KR20210052449A - 재조합 단백질 변이체 - Google Patents

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KR20210052449A
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수딥 쿠마
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Abstract

서열 번호: 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변형 렉틴 단백질이 제공된다. 상기 아미노산 변형은, 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형; N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형; 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 중 하나 이상에서 선택된다. 상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는다.

Description

재조합 단백질 변이체
본 발명은 변형된 렉틴 단백질 및 변형된 렉틴 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 렉틴 단백질을 포함하는 약학 조성물 및 암세포의 검출, 암 진단 및 환자의 암 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 스크렐로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴 단백질 생산 방법에 관한 것이다.
렉틴은 다른 분자의 당 모이어티(sugar moieties)에 매우 특이적인 거대 분자, 매우 특이적인 탄수화물 결합 단백질이다. 렉틴은 세포 및 분자 수준에서 인식을 수행하고, 세포, 탄수화물 및 단백질을 수반하는 생물학적 인식 현상에서 많은 역할을 한다. 상기는 당단백질에 결합하고 침전시키며 적혈구를 응집시키는 2가 또는 다가의 탄수화물 결합 단백질이다. 동물에서 발견되는 렉틴은 대부분 세포 상호 작용을 돕는 것으로 종종 발견되나, 식물 렉틴은 잠재적인 포식자 또는 병원체를 막는 것으로 공지되어 있다.
정제된 렉틴은 혈액 분류(typing)에 사용되기 때문에 임상 환경에서 중요하다. 개인의 적혈구 상의 일부 당지질 및 당단백질이 렉틴에 의해 확인될 수 있다. 많은 렉틴은 악성 성장의 조기 발견을 나타내는 바이오마커(biomarkers) 또는 자가 포식(autophagy) 유도제로 사용되나 다른 렉틴은 또한 세포 자멸사를 통해 암 성장을 억제하는 능력을 나타낸다. 조절되지 않는 세포 증식으로 인해, 일부 탄수화물 모이어티는 암세포 상에 항원으로 발현된다. 렉틴은 악성 종양에 특이적으로 결합하기 때문에 암 치료에서 약물 전달 제제로 사용된다. 또한, 렉틴은 암 관련 경로를 조절하기 때문에 암 진단 및 치료제로서의 가능성이 있다.
렉틴이 결합하고 암세포 표면 상에서 특성화된 몇몇 항원이 있고; 대부분의 항원은 특정 유형의 암에 특이적이며, 상기 항원에 대한 렉틴 결합은 암세포에서 세포 자멸사 유도를 통해 암 성장의 억제를 초래할 수 있다. 현재, 대부분의 상업적으로 이용 가능한 렉틴은 식물 및 기타 진핵 생물 유래이다.
스크렐로티움 롤프시 렉틴(Sclerotium rolfsii lectin, SRL)은 토양 매개 식물 병원성 곰팡이 S. 롤프시의 균핵체에서 단리된 렉틴이다. SRL은 TF(Thomsen-Friedenreich) 항원 및 Tn 항원에 대한 특이성을 갖는다. TF 항원은 다양하고 상이한 인간 암세포의 세포 표면 상에서 과발현되는 이당류(Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)이다. Tn 항원은 단당류(GalNAc-α-)이다. TF 및 Tn 항원에 대한 특이성 때문에, SRL은 인간 대장암, 난소암 및 백혈병 세포에 결합하는 것으로 나타났다. SRL의 결정 구조는 결정(Leonidas et al., J Mol Biol. 2007 May 11;368(4):1145-61)되었으나, 결정 구조에서 확인된 탄수화물 결합 부위의 실험적 검증은 수행되지 않았다.
렉틴은 항암 도구로 많은 이점을 제공하나, 선택성 부족, 일관되지 않은 품질 및 성능 및 용이하게 확장할 수 없는 생산과 같은 많은 한계를 여전히 가지고 있다. 또한, 식물 유래 렉틴은 종종 상이한 범위의 글리칸 구조에 결합하는 것으로 보고되어 많은 응용 분야에 필요한 선택성이 부족하다. 또한, 식물 렉틴을 사용할 경우, 배치 대 배치 가변성이 일반적이다. 생성물의 품질은 식물 재료의 단리 방법 및 출발 식물 재료 자체의 품질에 따라 달라진다.
천연 소스에서 렉틴의 단리는, 그렇게 수득된 렉틴이 원하는 특성에 대한 일관성이 부족하기 때문에 신뢰할 수 없다. 또한, 천연 소스에서 단백질의 단리는 비싸고 어려운 과정이다. 천연 발생 렉틴을 단리하기 위해 사용되는 기술은, 특별히 단백질이 낮은 농도로만 존재할 경우 보통 매우 낮은 수율을 제공한다. 또한 상기는 때때로 동일한 렉틴의 동형 단백질을 구별할 수 없다. 따라서, 상기는 광범위한 불확실성을 제공하는 혼합물로 수득된다. 이런 의미에서, 재조합 DNA(rDNA) 기술에 의한 재조합 렉틴의 생산은, 훨씬 적은 시간으로 정확한 특성을 가지며 동시에 용이하게 확장 가능한 보다 양호하고 일관된 수율의 단일 단백질을 제공하는 장점이 있다. rDNA 기술을 이용하여 관심 단백질을 생산하는 유전자를 적절한 숙주로 전달할 수 있다. 이어서 단백질은 전통적인 방법에 비해 적은 시간과 노력으로 생성되고 단리될 수 있다.
문헌[국제 출원 WO 2010/095143]은, 각각 3 또는 5 개의 아미노산 치환에 의해 천연 SRL 서열에서 유래된 재조합 렉틴 변이체 Rec-2 및 Rec-3을 개시한다. 상기 변이체의 결정 구조가 보고되었다(Peppa et al., Molecules. 2015 Jun 12;20(6):10848-65).
문헌[국제 출원 WO 2014/203261]은 12 개의 아미노산 치환에 의해 천연 SRL 서열에서 유래된 재조합 렉틴 변이체를 개시한다.
대안적인 특성을 나타내는 추가 렉틴 변이체에 대한 필요성이 남아 있다. 특히, 암 진단 및 치료제로서 사용될 렉틴은 악성 종양/암세포에 대한 특이적인 친화도를 타협하지 않으면서 가용성 및 안정적인 것이 유리하다. 따라서, 악성 세포에 대한 친화도를 또한 유지하면서 용해도 및/또는 안정성을 갖고 적절한 숙주 세포에서 충분한 수준의 전이 유전자가 발현되는 재조합 렉틴을 생산하기 위해 새로운 재조합 렉틴 서열 및 효율적인 방법이 필요하다.
본 발명은 상기 요구 중 하나 이상을 해결하기 위해 노력한다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 이의 전문이 여기에 참조로 포함된 2018년 8월 31일에 출원된 인도 가출원 번호 제201821032765호의 우선권을 주장한다.
본 발명의 일 측면에 따라,
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형;
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형 - 여기에서 개시 메티오닌 절단이 ⅰ)의 아미노산 서열에 비해 증가됨 - ;
c) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 2량체 형성이 감소된 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 산화가 감소된 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형 렉틴 단백질이 제공된다.
일부 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는다. 일부 추가 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 세포독성 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따라, 변형 렉틴 단백질이 제공되고, 여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a. ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
b. ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형;
c. 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d. 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중 어느 하나에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 변형 렉틴 단백질이 제공되고, 여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형;
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형 - 여기에서 개시 메티오닌 절단이 ⅰ)의 아미노산 서열에 비해 증가됨 - ;
c) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 2량체 형성이 감소된 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 산화가 감소된 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중 어느 하나에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 변형 렉틴 단백질은 생물학적 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1에 대해 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라,
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형 렉틴 단백질이 제공되고,
여기에서 아미노산 치환은:
a. 1차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환 - 여기에서 상기 치환 아미노산은:
ⅰ. 27번 위치 및/또는 28번 위치에서 비극성, 극성, 산성 또는 염기성 아미노산;
ⅱ. 47번 위치에서 비극성 아미노산 및/또는 48번 위치에서 극성 아미노산;
ⅲ. 70번 위치에서 비극성 아미노산, 71번 위치에서 극성 아미노산 및/또는 72번 위치에서 비극성 아미노산; 및/또는
ⅳ. 105번 위치에서 임의의 기타 아미노산;
중 하나 이상에서 선택됨 - ;
b. 2차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환 - 여기에서 상기 치환 아미노산은:
ⅰ. 77번 위치에서 비극성 아미노산, 78번 위치에서 비극성 아미노산 및/또는 80번 위치에서 극성 아미노산;
ⅱ. 101번 위치에서 임의의 기타 아미노산;
ⅲ. 112번 위치에서 비극성 아미노산; 및/또는 114번 위치에서 극성 아미노산;
중 하나 이상에서 선택됨 - ;
중 하나 이상에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 i) 또는 ii)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 탄수화물 결합 부위는 1차 및/또는 2차 탄수화물 결합 부위이다.
일 구현예에서, 1차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1에 있는 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 및 105 중 하나 이상에서 선택된 위치 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치를 포함한다.
상기 일 구현예에서, 아미노산 변형의 위치는:
i) 27 및/또는 28;
ii) 47 및/또는 48;
iii) 70, 71 및/또는 72; 및/또는
iv) 105;
중 하나 이상에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 2차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1에 있는 77, 78, 80, 101, 112 및 114 중 하나 이상에서 선택된 위치 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치를 포함한다.
상기 일 구현예에서, 아미노산 변형의 위치는:
i) 77, 78 및/또는 80;
ii) 101;
iii) 112 및/또는 114;
중 하나 이상에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 아미노산 변형은 아미노산 치환이어서 치환 아미노산은 원래의 아미노산을 대체한다. 일 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이거나 유리한 아미노산 치환이다.
일 구현예에서, 1차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환은:
i) 27번 위치: 보존적, 유리 및 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 비극성 또는 산성; 유리는 극성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 비극성임 - ;
ii) 28번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 극성임 - ;
iii) 47번 위치: 염기성 또는 비극성인 불리한 아미노산;
ⅳ) 48번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ⅴ) 70번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ⅵ) 71번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ⅶ) 72번 위치: 비극성인 불리한 아미노산; 및/또는
ⅷ) 105번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 염기성 또는 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성, 염기성 또는 극성 및/또는 불리한 아미노산은 극성, 비극성 또는 산성;
중 하나 이상에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 2차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환은:
i) 77번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ii) 78번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
iii) 80번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ⅳ) 101번 위치: 유리, 불리 또는 중성 아미노산 - 여기에서 유리한 아미노산은 극성 또는 염기성, 불리한 아미노산은 비극성이고 중성 아미노산은 비극성 또는 산성임 - ;
ⅴ) 112번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
ⅵ) 114번 위치: 극성인 불리한 아미노산;
중 하나 이상에서 선택된다.
