BR112021003628A2

BR112021003628A2 - variantes de proteína recombinantes

Info

Publication number: BR112021003628A2
Application number: BR112021003628-8A
Authority: BR
Inventors: Dhananjay Sathe; Sudeep Kumar
Original assignee: Unichem Laboratories Ltd
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-05-18
Also published as: KR20210052449A; SG11202101391WA; CN113383015A; ZA202100859B; WO2020044296A2; JP2021534776A; CN113383015B; US20210317171A1; CA3108842A1; EA202190240A1; MA53498A; AU2019330367A1; EP3844183A2; US11965003B2; WO2020044296A3; JP7453213B2; MX2021002295A

Abstract

VARIANTES DE PROTEÍNA RECOMBINANTES. Uma proteína de lectina modificada é provida tendo pelo menos uma modificação de aminoácido em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 ou em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia com esta. A modificação de aminoácido é selecionada de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma modificação de aminoácido em um sítio de ligação com carboidrato; pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal; pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 76; ou pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 44 ou 89. A proteína de lectina modificada não consiste na sequência de aminoácidos de nenhuma das SEQ ID NOs: 2 a 4.

Description

VARIANTES DE PROTEÍNA RECOMBINANTES Referência Cruzada para Aplicações Relacionadas

[001] É reivindicado o benefício do Pedido Provisório Indiano No. 201821032765 depositado em 31 de agosto de 2018, todo o conteúdo do qual é incorporado neste documento por referência. Campo de invenção

[002] A presente invenção se refere a uma proteína de lectina modificada e a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de lectina modificada. A invenção também se refere a um vetor recombinante compreendendo essa molécula de ácido nucleico e a uma célula hospedeira transformada compreendendo o vetor recombinante. Além disso, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de lectina modificada e à detecção de uma célula cancerosa, ao diagnóstico de câncer e ao tratamento de câncer em um paciente. A presente invenção também se refere a um processo para a produção de uma proteína de lectina Sclerotium rolfsii recombinante. Fundamentos da Invenção

[003] Lectinas são proteínas de ligação com carboidratos altamente específicas, macromoléculas que são altamente específicas para frações de açúcar de outras moléculas. Lectinas realizam reconhecimento em nível celular e molecular e desempenham vários papéis em fenômenos de reconhecimento biológico envolvendo células, carboidratos e proteínas. São proteínas divalentes ou polivalentes de ligação com carboidratos que se ligam e precipitam glicoproteínas e aglutinam as hemácias. As lectinas encontradas em animais são mais frequentemente encontradas para auxiliar nas interações celulares, enquanto as lectinas de plantas são conhecidas por afastar predadores ou patógenos em potencial.

[004] As lectinas purificadas são importantes em um ambiente clínico porque são usadas para tipagem sanguínea. Alguns dos glicolipídeos e glicoproteínas nos glóbulos vermelhos de um indivíduo podem ser identificados por lectinas. Muitas lectinas são usadas como biomarcadores indicando a detecção precoce de crescimento maligno ou como indutores de autofagia, enquanto outras lectinas também mostram a capacidade de inibir o crescimento canceroso por meio de apoptose. Devido à proliferação celular desregulada, algumas das porções de carboidrato são expressas como um antígeno em células cancerosas. As lectinas são usadas como um agente de entrega de drogas na terapia do câncer porque se ligam especificamente aos tumores malignos. Além disso, uma vez que as lectinas também modulam as vias associadas ao câncer, elas têm potencial como agentes terapêuticos e de diagnóstico de câncer.

[005] Existem vários antígenos aos quais lectinas se ligam e que têm sido caracterizados na superfície da célula de câncer; a maioria dos antígenos é específica para um tipo particular de câncer e a ligação da lectina a esses antígenos pode resultar na inibição do crescimento canceroso por meio da indução de apoptose nas células cancerosas. Atualmente, a maioria das lectinas disponíveis comercialmente são de plantas e outros eucariotos.

[006] Sclerotium rolfsii lectina (SRL) é uma lectina que tem sido isolada a partir dos corpos de escleródios do fungo fitopatogênico de solo S. rolfsii. SRL tem especificidade para com o antígeno Thomsen-Friedenreich (TF) e antígeno Tn. O antígeno TF é um dissacarídeo (Galβ1 → 3GalNAc-α- Ser/Thr) que é superexpresso na superfície celular de várias células cancerosas humanas diferentes. O antígeno Tn é um monossacárideo (GalNAc-α-). Devido à sua especificidade para os antígenos TF e Tn, o SRL demonstrou se ligar ao câncer de cólon humano, câncer de ovário e células leucêmicas. A estrutura cristalina do SRL foi determinada (Leonidas et al., J Mol Biol. 2007 May 11; 368 (4): 1145-61), mas a validação experimental dos sítios de ligação com carboidratos identificados a partir da estrutura cristalina não foi realizada.

[007] Enquanto as lectinas oferecem muitas vantagens como ferramentas anti- câncer, elas ainda apresentam muitas limitações, como a falta de seletividade, qualidade inconsistente e desempenho e a produção não sendo facilmente escalável. Além disso, as lectinas derivadas de plantas têm sido frequentemente relatadas por se ligar a uma variedade de diferentes estruturas de glicano e assim carecem da seletividade necessária para muitas aplicações. Além disso, a variabilidade lote a lote é comum ao usar lectinas vegetais. A qualidade dos produtos depende da metodologia de isolamento do material vegetal e da própria qualidade do material vegetal inicial.

[008] O isolamento da lectina das fontes naturais não é confiável porque a lectina assim obtida carece de consistência em relação às propriedades desejadas. O isolamento adicional de proteínas de fontes naturais é um processo caro e difícil. As técnicas usadas para isolar as lectinas de ocorrência natural geralmente provem rendimentos muito baixos, especialmente se a proteína estiver presente apenas em baixas concentrações. Também são ocasionalmente incapazes de distinguir entre isoformas da mesma lectina. Portanto, eles são obtidos como misturas, que provem uma grande faixa de incerteza. Neste sentido, a produção de lectinas recombinantes por técnicas de DNA recombinante (rDNA) tem a vantagem de prover proteínas individuais, com melhores rendimentos e consistentes com caracterização precisa em quantidade drasticamente menor de tempo e, ao mesmo tempo, sendo facilmente escalável. Usando a tecnologia de rDNA, pode-se transferir o gene que produz a proteína de interesse para um hospedeiro adequado. A proteína então pode ser produzida e isolada com menos tempo e esforço em comparação com os métodos tradicionais.

[009] A referência WO 2010/095143 divulga variantes de lectina recombinante Rec-2 e Rec-3, que são derivadas da sequência de SRL nativa pela substituição de 3 ou 5 aminoácidos respectivamente. A estrutura cristalina dessas variantes foi relatada (Peppa et al., Molecules. 12 de junho de 2015; 20(6):10848-65).

[0010] A referência WO 2014/203261 divulga uma variante de lectina recombinante derivada da sequência de SRL nativa pela substituição de 12 aminoácidos.

[0011] Permanece a necessidade de outras variantes de lectina que exibam propriedades alternativas. Em particular, é vantajoso para lectinas que devem ser usadas em diagnóstico de câncer e como agentes terapêuticos que sejam solúveis e estáveis sem comprometer a sua afinidade específica com relação às células de tumores malignos / câncer. Portanto, existe uma necessidade de novas sequências de lectina recombinante e métodos eficientes para produzir as lectinas recombinantes que têm níveis suficientes de expressão transgênica nas células hospedeiras apropriadas e com solubilidade e/ou estabilidade, enquanto também retêm a afinidade para com as células malignas.

[0012] A presente invenção visa atender a uma ou mais das necessidades acima.

Sumario da invenção

[0013] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provida uma proteína de lectina modificada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que a clivagem de um iniciador metionina é aumentada em comparação com a sequência de aminoácidos de i); c) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a formação de dímero da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a oxidação da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1

[0014] Em algumas modalidades, a proteína de lectina modificada não consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 2 a 4. Em algumas outras modalidades, a proteína de lectina modificada tem um efeito citotóxico.

[0015] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provida uma proteína de lectina modificada, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer um de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d):

a. pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); ou b. pelo menos uma modificação de aminoácido em um N-terminal de i) ou ii), c. pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 76; ou d. pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 44 ou 89, em que a proteína de lectina modificada não consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 2 a 4.

[0016] De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma proteína de lectina modificada, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer um de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); ou b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que a clivagem de um iniciador metionina é aumentada em comparação com a sequência de aminoácidos de i); c) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a formação de dímero da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 na posição 76; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a oxidação da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 na posição 44 ou 89, em que a proteína de lectina modificada não consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 2 a 4.

[0017] Opcionalmente, uma proteína de lectina modificada da invenção tem uma atividade biológica.

