발현 감소 및/또는 기능 이상과 관련된 암일 수 있으며, 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암도 포함한다.

상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 및/또는 전이(metastasis) 등을 억제하여, 이로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.

다른 예에서, p15 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 다른 아미노산으로 변이시키는 단계를 포함하는 가용성이 증진된 p15 단백질 변이체의 제조 방법 또는 p15 단백질의 가용성 증진 방법이 제공된다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 p15 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들은 단백질의 3차 구조의 용매에 접하는 외부에 노출된 소수성 잔기로서 CDKs (예컨대, Cdk4/6)와의 결합부위와는 무관한 부위에 위치하는 아미노산 잔기들로서, 서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 변이는 상기 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 것을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이는 서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 아미노산을 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 으로 치환하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 가용성이 증진된 p15 단백질 변이체의 제조 방법 또는 p15 단백질의 가용성 증진 방법은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환을 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다:

서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67)을 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로 치환,

서열번호 1의 74번째 위치의 시스테인(C74)을 세린(S)으로 치환,

서열번호 1의 80번째 위치의 류신(L80)을 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로 치환,

서열번호 1의 108번째 위치의 발린(V108)을 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로 치환, 및

서열번호 1의 115번째 위치의 류신(L115)을 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로 치환.

또 다른 예에서, 상기 p15 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들은 단백질의 3차 구조의 용매에 접하는 외부에 노출된 소수성 잔기로서 CDKs (예컨대, Cdk4/6)와의 결합부위와는 무관한 부위에 위치하는 아미노산 잔기들로서, 마우스 p15 (서열번호 4) 또는 래트 p15(서열번호 5)의 59번째 위치의 류신(L59)(서열번호 1의 L67에 해당), 66번째 위치의 시스테인(C66)(서열번호 1의 C74에 해당), 72번째 위치의 류신(L72)(서열번호 1의 L80에 해당), 100번째 위치의 발린(V100)(서열번호 1의 V108에 해당), 및 107번째 위치의 류신(L107)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 변이는 상기 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 것을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 59번째 위치의 류신(L59), 66번째 위치의 시스테인(C66), 72번째 위치의 류신(L72), 100번째 위치의 발린(V100), 및 107번째 위치의 류신(L107)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 아미노산을 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 으로 치환하는 것일 수 있다.

서열번호 4 또는 서열번호 5의 59번째 위치의 류신(L59)을 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로 치환,

서열번호 4 또는 서열번호 5의 66번째 위치의 시스테인(C66)을 세린(S)으로 치환,

서열번호 4 또는 서열번호 5의 72번째 위치의 류신(L72)을 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로 치환,

서열번호 4 또는 서열번호 5의 100번째 위치의 발린(V100)을 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로 치환, 및

서열번호 4 또는 서열번호 5의 107번째 위치의 류신(L107)을 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로 치환.

일 예에서, 상기 p15 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들은 단백질의 3차 구조의 용매에 접하는 외부에 노출된 소수성 잔기로서, CDKs (예컨대, Cdk4/6)와의 결합부위와는 무관한 부위에 위치하는 아미노산 잔기들일 수 있다. 이들 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들은 p15 단백질과 같이 ANK repeat (ankyrin repeat)를 가지면서 대장균 등의 선택된 숙주세포에서의 발현 수준 및 가용성 정도 등이 높은 단백질들 중에서, p15 단백질과 2차 구조 또는 3차 구조가 유사한 단백질들을 선택하여, p15 단백질과 아미노산 서열, 2차 구조의 배열, 및 3차 구조를 비교 분석하여 선택된 것들일 수 있다. 예컨대, 상기 ANK repeat를 가지면서 대장균 등의 선택된 숙주세포에서의 발현 수준 및 가용성 정도 등이 높은 단백질들 중에서 p15 단백질과 2차 구조 또는 3차 구조가 유사한 단백질은 DARPins (designed ankyrin repeat proteins; PDB 3HG0; 서열번호 7) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

참고로, 인간 p15 단백질(서열번호 1)과 DARPins과의 이차 구조 기반의 서열 비교 결과를 도 2 내지 4에 나타내었다.

도 2는 Phyre2 를 이용한 인간 p15 단백질의 2차 구조 분석 결과를 보여준다 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/). 도 3은 Phyre2 를 이용한 인간 p15 단백질의 3차원 구조 모델링 결과를 보여준다 (http://http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/).

DALI database(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/) 조사 결과, DARPin (PDB 3HG0) 이 human p15 의 3차원 구조와 가장 유사하면서, 대장균 발현시 향상된 solubility 를 갖는 것으로 나타나서, p15 단백질 변이지점을 판단하는데 사용하였다. 도 4는 단백질 2차구조 위치(주로 α-helix)를 기준으로 한 인간 p15 및 DARPin 3HG0 의 아미노산 서열의 배열 분석(alignment) 결과를 보여준다.