일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 i) 또는 ii)의 N 말단에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서 N 말단은 서열 번호: 1의 1 및/또는 2 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치에서 선택된 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 아미노산 변형은 1번 위치에서 아미노산 치환이고, 여기에서 치환 아미노산은 트레오닌 또는 발린이 아니다. 추가 구현예에서, 치환 아미노산은 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 세린 중에서 선택된다. 여전히 추가 구현예에서, 아미노산 변형은 2번 위치에서 아미노산 치환이고, 여기에서 치환 아미노산은 트립토판이다.
일부 구현예에서, 개시 메티오닌의 절단은 대조군에 비해 증가 또는 감소된다.
또 다른 구현예에서, 76번 위치의 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로의 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 비극성 아미노산은 글리신, 발린 또는 류신 중에서 선택된다.
일 구현현예에서, 44 또는 89번 위치의 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로의 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 바람직하게는 89번 위치이다. 일부 구현예에서, 비극성 아미노산은 류신, 이소류신 또는 발린 중에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 가용성, 부분적 가용성 또는 불용성이고/거나 세포 독성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없다. 또 다른 대안적인 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 세포 독성에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100% 증가된 세포 독성 백분율을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질의 길이는 500, 400, 300, 250, 200 또는 150개 이하의 아미노산이다.
본 발명의 추가 측면에 따라, 변형 렉틴 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 및 선택적으로 추가 치료 성분을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 환자에게 변형 렉틴 단백질 또는 변형 렉틴 단백질의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 환자의 암 치료 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 및 선택적으로 추가 치료 성분을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 발명의 추가 측면에 따라, 환자에게 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질을 투여하는 것을 포함하는 환자의 암 치료 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 환자에게 상기 기재된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 암 치료에 사용하기 위한 변형 렉틴 단백질 또는 변형 렉틴 단백질의 약학 조성물이 제공된다. 또한 암세포의 검출, 암 진단 및/또는 암 치료에 사용되는 변형 렉틴 단백질이 제공된다.
발명의 추가 측면에 따라, 의약에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질이 제공된다. 대안적으로, 의약에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질 또는 약학 조성물은 암 치료용이다. 발명의 추가 측면에 따라, 암세포의 검출, 암 진단 및/또는 암 치료에 사용되는 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따라, 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공되고, 여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형;
c) 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공되고, 여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형;
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형 - 여기에서 개시 메티오닌 절단이 ⅰ)의 아미노산 서열에 비해 증가됨 - ;
c) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 2량체 형성이 감소된 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 산화가 감소된 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 발명의 추가 측면에서, 상기 핵산 분자의 삽입을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
일부 구현예에서, 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된 벡터는, 숙주 세포에서 기능하는 프로모터; 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 상기 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열; 및 종결 신호를 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 벡터는 단세포 유기체에서 복제, 전사, 번역 및/또는 발현될 수 있다.
발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 핵산 분자를 포함하는 형질 전환된 숙주 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대장균 또는 효모 세포이다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 핵산 분자 삽입을 포함하는 재조합 벡터가 제공되고, 여기에서 상기 핵산 분자는:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형;
c) 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 핵산 분자 삽입을 포함하는 재조합 벡터가 제공되고, 여기에서 상기 핵산 분자는:
ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
- 여기에서 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형;
b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형 - 여기에서 개시 메티오닌 절단이 ⅰ)의 아미노산 서열에 비해 증가됨 - ;
c) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 2량체 형성이 감소된 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
d) 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 변형 렉틴 단백질의 산화가 감소된 하나 이상의 아미노산 변형;
중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함 - ;
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
발명의 최종 측면에서,
ⅰ) 재조합 렉틴 단백질을 코딩하는 상기 기재된 바와 같은 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 배양 단계;
ⅱ) 재조합 렉틴 단백질 발현 단계;
ⅲ) 배양물에서 가공되지 않은 재조합 렉틴 단백질 단리 단계;
를 포함하는 재조합 스크렐로티움 롤프시 렉틴 단백질 생산 방법이 제공된다.
첨부된 서열의 간단한 설명
ㆍ서열 번호: 1은 천연 S. 롤프시 렉틴 아미노산 서열을 나타낸다.
ㆍ서열 번호: 2는 S. 롤프시 렉틴 아미노산 서열의 변이체(국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-2로 보고됨)를 나타낸다.
ㆍ서열 번호: 3은 S. 롤프시 렉틴 아미노산 서열의 변이체(국제 출원 WO 2010/095143에서 Rec-3으로 보고됨)를 나타낸다.
ㆍ서열 번호: 4는 S. 롤프시 렉틴 아미노산 서열의 변이체(국제 출원 WO 2014/203261에 보고됨)를 나타낸다.
정의
여기에 사용된 바와 같은 용어 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "렉틴(lectin)"은 탄수화물 결합 단백질을 지칭한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "변형 렉틴 단백질(modified lectin protein)"은 탄수화물 결합 활성을 가지며 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산(amino acid)"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 갖는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산이며 단백질 생성 아미노산을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 또한 세포에서 번역 후에 변형된 것을 포함한다. 합성 아미노산은 셀레노시스테인 및 피롤리신과 같은 비정규 아미노산을 포함한다. 전형적으로 합성 아미노산은 단백질 생성 아미노산이 아니다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 변형(amino acid modification)"은 아미노산 서열의 특정 위치에서 아미노산의 추가, 결실 또는 치환을 지칭한다. 일 구현예에서, 아미노산 추가는 아미노산 서열의 특정 위치에 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산 추가를 지칭한다. 추가, 결실 또는 치환 과정은 본 발명에 따라 또는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행된다. 일 구현예에서, 여기에 사용된 바와 같은 "아미노산 변형(amino acid modification)"은 아세틸화, 질화(nitration), 당화 및/또는 설폰화에서 선택된 하나 이상의 변형을 지칭한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 치환(amino acid substitution)"은 아미노산 서열의 특정 위치에서 아미노산의 대체를 지칭한다. 용어 "아미노산 치환(amino acid substitution)"은 보존적 및 비보존적 아미노산 치환 둘 다를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 기능적으로 유사한 아미노산을 제공한다. 즉, 원래 아미노산을 대체하는 아미노산(즉, "치환(substituting)" 아미노산)은 유사한 생화학적 특성을 갖는다. 비보존적 치환은 기능적으로 상이한 아미노산을 제공한다. 즉, 원래 아미노산을 대체하는 아미노산(즉, "치환(substituting)" 아미노산)은 상이한 생화학적 특성을 갖는다. 일 구현예에서, 아미노산 치환은 유리한(favourable) 아미노산 치환이다. 유리한 아미노산 치환은 변형 렉틴 단백질의 생물학적 기능 및/또는 기타 특성을 보존한다. 다른 구현예에서, 보존적 및 유리한 아미노산 치환 둘 다는 렉틴 단백질의 쌍 또는 다중 서열 정렬을 기반으로 한다. 보존적 치환은 해당 위치의 최대 천연 렉틴 단백질에서 발생하는 아미노산으로의 치환이고, 유리한 치한은 해당 위치의 극소수 천연 렉틴 단백질에서 발생하는 아미노산으로의 치환이다. 두 치환 모두 변형 단백질의 세포 독성을 보유하거나 향상시킬 것으로 예상된다. 일 구현예에서, 생물학적 기능은 하기 정의된 바와 같은 "세포독성 효과(cytotoxic effect)"이다. 일 구현예에서, 치환 아미노산은 렉틴 단백질, 바람직하게는 곰팡이 렉틴 단백질의 쌍 또는 다중 서열 정렬에 기초한 유리한 아미노산 치환으로 선택된다.
아미노산은 상이한 생화학적 특성에 따라 그룹화될 수 있는 것으로 이해된다. 예에는 극성 아미노산, 비극성 아미노산, 산성 아미노산 및 염기성 아미노산이 포함된다. 일 구현예에서, 아미노산 변형에 사용되는 아미노산은 비제한적으로 극성, 비극성, 산성, 염기성, 셀레노시스테인, 피롤리신 및 비정규로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "상동성(homology)" 또는 "상동성의(homologous)"는 주어진 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 일부 동일성을 공유하는 2개 이상의 참조된 엔티티(entities)를 지칭한다. 상동성 또는 동일성의 구역, 영역 또는 도메인은 상동성을 공유하거나 동일한 2개 이상의 참조된 엔티티의 일부를 지칭한다. 따라서, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우, 상기 영역에서 동일성을 공유한다. 실질적인 상동성은 구조적 또는 기능적으로 보존되어 참조 분자의 하나 이상의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성)의 적어도 일부 구조 또는 기능 또는 상동성을 공유하는 참조 분자의 관련/해당 영역 또는 일부를 갖거나 가질 것으로 예측되는 분자를 지칭한다.
일 구현예에서, 2개의 서열 사이 "상동성(homology)" 백분율은 기본 매개 변수를 갖는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정된다(Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402). 특히, BLAST 알고리즘은 URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.을 이용하여 인터넷에서 액세스할 수 있다. 대안적 구현예에서, 전체 서열 정렬을 위해, 2개의 서열 사이 상동성 백분율은 기본 매개 변수를 이용한 EMBOSS Needle 알고리즘을 사용하여 결정된다. 특히, EMBOSS Needle 알고리즘은 URL:https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/.을 이용하여 인터넷에서 액세스할 수 있다.