[0018] Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a SEQ ID NO. 1

[0019] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma proteína de lectina modificada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: i. SEQ ID NO. 1; ou ii. uma sequência de amina ou ácido tendo pelo menos 60% de homologia com i), em que a substituição de aminoácido é selecionada a partir de um ou mais de: a) uma substituição de aminoácido no sítio de ligação com carboidrato primário, em que o aminoácido de substituição é selecionado de um ou mais de: i. um aminoácido não polar, polar, ácido ou básico na posição 27 e/ou na posição 28; ii. um aminoácido não polar na posição 47 e/ou um aminoácido polar na posição 48; iii. um aminoácido não polar na posição 70, um aminoácido polar na posição 71 e/ou um aminoácido não polar na posição 72; e/ou iv. qualquer outro aminoácido na posição 105, b. uma substituição de aminoácido no local de ligação com carboidrato secundário, em que o aminoácido de substituição é selecionado de um ou mais de: i. um aminoácido não polar na posição 77, um aminoácido não polar na posição 78 e/ou um aminoácido polar na posição 80; ii. qualquer outro aminoácido na posição 101; iii. um aminoácido não polar na posição 112; e/ou um aminoácido polar na posição 114.

[0020] Em outra modalidade, a proteína de lectina modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii).

[0021] Em algumas modalidades, o local de ligação com carboidrato é um local de ligação com carboidrato primário e/ou secundário.

[0022] Em uma modalidade, o sítio de ligação com carboidrato primário compreende uma posição selecionada de um ou mais dentre: 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 e 105 na SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

[0023] Em tal modalidade, a posição da modificação de aminoácido é selecionada a partir de um ou mais de: i) 27 e/ou 28; ii) 47 e/ou 48; iii) 70, 71 e/ou 72; e/ou iv) 105.

[0024] Em outra modalidade, o sítio de ligação com carboidrato secundário compreende uma posição selecionada de um ou mais dentre: 77, 78, 80, 101, 112 e 114 na SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente na sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

[0025] Em tal modalidade, a posição da modificação de aminoácido é selecionada a partir de um ou mais de: i) 77, 78 e/ou 80; ii) 101; iii) 112 e/ou 114.

[0026] Em ainda outra modalidade, a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido de modo que um aminoácido substituto substitui um aminoácido original. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservativa ou favorável.

[0027] Em uma modalidade, a substituição de aminoácido no sítio de ligação com carboidrato primário é selecionada a partir de um ou mais de: i) na posição 27: um aminoácido conservativo, favorável ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar ou ácido; favorável é polar ou básico e o aminoácido desfavorável é não polar;

ii) na posição 28: um aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar; favorável é polar, neutro é ácido ou básico e o aminoácido desfavorável é polar; iii) na posição 47: um aminoácido desfavorável, que é básico ou não polar; iv) na posição 48: um aminoácido desfavorável, que é não polar; v) na posição 70: um aminoácido desfavorável, que é não polar; vi) na posição 71: um aminoácido desfavorável, que é não polar; vii) na posição 72: um aminoácido desfavorável, que é não polar; e/ou viii) na posição 105: um aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é básico ou não polar; favorável é polar, neutro é ácido, básico ou polar e/ou aminoácido desfavorável é polar, não polar ou ácido.

[0028] Em outra modalidade, a substituição de aminoácido no local de ligação do carboidrato secundário é selecionada a partir de um ou mais de: i) na posição 77: um aminoácido desfavorável que é não polar; ii) na posição 78: um aminoácido desfavorável que é não polar; iii) na posição 80: um aminoácido desfavorável que é não polar; iv) na posição 101: um aminoácido favorável, um desfavorável ou um neutro, em que o aminoácido favorável é polar ou básico, o aminoácido desfavorável é não polar e o aminoácido neutro é não polar ou ácido; v) na posição 112: um aminoácido desfavorável que é não polar; vi) na posição 114: um aminoácido desfavorável que é polar.

[0029] Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que o N-terminal compreende uma posição selecionada de: 1 e/ou 2 em SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente na sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

[0030] Em uma modalidade, a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido na posição 1, em que um aminoácido substituto não é treonina ou valina. Em outras modalidades, o aminoácido substituto é selecionado a partir de: alanina,

glicina, prolina ou serina. Em outras modalidades, a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido na posição 2, em que um aminoácido substituto é o triptofano.

[0031] Em algumas modalidades, a clivagem de um iniciador de metionina é aumentada ou diminuída em comparação com um controle.

[0032] Em outra modalidade, a modificação de aminoácido na posição 76 é uma substituição de aminoácido por um aminoácido não polar. Em algumas modalidades, o aminoácido não polar é selecionado a partir de: glicina, valina ou leucina.

[0033] Em uma modalidade, a modificação de aminoácido na posição 44 ou 89 é uma substituição de aminoácido por um aminoácido não polar. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido está de preferência na posição 89. Em algumas modalidades, o aminoácido não polar é selecionado a partir de: leucina, isoleucina ou valina.

[0034] Em outra modalidade, a proteína de lectina modificada é solúvel, parcialmente solúvel ou insolúvel e/ou tem citotoxicidade. Em algumas modalidades, a proteína de lectina modificada tem uma citotoxicidade que é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle. Em uma modalidade alternativa, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é inferior a 10% de um controle, ou está ausente de citotoxicidade. Em outra modalidade alternativa, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é pelo menos um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com o de um controle.

[0035] Em ainda outra modalidade, a proteína de lectina modificada é igual ou inferior a 500, 400, 300, 250, 200 ou 150 aminoácidos de comprimento.

[0036] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de lectina modificada e um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um outro ingrediente terapêutico. Também é provido um método de tratamento de câncer em um paciente, compreendendo a administração da proteína de lectina modificada ou da composição farmacêutica da proteína de lectina modificada ao paciente.

[0037] De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de lectina modificada como descrito acima e um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um outro ingrediente terapêutico. De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um método de tratamento de câncer em um paciente, que compreende a administração da proteína de lectina modificada, conforme descrito acima, a um paciente. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da composição farmacêutica descrita acima a um paciente.

[0038] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é provida uma proteína de lectina modificada ou a composição farmacêutica de proteína de lectina modificada para uso no tratamento de câncer. Além disso, é provida uma proteína de lectina modificada usada na detecção de uma célula cancerosa, diagnóstico de câncer e/ou terapia de câncer.

[0039] De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida uma proteína de lectina modificada como descrito acima para uso em medicina. Alternativamente, é provida uma composição farmacêutica como descrito acima para uso em medicina. Em algumas modalidades, a proteína de lectina modificada ou a composição farmacêutica, conforme descrito acima, são para uso no tratamento de câncer. De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida a proteína de lectina modificada conforme descrito acima quando usada na detecção de uma célula cancerosa, diagnóstico de câncer e/ou terapia de câncer.

[0040] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provida uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), e em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d):

a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii); c) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 76; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 44 ou 89,

[0041] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é provida uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), e em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que a clivagem de um iniciador metionina é aumentada em comparação com a sequência de aminoácidos de i); c) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a formação de dímero da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a oxidação da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1

[0042] De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada como descrito acima. Em um outro aspecto da invenção, é provido um vetor recombinante que compreende uma inserção desta molécula de ácido nucleico.

[0043] Em algumas formas de realização, o vector operacionalmente ligado em uma direção 5' para 3' compreende: um promotor que funciona em uma célula hospedeira; uma sequência de nucleotídeos como descrito acima que codifica uma proteína de lectina modificada; e um sinal de terminação. Em outra modalidade, o vetor recombinante é capaz de ser replicado, transcrito, traduzido e/ou expresso em um organismo unicelular.

[0044] Em ainda outro aspecto da invenção, é provida uma célula hospedeira transformada compreendendo a molécula de ácido nucleico descrita acima. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma bactéria Escherichia coli ou uma célula de levedura.

[0045] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é provido um vector recombinante compreendendo uma inserção de uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de lectina modificada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), e em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii); c) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 76; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 44 ou 89.

[0046] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor recombinante compreendendo uma inserção de uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), e em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); b) pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que a clivagem de um iniciador metionina é aumentada em comparação com a sequência de aminoácidos de i); c) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a formação de dímero da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a oxidação da proteína de lectina modificada em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1

[0047] Em um aspecto final da invenção, é provido um método para a produção de uma proteína de lectina Sclerotium rolfsii recombinante que compreende: i) cultivar uma célula hospedeira contendo o vetor recombinante como descrito acima codificando para uma proteína de lectina recombinante; ii) expressar a proteína de lectina recombinante; iii) isolar uma proteína de lectina recombinante bruta da cultura. Breve Descrição das Sequências Anexas • SEQ ID NO. 1: representa a sequência de aminoácidos da lectina nativa de S. rolfsii. • SEQ ID NO. 2: representa uma variante da sequência de aminoácidos da lectina de S. rolfsii (relatada como Rec-2 em WO 2010/095143). • SEQ ID NO. 3: representa uma variante da sequência de aminoácidos da lectina de S. rolfsii (relatada como Rec-3 em WO 2010/095143). • SEQ ID NO. 4: representa uma variante da sequência de aminoácidos da lectina de S. rolfsii (relatada em WO 2014/203261). Descrição Detalhada da Invenção

Definições:

[0048] O termo "proteína", tal como aqui utilizado, refere-se a um polímero de resíduos de aminoácidos.

[0049] O termo "lectina", tal como aqui utilizado, refere-se a uma proteína de ligação com carboidratos.

[0050] O termo "proteína de lectina modificada", tal como aqui utilizado, refere- se a um polímero de resíduos de aminoácidos que tem atividade de ligação com carboidratos e que contém pelo menos uma modificação de aminoácido.