도 5는 상기 도 3 및 도 4의 단백질의 3차원 구조분석을 통해 얻어진 인간 p15 의 변이 지점(mutation points)을 보여주는 모식도이다. 상기 변이 지점은 두 단백질의 아미노산 서열분석, 2차구조 배열 분석 및 3차구조 사이의 차이 등을 분석하여 얻어진 것으로, 용매 노출 영역(solvent-exposed area)에 노출된 소수성 잔기로이며, Cdk4/6 와 결합을 방해 하지 않는 부분이다.

이와 같이, 가용성을 높이고자 하는 목적 단백질과, 가용성이 높고 상기 목적 단백질과 유사한 2차 또는 3차 구조를 갖는 비교 단백질과의 2차 또는 3차 구조 기반의 아미노산 서열 분석을 통하여 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조를 분석하고, 이를 통하여 목적 단백질의 가용성을 높일 수 있는 변이 위치(용매 노출 영역에 노출되어 용매와 접촉하고 소수성 아미노산을 가지면서 목적 단백질의 원래 기능에 영향이 없는 위치)를 탐색하고, 이 위치의 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 변이시킴으로써, 목적 단백질의 가용성을 증진시키는 것이 가능하다.

따라서, 다른 예는 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조 분석 방법, 및 상기 구조 분석 방법을 이용하는 목적 단백질의 가용성 증진을 위한 정보 제공 방법 또는 가용성 증진 방법을 제공한다.

상기 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조 분석 방법은,

목적 단백질과 비교 단백질의 2차 또는 3차 구조 기반의 서열 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 2차 또는 3차 구조 기반의 서열 분석은 목적 단백질과 비교 단백질의 아미노산 서열을 2차 구조 또는 3차 구조상에서 배열하여 비교하는 것을 의미한다.

상기 목적 단백질은 구조를 분석하고자 하는 모든 단백질일 수 있으며, 예컨대, 용매 가용성을 높여서 제제화시 안정성을 도모하고 체내 전달 효율을 높이고자 목적하는 단백질로서, 생체에서 유리한 활성을 나타내는 모든 단백질일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 단백질은 INK4 계열 단백질 (예컨대, p15(INK4b; 예컨대, 인간 p15 단백질 (Accession No. P42772), 마우스 p15 단백질 (Accession No. P55271), 래트 p15 단백질 (Accession No. P55272) 등), p16(INK4a; 예컨대, 인간 p16 단백질(Accession No. NP_000068; 서열번호 18), 마우스 p16 단백질 (Accession No. NP_001035744; 서열번호 20), 래트 p16 단백질 (서열번호 21) 등), p18(INK4c; 예컨대, 인간 p18 단백질(Accession No. NP_001253), 마우스 p18 단백질(Accession No. NP_031697) 등), p19(INK4d; 예컨대, 인간 p19 단백질(Accession No. NP_001791), 마우스 p19 단백질(Accession No. NP_034008)), 등), p53 (예컨대, 인간 p53 단백질(Accession No. NP_000537), 마우스 p53 단백질(Accession No. NP_001120705 등) 등의 다양한 항암 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비교 단백질은 가용성이 높고 상기 목적 단백질과 유사한 2차 또는 3차 구조를 갖는 단백질로서, 입수 용이성을 위하여 대장균 등 숙주 세포에서의 발현 효율이 높은 단백질일 수 있다. 예컨대, 상기 비교 단백질은 ANK repeat를 갖는 단백질, 예컨대, DARPins (designed ankyrin repeat proteins) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

DARPin (designed ankyrin repeat protein)은 표적 단백질에 대하여 높은 특이성과 높은 결합 친화도를 보이는 유전공학적으로 제작된 항체 모사 단백질 (antibody mimetic protein)이다. DARPin은 천연 안키린 (ankyrin; ANK) 단백질로부터 유래된 것으로 ANK 반복 단위체(ankyrin repeat motif)가 2개 이상 또는 3개 이상, 예컨대 3개, 4개, 또는 5개 반복된 구조를 갖는다. 상기 반복 단위체가 3개, 4개, 또는 5개 반복된 DARPin의 경우 분자량이 각각 약 10 kDa, 14 kDa 또는 약 18 kDa 정도이다.

일 예에서, 상기 비교 단백질로서 사용 가능한 DARPins은 4 ANK repeat 함유 DARPin (예컨대, DARPin 3HGO, 2Y0B, 2XZT, 2XZD, 2V4H 등), 5 ANK repeat 함유 DARPin (예컨대, DARPin 2Y1L, 2J8S, 4DX6, 5V5Q, 4DRX, 2P2C, 3NOG 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

비교 단백질로서 사용 가능한 DARPins의 아미노산 서열을 아래의 표 1 및 표 2에 나타내었다:

4 ANK repeat 함유 DARPin

DARPin	아미노산 서열
3HGO	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAEDKVGLTPLHLAAMNDHLEIVEVLLKNGADVNAIDAIGETPLHLVAMYGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 7)
2Y0B	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEATRAGQDDEVRILMANGADVNAMDDAGVTPLHLAAKRGHLEIVEVLLKHGADVNARDIWGRTPLHLAATVGHLEIVEVLLEYGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 8)
2XZT	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEATRAGQDDEVRILMANGADVNAMDDAGVTPLHLAAKRGHLEIVEVLLKHGADVNASDSWGRTPLHLAATVGHLEIVEVLLEYGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 9)
2XZD	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEATRAGQDDEVRILMANGADVNAMDDAGVTPLHLAAKRGHLEIVEVLLKHGADVNASDIWGRTPLHLAATVGHLEIVEVLLEYGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 10)
2V4H	HHHHHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNANDRKGNTPLHLAADYDHLEIVEVLLKHGADVNAHDNDGSTPLHLAALFGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 11)

5 ANK repeat 함유 DARPin

DARPin	아미노산 서열
2Y1L	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGRDDEVRILMANGADVNAEDASGWTPLHLAAFNGHLEIVEVLLKNGADVNAVDHAGMTPLRLAALFGHLEIVEVLLKNGADVNANDMEGHTPLHLAAMFGHLEIVEVLLKNGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 12)
2J8S	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGRDDEVRILMANGADVNAADVVGWTPLHLAAYWGHLEIVEVLLKNGADVNAYDTLGSTPLHLAAHFGHLEIVEVLLKNGADVNAKDDNGITPLHLAANRGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKFGKTAFDISINNGNEDLAEILQKLN (서열번호 13)
4DX6	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGRDDEVRILMANGADVNAADVVGWTPLHLAAYWGHLEIVEVLLKNGADVNAYDTLGSTPLHLAAHFGHLEIVEVLLKNGADVNAKDDNGITPLHLAANRGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKFGKTAFDISINNGNEDLAEILQKLN (서열번호 14)
4DRX	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNATDASGLTPLHLAATYGHLEIVEVLLKHGADVNAIDIMGSTPLHLAALIGHLEIVEVLLKHGADVNAVDTWGDTPLHLAAIMGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 15)
2P2C	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNATDWLGHTPLHLAAKTGHLEIVEVLLKYGADVNAWDNYGATPLHLAADNGHLEIVEVLLKHGADVNAKDYEGFTPLHLAAYDGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 16)
3NOG	MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNASDHVGWTPLHLAAYFGHLEIVEVLLKNGADVNADDSLGVTPLHLAADRGHLEVVEVLLKNGADVNANDHNGFTPLHLAANIGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (서열번호 17)

(상기 표 1 및 2에 기재된 아미노산 서열 중 밑줄로 표시된 부분은 단백질 정제를 위한 N-terminal His tag 부위이므로, 정제된 단백질은 이들 부위를 포함하지 않을 수 있다.)

예컨대, 구조적 유사성을 고려할 때, 비교단백질로서, p15 또는 p16의 경우에는 4 ANK repeat 함유 DARPin (예컨대, DARPin 3HGO, 2Y0B, 2XZT, 2XZD, 2V4H 등)를 사용할 수 있으며, p18 또는 p19의 경우에는 5 ANK repeat 함유 DARPin (예컨대, DARPin 2Y1L, 2J8S, 4DX6, 5V5Q, 4DRX, 2P2C, 3NOG 등)를 사용할 수 있다.

상기 가용성 증진을 위한 정보 제공 방법 또는 가용성 증진 방법은 상기 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조 분석 방법을 기초로 할 수 있다. 상기 정보 제공 방법은 목적 단백질의 가용성 증진을 위한 변이 위치에 대한 정보를 제공함으로써 목적 단백질의 가용성 증진에 기여하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 목적 단백질의 가용성 증진을 위한 정보 제공 방법 또는 목적 단백질의 가용성 증진 방법은

목적 단백질과 비교 단백질의 2차 또는 3차 구조 기반의 서열 분석을 수행하여 목적 단백질과 비교 단백질의 용매 노출 영역을 비교하는 단계; 및

상기 목적 단백질과 비교 단백질의 용매 노출 영역의 아미노산 중 목적 단백질은 소수성 아미노산이고 비교 단백질은 친수성 아미노산인 위치를 탐색하는 단계

를 포함할 수 있다.

이 때 적용 가능한 목적 단백질과 비교 단백질은 앞서 설명한 바와 같다.

일 예에서, 상기 가용성 증진을 위한 정보 제공 방법 또는 가용성 증진 방법은 상기 두 단백질(목적 단백질/비교 단백질)의 용매 노출 영역을 비교하는 단계 이전에 앞서 설명한 비교 단백질을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 가용성 증진을 위한 정보 제공 방법 또는 가용성 증진 방법은 상기 두 단백질의 용매 노출 영역을 비교하는 단계 이전 (및/또는 비교 단백질을 선택하는 단계 이후)에 목적 단백질 및 비교 단백질의 2차 또는 3차 구조 정보를 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단백질의 2차 또는 3차 구조 정보는 단백질의 아미노산 서열 정보를 포함하는 다양한 데이터베이스에 준비되어 있거나 단백질 구조(서열) 분석 수단을 통하여 얻을 수 있다. 상기 단백질의 2차 또는 3차 구조 정보를 준비하는데 사용 가능한 데이터베이스 및/또는 분석 수단은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/), DALI database(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/) 등으로 이루어진 군에서 선택된 데이터베이스의 정보를 이용하는 통상의 단백질 구조(서열) 분석 수단일 수 있다.