달리 시사하지 않는 한, 용어 "상동성(homology)"은 본 명세서에서 용어 "서열 동일성(sequence identity)"과 상호 교환적으로 사용된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "해당 위치(corresponding position)"는 2개 이상의 서열 사이의 유사한 위치를 지칭한다. 일 구현예에서, 해당 위치는 적어도 제1 및 제2 서열의 서열 정렬을 통해 결정된다. 적어도 제1 및 제2 서열의 해당 위치는 서열 정렬의 산출로 정렬되고 따라서 확인될 수 있다. 일 구현예에서, 서열 정렬은 쌍 또는 다중 서열 정렬이다. 일 구현예에서, 서열 정렬은 알고리즘에 의해 수행된다. 일 구현예에서, 알고리즘은 상기 논의된 바와 같은 BLAST 또는 EMBOSS Needle이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "탄수화물 결합 부위(carbohydrate binding site)"는 탄수화물 구조의 인식 및 결합에 관여하는 렉틴 단백질의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일 구현예에서, 탄수화물 결합 부위는 TF 항원(이당류; Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr) 및/또는 Tn 항원(단당류; GalNAc-α-)의 인식 및 결합에 관여한다. 일 구현예에서, "탄수화물 결합 부위(carbohydrate binding site)"는 "1차 탄수화물 결합 부위(primary carbohydrate binding site)" 및/또는 "2차 탄수화물 결합 부위(secondary carbohydrate binding site)"를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "1차 탄수화물 결합 부위(primary carbohydrate binding site)"는 특정 탄수화물 구조의 인식 및 결합에 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일 구현예에서, 특정 탄수화물 구조는 TF 항원이다. 일 구현예에서, 1차 탄수화물 결합 부위를 구성하는 아미노산 잔기는 서열 번호: 1의 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 및/또는 105번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치 중 하나 이상에서 선택된다. 일 구현예에서, 해당 위치는 서열 정렬을 통해 결정된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "2차 탄수화물 결합 부위(secondary carbohydrate binding site)"는 특정 탄수화물 구조의 인식 및 결합에 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일 구현예에서, 특정 탄수화물 구조는 Tn 항원이다. 일 구현예에서, 2차 탄수화물 결합 부위를 구성하는 아미노산 잔기는 서열 번호: 1의 77, 78, 80, 101, 112 및/또는 114번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치 중 하나 이상에서 선택된다. 일 구현예에서, 해당 위치는 서열 정렬을 통해 결정된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "세포 독성 효과(cytotoxic effect)"는 암세포를 죽이거나 암세포의 성장을 억제하는(즉, 항증식 활성을 발휘하는) 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 물질의 세포 독성 백분율은 실시예 5에 상세히 설명된 바와 같은 SRB(Sulforhodadmine B) 분석을 사용하여 결정된다. 일 구현예에서, SRB 분석에 의해 결정된 바와 같은 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포 독성 백분율은 세포 독성 효과를 나타낸다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 세포 독성 백분율을 갖는다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단(N-terminus)"은 아미노산 서열의 시작 쪽(즉, 아미노 말단 쪽)에 위치한 아미노산 잔기를 지칭한다. 일 구현예에서, N-말단은 아미노산 서열의 처음 10% 또는 5%에 위치한 아미노산 잔기를 지칭한다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "개시 메티오닌의 절단(cleavage of an initiator methionine)"은 아미노산 서열에서 N-말단(개시) 메티오닌의 제거를 지칭한다. 일 구현예에서, 개시 메티오닌의 절단은 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase, MAP) 효소에 의해 촉매된다. 일 구현예에서, 개시 메티오닌의 절단은 당업자에게 공지된 질량 분석법 또는 HPLC 분석을 사용하여 결정된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "개시 메티오닌의 절단 증가(cleavage of an initiator methionine is increased)"는 대조군에 비해 개시 메티오닌 절단 정도의 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, 상기는 대조군에 비해 개시 메티오닌 절단 정도에서 5%, 10%, 25% 또는 50% 이상의 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "2량체 형성(dimer formation)"은 동일하거나 동일하지 않은 2개의 단량체를 함유하는 올리고머 형성을 지칭한다. 일 구현예에서, 2량체 형성은 본 발명에 따른 2개의 변형 렉틴 단백질(동일하거나 동일하지 않음)을 함유하는 2량체의 생성을 지칭한다. 대안적인 구현예에서, 2량체 형성은, 서열 번호: 1의 서열로 구성된 것과 같은 대안적인 렉틴 단백질 및 본 발명에 따른 변형 렉틴 단백질을 함유하는 2량체 생성을 지칭한다. 일 구현예에서, 2량체 형성은 각 단량체의 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합에 의해 매개된다. 일 구현예에서, 시스테인 잔기는 서열 번호: 1의 76번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 해당 위치에 존재한다. 일 구현예에서, 해당 위치는 서열 정렬을 통해 결정된다. 일 구현예에서, 2량체 형성 수준은 질량 분석, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 SDS-PAGE 분석 중 어느 하나를 사용하여 결정된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "2량체 형성 감소(reduced dimer formation)"는 대조군에 비해 2량체 형성 수준의 감소를 지칭한다. 일 구현예에서, "2량체 형성 감소(reduced dimer formation)"는 대조군에 비해 2량체 형성 수준에서 5%, 10%, 25% 또는 50% 이상의 감소를 지칭한다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "산화(oxidation)"는 전자의 손실 또는 산화 상태의 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "산화(oxidation)"는 아미노산 잔기의 산화를 지칭하며, 이의 예에는 메티오닌, 시스테인, 트립토판, 티로신 및/또는 히스티딘이 포함된다. 일 구현예에서, 용어 "산화(oxidation)"는 메티오닌 잔기가 메티오닌 설폭사이드로의 산화를 지칭한다. 일 구현예에서, 산화되기 쉬운 메티오닌 잔기는 서열 번호: 1의 44 또는 89번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 해당 위치에 존재한다. 일 구현예에서, 해당 위치는 서열 정렬을 통해 결정된다. 일 구현예에서, 산화 수준은 질량 분석 및/또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)를 사용하여 결정된다. 산화는 단백질의 발현 및 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 일 구현예에서, 산화의 영향은 렉틴 단백질의 가용성 발현 및/또는 활성에 대한 서열 번호: 1의 44 또는 89번 위치에서 산화하기 쉬운 아미노산의 치환 효과에 의해 결정된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "산화 감소(reduced oxidation)"는 대조군에 비해 산화 수준의 감소를 지칭한다. 일 구현예에서, "산화 감소(reduced oxidation)"는 대조군에 비해 산화 수준에서 5%, 10%, 25% 또는 50% 이상의 감소를 지칭한다. 대안적인 구현예에서, "산화 감소(reduced oxidation)"는 렉틴 단백질의 가용성 발현 및/또는 활성의 향상을 지칭한다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "가용성(soluble)"은 가용성 또는 적어도 부분적으로 가용성 형태로 발현되는 변형 렉틴 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질의 용해도는 변형 렉틴 단백질을 발현하는 숙주 세포의 세포 용해 및 후속적인 용해 상청액 및 펠릿의 SDS-PAGE 분석에 의해 결정된다. 용해 상청액에 변형 렉틴 단백질의 존재는 상기가 가용성임을 나타낸다. 용해 상청액 및 펠릿에 변형 렉틴 단백질의 존재는 상기가 부분적으로 가용성임을 나타낸다. 일 구현예에서, 여기에 사용된 바와 같은 용어 가용성(soluble)은 봉입체(inclusion bodies)를 형성하지 않는 변형 렉틴 단백질을 지칭한다. 상기 기재된 방법을 이용하여 펠릿에 변형 렉틴 단백질의 존재는 상기가 봉입체로 발현됨을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 복수의 뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 핵산 분자는 자연 발생 핵산을 포함하거나 인공 핵산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 또는 이의 유도체이다. 대안적인 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 또는 이의 유도체이다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 뉴클레오티드(nucleotide)는 자연 발생 뉴클레오티드 및 세포의 효소에 의해 인식되는 합성 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다.
본 발명의 발명자들은 변경되고/거나 개선된 물리 화학적 특성 및/또는 생물학적 활성을 가진 새로운 렉틴을 개발하기 위한 탐색에서, 활성 및 비활성 부위에서 천연 렉틴 서열에 대한 변형을 갖는 몇몇 렉틴 변이체를 개발하였다.
일 구현예에서, 본 발명은 변경된 특성을 나타내는; 바람직하게는 특정 암세포 상에서 독특하게 발현되는 특정 당 사슬에 대한 특이성 및/또는 천연 단백질에 비해 가용성 및/또는 안정성 향상을 나타내는 천연 렉틴 서열 유래 재조합 렉틴 변이체를 제공한다. 상기 재조합 렉틴은 천연 렉틴에 대한 의도적인 변형을 수행하여 수득된다. 본 발명의 구현예에서, 천연 렉틴은 비제한적으로, 곰팡이 및 식물로 구성된 군에서 유래된다. 전형적으로, 천연 렉틴은 토양 매개 식물 병원성 곰팡이에서 유래된다. 본 발명의 예시적인 구현예에서, 식물 병원성 곰팡이는 S. 롤프시이다. 천연 렉틴의 아미노산 서열 유래 재조합 렉틴은 Tn 항원 및/또는 TF 항원에 대한 특이성을 갖고 따라서 인간 대장암, 난소암 및 백혈병 세포에 결합하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 본 발명은 서열 번호: 1 또는 이에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형 렉틴 단백질과 관련되고, 여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1 또는 이에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 서열 번호: 1의 서열은 천연 S. 롤프시 렉틴 서열(국제 출원 WO 2010/095143에 보고됨)에 해당한다. 아미노산 변형은 서열 번호: 1 또는 이에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 탄수화물 결합 부위에서 아미노산 변형; 서열 번호: 1 또는 이에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 N 말단에서 아미노산 변형; 변형 렉틴 단백질의 2량체 형성을 감소시키는 아미노산 변형; 및/또는 산화를 감소시키는 아미노산 변형; 중 하나 이상에서 선택된다.
변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2(Rec-2 재조합 변이체로 국제 출원 WO 2010/095143에 보고된 바와 같음), 서열 번호: 3(Rec-3 재조합 변이체로 국제 출원 WO 2010/095143에 보고된 바와 같음) 또는 서열 번호: 4(국제 출원 WO 2014/203261에 보고된 바와 같음) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는 것이 바람직하다. 서열 번호: 2 내지 4는 서열 번호: 1에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 예이다. 특히, 서열 번호: 2, 3 및 4는 서열 번호: 1에 대해 각각 97.9%, 96.5% 및 91.5%의 상동성을 갖는다(EMBOSS Needle을 이용하여 결정됨).
탄수화물 결합 부위
본 발명의 제1 구현예에서, 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1(문헌[Leonidas et al. 2007]에 보고됨)의 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 및 105번 위치 또는 서열 번호: 1에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치 아미노산을 포함하는 1차 탄수화물 결합 부위이다. 1차 탄수화물 결합 부위는 암세포의 표면 상에 발현되는 TF 항원(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)에 대한 특이성을 나타낸다. 제1 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 1차 결합 부위의 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 함유한다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 27 및/또는 28; 47 및/또는 48; 70, 71 및/또는 72; 및/또는 105; 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 함유한다.