[0051] O termo "aminoácido", tal como aqui utilizado, refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que têm uma função que é semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético e incluem os aminoácidos proteinogênicos. Os aminoácidos de ocorrência natural também incluem aqueles modificados após a tradução nas células. Os aminoácidos sintéticos incluem aminoácidos não canônicos, como selenocisteína e pirrolisina. Normalmente, os aminoácidos sintéticos não são aminoácidos proteinogênicos.

[0052] O termo "modificação de aminoácido", tal como aqui utilizado, refere-se à adição, deleção ou substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, a adição de um aminoácido refere-se à adição de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em uma posição particular em uma sequência de aminoácidos. Os processos de adição, deleção ou substituição são realizados de acordo com a presente invenção ou por métodos conhecidos do especialista. Em uma modalidade, "modificação de aminoácido", tal como aqui utilizado, refere-se a uma ou mais modificações selecionadas a partir de: acetilação, nitração, glicação e/ou sulfonação.

[0053] O termo "substituição de aminoácido", tal como aqui utilizado, refere-se à substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de aminoácidos. O termo "substituição de aminoácido" abrange substituições de aminoácidos conservativas e não conservativas. Uma substituição conservativa de aminoácidos provê um aminoácido funcionalmente semelhante. Em outras palavras, o aminoácido que substitui o aminoácido original (ou seja, o aminoácido “substituto”) tem propriedades bioquímicas semelhantes. Uma substituição não conservativa provê um aminoácido funcionalmente diferente. Em outras palavras, o aminoácido que substitui o aminoácido original (ou seja, o aminoácido “substituto”) possui propriedades bioquímicas diferentes. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido "favorável". Uma substituição de aminoácido favorável preserva uma função biológica e/ou outra propriedade da proteína de lectina modificada. Em outra modalidade, ambas as substituições de aminoácidos conservativas e favoráveis são baseadas em pares ou em um alinhamento de sequência múltipla de proteínas de lectina. A substituição conservativa é a substituição com aminoácido que ocorre nas proteínas de lectina naturais máximas na posição correspondente e a substituição favorável é a substituição com aminoácido que ocorre em poucas proteínas de lectinas naturais na posição correspondente. Espera-se que ambas as substituições retenham ou aumentem a citotoxicidade da proteína modificada. Em uma modalidade, a função biológica é "um efeito citotóxico" conforme definido abaixo. Em uma modalidade, o aminoácido substituto é selecionado como uma substituição de aminoácido favorável com base em um alinhamento par a par ou de sequência múltipla de proteínas de lectina, de preferência proteínas de lectina fúngica.

[0054] Entende-se que os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com diferentes propriedades bioquímicas. Os exemplos incluem: os aminoácidos polares, os aminoácidos não polares, os aminoácidos ácidos e os aminoácidos básicos. Em uma modalidade, o aminoácido usado para a modificação de aminoácido é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em, mas não se limita a: polar, não polar, ácido, básico, selenocisteína, pirrolisina e não canônico.

[0055] Os termos "homologia" ou "homólogo", conforme usados neste documento, referem-se a duas ou mais entidades referenciadas que compartilham pelo menos identidade parcial sobre uma determinada região ou porção. Áreas, regiões ou domínios de homologia ou identidade referem-se a uma porção de duas ou mais entidades referenciadas que compartilham homologia ou são iguais. Assim, onde duas sequências são idênticas em uma ou mais regiões de sequência, elas compartilham identidade nessas regiões. Homologia substancial refere-se a uma molécula que é estruturalmente ou funcionalmente conservada de modo que tenha ou seja previsto ter pelo menos uma estrutura ou função parcial de uma ou mais das estruturas ou funções (por exemplo, uma função ou atividade biológica) da molécula de referência, ou uma região ou porção relevante / correspondente da molécula de referência com a qual compartilha homologia.

[0056] Em uma modalidade, a porcentagem de "homologia" entre duas sequências é determinada usando o algoritmo BLASTP com parâmetros padrão (Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Set 1; 25 (17):3389-402). Em particular, o algoritmo BLAST pode ser acessado na Internet usando a URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Em uma modalidade alternativa, para alinhamentos de sequência global, a homologia percentual entre duas sequências é determinada usando o algoritmo EMBOSS Needle usando parâmetros padrão. Em particular, o algoritmo EMBOSS Needle pode ser acessado na Internet usando a URL: https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/.

[0057] A menos que indicado de outra forma, o termo "homologia" é usado indistintamente com o termo "identidade de sequência" na presente especificação.

[0058] O termo "uma posição correspondente", conforme usado neste documento, refere-se a uma posição análoga entre duas ou mais sequências. Em uma modalidade, a posição correspondente é determinada através de um alinhamento de sequência de pelo menos uma primeira e uma segunda sequência. A posição correspondente nas pelo menos primeira e segunda sequências está alinhada na saída do alinhamento de sequência e, portanto, pode ser identificada. Em uma modalidade, o alinhamento de sequência é um alinhamento de pares ou de sequência múltipla. Em uma modalidade, o alinhamento de sequência é realizado por um algoritmo. Em uma modalidade, o algoritmo é BLAST ou EMBOSS Needle como discutido acima.

[0059] O termo "sítio de ligação com carboidrato", tal como aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácidos em uma proteína de lectina que estão envolvidos no reconhecimento e ligação de uma estrutura de carboidrato. Em uma modalidade, o sítio de ligação com carboidrato está envolvido no reconhecimento e ligação do antígeno TF (um dissacarídeo; Galβ1 → 3GalNAc-α-Ser/Thr) e/ou o antígeno Tn (um monossacarídeo; GalNAc-α-). Em uma modalidade, o "sítio de ligação com carboidrato" abrange um "sítio de ligação com carboidrato primário" e/ou um "sítio de ligação com carboidrato secundário".

[0060] O termo "sítio de ligação com carboidrato primário", tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidos que estão envolvidos no reconhecimento e na ligação de uma estrutura de carboidrato específica. Em uma modalidade, a estrutura de carboidrato específica é o antígeno TF. Em uma modalidade, os resíduos de aminoácidos que constituem o sítio de ligação com carboidrato primário são selecionados de uma ou mais das posições 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 e/ou 105 em SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta. Em uma modalidade, a posição correspondente é determinada por meio de um alinhamento de sequência.

[0061] O termo "sítio de ligação com carboidrato secundário", tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidos que estão envolvidos no reconhecimento e na ligação de uma estrutura de carboidrato específica. Em uma modalidade, a estrutura de carboidrato específica é o antígeno Tn. Em uma modalidade, os resíduos de aminoácidos que constituem o sítio de ligação com carboidrato secundário são selecionados a partir de uma ou mais das posições 77, 78, 80, 101, 112 e/ou 114 em SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta. Em uma modalidade, a posição correspondente é determinada por meio de um alinhamento de sequência.

[0062] O termo "um efeito citotóxico", tal como aqui utilizado, refere-se a uma substância que mata células cancerosas ou inibe o crescimento de células cancerosas (ou seja, exerce uma atividade antiproliferativa). Numa forma de realização, a percentagem de citotoxicidade de uma substância é determinada usando um ensaio de Sulforodamina B (SRB) como detalhado no Exemplo 5. Numa forma de realização, uma percentagem de citotoxicidade de, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60% como determinado pelo ensaio de SRB é indicativo de um efeito citotóxico. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2

[0063] O termo "N-terminal", tal como aqui utilizado, refere-se a resíduos de aminoácidos que estão localizados no início da sequência de aminoácidos (ou seja, em direção ao amino terminal). Em uma modalidade, o N-terminal refere-se aos resíduos de aminoácidos localizados nos primeiros 10% ou 5% da sequência de aminoácidos.

[0064] O termo "clivagem de uma metionina iniciadora", tal como aqui utilizado, refere-se à remoção da metionina N-terminal (iniciadora) de uma sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, a clivagem da metionina iniciadora é catalisada pela enzima metionina aminopeptidase (MAP). Em uma modalidade, a clivagem da metionina iniciadora é determinada usando espectrometria de massa ou análise de HPLC conhecida por um especialista na técnica.

[0065] O termo "clivagem de uma metionina iniciadora é aumentada", tal como aqui utilizado, refere-se a um aumento na extensão da clivagem de iniciador de metionina em relação a um controle. Em uma modalidade, refere-se a pelo menos 5%, 10%, 25% ou 50% de aumento na extensão da clivagem da metionina iniciadora em relação a um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2.

[0066] O termo "formação de dímero", tal como aqui utilizado, refere-se à formação de um oligômero contendo dois monômeros que são idênticos ou não idênticos. Em uma modalidade, a formação de dímero refere-se à produção de um dímero contendo duas proteínas de lectina modificadas de acordo com a presente invenção (idênticas ou não idênticas). Numa forma de realização alternativa, a formação de dímero refere-se à produção de um dímero contendo uma proteína de lectina modificada de acordo com a presente invenção e uma proteína de lectina alternativa, tal como uma consistindo na sequência de SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade, a formação de dímero é mediada por uma ligação dissulfeto entre resíduos de cisteína em cada monômero. Em uma modalidade, o resíduo de cisteína está na posição 76 da SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia com aquela. Em uma modalidade, a posição correspondente é determinada por meio de um alinhamento de sequência. Em uma modalidade, o nível de formação de dímero é determinado usando qualquer um de espectrometria de massa, cromatografia de exclusão de tamanho e/ou análise SDS-PAGE.