상기 용매 노출 영역을 비교하는 단계에 있어서, 목적 단백질과 비교 단백질의 용매 노출 영역은 상기 단백질의 2차 또는 3차 구조 정보를 통하여 결정할 수 있다.

상기 목적 단백질의과 비교 단백질의 용매 노출 영역의 아미노산 중 목적 단백질은 소수성 아미노산이고 비교 단백질은 친수성 아미노산인 위치를 탐색하는 단계를 통하여 탐색된 목적 단백질의 소수성 아미노산이 변이(치환)의 후보 위치일 수 있으며, 이를 친수성 아미노산으로 치환시킴으로써, 목적 단백질의 가용성을 증진시킬 수 있다.

따라서, 상기 목적 단백질의 가용성 증진 방법은 상기 탐색하는 단계 이후에, 상기 탐색된 목적 단백질의 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 치환될 소수성 아미노산은, 예컨대, 류신, 시스테인, 발린, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 이소류신(I), 프롤린(P), 메티오닌(M) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 치환되는 친수성 아미노산은 예컨대, 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 아르기닌(R) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 변이 후보 위치로 탐색된 소수성 아미노산은 하나 이상일 수 있으며, 이들은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 친수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한 변이(치환) 후 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조의 변화를 방지하거나 본래 기능에 영향이 없도록 최소화하기 위하여, 상기 친수성 아미노산은 치환되는 소수성 아미노산의 크기를 고려하여 단백질의 2차 또는 3차 구조에 유의미한 변화가 없도록(본래 기능에 영향이 없도록) 하는 것으로 선택할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 고려할 수 있는 사항이다.

상기 목적 단백질의 본래 기능을 유지하면서 가용성을 증진시키기 위하여, 상기 변이 후보 위치는 용매 노출 영역에 노출되어 용매와 접촉하고 소수성 아미노산을 가지면서 동시에 목적 단백질의 원래 기능에 영향이 없는 부위, 예컨대 상기 목적 단백질의 활성 부위 또는 상기 목적 단백질과 이의 상호작용 물질 간의 상호작용(예컨대 결합) 부위 등을 제외한 부위에 위치하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 p15 단백질 변이체는 가용성이 크게 증진되어 안정한 형태로 제제화될 수 있으면서도 Cdk4/6에 대한 결합력은 유지하여, 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 p15 단백질 변이체는 세포막 투과 펩타이드와 연결되어 세포내 투과성이 증진되어 보다 효과적인 암 치료를 가능하게 한다.

도 1은 세포주기 및 3개의 체크 포인트(checkpoint)를 보여주는 모식도이다.
도 2는 Phyre2 를 이용한 인간 p15 단백질의 2차 구조 분석 결과를 보여준다 (http://http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/).
도 3은 Phyre2 를 이용한 인간 p15 단백질의 3차원 구조 모델링 결과를 보여준다 (http://http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/).
도 4는 단백질 2차구조 위치(주로 α-helix)를 기준으로 한 인간 p15 및 DARPin 3HG0 의 아미노산 서열 alignment 결과를 보여준다.
도 5는 상기 도 3 및 도 4의 단백질의 3차원 구조분석을 통해 얻어진 인간 p15 의 변이 지점(mutation points)을 보여주는 모식도이다.
도 6은 야생형 p15 및 p15 변이체의 단백질 발현양상 (좌)을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 His-affinity column으로부터 용출된 인간 p15 변이체의 양을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 8은 p15 변이체의 단백질의 Cdk6 단백질과의 결합력을 보여주는 그래프이다.
도 9는 인간 p15의 아미노산 서열과 마우스 p15 및 래트 p15의 아미노산 서열을 서로 비교하여 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: p15 단백질의 변이 위치 결정

p15 단백질의 3차원 구조 상의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들 중 친수성 잔기로 치환할 위치를 결정하기 위하여, 다음의 시험을 수행하였다.

Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)를 이용하여 인간 p15 단백질(서열번호 1)의 2차 구조를 분석하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, Phyre2(http://http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)를 이용하여 인간 p15 단백질(서열번호 1)의 3차원 구조를 모델링하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

DALI database(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/)를 조사하여, 3 ANK repeat를 갖는 DARPin (PDB 3HG0)(서열번호 7)이 상기 얻어진 인간 p15의 3차원 구조와 가장 유사하면서 대장균 발현시 향상된 solubility 를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 기초로 DARPin (PDB 3HG0)(서열번호 7)를 p15 단백질 변이지점을 판단하는데 사용하였다.