본 발명의 제2 구현예에서, 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1의 77, 78, 80, 101, 112 및 114번 위치 또는 서열 번호: 1(문헌[Leonidas et al. 2007]에 보고됨)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치 아미노산을 포함하는 2차 탄수화물 결합 부위이다. 2차 탄수화물 결합 부위는 Tn 항원(GalNAc-α-)에 대한 특이성을 나타낸다. 제2 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 2차 결합 부위 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 함유한다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 77, 78 및/또는 80; 101; 및/또는 112 및/또는 114; 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 함유한다.
제1 및/또는 제2 구현예에 따른 아미노산 치환은 보존적 또는 유리한 아미노산 치환인 것이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환은 원래 아미노산과 유사한 생화학적 특성을 갖는 치환 아미노산(즉, 원래 아미노산을 대체하는 것)을 지칭한다. 일 구현예에서, 극성 아미노산은 상이한 극성 아미노산에 의해 대체되거나; 비극성 아미노산은 상이한 비극성 아미노산에 의해 대체되거나; 산성 아미노산은 상이한 산성 아미노산에 의해 대체되거나; 또는 염기성 아미노산은 상이한 염기성 아미노산에 의해 대체된다. 상기는 렉틴 단백질의 쌍 또는 복수의 서열 정렬에 기초하여 해당 위치의 최대 천연 렉틴 단백질에서 발생하는 아미노산으로의 치환을 또한 지칭한다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 유리한 아미노산 치환을 함유하여 변형 렉틴 단백질이 변형 렉틴 단백질의 생물학적 기능 및/또는 기타 특성을 유지한다. 바람직한 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 유리한 아미노산 치환을 함유하여 변형 렉틴 단백질이 세포 독성 효과를 유지하고/거나 가용성이다. 일 구현예에서 아미노산 잔기는 천연 렉틴 단백질, 바람직하게는 곰팡이 렉틴 단백질의 쌍 또는 복수의 서열 정렬에 기초하여 유리한 아미노산 치환을 위해 선택된다. 유리한 치환은 해당 위치에서 극소수 천연 렉틴 단백질에서 발생하는 아미노산으로의 치환이다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, 상동 서열의 해당 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 선택 및 변형 렉틴 단백질에 이의 포함이 변형 렉틴 단백질의 생물학적 기능 및/또는 기타 특성(예컨대 세포 독성 효과 및/또는 용해도)을 유지할 가능성이 보다 높은 것으로 여겨진다.
대안적인 구현예에서, 제1 및/또는 제2 구현예에 따른 아미노산 치환은 비보존적 또는 불리한 아미노산 치환이다. 비보존적 또는 불리한 아미노산 치환은 원래 아미노산과 상이한 생화학적 특성을 갖는 치환 아미노산(즉, 원래 아미노산을 대체하는 것)을 지칭한다. 예를 들어, 극성 아미노산은 비극성 아미노산으로 대체되거나 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 비보존적 또는 불리한 아미노산 치환은 쌍 또는 복수의 서열로 정렬될 경우 다른 천연 렉틴 단백질의 해당 위치에 존재하지 않는 아미노산으로의 치환을 또한 지칭한다. 일 구현예에서, 비보존적 또는 불리한 아미노산 치환은 대조군과 비교하여 변형 렉틴 단백질의 세포 독성 효과 및/또는 용해도를 변경시킨다. 일 구현예에서, 변경된 세포 독성 효과 및/또는 용해도는 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 대하여 결정되고, 다른 구현예에서 세포 독성 효과 및/또는 용해도는 서열 번호: 2의 렉틴 단백질에 대하여 결정된다.
일 구현예에서, 1차 탄수화물 결합 부위의 치환 아미노산은:
a. 27번 위치: 보존적, 유리 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 비극성 또는 산성; 유리는 극성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 비극성임 - ;
b. 28번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성 또는 염기성이고 불리한 아미노산은 극성임 - ;
c. 47번 위치: 염기성 또는 비극성인 불리한 아미노산;
d. 48번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
e. 70번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
f. 71번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
g. 72번 위치: 비극성인 불리한 아미노산; 및/또는
h. 105번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 보존적 아미노산은 염기성 또는 비극성; 유리는 극성, 중성은 산성, 염기성 또는 극성 및/또는 불리한 아미노산은 극성, 비극성 또는 산성;
중 하나 이상에서 선택된다.
특히, 1차 탄수화물 결합 부위의 치환 아미노산은:
a. 27번 위치에서 글리신(Y27G), 트립토판(Y27W), 페닐알라닌(Y27F), 글루탐산(Y27E) 또는 히스티딘(Y27H); 및/또는 28번 위치에서 글리신(A28G), 트립토판(A28W), 세린(A28S), 아스파르트산(A28D) 또는 히스티딘(A28H);
b. 47번 위치에서 류신(S47L); 및/또는 48번 위치에서 트립토판(G48W);
c. 70번 위치에서 이소류신(H70I); 71번 위치에서 트립토판(N71W); 및/또는 72번 위치에서 글리신(Y72G); 및
d. 105번 위치에서 페닐알라닌(R105F), 글루타민(R105Q), 글루탐산(R105E), 류신(R105L), 리신(R105K), 알라닌(R105A), 세린(R105S), 발린(R105V), 이소류신(R105I), 프롤린(R105P), 메티오닌(R105M), 글리신(R105G), 트레오닌(R105T), 티로신(R105Y), 트립토판(R105W), 아스파라긴(R105N), 시스테인(R105C), 아스파르트산(R105D), 또는 히스티딘(R105H);중 하나 이상에서 선택된다.
일 구현예에서, 2차 탄수화물 결합 부위의 치환 아미노산은:
a. 77번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
b. 78번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
c. 80번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
d. 101번 위치: 유리, 불리 또는 중성 아미노산 - 여기에서 유리한 아미노산은 극성 또는 염기성, 불리한 아미노산은 비극성이고 중성 아미노산은 비극성 또는 산성임 - ;
e. 112번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
f. 114번 위치: 극성인 불리한 아미노산;
중 하나 이상에서 선택된다.
특히, 2차 탄수화물 결합 부위의 치환 아미노산은:
a. 77번 위치에서 페닐알라닌(D77F), 78번 위치에서 글리신(I78G) 및 80번 위치에서 트립토판(T80W);
b. 101번 위치에서 페닐알라닌(R101F), 글루타민(R101Q), 메티오닌(R101M), 글루탐산(R101E); 및 리신(R101K);
c. 112번 위치에서 글리신(Y112G) 및/또는 114번 위치에서 아스파라긴(V114N);
중 하나 이상에서 선택된다.
제1 및/또는 제2 구현예에 따른 아미노산 치환을 함유하는 변형 렉틴 단백질이 세포 독성 효과를 갖는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 세포 독성 효과는 SRB 분석을 이용하여 결정된다. 특히 바람직한 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 세포 독성 이상의 세포 독성 백분율을 갖는다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이다. 대안적인 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1이 아닌 렉틴 단백질이다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질의 세포 독성 백분율은 대조군의 세포 독성에 비해 20% 백분율 증가를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 상기는 45% 백분율 증가를 나타낸다. 대안적인 구현예에서, 변형 렉틴 단백질의 세포 독성 백분율은 대조군의 세포 독성에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100% 증가를 나타낸다. 제1 및/또는 제2 구현예에 따른 아미노산 치환을 함유하는 변형 렉틴 단백질이 가용성 또는 부분적으로 가용성인 것이 또한 바람직하다.
N 말단 변형
본 발명의 제3 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 1 및/또는 2번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 1번 위치에서 치환 아미노산(즉, 원래 아미노산을 대체하는 아미노산)이 발린 또는 트레오닌 중 하나가 아닌 것이 바람직하다. 특히, 1번 위치에서 치환 아미노산이 작은 측쇄를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 치환 아미노산은 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 세린 중 하나에서 선택된다. 추가 구현예에서, 2번 위치의 치환 아미노산은 트립토판이다. 대안적인 구현예에서, 2번 위치의 치환 아미노산은 상이한 비극성 아미노산이다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 1 및 2번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치에서 상기 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 1 및 2번 위치에서 치환 아미노산은 각각 알라닌과 트립토판이다.
제3 구현예에 따른 변형 렉틴 단백질의 아미노산 서열은 대조군에 비해 N 말단(개시) 메티오닌의 절단을 증가시키는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 아미노산 서열이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다. 일 구현예에서, 개시 메티오닌의 절단은 메티오닌 아미노펩티다제(MAP) 효소에 의해 촉매된다. 개시 메티오닌의 절단 정도는 당업자에게 공지된 방법; 바람직하게는 질량 분광법 분석 또는 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 결정된다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, MAP에 의한 개시 메티오닌의 절단 정도는 개시 메티오닌 위치 다음의 제1 및/또는 제2 위치(예를 들어 서열 번호: 1의 1 및/또는 2번 위치)에 있는 아미노산 잔기의 영향을 받는 것으로 여겨진다. 특히, 개시 메티오닌 다음의 첫 번째 위치에 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열은 개시 메티오닌의 절단 정도를 증가시키는 것으로 여겨진다(상기 논의된 바와 같음).
또한, 제3 구현예에 따른 변형 렉틴 단백질이 가용성이고/거나 세포 독성 효과를 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 변형 렉틴 단백질은 가용성이며 세포 독성 효과를 갖는다. 일 구현예에서, 세포 독성 효과는 SRB 분석을 이용하여 결정된다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성 백분율을 나타낸다. 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없다. 추가 구현예에서, 세포 독성 백분율은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질 세포 독성의 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이다.
제3 구현예의 변형에서, N 말단의 아미노산 치환은 서열 번호: 1의 1 및/또는 2번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치가 아닌 위치이다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 처음 10% 또는 5%의 아미노산 서열(1 및/또는 2번 위치 제외)에서 아미노산 치환을 함유한다.
2량체 형성 감소
천연 S. 롤프시 단백질은 산성 조건 하에서 단량체로 존재하고 중성 또는 염기성 pH에서 2량체를 형성하는 것으로 보고되었다(Leonidas et al. 2007). 이론에 구속되기를 바라지 않고, 서열 번호: 1의 76번 위치의 시스테인 잔기가 이황화물 결합 형성을 통해 2량체 형성을 매개하는 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 2량체 형성을 감소시키는 것이 바람직하여 한가지 형태의 단백질(즉, 단량체 형태)만이 존재한다.