[0067] O termo "formação de dímero reduzida", tal como aqui utilizado, refere- se a uma diminuição no nível de formação de dímero em relação a um controle. Em uma modalidade, "formação de dímero reduzida" refere-se a pelo menos 5%, 10%, 25% ou 50% de diminuição no nível de formação de dímero em relação a um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2.

[0068] O termo "oxidação", conforme aqui usado, refere-se a uma perda de elétrons ou a um aumento no estado de oxidação. Em uma modalidade, o termo "oxidação" se refere à oxidação de um resíduo de aminoácido, exemplos dos quais incluem metionina, cisteína, triptofano, tirosina e/ou histidina. Em uma modalidade, o termo "oxidação" refere-se à oxidação de um resíduo de metionina em sulfóxido de metionina. Em uma modalidade, o resíduo de metionina que é suscetível à oxidação está na posição 44 ou 89 da SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia a esta. Em uma modalidade, a posição correspondente é determinada por meio de um alinhamento de sequência. Em uma modalidade, o nível de oxidação é determinado usando espectrometria de massa e/ou cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC). Acredita-se que a oxidação esteja afetando a expressão e a atividade da proteína. Numa forma de realização, o efeito de oxidação é determinada pelo efeito da substituição de aminoácidos que são susceptíveis a oxidação na posição 44 ou 89 da SEQ ID NO. 1 sobre a expressão e/ou atividade solúvel da proteína de lectina.

[0069] O termo "oxidação reduzida", tal como aqui utilizado, refere-se a uma diminuição no nível de oxidação em relação a um controle. Em uma modalidade, "oxidação reduzida" se refere a uma diminuição de pelo menos 5%, 10%, 25% ou 50% no nível de oxidação em relação a um controle. Em uma modalidade alternativa, "oxidação reduzida" refere-se a expressão e/ou atividade solúvel aprimorada da proteína de lectina. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2.

[0070] O termo "solúvel", tal como aqui utilizado, refere-se à proteína de lectina modificada sendo expressa em uma forma solúvel ou pelo menos parcialmente solúvel. Em uma modalidade, a solubilidade da proteína de lectina modificada é determinada por lise celular de uma célula hospedeira que expressa a proteína de lectina modificada e subsequente análise SDS-PAGE do sobrenadante de lise e sedimento. A presença da proteína de lectina modificada no sobrenadante da lise indica que ela é solúvel. A presença da proteína de lectina modificada no sobrenadante da lise e no sedimento indica que é parcialmente solúvel. Em uma modalidade, o termo "solúvel", tal como aqui utilizado, refere-se à proteína de lectina modificada que não forma corpos de inclusão. Usando o método descrito acima, a presença da proteína de lectina modificada no sedimento indica que ela é expressa como corpos de inclusão.

[0071] O termo "molécula de ácido nucleico", tal como aqui utilizado, refere-se a um polímero de múltiplos nucleotídeos. As moléculas de ácido nucleico podem compreender ácidos nucleicos de ocorrência natural ou podem compreender ácidos nucleicos artificiais. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é DNA ou um derivado deste. Em uma modalidade alternativa, a molécula de ácido nucleico é RNA ou um derivado deste.

[0072] O termo "nucleotídeo", tal como aqui utilizado, refere-se a nucleotídeos de ocorrência natural e análogos de nucleotídeos sintéticos que são reconhecidos por enzimas celulares.

[0073] Na busca de desenvolver novas lectinas com propriedades físico- químicas alteradas e/ou melhoradas e/ou atividade biológica, os inventores da presente invenção desenvolveram várias variantes da lectina, com modificação da sequência de lectina nativa em locais ativos e não ativos.

[0074] Numa forma de realização, a presente invenção provê variantes de lectina recombinante derivadas da sequência de lectina nativa apresentando propriedades alteradas; de preferência mostrando a especificidade de certas cadeias de açúcar encontradas exclusivamente em certas células cancerosas e/ou solubilidade e/ou estabilidade aprimorada em comparação com a proteína nativa. Estas lectinas recombinantes são obtidas através da realização de modificações deliberadas na lectina nativa. Em uma modalidade da presente invenção, a lectina nativa é derivada do grupo que consiste em, mas não se limita a, fungo e plantas. Normalmente, a lectina nativa é derivada de um fungo fitopatogênico transmitido pelo solo. Numa forma de realização exemplar da presente invenção, o fungo fitopatogénico é S. rolfsii. É preferido que as lectinas recombinantes derivadas da sequência de aminoácidos da lectina nativa tenham especificidade para o antígeno Tn e/ou antígeno TF e, portanto, se liguem ao câncer de cólon humano, câncer de ovário e células leucêmicas.

[0075] Em termos gerais, a presente invenção refere-se a uma proteína de lectina modificada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60% de homologia com esta e em que a proteína de lectina modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em SEQ ID NO. 1 ou na sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com aquele. A sequência de SEQ ID NO. 1 corresponde à sequência de lectina nativa de S. rolfsii (conforme relatado em WO 2010/095143). A modificação de aminoácido é selecionada a partir de um ou mais de: uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta; uma modificação de aminoácido no N-terminal de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta; uma modificação de aminoácido que reduz a formação de dímero da proteína de lectina modificada; e/ou uma modificação de aminoácidos que reduz a oxidação.

[0076] É preferido que a proteína de lectina modificada não consista na sequência de aminoácidos de nenhuma das SEQ ID NO. 2 (conforme relatado em WO 2010/095143 como a variante recombinante Rec-2), SEQ ID NO. 3 (conforme relatado em WO 2010/095143 como a variante recombinante Rec-3) ou SEQ ID NO. 4 (conforme relatado em WO 2014/203261). SEQ ID NOS. 2 a 4 são exemplos de sequências de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID N O.1. Em particular, SEQ

ID NOS. 2, 3 e 4 têm uma homologia de 97,9%, 96,5% e 91,5% com a SEQ ID NO. 1 respectivamente (conforme determinado usando EMBOSS Needle). Local de ligação com carboidratos

[0077] Em uma primeira modalidade da presente invenção, o local de ligação com carboidrato é um local de ligação com carboidrato primário que compreende as posições de aminoácidos 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 e 105 em SEQ ID NO. 1 (conforme relatado em Leonidas et al. 2007) ou as posições correspondentes de uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO. 1. O local de ligação com carboidrato primário exibe especificidade para o antígeno TF (Galβ1 → 3GalNAc-α- Ser//Thr), que é expresso na superfície das células cancerosas. Na primeira modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições do local de ligação primário. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas de: 27 e/ou 28; 47 e/ou 48; 70, 71 e/ou 72; e/ou 105.

[0078] Em uma segunda modalidade da presente invenção, o local de ligação com carboidrato é um local de ligação com carboidrato secundário que compreende as posições de aminoácidos 77, 78, 80, 101, 112 e 114 em SEQ ID NO. 1 (conforme relatado em Leonidas et al. 2007) ou as posições correspondentes de uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO. 1. O sítio de ligação do carboidrato secundário exibe especificidade para o antígeno Tn (GalNAc-α-). Na segunda forma de realização, a proteína modificada lectina contém uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições do sítio de ligação secundário. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas a partir de: 77, 78 e/ou 80; 101; e/ou 112 e/ou 114.

[0079] É preferido que uma substituição de aminoácido de acordo com a primeira e/ou segunda concretização seja uma substituição de aminoácido conservativa ou favorável. Uma substituição conservativa de aminoácido refere-se ao aminoácido substituto (isto é, aquele que substitui o aminoácido original) possuindo propriedades bioquímicas semelhantes às do aminoácido original. Em uma modalidade, um aminoácido polar é substituído por um aminoácido polar diferente; um aminoácido não polar é substituído por um aminoácido não polar diferente; um aminoácido acídico é substituído por um aminoácido acídico diferente; ou um aminoácido básico é substituído por um aminoácido básico diferente. Também se refere à substituição com o aminoácido que ocorre nas proteínas de lectina natural máxima em posições correspondentes com base em pares ou um alinhamento de múltiplas sequências de proteínas de lectina. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido favorável de modo que a proteína de lectina modificada preserva uma função biológica e/ou outra propriedade da proteína de lectina modificada. Numa forma de realização preferida, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido favorável, de modo que a proteína de lectina modificada retém um efeito citotóxico e/ou é solúvel. Em uma modalidade, um resíduo de aminoácido é selecionado para uma substituição de aminoácido favorável com base em pares ou um alinhamento de sequências de múltiplas proteínas de lectina naturais, de preferência proteínas de lectina fúngicas. Substituição favorável é a substituição com amino ácido que ocorre em algumas proteínas de lectina naturais em posições correspondentes. Sem desejar ser limitado pela teoria, pensa-se que a seleção de um resíduo de aminoácido que está presente em uma posição correspondente em uma sequência homóloga e sua inclusão na proteína de lectina modificada tem mais probabilidade de manter uma função biológica e/ou outra propriedade (tal como o efeito citotóxico e/ou solubilidade) da proteína de lectina modificada.