단백질 2차구조 위치(주로 α-helix)를 기준으로, 인간 p15 단백질 (서열번호 1) 및 DARPin 3HG0 (서열번호 7)의 아미노산 서열의 배열 분석(alignment) 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 분석은 CCP4 module (ftp://ftp.ccp4.ac.uk/ccp4/4.0.1/ccp4-4.0.1/ccp4i/help/modules/coord_utils.html)의 LSQKAB 프로그램으로 superposition (least-square method)하여 단백질 구조의 유사성을 확인하여 수행하였다.

상기 얻어진 도 3 및 도 4의 단백질의 3차원 구조분석을 통해 얻어진 결과를 통하여, 인간 p15 의 변이 지점(mutation points)을 선택하여 도 5에 나타내었다.

상기 결과를 기초로, 인간 p15 단백질(서열번호 1)의 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)을 용매 노출 영역(solvent-exposed area)에 노출된 소수성 잔기이면서, Cdk4/6 와 결합을 방해 하지 않는 잔기인 것으로 확인하고, p15 단백질 변이체의 치환 위치로 결정하였다.

실시예 2: p15 단백질 변이체 발현 균주의 제작

상기 실시예 1의 결과를 기초로, 인간 p15 단백질 (서열번호 1)와, 인간 p15 단백질 (서열번호 1) 중에서 67번째 위치의 류신(L67)이 라이신(K)으로, 74번째 위치의 시스테인(C74)이 세린(S)으로, 80번째 위치의 류신(L80)이 세린(S)으로, 108번째 위치의 발린(V108)이 알라닌(A)으로, 115번째 위치의 류신(L115)이 트레오닌(T)으로 각각 치환된 p15 단백질 변이체 (서열번호 2)를 각각 제작하였다.

상기 서열번호 1의 인간 p15 단백질(wild-type)과 서열번호 2의 p15 단백질 변이체를 제작하기 위하여, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (인간 p15 단백질의 코딩 염기서열: 서열번호 6; 인간 p15 단백질 변이체 코딩 염기서열: 서열번호 3)를 사용하였다. 보다 구체적으로, 제한효소 NdeI 및 XhoI (NEB)를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드를 pET21b 벡터 (Novagen)에 클로닝하여, 인간 p15 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 pET21b:WT p15INK4b와 인간 p15 단백질 변이체 발현을 위한 재조합 벡터 pET21b:p15INK4b variant 를 각각 제작하였다. 상기 제작된 재조합 벡터를 대장균 균주 (BL21(DE3)Codon Plus-RIPL; Invitrogen)에 도입시켜, 인간 p15 단백질 발현을 위한 재조합 균주 pET21b:WT p15INK4b/BL21(DE3)CodonPlus-RIPL와 인간 p15 단백질 변이체 발현을 위한 재조합 균주 pET21b:p15INK4b variant/BL21(DE3)Codon Plus-RIPL를 각각 제작하였다.

실시예 3: p15 단백질 변이체의 가용성 실험

상기 실시예 2에서 제작된 pET21b:WT p15INK4b/BL21(DE3)CodonPlus-RIPL (primary culture) 100uL(microliter)와 pET21b:p15INK4b variant/BL21(DE3)Codon Plus-RIPL (primary culture) 100uL을 각각 5mL의 LB 배지(Sigma; Tryptone (pancreatic digest of casein) 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하고, 37℃에서 O/N(overnight) 동안 배양하였다. OD600 값이 ~0.8 정도 되었을 때 1mM IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 넣어주고 18℃에서 12시간 더 배양하였다. 상기 배양물 5mL을 취하여 4℃에서 4000rpm로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액은 버리고 침전된 세포를 0.4mL lysis buffer (1x PBS pH7.4)로 재현탁시켰다. 상기 얻어진 세포 현탁물을 소니케이션(sonication: pulse 1s/1s, 50% amplitude, 1min)하여 세포를 용해시켰다. 상기 얻어진 세포 용해물에서 20uL를 샘플링하였다 (total sample: total). 또한, 상기 얻어진 세포 용해물을 4℃에서 13200rpm로 10분동안 원심분리한 후, 상청액 20uL을 샘플링하고 (supernatant sample: sup), 침전된 봉입체(inclusion body: IB)를 1x PBS pH7.4 0.4mL로 재현탁하여 20uL을 샘플링(inclusion body sample)하였다. 상기 얻어진 각각의 샘플을 95℃에서 5분 동안 끓이고 SDS-PAGE를 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 야생형 p15 단백질은 대부분(거의 100%) 세포(whole cell; W) 안에 존재하는데 반하여, p15 단백질 변이체는 많은 양(90% 이상)이 상청액(S)에 존재하는 것으로 나타났다. 이는 야생형 p15 단백질이 대장균 균주에서 거의 불용(insoluble)한 상태로 발현되는 반면, p15 단백질 변이체는 많은 양(90% 이상)이 가용(soluble)한 상태로 발현되어 세포막을 통하여 세포 외로 분비되는 분비량이 현저하게 증가됨을 보여준다 (p15의 분자량: 14721.6Da, p15 변이체의 분자량: 14654.4Da).