따라서 본 발명의 제4 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은, 서열 번호: 1의 76번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 서열의 해당 위치에서 아미노산 치환을 함유하여 상기 위치의 아미노산 잔기는 더 이상 시스테인이 아니다. 바람직한 구현예에서, 76번 위치의 치환 아미노산(즉, 원래 아미노산을 대체하는 것)은 글리신이다. 대안적인 구현예에서, 76번 위치의 치환 아미노산은 상이한 비극성 아미노산 잔기이다. 일 구현예에서, 치환 아미노산은 문헌[Leonidas et al. 2007]의 그림 6에 보고된 바와 같은 곰팡이 렉틴 단백질의 서열 정렬에 기초하여 선택된다. 따라서 일 구현예에서, 비극성 치환 아미노산은 발린 또는 류신 중 하나에서 선택된다.
제4 구현예에 따른 아미노산 치환을 함유한 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 2량체 형성의 감소를 나타낸다. 일 구현예에서, 2량체 형성의 수준은 질량 분석을 이용하여 결정된다. 대안적인 구현예에서, 2량체 형성 수준은 크기 배제 크로마토그래피 또는 SDS-PAGE 분석을 이용하여 결정된다. 제4 구현예에 따른 변형 렉틴 단백질이 가용성이고/거나 세포 독성 효과를 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 변형 렉틴 단백질은 가용성이며 세포 독성 효과를 갖는다. 일 구현예에서, 세포 독성 효과는 SRB 분석을 이용하여 결정된다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성 백분율을 나타낸다. 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없다. 추가 구현예에서, 세포 독성 백분율은 대조군의 60%, 80% 또는 90% 이상이다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
제4 구현예의 변형에서, 2량체 형성을 감소시키는 아미노산 치환은 76번 위치가 아닌 위치에 있다. 예를 들어, 이론에 구속되기를 바라지 않고, 일 구현예에서, 이황화물 결합이 아닌 대안적인 결합이 2량체 형성에 기여하고, 대안적인 아미노산 치환이 이용되어 상기 결합의 형성을 방해하고 따라서 2량체 형성을 감소시킨다.
산화 감소
본 발명의 제5 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 89번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 해당 위치에서 아미노산 치환을 함유한다. 추가 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 44 및/또는 89번 위치 또는 상기 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 해당 위치에서 아미노산 치환을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 89번 위치의 치환 아미노산(즉, 원래 아미노산을 대체하는 것)은 발린이다. 대안적인 구현예에서, 89번 위치의 치환 아미노산은 상이한 비극성 아미노산 잔기이다. 일 구현예에서, 치환 아미노산은 문헌[Leonidas et al. 2007]의 그림 6에 보고된 바와 같은 곰팡이 렉틴 단백질의 서열 정렬에 기초하여 선택된다. 따라서 일 구현예에서, 비극성 아미노산 잔기는 류신 또는 이소류신 중 하나에서 선택된다. 추가 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 89번 위치에 대해 상기 정의된 바와 같이 44번 위치에서 아미노산 치환을 함유한다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 상기 정의된 바와 같이 44 및 89번 위치에서 아미노산 치환을 함유한다.
이론에 구속되기를 바라지 않고, 서열 번호: 1의 44 및/또는 89번 위치의 메티오닌 잔기는 산화되기 쉽고, 이는 상기 위치에서 메티오닌 설폭사이드 형성을 초래하는 것으로 여겨진다. 메티오닌 잔기의 메티오닌 설폭사이드로의 산화는 렉틴의 생물학적 활성을 손상시킬 가능성이 있다. 따라서 특정 구현예에서, 렉틴 단백질의 산화를 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제5 구현예에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 함유한 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질에 비해 산화 감소를 나타낸다. 일 구현예에서, 산화 수준은 질량 분석을 이용하여 결정된다. 대안적인 구현예에서, 산화 수준은 RP-HPLC를 이용하여 결정된다. 또한, 제5 구현예에 따른 변형 렉틴 단백질이 가용성이고/거나 세포 독성 효과를 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 변형 렉틴 단백질은 가용성이며 세포 독성 효과를 갖는다. 일 구현예에서, 세포 독성 효과는 SRB 분석을 이용하여 결정된다. 일 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성 백분율을 나타낸다. 다른 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없다. 추가 구현예에서, 세포 독성 백분율은 대조군의 60%, 70% 또는 90% 이상이다. 일 구현예에서, 대조군은 서열 번호: 1의 렉틴 단백질이고, 다른 구현예에서 대조군은 서열 번호: 2이다.
제5 구현예의 변형에서, 산화를 감소시키는 아미노산 치환은 44 및/또는 89번 위치를 제외한 위치에 있다. 예를 들어, 이론에 구속되기를 바라지 않고, 일 구현예에서, 시스테인, 트립토판, 티로신 및 히스티딘 아미노산 잔기와 같은 대안적인 아미노산 잔기가 렉틴 단백질의 산화에 기여한다. 따라서 대안적인 아미노산 치환이 이용되어 상기 부위에서의 산화를 제한하고 따라서 단백질의 산화를 전반적으로 감소시킨다.
추가 구현예
상기 기재된 제1 내지 제5 구현예에서, 아미노산 변형은 아미노산 치환이다. 그러나, 제1 내지 제5 구현예 중 어느 하나의 변형에서, 아미노산 변형은 아미노산 치환이 아닌 변형이다. 일 변형 구현예에서, 아미노산 변형은 아미노산 서열의 특정 위치에서 아미노산의 추가 또는 결실이다. 일 구현예에서, 아미노산 추가는 아미노산 서열의 특정 위치에 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산 추가이다.
상기 기재된 제1 내지 제5 구현예에서, 변형 렉틴 단백질이 세포 독성 효과를 갖는 것이 바람직하다. 제1 내지 제5 구현예 중 어느 하나와 관련된 추가 구현예에서, 변형 렉틴은 추가 생물학적 기능(세포 독성 효과를 가질 뿐만 아니라)을 갖는다. 일 구현예에서, 생물학적 기능은 항원에 대한 변형 렉틴 단백질의 특이성에 관한 것이다.
상기에 기재된 제1 내지 제5 구현예에서, 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열에서 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 제1 내지 제5 구현예 중 어느 하나와 관련된 추가 구현예에서, 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 70%, 75%, 80% 또는 85% 이상의 상동성을 갖는다. 아미노산 서열이 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것이 특히 바람직하다.
변형 렉틴 단백질은 제1 내지 제5 구현예와 관련하여 상기 기재된 아미노산 변형 중 어느 하나의 복수 또는 조합을 함유할 수 있음이 이해된다.
본 발명의 추가 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 또한, 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 포함한다. 예시적인 희석제 및 부형제는 멸균수, 생리 식염수 및 인산염 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 추가 치료 성분을 또한 포함한다.
약학 조성물의 추가 구성 요소에 대한 자세한 내용은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA]에서 찾을 수 있다.
용도에 있어, 상기 설명된 바와 같은 변형 렉틴 단백질(이하 "약제(medicament)")이 치료가 필요한 환자에게 투여된다. 일 구현예에서, 약제에 적합한 용량은 0.1 내지 1 mg/kg이다. 일 구현예에서, 환자는 암을 앓고 있다. 일 구현예에서, 암은 난소암, 백혈병 및/또는 대장암 중 하나에서 선택된다. 원칙적으로, 임의의 방식의 약제 투여가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 약제는 주입, 분무 또는 흡입 중 하나에 의해 투여된다.
일 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질은 암세포의 검출에 사용된다.
일 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질은 진단 방법; 바람직하게는, 암의 진단 방법에 사용된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 관련된다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 비제한적으로 치환, 결실 및/또는 추가를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 임의의 변화를 포함한다.
유전자 코드의 퇴화로 인해, 특정 변형 렉틴 변이체를 암호화하는 핵산 분자가 다양한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있음이 인식되어야 한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCT는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다.
핵산 분자는 DNA 또는 RNA 또는 이의 유도체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 삽입을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 추가 구현예에서, 재조합 벡터는 발현 벡터이고, 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된, 숙주 세포에서 기능하는 프로모터; 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 구조 핵산 서열; 및 종결 신호;를 포함한다.
본 발명의 추가 구현예에서, 재조합 스크렐로티움 롤프시 렉틴 단백질; 및 특히 상기 기재된 바와 같은 변형 렉틴 단백질의 제조 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 클로닝된 뉴클레오티드 서열은 천연 렉틴 아미노산 서열에 가깝지만 대안적인 특성을 제공하는 변형 렉틴 단백질을 암호화한다. 대안적으로, 변형 렉틴 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 화학적 또는 재조합 방법을 이용하여 합성되고 적합한 숙주에서 발현되어 재조합 단백질을 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 세포 및 보다 하위의 진핵 세포뿐만 아니라 보다 상위의 진핵 세포 둘 다를 포함한다. 숙주 세포로 재조합 분자의 도입은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 예시적인 구현예에서, 적합한 숙주는 미생물 세포이다. 바람직한 구현예에서, 미생물 세포는 비제한적으로 효모 세포, 대장균, 곤충 세포주 또는 포유류 세포주로 구성된 군에서 선택된다.
상기 기재된 바와 같은 재조합 단백질은 재조합 숙주로부터 발현 산물로서의 단리에 의해 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 종래의 기술, 전형적으로 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다. 본 발명의 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 렉틴의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 결정되며, 대략 16,000 Da이다. 본 발명의 또 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 렉틴은 혈액군, 전형적으로 인간 혈액군에 대한 특이성을 보유할 수 있다. 본 발명의 또 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 TF 항원 및 이의 숨은 형태를 인식할 수 있는 독점적인 능력을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 예시적인 구현예에 관하여 기재되었으나, 상기 기재가 제한적인 의미로의 해석으로 의도되지 않는다. 발명의 다른 구현예뿐만 아니라 예시적인 구현예의 다양한 변형은, 상기 기재에 대한 참조로 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 발명의 진정한 범위에 속하는 임의의 상기 변형 또는 구현예를 포함할 것임이 고려된다.
실시예
실시예 1: 부위 지정 돌연변이 유발
천연 S. 롤프시 렉틴 서열의 아미노산 서열(서열 번호: 1)은 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 하기 표 1에서 여기 언급된 바와 같이 상이한 특정 위치에서 변형되었다. pET20b 벡터에 클로닝된 천연 SRL 서열의 아미노산 서열을 암호화하는 E. Coli BL21 DE3 세포에서 플라스미드를 추출하고 이를 주형으로 사용하였다. 10 ㎕의 5X Q5 반응 완충제, 1 ㎕의 10 mM dNTP, 2.5 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 2.5 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 0.5 ㎕의 Q5 고 충실도 DNA 중합 효소 및 20 ng의 주형을 함유하는 PCR 반응물을 준비하였고, 총부피는 증류수를 이용하여 50 ㎕로 조정했다.