[0080] Em uma modalidade alternativa, uma substituição de aminoácido de acordo com a primeira e/ou segunda modalidades é uma substituição de aminoácido não conservativa ou desfavorável. Uma substituição de aminoácido não conservativa ou desfavorável refere-se ao aminoácido substituto (isto é, aquele que substitui o aminoácido original) possuindo propriedades bioquímicas diferentes das do aminoácido original. Por exemplo, um aminoácido polar é substituído por um aminoácido não polar ou vice-versa. Uma substituição de aminoácido não conservativa ou desfavorável também se refere à substituição com aminoácido que não está presente nas posições correspondentes de outras proteínas de lectinas naturais quando alinhadas aos pares ou em sequência múltipla. Em uma modalidade, a substituição de aminoácidos não conservativa ou desfavorável altera o efeito citotóxico e/ou a solubilidade da proteína de lectina modificada em relação a um controle. Em uma modalidade, o efeito citotóxico alterado e/ou solubilidade é determinado em relação à proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o efeito citotóxico e/ou solubilidade é determinado em relação à proteína de lectina de SEQ ID NO 2.

[0081] Em uma modalidade, o aminoácido substituto no sítio de ligação com carboidrato primário é selecionado a partir de um ou mais de: a. na posição 27: aminoácido conservativo, favorável ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar ou ácido; favorável é polar ou básico e o aminoácido desfavorável é não polar; b. na posição 28: aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar; favorável é polar, neutro é ácido ou básico e o aminoácido desfavorável é polar; c. na posição 47: aminoácido desfavorável, que é básico ou não polar; d. na posição 48: aminoácido desfavorável, que é não polar; e. na posição 70: aminoácido desfavorável, que é não polar; f. na posição 71: aminoácido desfavorável, que é não polar; g. na posição 72: aminoácido desfavorável, que é não polar; e/ou h. na posição 105: aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é básico ou não polar; favorável é polar, neutro é ácido, básico ou polar e/ou aminoácido desfavorável é polar, não polar ou ácido.

[0082] Em particular, o aminoácido de substituição no sítio de ligação com carboidrato primário é selecionado a partir de um ou mais de: a. glicina (Y27G), triptofano (Y27 W), fenilalanina (Y27 F), ácido glutâmico (Y27 E) ou histidina (Y27 H) na posição 27; e/ou glicina (A28G), triptofano (A28W), serina (A28S), ácido aspártico (A28D) ou histidina (A28H) na posição 28; b. leucina na posição 47 (S47L); e/ou triptofano na posição 48 (G48W); c. isoleucina na posição 70 (H70I); triptofano na posição 71 (N71W); e/ou glicina na posição 72 (Y72G); e d. fenilalanina (R105F), glutamina (R105Q), ácido glutâmico (R105E), leucina (R105L), lisina (R105K), alanina (R105A), serina (R105S), valina (R105V), isoleucina (R105I), prolina (R105P), metionina (R105M), glicina (R105G), treonina (R105T), tirosina (R105Y), triptofano (R105W), asparagina (R105N), cisteína (R105C), ácido aspártico (R105D), ou histidina (R105H) na posição 105.

[0083] Em uma modalidade, o aminoácido de substituição no local de ligação do carboidrato secundário é selecionado a partir de um ou mais de: a. na posição 77: um aminoácido desfavorável que é não polar; b. na posição 78: um aminoácido desfavorável que é não- polar; c. na posição 80: um aminoácido desfavorável que é não polar; d. na posição 101: um aminoácido favorável, um desfavorável ou um neutro, em que o aminoácido favorável é polar ou básico, o aminoácido desfavorável é não polar e o aminoácido neutro é não polar ou ácido; e. na posição 112: um aminoácido desfavorável que é não polar; f. na posição 114: um aminoácido desfavorável que é polar.

[0084] Em particular, o aminoácido de substituição no local de ligação com carboidrato secundário é selecionado de um ou mais de: a. fenilalanina na posição 77 (D77F), glicina na posição 78 (I78G) e triptofano na posição 80 (T80W); b. fenilalanina (R101F), glutamina (R101Q), metionina (R101M), ácido glutâmico (R101E); e lisina (R101K) na posição 101; c. glicina na posição 112 (Y112G) e/ou asparagina na posição 114 (V114N).

[0085] É preferido que a proteína de lectina modificada contendo uma substituição de aminoácido de acordo com a primeira e/ou segunda forma de realização tenha um efeito citotóxico. Em uma modalidade, o efeito citotóxico é determinado usando um ensaio SRB. Numa forma de realização particularmente preferida, a proteína de lectina modificada tem uma percentagem de citotoxicidade que é superior ou igual à de um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade alternativa, o controle é uma proteína de lectina diferente de SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade, a porcentagem de citotoxicidade da proteína de lectina modificada representa um aumento percentual de 20% em comparação com a do controle. Em uma modalidade preferida, representa um aumento percentual de 45%. Em modalidades alternativas, a porcentagem de citotoxicidade da proteína de lectina modificada representa pelo menos um aumento de 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com aquele de o controle. É também preferido que a proteína de lectina modificada contendo uma substituição de aminoácido de acordo com a primeira e/ou segunda forma de realização seja solúvel ou parcialmente solúvel. Modificação N-terminal (pg 24)

[0086] Numa terceira forma de realização da presente invenção, a proteína de lectina modificada compreende uma substituição de aminoácido na posição 1 e/ou 2 de SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente de uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta. É preferido que o aminoácido substituto (isto é, aquele que substitui o aminoácido original) na posição 1 não seja valina ou treonina. Em particular, é preferido que o aminoácido substituto na posição 1 tenha uma pequena cadeia lateral. De preferência, o aminoácido substituto é selecionado de um de: alanina, glicina, prolina ou serina. Em uma outra modalidade, o aminoácido substituto na posição 2 é triptofano. Em uma modalidade alternativa, o aminoácido substituto na posição 2 é um aminoácido não polar diferente. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém as substituições de aminoácidos conforme definido acima nas posições 1 e 2 da SEQ ID NO. 1 ou as posições correspondentes de uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com aquela. Em uma modalidade preferida, os aminoácidos de substituição nas posições 1 e 2 são alanina e triptofano, respectivamente.

[0087] É preferido que a sequência de aminoácidos da proteína de lectina modificada de acordo com a terceira modalidade aumente a clivagem de uma metionina N-terminal (iniciador) em comparação com um controle. Em uma modalidade, o controle é uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2. Em uma modalidade, a clivagem da metionina iniciadora é catalisada pela enzima metionina aminopeptidase (MAP). A extensão da clivagem do iniciador com metionina é determinada usando um método conhecido por um especialista na técnica; preferencialmente usando análise de espectrometria de massa ou Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Sem querer ser limitado pela teoria, acredita-se que a extensão da clivagem da metionina iniciadora por MAP é afetada pelo resíduo de aminoácido na primeira e/ou segunda posição após aquela da metionina iniciadora (por exemplo, posição 1 e/ou 2 da SEQ ID NO. 1). Em particular, pensa-se que uma sequência de aminoácidos compreendendo um resíduo de aminoácido com uma pequena cadeia lateral na primeira posição após a metionina iniciadora aumenta a extensão da clivagem da metionina iniciadora (como discutido acima).

[0088] Além disso, é preferido que a proteína de lectina modificada de acordo com a terceira forma de realização seja solúvel e/ou tenha um efeito citotóxico. Mais preferencialmente, a proteína de lectina modificada é solúvel e tem um efeito citotóxico. Em uma modalidade, o efeito citotóxico é determinado usando um ensaio SRB. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada exibe uma porcentagem de citotoxicidade que é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle. Em outra modalidade, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é inferior a 10% de um controle, ou está ausente de citotoxicidade. Em uma outra modalidade, a porcentagem de citotoxicidade é de pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% daquela de uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1

[0089] Em uma variante da terceira modalidade, a substituição de aminoácido no N-terminal está em uma posição diferente da posição 1 e/ou 2 da SEQ ID NO. 1 ou a posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido nos primeiros 10% ou 5% da sequência de aminoácidos (diferente das posições 1 e/ou 2). Formação reduzida de dímero

[0090] Foi relatado que a proteína nativa S. rolfsii existe como um monômero em condições ácidas e forma um dímero em pH neutro ou básico (Leonidas et al. 2007). Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o resíduo de cisteína na posição 76 da SEQ ID NO. 1 medeia a formação de dímero através da formação de uma ligação dissulfeto. Em certas modalidades, é preferível reduzir a formação de dímero de modo que apenas uma forma da proteína (isto é, a forma monomérica) esteja presente.

[0091] Assim, em uma quarta modalidade da presente invenção, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido na posição 76 de SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente de uma sequência tendo pelo menos 60% de homologia com esta, de modo que o resíduo de aminoácido nessa posição não seja mais cisteína. Em uma modalidade preferida, o aminoácido substituto (isto é, aquele que substitui o aminoácido original) na posição 76 é glicina. Em uma modalidade alternativa, o aminoácido substituto na posição 76 é um resíduo de aminoácido não polar diferente. Em uma modalidade, o aminoácido substituto é selecionado com base no alinhamento de sequência de proteínas de lectina fúngica, conforme relatado na Figura 6 de Leonidas et al. 2007. Assim, em uma modalidade, o aminoácido de substituição não polar é selecionado de um dentre: valina ou leucina.