실시예 4: p15 단백질 변이체의 정제

상기 실시예 2에서 제작된 pET21b:p15INK4b variant/BL21(DE3)Codon Plus-RIPL (primary culture) 2mL을 1L의 LB 배지 (Sigma; Tryptone (pancreatic digest of casein) 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 넣고 37℃에서 O/N(overnight) 동안 배양하였다. OD600 값이 ~0.8 정도 되었을 때 1mM IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 넣어주고 18℃에서 12시간 더 배양하였다. 상기 배양물 1L을 취하여 4℃에서 4000rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액은 버리고, 침전된 세포를 50mL lysis buffer (20mM Tris-HCl pH8.0, 1mM PMSF)로 재현탁하였다. 상기 세포 재현탁물을 소니케이션(sonication: pulse 1s/1s, 50% amplitude, 1min, 4 times total)하여 세포를 용해시켰다. 상기 용해된 세포를 4℃에서 18000rpm로 50분동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 AKTA FPLC 시스템(GE healthcare)을 이용하여 이온교환 크로마토그래피(Ion-exchange chromatography)를 수행하였다. 이때 사용된 컬럼과 버퍼는 다음과 같다:

컬럼: HisTrap crude FF, 5mL size, GE healthcare,

버퍼: A= 20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl, B=20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl, 500mM imidazole

선형 농도구배(linear gradient; 0 -> 500mM imidazole, 100mL length)를 통하여 p15 단백질 변이체를 elution시켰다. 상기 용출물에 대하여 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography; SEC)를 수행하였으며, 이때 사용된 컬럼과 버퍼는 다음과 같다:

컬럼: 10/300 superdex-75gl (GE healthcare)

버퍼: 1x PBS pH7.4

상기 크기-배제 크로마토그래피로 분리한 p15 단백질 변이체를 YM-10 필터(Millipore)를 이용하여 최종 농도 5mg/mL(3mM)까지 한외여과(ultrafiltration)하여, p15 단백질 변이체를 정제하였다.

상기 정제 결과를 도 7에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 정제된 p15 단백질 변이체는 크기-배제 크로마토그래피 분석 결과 균일한 한 형태로 존재하며, 0.3mM 이상의 높은 농도로 농축이 가능하다.

실시예 5: p15 단백질 변이체와 Cdk4 /6와 결합력 실험

상기 실시예 2에서 제조된 p15 단백질 변이체와 Cdk4/6과의 결합력을 다음과 같이 시험하였다.

Bicarbonate/carbonate buffer (100 mM, pH9.6; 3.03 g Na₂CO₃, 6.0 g NaHCO₃, in 1000 ml distilled water)를 사용하여 Cdk6 단백질 (abcam's ab84717, recombinant full length Human Cdk6(amino acids 1-326) with N-terminal His tag)을 1?/ml 농도로 희석한 뒤, ELISA용 96-well plate(Nunc's MaxiSorp)의 각 well에 50?씩 분주하고, 4℃에서 overnight incubation하였다. plate의 Cdk6 용액을 제거한 뒤, PBST(PBS+Tween20: 1.16g Na₂HPO₄, 0.1g KCl, 0.1g K₃PO₄, 4.0g NaCl (in 500 ml distilled water), pH 7.4; 0.05% (v/v) Tween20) 200?로 두 번 세척하여, well 표면을 Cdk6 단백질로 코팅하였다. 그 후, 200?의 Blocking solution(5%(v/v) skim milk in PBST)으로 실온에서 1시간동안 인큐베이션하여 반응시켰다. Blocking solution을 제거한 뒤, PBST 200?로 두 번 세척하였다.

상기 Cdk6 단백질로 코팅된 각 well에 상기 실시예 3에서 정제된 p15 단백질 변이체를 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10?)로 100?씩 각각 넣고, 실온에서 2시간동안 인큐베이션하여 반응시켰다. 그 후, 미반응 단백질을 제거하고, 200?의 PBST로 두 번 세척하였다.

항-GST 항체 (GE Healhcare's; 17-4577-01 1차 항체)를 Blocking solution(5%(v/v) skim milk in PBST)으로 1/200 희석하여, 100?씩 각 well에 넣고, 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 그 후, 항체 용액을 제거한 뒤, 200?의 PBST로 두 번 세척하였다.

항-goat IgG 항체 (HRP) (Thermo's PA1-28664; 이차항체)를 Blocking solution으로 1/10000 희석하여, 100?씩 각 well에 넣고, 실온에서 30분동안 인큐베이션하였다. 그 후, 항체 용액을 제거한 뒤, 200?의 PBST로 4번, 200?의 PBS로 2번 세척하였다.