98 ℃에서 30 초 동안 초기 변성 단계 후, 98 ℃에서 30 초 동안 변성 단계, 55 ℃에서 30 초 동안 어닐링 단계 및 72 ℃에서 30 초 동안 연장 단계로 구성된 35 회의 증폭 주기로 PCR을 이용하여 관심 유전자를 증폭했다. 마지막으로, 추가 연장 단계는 72 ℃에서 5 분 동안 수행되었다. 모든 PCR 반응은 Mastercycler Pro로 수행되었다. PCR 산물은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)를 함유하는 1.2 % 아가로스 겔에서 분석되었다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 2: 제한효소 분해
PCR 산물(실시예 1에서 수득) 또는 플라스미드를, 10 ㎕의 최종 부피로 500 ng의 PCR 산물/플라스미드, 1 ㎕의 10x CutSmart 완충제 및 1-2 유닛의 NdeI 및 1-2 유닛의 BamHI을 이용하여 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 분해하였다. 반응물을 37 ℃에서 45 분 내지 1 시간 동안 인큐베이션하고, 분해 결과물을 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유한 1.2 % 아가로스 겔에서 관찰했다.
이어서 DNA를 추출하고 아가로스 겔에서 정제했다.
실시예 3: pET 벡터 결찰 및 콜로니 PCR에 의한 형질 전환체 확인
pET 벡터로의 결찰 반응은 최종 부피 10 ㎕로 100 ng의 DNA 샘플(실시예 2의 제한 효소 분해 산물), 50 ng의 분해된 pET 벡터, 1 ㎕의 10X T4 DNA 리가제 완충제 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제 효소로 구성된 혼합물을 사용하여 수행되었다. 상기 반응은 22 ℃에서 1 시간 동안 수행되었다.
결찰 혼합물은 열 충격 방법에 의해 E.coli DH5α 적격 세포로 형질 전환되었다. 이어서 세포를 LA/카나마이신 플레이트에 도금하고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서 형질 전환체에 PCR을 수행하여 하기 PCR 조건으로 pET 정방향 및 pET 역방향 프라이머로 삽입물의 완전성 및 온전성을 확인하였다. PCR 프로그램은 95 ℃에서 10 분 동안 초기 변성 단계 후, 95 ℃에서 30 초 동안 변성 단계, 55 ℃에서 30 초 동안 어닐링 단계 및 72 ℃에서 45 초 동안 연장 단계로 구성된 35 회의 증폭 주기를 포함했다. 마지막으로, 추가 연장 단계는 72 ℃에서 10 분 동안 수행되었다. PCR 반응물은 세균 콜로니(DNA 주형), 10 μM의 pET 정방향 프라이머, 10 μM의 pET 역방향 프라이머, 5 ㎕의 EconoTaq PLUS GREEN 2X 마스터 믹스(Lucigen) 및 최종 부피를 10 ㎕로 만들기 위한 증류수로 구성되었다. PCR 산물을 EtBr을 함유한 1.2 % 아가로스 겔에서 분석하였다.
실시예 4: 플라스미드 DNA 추출 및 발현 분석
양성 형질 전환체를 LB/카나마이신 액체 배양물로 접종한 다음 대장균(E. coli)에서 플라스미드 DNA 추출을 수행했다. 상기 작업으로 준비된 pET 벡터에 삽입물을 가진 모든 작제물을 서열 분석으로 확인하였다.
렉틴 변이체를 암호화하는 각각의 변형 뉴클레오티드 서열을 함유하는 pET27b 벡터로 E. coli BL 21DE3 GOLD 세포를 형질 전환시켰다. 양성 클론은 자동 유도 배지에서 발현 분석에 의해 선택되었다. 재조합 렉틴 발현 수준 및 크기는 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다. 양성 클론의 글리세롤 스톡을 준비하여 -80 ℃에서 유지하였다.
글리세롤 스톡(40 ㎕)을 50 ml LB 배양액(20 ㎍/ml 카나마이신 함유)에 접종하고, 16 시간 동안 140 rpm으로 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 1% 효모 추출물(w/v), 1.2% 덱스트로스(w/v), 0.3% KH2PO4(w/v), 1.25% K2HPO4(w/v), 0.5% (NH4)2SO4(w/v), 0.05% NaCl(w/v), 0.1% MgSO4.7H2O(w/v) 및 0.1%(v/v)의 미량 금속 용액을 포함하는 200 ml 생산 배지에 1 % 배양물을 접종하였다. 카나마이신은 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 플라스크를 37 ℃ 및 140 rpm으로 인큐베이션하였다. 배양물의 OD600이 1.5에 도달할 경우, 온도를 18 ℃로 내리고, 배양물을 1 시간 동안 더 인큐베이션하였다. 이어서 0.25 mM IPTG로 배양물을 유도하고, 20 시간 동안 18 ℃에서 더 인큐베이션하였다. 유도 전 및 유도 후 배양 샘플을 SDS-PAGE 분석에 의해 단백질 발현 및 용해도에 대해 분석하였다. 배양액을 15 ℃에서 15 분 동안 9000 rpm으로 원심분리하였다. 수득된 펠릿을 용해 완충제(25 mM tris, 1mM EDTA, pH 8.0)로 재현탁하였다. 세포를 18000 psi(124, 100 kPa)에서 고압 균질화에 의해 용해시켰다. 용해물을 용해 완충제로 미리 평형화된 0.1 미크론 중공 섬유를 사용하여 투명하게 만들었다.
투명해진 단백질 용액을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 재조합 렉틴을 정제하였다.
실시예 5: 생물학적 분석 - 난소암 세포주(PA-1)에 대한 정제 렉틴의 항증식 활성
재조합, 정제 렉틴 변이체의 항증식 활성을 설포로다민 B(Sulforhodamine B, SRB) 분석을 이용하여 결정하였다. 렉틴 단백질은 TF/Tn 항원에 대한 결합을 통해 PA-1 난소암 세포주에 세포 독성 효과를 발휘하는 것으로 여겨지고; 따라서 상기 분석은 렉틴 단백질의 특이성에 대한 정보를 또한 제공할 수 있다. 항증식 활성은, 단백질의 형태가 활성을 보유하도록 유지될 것으로 여겨짐에 따라 렉틴 단백질의 안정성을 또한 나타낸다. 상기 분석은 SRB를 가진 세포 단백질을 염색함으로써 총 생물량을(biomass) 측정했다. SRB는 약간 산성 조건에서 트리클로로아세트산 고정 세포 단백질의 염기성 아미노산 잔기와 정전기 복합체를 형성할 수 있는 밝은 분홍색 아미노 크산텐 염료이다. 상기는 약한 염기성 조건 하에서 해리될 수 있고, 측정을 위해 용해될 수 있다. 상기는 암세포주 및 비-암세포주의 상이한 유형에 대한 약물 독성 검사에 널리 사용되어 왔다. 세포를 간단히 세척, 고정 및 염료로 염색했다. 이어서 통합된 염료를 Tris 염기성 용액으로 세포에서 방출시켰다. 염색된 세포에서 방출된 통합 염료는 세포 생물량에 직접 비례하고, 시험 물질에 의해 야기된 세포 독성의 정도를 나타내도록 측정될 수 있다.
세포의 세포 독성은 세포가 성장의 로그 단계에 있을 때 모니터링/측정되었다. 테스트는 200 ㎕의 최종 부피에서 수행되었고, 빈 흡광도 판독값으로 사용될 무세포 배지의 200 ㎕ 대조군 샘플을 포함하였다. 상기 테스트의 희석은 무혈청 배지로 수행하여 배경값을 감소시켰고, 원하는 농도보다 10 배 더 높은 희석을 준비했다.
제1 일에, 세포를 초기 트립신화 단계에 의해 시딩하였고, Neuebauer's Chamber에서 트리판 블루(Trypan blue) 방법으로 계수하였고, 5000 세포/웰의 밀도로 평평한 바닥 96 웰 플레이트(어두운 벽의 플레이트)의 웰에 플레이팅하였다. 제2 일에, 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 플레이트의 배지를 180 ㎕/웰로 보충한 다음, 세포를 2.5 내지 80 ㎍/ml의 범위 농도에서 각 테스트 항목의 20 ㎕로 처리하여 각 웰의 총 부피가 200 ㎕이었다. 플레이트를 제2 일부터 제4 일까지 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 제5 일에 SRB로 처리하였다. 이어서 플레이트를 멸균 조건 하에서 현미경 아래서 관찰하였다.
세포를 성장 배지 위에 50 ㎕의 50 % 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 용액(차가움)을 부드럽게 겹쳐서 고정하였다. 부정확성을 초래하는 세포의 탈락을 피하기 위해 고정 단계 후에 플레이트를 옮기지 않았다. 이어서 상기 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 정제수로 4 회 세척하여 과도한 고정액 및 혈청 단백질을 제거했다. 플레이트를 공기 건조했다. 상기 플레이트 중 일부는 추가 사용을 위해 실온에서 보관했다. 이어서 플레이트는 0.4 %(50 ㎕) SRB 염료 용액을 추가함으로써 SRB 염료로 염색되어 웰의 배양 표면을 덮은 뒤 28 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
이어서 염색을 가만히 따라냄으로써 제거한 다음 세척 용액(1 % 아세트산)으로 씻어냈다. 통합되지 않은 염료가 제거될 때까지 5 회의 세척 주기로 플레이트를 세척하였다. 습기가 보이지 않을 때까지 플레이트를 더 공기 건조시켰다.
가용화를 위해, 200 ㎕의 SRB 가용화 완충제(10 mm Tris)를 웰, 즉 웰의 원래 부피와 동일하게 첨가한 뒤 28 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 5 내지 10 분 동안 약하게 교반하여 염료를 용해시키고, 580 nm에서 흡광도를 측정했다.