[0092] A proteína de lectina modificada contendo a substituição de aminoácido de acordo com a quarta modalidade exibe formação de dímero reduzida em comparação com uma lectina na proteína de SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade, o nível de formação de dímero é determinado usando espectrometria de massa. Em uma modalidade alternativa, o nível de formação de dímero é determinado usando cromatografia de exclusão de tamanho ou análise SDS-PAGE. É preferido que a proteína de lectina modificada de acordo com a quarta forma de realização seja solúvel e/ou tenha um efeito citotóxico. Mais preferencialmente, a proteína de lectina modificada é solúvel e tem um efeito citotóxico. Em uma modalidade, o efeito citotóxico é determinado usando um ensaio SRB. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada exibe uma porcentagem de citotoxicidade que é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle. Em outra modalidade, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é inferior a 10% de um controle, ou está ausente de citotoxicidade. Em uma outra modalidade, a porcentagem de citotoxicidade é de pelo menos 60%, 80% ou 90% daquela de um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2.

[0093] Em uma variante da quarta modalidade, a substituição de aminoácido que reduz a formação de dímero está em uma posição diferente da posição 76. Por exemplo, sem desejar ser limitado pela teoria, em uma modalidade, ligações alternativas diferentes de uma ligação dissulfeto contribuem para a formação de dímero e uma substituição de aminoácido alternativa é empregada para interromper a formação dessas ligações e, portanto, reduzir a formação de dímero. Oxidação reduzida

[0094] Numa quinta forma de realização da presente invenção, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido na posição 89 de SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia com aquela. Em uma outra modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido na posição 44 e/ou 89 da SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de homologia com aquela. Em uma modalidade preferida, o aminoácido substituto (isto é, aquele que substitui o aminoácido original) na posição 89 é a valina. Em uma modalidade alternativa, o aminoácido substituto na posição 89 é um resíduo de aminoácido não polar diferente. Em uma modalidade, o aminoácido substituto é selecionado com base no alinhamento de sequência de proteínas de lectina fúngica, conforme relatado na Figura 6 de Leonidas et al. 2007. Assim, em uma modalidade, um resíduo de aminoácido não polar selecionado de um de: leucina ou isoleucina. Em uma outra modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido na posição 44 de acordo com o definido acima para a posição 89. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada contém uma substituição de aminoácido nas posições 44 e 89 conforme definido acima.

[0095] Sem desejar estar limitado pela teoria, pensa-se que os resíduos de metionina nas posições 44 e/ou 89 da SEQ ID NO. 1 são suscetíveis à oxidação, que resulta na formação de sulfóxido de metionina nessas posições. A oxidação dos resíduos de metionina em sulfóxido de metionina tem o potencial de prejudicar a atividade biológica da lectina. Assim, em certas modalidades, é preferível reduzir a oxidação da proteína de lectina. Consequentemente, a proteína de lectina modificada contendo a substituição de aminoácido conforme definido pela quinta modalidade exibe oxidação reduzida em comparação com uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade, o nível de oxidação é determinado usando espectrometria de massa. Em uma modalidade alternativa, o nível de oxidação é determinado usando RP-HPLC. Além disso, é preferido que a proteína de lectina modificada de acordo com a quinta forma de realização seja solúvel e/ou tenha um efeito citotóxico. Mais preferencialmente, a proteína de lectina modificada é solúvel e tem um efeito citotóxico. Em uma modalidade, o efeito citotóxico é determinado usando um ensaio SRB. Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada exibe uma porcentagem de citotoxicidade que é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle. Em outra modalidade, a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é inferior a 10% de um controle, ou está ausente de citotoxicidade. Em uma outra modalidade, a porcentagem de citotoxicidade é de pelo menos 60%, 70% ou 90% daquela de um controle. Em uma modalidade, o controle é uma proteína de lectina de SEQ ID NO. 1 e em outra modalidade, o controle é SEQ ID NO. 2.

[0096] Em uma variante da quinta modalidade, a substituição de aminoácido que reduz a oxidação está em uma posição diferente da posição 44 e/ou 89. Por exemplo, sem desejar ser limitado pela teoria, em uma modalidade, resíduos de aminoácidos alternativos, tais como resíduos de aminoácidos de cisteína, triptofano, tirosina e histidina contribuem para a oxidação da proteína de lectina. Assim, uma substituição alternativa de aminoácidos é empregada para limitar a oxidação nesses locais e, portanto, reduzir a oxidação da proteína em geral. Outras modalidades

[0097] Na primeira à quinta modalidades descritas acima, a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido. No entanto, em uma variante de qualquer uma da primeira à quinta modalidades, a modificação de aminoácido é uma modificação diferente de uma substituição de aminoácido. Em uma modalidade variante, a modificação de aminoácido é uma adição ou uma deleção de um aminoácido em uma posição particular na sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, a adição de um aminoácido é a adição de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em uma posição particular em uma sequência de aminoácidos.

[0098] Na primeira a quinta concretizações descritas acima, é preferido que a proteína de lectina modificada tenha um efeito citotóxico. Em uma outra modalidade que é relevante para qualquer uma da primeira à quinta modalidades, a lectina modificada tem uma função biológica adicional (além de ter um efeito citotóxico). Em uma modalidade, a função biológica se refere à especificidade da proteína de lectina modificada para um antígeno.

[0099] Na primeira à quinta modalidades descritas acima, a proteína de lectina modificada pode conter uma modificação de aminoácido em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO. 1. Em uma outra modalidade que é relevante para qualquer uma da primeira à quinta modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 70%, 75%, 80% ou 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. É particularmente preferido que a sequência de aminoácidos tenha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1

[00100] Deve ser entendido que a proteína de lectina modificada pode conter uma combinação ou pluralidade de qualquer uma das modificações de aminoácidos descritas acima em relação à primeira à quinta modalidades.

[00101] Numa outra forma de realização da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de lectina modificada como descrito acima. Além disso, a composição farmacêutica compreende um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Diluentes e excipientes exemplares incluem água esterilizada, solução salina fisiológica e tampão fosfato. A composição farmacêutica, em algumas modalidades, também compreende um outro ingrediente terapêutico.

[00102] Detalhes adicionais de componentes adicionais da composição farmacêutica podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences e US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.

[00103] Em uso, a proteína de lectina modificada, conforme explicado acima (a seguir, o "medicamento") é administrada a um paciente em necessidade de tratamento. Em uma modalidade, uma dose adequada para o medicamento é de 0,1 a 1 mg / kg. Em uma modalidade, o paciente está sofrendo de um câncer. Em uma modalidade, o câncer é selecionado de um de: câncer de ovário, leucemia e/ou câncer de cólon. Em princípio, qualquer modo de administração do medicamento pode ser usado. Em uma modalidade, o medicamento é administrado por um dos seguintes modos: injeção, spray ou inalação.

[00104] Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada, conforme descrito acima, é usada na detecção de uma célula cancerosa.

[00105] Em uma modalidade, a proteína de lectina modificada conforme descrito acima é usada em um método de diagnóstico; preferencialmente, em um método de diagnóstico de câncer.

[00106] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada como descrito acima. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico inclui qualquer alteração na sequência de nucleótidos, incluindo, mas não se limitando a, substituição, deleção e/ou adição.

[00107] Deve ser apreciado que, devido à degenerescência do código genético, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma determinada variante de lectina modificada podem ter uma gama de sequências de nucleotídeos. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCT codificam o aminoácido alanina.

[00108] As moléculas de ácido nucleico podem ser DNA ou RNA ou seus derivados.

[00109] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma molécula de DNA recombinante que compreende um vetor. É preferido que o vetor seja um plasmídeo ou um vetor viral. Em uma modalidade, é provido um vetor recombinante que compreende uma inserção da molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma lectina modificada como descrito acima. Em uma outra modalidade, o vetor recombinante é um vetor de expressão e compreende operacionalmente ligado na direção 5' para 3': um promotor que funciona em uma célula hospedeira; uma sequência de ácido nucleico estrutural que codifica uma proteína de lectina modificada conforme descrito acima; e um sinal de terminação.

[00110] Numa outra forma de realização da presente invenção, é provido um processo para a produção de uma proteína de lectina de Sclerotium rolfsii recombinante; e, em particular, uma proteína de lectina modificada como descrito acima. Numa forma de realização, as sequências de nucleotídeo clonado codificam proteínas de lectina modificadas que estão perto da lectina nativa sequência de aminoácidos, mas que proveem propriedades alternativas. Alternativamente, as sequências de nucleotídeos que codificam as variantes de lectina modificadas podem ser sintetizadas usando meios químicos ou recombinantes e expressas em um hospedeiro adequado para obter as proteínas recombinantes. As células hospedeiras adequadas incluem células procarióticas e células eucarióticas inferiores, bem como células eucarióticas superiores. A introdução da molécula recombinante nas células hospedeiras pode ser efetuada usando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização exemplar da presente invenção, o hospedeiro adequado é uma célula microbiana. Em uma modalidade preferida, a célula microbiana é selecionada a partir do grupo que consiste em, mas não se limita a, uma célula de levedura, Escherichia coli, uma linhagem de células de inseto ou uma linhagem de células de mamífero.