세척액을 완전히 제거 한 뒤, 발색기질로서 Super AquaBlue ELISA Substrate 용액 (eBioscience사, Cat.Number: # 00-4203-58) 100ul을 가하였다. 원하는 정도의 발색 세기가 되면 microwell reader(Molecular Device사, 모델명: 340PC384)로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교를 위하여, p15 단백질(wild-type)과 구조가 유사한 p16 단백질(wild-type; 서열번호 18) 및 p16 단백질의 변이체 (서열번호 19)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 Cdk6 단백질과의 결합력을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다 (mt p15: p15 단백질 변이체; wt p16: wild-type p16 단백질; mt p16: p16 단백질 변이체). 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 p15 단백질 변이체는 p15 단백질(wild-type)과 유사한 구조의 p16 단백질(wild-type)과 동등한 정도로 Cdk4/6과의 결합력을 유지하고 있음을 확인할 수 있다.

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> p15 protein variant and composition for preventing or treating a cancer containing the same <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Wild-Type Human p15 (Accession No. P42772) <400> 1 Met Arg Glu Glu Asn Lys Gly Met Pro Ser Gly Gly Gly Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Gln 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Gly Val Asn Arg Phe Gly Arg 35 40 45 Arg Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu 50 55 60 Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu 65 70 75 80 Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu 85 90 95 Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val 115 120 125 Ala Gly Tyr Leu Arg Thr Ala Thr Gly Asp 130 135 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Human p15 Variant <400> 2 Met Arg Glu Glu Asn Lys Gly Met Pro Ser Gly Gly Gly Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Gln 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Gly Val Asn Arg Phe Gly Arg 35 40 45 Arg Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu 50 55 60 Leu Leu Lys His Gly Ala Glu Pro Asn Ser Ala Asp Pro Ala Thr Ser 65 70 75 80 Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu 85 90 95 Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Ala Arg Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Arg Thr Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val 115 120 125 Ala Gly Tyr Leu Arg Thr Ala Thr Gly Asp 130 135 <210> 3 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence of human p15 variant <400> 3 atgcgcgaag aaaacaaagg catgccgagc ggcggcggca gcgatgaagg cctggcgagc 60 gcggcggcgc gcggcctggt ggaaaaagtg cgccagctgc tggaagcggg cgcggatccg 120 aacggcgtga accgctttgg ccgccgcgcg attcaggtga 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105 110 Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 130 135 <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 ANK repeat DARPin 2Y0B <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 8 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Thr Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Met Asp Asp Ala Gly Val 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ile Trp Gly 65 70 75 80 Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Val Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Glu Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe 100 105 110 Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 130 135 <210> 9 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala His Asp Asn Asp Gly 65 70 75 80 Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Phe Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe 100 105 110 Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 130 135 <210> 12 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 2Y1L <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 12 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Arg Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Ala Ser Gly Trp 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp His Ala Gly 65 70 75 80 Met Thr Pro Leu Arg Leu Ala Ala Leu Phe Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp Met Glu 100 105 110 Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Phe Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 13 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 2J8S <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 13 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Arg Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp Val Val Gly Trp 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp Thr Leu Gly 65 70 75 80 Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Phe Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Asn 100 105 110 Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Arg Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asn Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 14 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 4DX6 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 14 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Arg Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp Val Val Gly Trp 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp Thr Leu Gly 65 70 75 80 Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Phe Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Asn 100 105 110 Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Arg Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asn Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 15 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 4DRX <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 15 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Asp Ala Ser Gly Leu 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile Asp Ile Met Gly 65 70 75 80 Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Ile Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Thr Trp 100 105 110 Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Met Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 16 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 2P2C <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 16 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Asp Trp Leu Gly His 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Trp Asp Asn Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Asn Gly His Leu Glu Ile Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Glu 100 105 110 Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Asp Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 17 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 ANK repeat DARPin 3NOG <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal His tag for purification <400> 17 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 20 25 30 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser Asp His Val Gly Trp 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp Ser Leu Gly 65 70 75 80 Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Arg Gly His Leu Glu Val Val 85 90 95 Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp His Asn 100 105 110 Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Ile Gly His Leu Glu Ile 115 120 125 Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys 130 135 140 Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 165 <210> 18 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Wild-Type Human p16 <400> 18 Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu 20 25 30 Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro 35 40 45 Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu 50 55 60 Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg 65 70 75 80 Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val 85 90 95 Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg 100 105 110 Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg 115 120 125 Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg 130 135 140 Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp 145 150 155 <210> 19 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Human p16 Variant <400> 19 Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Lys Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu 20 25 30 Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro 35 40 45 Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu 50 55 60 Lys His Gly Ala Glu Pro Asn Ser Ala Asp Pro Ala Thr Ser Thr Arg 65 70 75 80 Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val 85 90 95 Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Ala Arg Asp Ala Trp Gly Arg 100 105 110 Thr Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg 115 120 125 Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg 130 135 140 Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp 145 150 155 <210> 20 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse_p16 <400> 20 Met Glu Ser Ala Ala Asp Arg Leu Ala Arg Ala Ala Ala Gln Gly Arg 1 5 10 15 Val His Asp Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Ser Pro Asn Ala 20 25 30 Pro Asn Ser Phe Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Asn 35 40 45 Val His Val Ala Ala Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Ala Asp Ser Asn Cys 50 55 60 Glu Asp Pro Thr Thr Phe Ser Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Gly Ser Gly Ala Arg Leu 85 90 95 Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Leu Asp Leu Ala Gln Glu 100 105 110 Arg Gly His Gln Asp Ile Val Arg Tyr Leu Arg Ser Ala Gly Cys Ser 115 120 125 Leu Cys Ser Ala Gly Trp Ser Leu Cys Thr Ala Gly Asn Val Ala Gln 130 135 140 Thr Asp Gly His Ser Phe Ser Ser Ser Thr Pro Arg Ala Leu Glu Leu 145 150 155 160 Arg Gly Gln Ser Gln Glu Gln Ser 165 <210> 21 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat_p16 <400> 21 Met Glu Ser Ser Ala Asp Arg Leu Ala Arg Ala Ala Ala Leu Gly Arg 1 5 10 15 Glu His Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala Ser Pro Asn Ala 20 25 30 Pro Asn Thr Phe Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Asn 35 40 45 Val Lys Val Ala Ala Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Asn Cys 50 55 60 Glu Asp Pro Thr Thr Leu Ser Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Gln Ala Gly Ala Arg Leu 85 90 95 Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Leu Asp Leu Ala Leu Glu 100 105 110 Arg Gly His His Asp Val Val Arg Tyr Leu Arg Tyr Leu Leu Ser Ser 115 120 125 Ala Gly Asn Val Ser Arg Val Thr Asp Arg His Asn Phe Cys Ser Ser 130 135 140 Thr Pro Arg Cys Leu Gly Leu Arg Gly Gln Pro Pro Lys Gln Arg 145 150 155