실시예 6: 천연 S. 롤프시 렉틴 서열의 아미노산 변형
천연 렉틴 서열을 변형시켜 하기 기재된 바와 같이 물리화학적 특성을 변경하였다.
a) 개시 메티오닌 절단의 효율 향상:
대장균에서 재조합 단백질의 빠른 발현 속도는 메티오닌 아미노 펩티다아제(MAP) 효소에 의한 N 말단 메티오닌(개시 메티오닌)의 절단을 제한하고, 따라서 Met-렉틴 및 Met이 없는 렉틴을 함유한 단백질 혼합물을 초래한다. 개시 메티오닌 절단에 영향을 미치는 한 가지 중요한 요인는 메티오닌 잔기 다음의 아미노산이다. MAP는 두 번째 위치(즉, 개시 메티오닌 후 첫 번째 아미노산 잔기)의 잔기에 작은 측쇄를 갖는 모든 단백질을 절단한다. 개시 메티오닌 후에 발린 또는 트레오닌 잔기를 갖는 단백질은 상기 위치에 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 세린을 가진 단백질보다 MAP에 의해 훨씬 덜 효율적으로 절단된다. 천연 렉틴 서열의 N 단말에 있는 제1(트레오닌) 및 제2(티로신) 아미노산을 4 개의 상이한 아미노산(표 2)으로 대체하여 개시 메티오닌 절단, 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 미치는 영향을 확인하기 위한 클론을 작제하였다. 렉틴 변이체의 용해도, 특이성 및 생물학적 활성은 변경 사항에 의해 영향을 받지 않았다.
쉐이크 플라스크 수준에서 효율적인 메티오닌 절단을 위해 설계된 천연 렉틴 서열 중 5 개의 모든 변이체에서 재조합 렉틴을 정제하였다. 1번 위치의 트레오닌이 알라닌, 글리신, 세린 및 프롤린으로 대체된 천연 렉틴 서열의 모든 변이체는 대조군과 비교하여 가용성 및 유사한 발현을 나타냈다. 모든 변이체의 생물학적 활성도 대조군과 유사하였다. 따라서 렉틴 서열의 제1 및/또는 제2 아미노산을 변경하는 것은 대조군과 비교할 때 발현 또는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
b) 2량체 형성 및 단백질 산화 방지:
S. 롤프시 렉틴 단량체에 존재하는 시스테인 잔기는 이황화물 결합에 의한 2량체 형성에 기여하는 것으로 여겨지고 따라서 렉틴의 특이성 및 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. S. 롤프시 렉틴의 메티오닌 잔기는 정제 과정 중에 산화되기 쉬운 것으로 여겨진다. 76 및 89번 위치의 시스테인 및 메티오닌 잔기는 아미노산 치환을 통해 대체되어 각각 2량체 형성 및 단백질 산화를 방지했다. 2량체 형성을 방지하기 위해 76번 위치의 시스테인이 글리신으로 대체된 천연 렉틴 서열의 ULLB-0005/015 변이체는 대조군과 비교하여 생물학적 활성에 영향을 받지 않은 가용성 형태의 재조합 렉틴을 발현했다. 마찬가지로, 단백질 산화를 방지하기 위해 89번 위치의 메티오닌이 발린으로 대체된 천연 렉틴 서열의 ULLB-0005/016 변이체는, 대조군과 비교하여 생물학적 활성에 영향을 받지 않은 가용성 형태로 발현되었다. 따라서, 76 및 89번 위치의 시스테인 및 메티오닌을 각각 글리신 및 발린으로 변경하는 것은 렉틴의 발현, 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다.
[표 2]
Figure pct00005
천연 렉틴 서열을 또한 변형시켜 하기 기재된 바와 같이 생물학적 활성을 변경하였다.
c) 1차 탄수화물 결합 부위 변형:
1차 탄수화물 결합 부위는 암세포에서 발현되는 TF 항원(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)에 대한 특이성을 나타낸다. 1차 탄수화물 결합 부위의 아미노산이 변경되었고, 변형 렉틴 단백질을 단백질 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 관해 조사하였다. 특이성 및 생물학적 활성에 미치는 영향에 관하여, 난소암 세포주(PA-1)에 대한 변형 렉틴 단백질의 세포 독성을 평가하였다. 1차 탄수화물 결합 부위에서 이루어진 아미노산 변형이 표 3에 도시된다. 천연 렉틴 서열의 ULLB-0005/008(Y27G 및 A28W) 및 ULLB-0005/011(R105F) 변이체는 가용성 형태로 재조합 렉틴을 발현했으나; 생물학적 활성은 손실되었다. ULLB-0005/010(H70I, N71W 및 Y72G) 변이체는 부분적 가용성으로 발현된 반면, 상기 변이체의 세포독성은 ULLB-0005/009(S47L 및 G48W) 변이체의 재조합 렉틴보다 더 높았고 봉입체로 발현되었다. 따라서, 1차 탄수화물 결합 부위를 변경하는 것은 렉틴의 생물학적 활성뿐만 아니라 용해도에 영향을 미친다. 본 실시예의 데이터는 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 및 105번 위치의 아미노산 잔기가 1차 탄수화물 결합 부위를 정의한다는 것을 논증한다. 1차 탄수화물 결합 부위가 암세포의 표면 상에 존재하는 TF 항원과의 결합에 관여한다는 결론을 내렸다.
[표 3]
Figure pct00006
d) 2차 탄수화물 결합 부위 변형:
GalNAc-α-(Tn 항원)와 결합에 관여하는 2차 탄수화물 결합 부위가 변형되었다. 2차 탄수화물 결합 부위의 아미노산이 변경되었고, 변형 렉틴 단백질을 단백질 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 관해 조사하였다. 난소암 세포주(PA-1)에 대한 특이성 및 생물학적 활성에 미치는 영향을 평가하였다. 2차 탄수화물 결합 부위에서 수행된 아미노산 변형이 표 4에 도시되고, 재조합 렉틴의 용해도, 특이성 및/또는 생물학적 활성에 영향을 미친다.
2차 탄수화물 결합 부위가 77, 78, 80, 101, 112 또는 114에서 선택되었고, D, I, T, R, Y 및 V를 각각 F, G, W, F, G 및 N으로 치환하도록 변형되어 천연 렉틴 서열에서 몇몇 새로운 변이체를 제조했다. 2차 탄수화물 결합 부위를 변경하도록 설계된 ULLB-0005/012(D77F, I78G 및 T80W) 및 ULLB-0005/014(Y112G 및 V114N) 변이체는 각각 봉입체 및 부분적 가용성 형태로 재조합 렉틴을 발현하였다. ULLB-0005/012 변이체에 이루어진 불리한 아미노산 치환이 상기 단백질의 불용성 발현에 기여했을 수 있다. ULLB-0005/013 변이체는 PA-1 세포주에 대해 항증식 활성의 손실을 나타냈으나 ULLB-0005/014 변이체는 PA-1 세포주에 대해 대조군 클론과 비교하여 유사한 항증식 활성을 나타냈다. 본 실시예의 데이터는 77, 78, 80, 101, 112 및 114번 위치의 아미노산 잔기가 2차 탄수화물 결합 부위를 정의한다는 것을 논증한다. 2차 탄수화물 결합 부위를 변경하면 렉틴의 생물학적 활성뿐만 아니라 용해도에 영향을 미친다는 결론을 내렸다.
[표 4]
Figure pct00007
실시예 7: 새로운 부위 지정 돌연변이 유발
실시예 1과 유사하게 변이체 렉틴 서열 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 여기 하기 표 5에서 언급된 바와 같이 상이한 특정 위치에서 변형시켰다.
[표 5]
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 8: 변이체 렉틴 서열 서열 번호: 2의 아미노산 변형
천연 렉틴 서열을 변형시켜 하기 기재된 바와 같은 물리화학적 특성을 변경하였다.
a. 1차 탄수화물 결합 부위 변형:
1차 탄수화물 결합 부위는 암세포에서 발현되는 TF 항원(Galβ1→3GalNAc-α-Ser//Thr)에 대한 특이성을 나타낸다. 1차 탄수화물 결합 부위의 아미노산이 변경되었고, 변형 렉틴 단백질을 단백질 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 관해 조사하였다. 특이성 및 생물학적 활성에 미치는 영향에 관하여, 난소암 세포주(PA-1)에 대한 변형 렉틴 단백질의 세포 독성을 평가하였다. 1차 탄수화물 결합 부위에서 이루어진 아미노산 변형이 표 6에 도시된다. 천연 렉틴 서열의 변이체, ULLB-0005/028(Y27E), ULLB-0005/032(A28D), ULLB-0005/018(R105Q), ULLB-0005/035(R105S), ULLB-0005/043(R105W) 및 ULLB-0005/045(R105C)는 가용성 형태로 재조합 렉틴을 발현하였으나; 생물학적 활성이 손실되었다. ULLB-0005/021(R105K) ULLB-0005/047(R105H) 변이체는 가용성 형태로 발현되었고, 상기 변이체의 세포 독성은 다른 변이체보다 상당히 더 높았다. 상기는 치환된 아미노산의 염기성 성질 때문일 수 있다. 마찬가지로, A28에서 비극성 글라긴(Glargine)으로의 보존적 치환(A28G - ULLB-0005/031)도 가용성 형태로 발현되었고, 상기 변이체의 세포 독성은 다른 변이체보다 상당히 더 높았다. ULLB-0005/019(R105E) 및 ULLB-0005/046(R105D) 변이체는 봉입체로 발현되었다. 산성 아미노산으로 R105의 치환이 상기 단백질의 불용성 발현에 기여했을 수 있다. ULLB-0005/034(R105A), ULLB-0005/037(R105I), ULLB-0005/038(R105P) 및 ULLB-0005/041(R105T) 변이체는 불용성 형태로 발현되었고, 따라서 대조군과 비교하여 영향을 받지 않았다. 따라서, 1차 탄수화물 결합 부위를 변경하는 것은 렉틴의 생물학적 활성뿐만 아니라 용해도에 영향을 미친다. 본 실시예의 데이터는 27, 28 및 105번 위치의 아미노산 잔기가 1차 탄수화물 결합 부위를 정의한다는 것을 논증한다. 1차 탄수화물 결합 부위가 암세포의 표면 상에 존재하는 TF 항원과의 결합에 관여한다는 결론을 내렸다.