[00111] As proteínas recombinantes conforme descrito acima podem ser obtidas por isolamento como um produto de expressão de um hospedeiro recombinante. As proteínas recombinantes da presente invenção, que em uma modalidade, são purificadas por técnicas convencionais, tipicamente métodos cromatográficos convencionais. Em outra modalidade exemplar da presente invenção, a massa molecular das lectinas recombinantes, determinada por SDS-PAGE, é de aproximadamente 16.000 Da. Em ainda outra modalidade exemplar da presente invenção, as lectinas recombinantes podem possuir especificidade de grupo sanguíneo, tipicamente em relação aos grupos sanguíneos humanos. Em ainda outra modalidade exemplar da presente invenção, as proteínas recombinantes podem ter capacidade exclusiva para reconhecer o antígeno TF e suas formas crípticas.

[00112] Consequentemente, embora esta invenção tenha sido descrita com referência a modalidades ilustrativas, esta descrição não se destina a ser interpretada em um sentido limitante. Várias modificações das modalidades ilustrativas, bem como outras modalidades da invenção, serão evidentes para os versados na técnica com referência a esta descrição. É, portanto, contemplado que a presente invenção irá abranger quaisquer modificações ou modalidades que caiam dentro do verdadeiro escopo da invenção. Exemplos Exemplo 1: Mutagênese direcionada ao local

[00113] A sequência de aminoácidos da sequência de lectina nativa de S. rolfsii (SEQ ID NO. 1) foi modificada nas diferentes posições específicas conforme mencionado aqui abaixo na Tabela 1 através de mutagênese dirigida ao local. Um plasmídeo foi extraído a partir de E. coli, células BL21 DE3, que codificavam a sequência de aminoácidos nativa da sequência SRL clonada em um vector pET20b e este foi utilizado como modelo. Uma reação de PCR foi configurada para 50 µl contendo 10 µl de 5X Q5 Reaction Buffer, 1 µl de 10mM dNTPs, 2,5 µl de 10 µM de Forward primer, 2,5 µl de 10 µM de Reverse primer, 0,5 µl de enzima Q5 DNA polimerase de alta fidelidade e 20 ng do volume total do modelo até 50 µl com água destilada.

[00114] O gene de interesse foi amplificado usando PCR com uma etapa de desnaturação inicial a 98 °C por 30 segundos, seguido por 35 ciclos de amplificação consistindo em uma etapa de desnaturação a 98 °C por 30 segundos, uma etapa de recozimento a 55 °C por 30 segundos, e uma etapa de extensão a 72 °C por 30 segundos. Finalmente, uma etapa de extensão adicional foi realizada a 72 °C por 5 minutos. Todas as reações de PCR foram realizadas com o Mastercycler Pro. Os produtos de PCR foram analisados em 1,2% de géis de agarose contendo brometo de etídio (EtBr). Tabela 1: Lista de primers usados para a construção de diferentes variantes de lectina derivadas da sequência de SRL nativa: a. Variantes de clones para clivagem eficiente de metionina iniciadora Variante do clone Mudar Forward Primer Reverse Primer ULLB-0005/001 T1S ATATACATATGAGCTATAAAATTACCG

ULLB-0005/002 T1A ATATACATATGGCGTATAAAATTACCG ULLB-0005/003 T1P ATATACATATGCCGTATAAAATTACCG TATGCTAGTTAT ULLB-0005/004 T1G ATATACATATGGGCTATAAAATTACCG TGCTCAGCGGT ULLB-0005/005 T1A, Y2W ATATACATATGGCGTGGAAAATTACCG b. Variantes do clone para alterar o local de ligação do carboidrato primário Variante do Mudar Forward Primer Reverse Primer clone ULLB-0005/00 8 Y27G, A28W GTGTGGAAAGGCTGGAATGGCGGTAC GTACCGCCATTCCAGCCTT

TCCACAC ULLB-0005/00 9 S47L, G48W GATGGGTGGTCTGTGGACCAGCGG CCGCTGGTCCACAGACCA

CCCATC ULLB-0005/010 H70I, N71W, CCTTTGGTGTGATTTGGGGCAAACGCT CACCAGCGTTTGCCCCAA Y72G GGTG ATCACACCAAAGG ULLB-0005/011 R105F CGAAGAAGCGTTTGAACGCCAG CTGGCGTTCAAACGCTTC

TTCG c. Variantes do clone para alterar o local de ligação do carboidrato secundário Variante do Mudar Forward Primer Reverse Primer clone D77F, I78G, CTGGTGTTTTTGGCGTGTGGAA CAGGTTCCACACGCC ULLB-0005/0 T80W CCTGGCAGCGGATGAAAC AAAACACCAGCGTTT 12 ATAATTATGC ULLB-0005/0 R101F GTCAGAAAAACTTTGAAGAAGC GCGCTTCTTCAAAGT 13 GC TTTTCTGAC ULLB-0005/0 Y112G, GGCCAGAACAAAAATGCGAAA GTTCTGGCCGTTACT 14 V114N GGCCGTAAC CAGCTGGCGTTC d. Variantes de clones para prevenção da formação de dímeros e oxidação de proteínas

Variante do Mudar Forward Primer Reverse Primer clone ULLB-0005/0 C76G CGCTGGGGCGATATTGTGACC GGTCACAATATCGCCCCAGCG 15 ULLB-0005/0 M89V GAAACCGGCGTGGTTATTAAT CTGATTAATAACCACGCCGGT 16 CAG TTC Exemplo 2: Digestão de restrição

[00115] Os produtos de PCR (obtidos no exemplo 1) ou plasmídeos foram digeridos com as enzimas de restrição NdeI e BamHI, usando 500 ng de produto / plasmídeo de PCR, 1 µl de tampão CutSmart 10x e 1-2 unidades de NdeI e 1-2 unidades de BamHI, para um volume final de 10 µl. A reação foi incubada a 37 °C durante 45 minutos a 1 hora e os resultados da digestão foram observados em gel de agarose a 1,2% contendo brometo de etídio (EtBr).

[00116] O DNA foi então extraído e purificado de géis de agarose. Exemplo 3: ligação do vetor pET e confirmação de transformantes por PCR de colônia

[00117] A reação de ligação ao vetor pET foi realizada utilizando uma mistura consistindo em 100 ng de amostra de DNA (produto digerido com enzima de restrição do exemplo 2), 50 ng de vetor pET digerido, 1 µl de tampão 10X T4 DNA ligase e 1 µl de T4 DNA enzima ligase, até um volume final de 10 µl. Esta reação foi conduzida a 22 °C durante 1 hora.

[00118] A mistura de ligação foi transformada em células competentes E.coli DH5α pelo método de choque térmico. As células foram então plaqueadas em placas de LA / canamicina e incubadas durante a noite a 37 °C. Os transformantes foram então submetidos a PCR para verificar a integridade e intactabilidade da inserção com pET forward e pET reverse primers com as seguintes condições de PCR. O programa de PCR incluiu uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 10 minutos, seguida por 35 ciclos de amplificação consistindo em uma etapa de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, uma etapa de recozimento a 55 °C por 30 segundos e uma etapa de extensão em 72 °C por 45 segundos. Finalmente, uma etapa de extensão adicional foi realizada a

72 °C por 10 minutos. A reação de PCR consistiu em colônia bacteriana (molde de DNA), 10 µM de pET forward primer, 10 µM de pET reverse primer, 5 µl de EconoTaq PLUS GREEN 2X Master Mix (Lucigen) e água destilada até um volume final de 10 µl. Os produtos de PCR foram analisados em 1,2% de gel de agarose contendo EtBr. Exemplo 4: Análise de extração e expressão de DNA de plasmídeo

[00119] Os transformantes positivos foram inoculados em culturas líquidas de LB / canamicina e, em seguida, a extração de DNA de plasmídeo foi realizada a partir de E. coli. Todas as construções preparadas neste trabalho, com as inserções nos vetores pET, foram confirmadas por sequenciamento.

[00120] O vetor pET27b contendo cada sequência de nucleotídeos modificada que codifica uma variante de lectina foi transformado em células E. coli BL 21DE3 GOLD. Os clones positivos foram selecionados por análise de expressão em meio de auto-indução. O tamanho e o nível de expressão de lectina recombinante foram confirmados por análise de SDS-PAGE. Os estoques de glicerol dos clones positivos foram preparados e mantidos a -80 °C.