Claims

p15 단백질의 3차 구조의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 친수성 아미노산으로 치환된 p15 단백질 변이체.
제1항에 있어서,
상기 p15 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
상기 p15 단백질 변이체는 서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 으로 치환된 것인,
p15 단백질 변이체.
제2에 있어서, 다음 중 하나 이상의 치환을 포함하는 p15 단백질 변이체:
서열번호 1의 67번째 위치의 류신(L67)의 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환,
서열번호 1의 74번째 위치의 시스테인(C74)의 세린(S)으로의 치환,
서열번호 1의 80번째 위치의 류신(L80)의 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환,
서열번호 1의 108번째 위치의 발린(V108)의 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 및
서열번호 1의 115번째 위치의 류신(L115)의 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환.
제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는, p15 단백질 변이체.
제1항에 있어서,
상기 p15 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
상기 p15 단백질 변이체는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 59번째 위치의 류신(L59), 66번째 위치의 시스테인(C66), 72번째 위치의 류신(L72), 100번째 위치의 발린(V100), 및 107번째 위치의 류신(L107)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 으로 치환된 것인,
p15 단백질 변이체.
제2에 있어서, 다음 중 하나 이상의 치환을 포함하는 p15 단백질 변이체:
서열번호 4 또는 서열번호 5의 59번째 위치의 류신(L59)의 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환,
서열번호 4 또는 서열번호 5의 66번째 위치의 시스테인(C66)의 세린(S)으로의 치환,
서열번호 4 또는 서열번호 5의 72번째 위치의 류신(L72)의 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환,
서열번호 4 또는 서열번호 5의 100번째 위치의 발린(V100)의 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아스파라진(N)으로의 치환, 및
서열번호 4 또는 서열번호 5의 107번째 위치의 류신(L107)의 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 또는 세린(S)으로의 치환.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 p15 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제7항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
제7항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 p15 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 약한 조성물.
p15 단백질의 3차 구조의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 친수성 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는, p15 단백질의 가용성 증진 방법.
제12항에 있어서, 상기 p15 단백질의 3차 구조의 외부에 노출된 소수성 아미노산 잔기는 ANK 반복 단위체(ankyrin repeat motif)가 4개 또는 5개 반복된 DARPin (designed ankyrin repeat protein)과의 구조 비교를 통하여 결정된 것인, p15 단백질의 가용성 증진 방법.
제12항에 있어서, 상기 치환하는 단계는 서열번호 1의 p15 단백질의 67번째 위치의 류신(L67), 74번째 위치의 시스테인(C74), 80번째 위치의 류신(L80), 108번째 위치의 발린(V108), 및 115번째 위치의 류신(L115)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R)으로 치환하는 단계에 의하여 수행되는 것인, p15 단백질의 가용성 증진 방법.
제12항에 있어서, 상기 치환하는 단계는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 p15 단백질의 59번째 위치의 류신(L59), 66번째 위치의 시스테인(C66), 72번째 위치의 류신(L72), 100번째 위치의 발린(V100), 및 107번째 위치의 류신(L107)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 독립적으로 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아스파라진(N), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 또는 아르기닌(R) 으로 치환하는 단계에 의하여 수행되는 것인, p15 단백질의 가용성 증진 방법.
제12항에 있어서, 상기 DARPin은 DARPin 3HGO, DARPin 2Y0B, DARPin 2XZT, DARPin 2XZD, DARPin 2V4H, DARPin 2Y1L, DARPin 2J8S, DARPin 4DX6, DARPin 5V5Q, DARPin 4DRX, DARPin 2P2C, 및 DARPin 3NOG로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, p15 단백질의 가용성 증진 방법.