[표 6]
Figure pct00011
b. 2차 탄수화물 결합 부위 변형:
GalNAc-α-(Tn 항원)와 결합에 관여하는 2차 탄수화물 결합 부위가 변형되었다. 2차 탄수화물 결합 부위의 아미노산이 변경되었고, 변형 렉틴 단백질을 단백질 용해도, 특이성 및 생물학적 활성에 관해 조사하였다. 난소암 세포주(PA-1)에 대한 특이성 및 생물학적 활성에 미치는 영향을 평가하였다. 2차 탄수화물 결합 부위에서 수행된 아미노산 변형이 표 7에 도시되고, 재조합 렉틴의 용해도, 특이성 및/또는 생물학적 활성에 영향을 미친다. 2차 결합 부위 101을 R에서 Q, M, E 및 K로 치환되도록 변형시켜 천연 렉틴 서열에서 몇몇 새로운 변이체를 제조했다. 101 위치에서 유리 및 중성 치환은 ULLB-0005/022(R101Q), ULLB-0005/023(R101M), ULLB-0005/024(R101E) 및 ULLB-0005/025(R101K) 변이체의 가용성 발현으로 이어졌고, PA-1 세포주에 대해 대조군 클론과 비교하여 유사한 항증식 활성을 나타냈다. 본 실시예의 데이터는 101번 위치의 아미노산 잔기가 2차 탄수화물 결합 부위를 정의한다는 것을 논증한다. 2차 탄수화물 결합 부위를 변경하는 것은 재조합 렉틴의 가용성 발현으로 이어지고, 대조군과 유사한 생물학적 활성을 나타낸다는 결론을 내렸다.
[표 7]
Figure pct00012
서열 요약
서열 번호: 1:
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서열 번호: 2:
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서열 번호: 3:
VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYANGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFTATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQLSNYQVKNAKGRNFQIVYTEAEGNDLHANLIIG
서열 번호: 4:
VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYADGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFTATFGVHDYKRWCDIVTDLAADETGMVINQEYYSEKDREEARERQNSNYEVKDAKGRNFEIVYTEAEGNDLHADLIIG
본 기재에서, 상기 유일하고 통합적인 발명을 구성하는 공정, 장비 및 시스템에 대한 복수의 접근으로 참조가 이루어졌고, 본 발명의 범위와 정신에서 벗어나지 않고 기재된 구현예에 많은 변화와 변경이 수행될 수 있음이 이해된다. 첨부된 실시예는 발명의 예시, 특정 예시적인 접근의 방법으로 제시된다. 상기 접근법은 당업자가 발명을 실행할 수 있도록 충분히 상세하게 기재되며, 개시된 다양한 접근법에 대한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
상기 기재된 방법 및 단계가 특정 순서로 발생하는 특정 사건을 나타내는 경우, 당업자는 특정 단계의 순서가 변형될 수 있으며 상기 변형은 본 발명의 원칙에 따른 것임을 인식할 것이다. 또한, 특정 단계는 가능한 경우 대응 프로세스에서 동시에 수행될 수 있을 뿐만 아니라 순차적으로 수행될 수 있다.
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Pro Asp Ala Phe 1 5 10 15 Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr 20 25 30 Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr 50 55 60 Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr 65 70 75 80 Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Asp Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr 100 105 110 Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu 115 120 125 Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly 130 135 140 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ULLB-0005/046 Forward Primer <400> 132 gaagaagcgg atgaacgcca g 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ULLB-0005/046 Reverse Primer <400> 133 ctggcgttca tccgcttctt c 21 <210> 134 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ULLB-0005/047 <400> 134 Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asp Ala Phe 1 5 10 15 Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly Thr 20 25 30 Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe Thr 50 55 60 Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val Thr 65 70 75 80 Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala His Glu Arg Gln Leu Ser Asn Tyr 100 105 110 Gln Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Gln Ile Val Tyr Thr Glu 115 120 125 Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly 130 135 140 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ULLB-0005/047 Forward Primer <400> 135 gaagaagcgc atgaacgcca g 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ULLB-0005/047 Reverse Primer <400> 136 ctggcgttca tgcgcttctt c 21

Claims (37)

  1. 변형 렉틴 단백질로서,
    여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은:
    ⅰ) 서열 번호: 1; 또는
    ⅱ) ⅰ)에 대해 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
    중 어느 하나에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    여기에서 상기 ⅰ) 또는 ⅱ)의 아미노산 서열은:
    a) ⅰ) 또는 ⅱ)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
    b) ⅰ) 또는 ⅱ)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형;
    c) 76번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형; 또는
    d) 44 또는 89번 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형;
    중 하나 이상에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며,
    여기에서 상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되지 않는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 서열 번호: 1에 대해 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 i) 또는 ii)의 탄수화물 결합 부위에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 탄수화물 결합 부위는 1차 및/또는 2차 탄수화물 결합 부위인 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 1차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1의 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 및 105 중 하나 이상에서 선택된 위치 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 대응 위치를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 아미노산 변형의 위치는:
    i) 27 및/또는 28;
    ii) 47 및/또는 48;
    iii) 70, 71 및/또는 72; 및/또는
    iv) 105;
    중 하나 이상에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 2차 탄수화물 결합 부위는 서열 번호: 1의 77, 78, 80, 101, 112 및 114 중 하나 이상에서 선택된 위치 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 대응 위치를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 아미노산 변형의 위치는:
    i) 77, 78 및/또는 80;
    ii) 101;
    iii) 112 및/또는 114;
    중 하나 이상에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 변형은 아미노산 치환이어서 치환 아미노산이 원래의 아미노산을 대체하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 1차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환은:
    i) 27번 위치: 보존적, 유리(favorable) 및 불리한(unfavorable) 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 비극성 또는 산성; 상기 유리는 극성 또는 염기성이고 상기 불리한 아미노산은 비극성임 - ;
    ii) 28번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 비극성; 상기 유리는 극성, 상기 중성은 산성 또는 염기성이고 상기 불리한 아미노산은 극성임 - ;
    iii) 47번 위치: 염기성 또는 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅳ) 48번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅴ) 70번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅵ) 71번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅶ) 72번 위치: 비극성인 불리한 아미노산; 및/또는
    ⅷ) 105번 위치: 보존적, 유리, 중성 또는 불리한 아미노산 - 여기에서 상기 보존적 아미노산은 염기성 또는 비극성; 상기 유리는 극성, 상기 중성은 산성, 염기성 또는 극성이고/거나 상기 불리한 아미노산은 극성, 비극성 또는 산성임 - ;
    중 하나 이상에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 2차 탄수화물 결합 부위의 아미노산 치환은:
    i) 77번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ii) 78번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    iii) 80번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅳ) 101번 위치: 유리, 불리 또는 중성 아미노산 - 여기에서 상기 유리한 아미노산은 극성 또는 염기성, 상기 불리한 아미노산은 비극성이고 상기 중성 아미노산은 비극성 또는 산성임 - ;
    ⅴ) 112번 위치: 비극성인 불리한 아미노산;
    ⅵ) 114번 위치: 극성인 불리한 아미노산;
    중 하나 이상에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 상기 i) 또는 ii)의 N 말단에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서 상기 N 말단은 서열 번호: 1의 1 및/또는 2에서 선택된 위치 또는 상기 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열의 대응 위치를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 아미노산 변형은 1번 위치의 아미노산 치환이고, 여기에서 치환 아미노산은 트레오닌 또는 발린이 아닌 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 치환 아미노산은 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 세린 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 아미노산 변형은 2번 위치의 아미노산 치환이고, 여기에서 치환 아미노산은 트립토판인 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  16. 제 12 항에 있어서,
    개시 메티오닌의 절단이 대조군에 비해 증가하거나 감소하는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  17. 제 1 항에 있어서,
    76번 위치의 상기 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로의 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 비극성 아미노산은 글리신, 발린 또는 류신 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  19. 제 1 항에 있어서,
    44 또는 89번 위치의 상기 아미노산 변형은 비극성 아미노산으로의 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 비극성 아미노산은 류신, 이소류신 또는 발린 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 가용성, 부분적 가용성 또는 불용성이고/거나 세포 독성을 갖는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 세포 독성을 갖는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 대조군의 10% 미만인 세포 독성 백분율을 갖거나 세포 독성이 없는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질은 대조군에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100% 증가된 세포 독성 백분율을 갖는 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형 렉틴 단백질의 길이는 500, 400, 300, 250, 200 또는 150개 이하의 아미노산인 것을 특징으로 하는,
    변형 렉틴 단백질.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 변형 렉틴 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 및 선택적으로 추가 치료 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 변형 렉틴 단백질 또는 제 26 항에 따른 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 암치료 방법.
  28. 의약에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 변형 렉틴 단백질 또는 제 26 항에 따른 약학 조성물.
  29. 암 치료에 사용하기 위한 제 28 항에 따른 변형 렉틴 단백질 또는 약학 조성물.
  30. 암세포 검출, 암 진단 및/또는 암 치료에 사용되는 경우의 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 변형 렉틴 단백질.
  31. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  32. 제 31 항에 따른 핵산 분자의 삽입을 포함하는 재조합 벡터.
  33. 제 32 항에 있어서,
    5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된, 숙주 세포에서 기능하는 프로모터; 변형 렉틴 단백질을 암호화하는 제 31 항에 따른 뉴클레오티드 서열; 및 종결 신호;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    재조합 벡터.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 단세포 유기체에서 복제, 전사, 번역 및/또는 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는,
    재조합 벡터.
  35. 제 31 항에 따른 핵산 분자 또는 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질 전환된 숙주 세포.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli) 또는 효모 세포인 것을 특징으로 하는,
    형질 전환된 숙주 세포.
  37. 재조합 스크렐로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴 단백질 생산 방법으로:
    ⅰ) 재조합 렉틴 단백질을 코딩하는 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    ⅱ) 상기 재조합 렉틴 단백질을 발현하는 단계;
    ⅲ) 상기 배양물에서 가공되지 않은(crude) 재조합 렉틴 단백질을 단리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    생산 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021015426A (es) * 2019-07-09 2022-01-24 Unichem Lab Ltd Formulaciones estables de proteinas recombinantes.
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WO2022149068A1 (en) * 2021-01-07 2022-07-14 Unichem Laboratories Ltd Lectin protein for treatment and prevention of neurodegenerative diseases
EP4366699A1 (en) 2021-07-08 2024-05-15 Unichem Laboratories Ltd Recombinant proteins, compositions and methods of stabilization thereof
CA3227834A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Dhananjay Sathe Protein compositions for the treatment of inflammatory diseases
CA3229988A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Dhananjay Sathe Recombinant glycan binding proteins and its use

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2014203261A2 (en) 2010-02-02 2014-12-24 Unichem Laboratories Ltd. Recombinant lectin and method of preparing thereof
CN103987855B (zh) * 2011-11-01 2017-04-26 独立行政法人产业技术综合研究所 未分化细胞检测方法及复合糖检测方法
CN107223019A (zh) * 2013-09-25 2017-09-29 胺细拉健康公司 用于维持和提高肌肉质量、强度和性能的组合物和制剂及其产生和使用方法
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