[00121] O estoque de glicerol (40 µl) foi inoculado em 50 ml de caldo LB (contendo 20 µg / ml de canamicina) e incubado a 37 °C a 140 rpm durante 16 horas. 1% de cultura foi inoculada em 200 ml de meio de produção compreendendo 1% de extrato de levedura (p / v), 1,2% de Dextrose (p / v), 0,3% de KH2PO4 (p / v), 1,25% de K2HPO4 (p / v), 0,5% (NH4)2SO4 (p / v), 0,05% NaCl (p / v), 0,1% de MgSO4.7H2O (p / v) e 0,1% (v / v) de solução de traços de metal. Canamicina foi adicionada na concentração final de 20 µg / ml. Os frascos foram incubados a 37 °C e a 140 rpm. Quando OD600 da cultura atingiu 1,5, a temperatura foi reduzida para 18 °C e a cultura foi ainda incubada durante 1 hora. A cultura foi então induzida com IPTG 0,25 mM e posteriormente incubada a 18 °C durante 20 horas. As amostras de cultura antes da indução e depois de indução, foram analisadas para a expressão de proteínas e solubilidade por análise de SDS-PAGE. O caldo de cultura foi centrifugado a 9000 rpm durante 15 minutos a 15 °C. O sedimento obtido foi ressuspenso em tampão de lise (25 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). As células foram lisadas por homogeneização de alta pressão a 18000 psi (124,100 kPa). O lisado foi clarificado usando fibra oca de 0,1 mícron pré-equilibrada com tampão de lise.

[00122] A solução de proteína clarificada foi submetida a cromatografia de troca iónica para purificar a lectina recombinante. Exemplo 5: Bioensaio - Atividade de antiproliferação de lectina purificada contra linha celular de câncer de ovário (PA-1)

[00123] A atividade anti-proliferação das variantes recombinantes, purificadas de lectina foi determinada usando um Ensaio de Sulforrodamina B (SRB). As proteínas de lectina são pensados para exercer um efeito citotóxico sobre a linha celular de câncer de ovário PA-1 através da ligação aos antígenos TF / Tn; assim, o ensaio pode também prover informação sobre a especificidade das proteínas de lectina. Uma atividade antiproliferativa indica ainda a estabilidade da proteína de lectina, visto que se pensa que a conformação da proteína é mantida para reter a atividade. O ensaio mediu a biomassa total pela coloração de proteínas celulares com SRB. SRB é um corante aminoxanteno rosa brilhante que pode formar um complexo eletrostático com resíduos de aminoácidos básicos de proteínas de células fixadas com ácido tricloroacético em condições ligeiramente ácidas. Ele pode dissociar sob condições básicas suaves e pode ser solubilizado para medição. Tem sido amplamente utilizado para o rastreamento de toxicidade de drogas contra diferentes tipos de linhagens de células cancerosas e não cancerosas. As células foram lavadas brevemente, fixadas e coradas com o corante. O corante incorporado foi então liberado das células com solução de base Tris. O corante incorporado liberado das células coradas foi diretamente proporcional à biomassa celular e pode ser medido para indicar o grau de citotoxicidade causada pelo material de teste.

[00124] A citotoxicidade das células foi monitorada / medida quando as células estavam na fase logarítmica de crescimento. Os testes foram realizados num volume final de 200 µl e incluíram uma amostra de controle de 200 µl de meio isento de células para ser usado como leituras de absorvência em branco. As diluições do teste foram realizadas em meio livre de soro para reduzir o fundo e uma diluição 10 vezes maior do que a concentração desejada foi preparada.

[00125] No primeiro dia, as células foram semeadas por uma etapa inicial de tripsinização, contado pelo método de azul de Tripano em Câmara de Neuebauer e plaqueadas nos poços de uma parte inferior plana de placa de 96 poços (placa de paredes escuras) a uma densidade de 5000 células / poço. No segundo dia, após a incubação durante a noite, o meio na placa foi reabastecido com 180 µL / poço e, em seguida, as células foram tratadas com 20 µl de cada item de teste em concentrações que variam de 2,5 a 80 µg / ml de modo que o volume total em cada poço tinha 200 µl. As placas foram incubadas do segundo ao quarto dia. As células foram então tratadas com SRB no quinto dia. As placas foram então observadas ao microscópio em condições estéreis.

[00126] As células foram fixadas por camadas delicadas de 50μl de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (frio), sobre o meio de crescimento. As placas não foram movidas após a etapa de fixação para evitar o deslocamento das células, o que resulta em imprecisões. Estas placas foram então incubadas durante 1 hora a 4 °C e depois lavadas com água purificada 4 vezes para remover o excesso de fixador e proteínas do soro. As placas foram secas ao ar. Algumas dessas placas foram armazenadas em temperatura ambiente para uso posterior. As placas foram então coradas com corante SRB pela adição de 0,4% (50μl) de solução de corante SRB para cobrir a superfície de cultura dos poços, seguido de incubação por 30 minutos a 28 °C.

[00127] A mancha foi removida por decantação e enxaguada com uma solução de lavagem (ácido acético a 1%). As placas foram lavadas em 5 ciclos de lavagem até o corante não incorporado ser removido. As placas foram ainda secas ao ar até nenhuma humidade era visível.

[00128] Para solubilização, 200μl de SRB Solubilisation Buffer (10 mm Tris) foi adicionado ao poço, ou seja, igual ao volume original do poço seguido de incubação a 28 °C por 5 minutos. A placa foi então agitada suavemente durante 5 a 10 minutos para dissolver o corante e a absorbância foi medida a 580 nm. Exemplo 6: modificação de aminoácidos da sequência de lectina nativa de S. rolfsii

[00129] A sequência de lectina nativa foi modificada para alterar as propriedades físico-químicas conforme descrito abaixo. a) Aumento da eficiência de clivagem da metionina iniciadora:

[00130] A alta taxa de expressão das proteínas recombinantes em E. coli limita a clivagem da metionina N-terminal (metionina iniciadora) pela enzima metionina amino peptidase (MAP), resultando assim na mistura de proteína contendo Met-lectina e Met-lectina livre. Um fator importante que afeta a clivagem da metionina do iniciador são os aminoácidos após o resíduo de metionina. O MAP cliva todas as proteínas com pequenas cadeias laterais no resíduo na segunda posição (ou seja, o primeiro resíduo de aminoácido após a metionina iniciadora). As proteínas com resíduos Valina ou Treonina após a metionina iniciadora são muito menos eficientemente clivadas pela MAP do que aqueles com alanina, glicina, prolina, ou serina nesta posição. Os clones foram construídos para substituir o primeiro (Treonina) e o segundo (Tirosina) aminoácido no N-terminal da sequência de lectina nativa por 4 aminoácidos diferentes (Tabela 2) para verificar o efeito na clivagem de metionina do iniciador, solubilidade, especificidade e atividade biológica. A solubilidade, especificidade e atividade biológica das variantes da lectina não foram afetadas pelas mudanças.

[00131] A lectina recombinante foi purificada de todas as cinco variantes da sequência de lectina nativa projetada para a clivagem eficiente da metionina ao nível do frasco de agitação. Todas as variantes da sequência de lectina nativa, em que a treonina na posição 1 foi substituída por alanina, glicina, serina e prolina mostrou expressão solúvel e semelhante em comparação com o controle. A atividade biológica de todas as variantes também foi semelhante à do controle. Foi assim observado que alterar o primeiro e/ou segundo aminoácido da sequência de lectina não afeta a expressão ou atividade biológica em comparação com o controle. b) Prevenção da formação de dímeros e oxidação de proteínas:

[00132] Acredita-se que os resíduos de cisteína presentes no monômero de lectina de S. rolfsii contribuam para a formação de dímeros por ligação dissulfeto e, portanto, podem afetar a especificidade e a atividade biológica da lectina. Acredita-se que o resíduo de metionina na lectina de S. rolfsii seja sujeito à oxidação durante o processo de purificação. Os resíduos de cisteína e metionina nas posições 76 e 89 foram substituídos por meio de uma substituição de aminoácido para prevenir a formação de dímero e a oxidação de proteínas, respectivamente. A variante ULLB-0005/015 da sequência de lectina nativa em que a cisteína na posição 76 foi substituída por glicina a fim de evitar a formação de dímero expressou lectina recombinante na forma solúvel sem afetar a atividade biológica em comparação com o controle. Da mesma forma, a variante ULLB-0005/016 da sequência de lectina nativa onde a metionina na posição 89 foi substituída por valina a fim de prevenir a oxidação da proteína foi expressa na forma solúvel sem afetar a atividade biológica em comparação com o controle. Portanto, modificar cisteína e metionina nas posições 76 e 89 com glicina e valina, respectivamente, não afeta a expressão, solubilidade, especificidade e atividade biológica da lectina. Tabela 2. Sumário dos clones projetados para clivagem eficiente da metionina iniciadora, prevenção da formação de dímeros e oxidação de proteínas i. Mudanças feitas para clivagem eficiente da metionina iniciadora Variante do Mudança na Peso Mol. Ponto Expressão Bioensaio (PA-1) Teor de metionina clone sequência Teórico isoelétrico (% citotoxicidade) (Met) (% Abundância) (Dalton) teórico Controle TYKIT….... 16044,73 6,47 Solúvel 31,6 - 58 7,31 ULLB- SYKIT …… 16029,70 6,49 Solúvel 1,99 35,13 0005/001 ULLB- AYKIT …… 16013,70 6,57 Solúvel 9,32 33,47 0005/002 ULLB- PYKIT …….. 16039,74 6,61 Solúvel 6,99 47,2 0005/003 ULLB- GYKIT…..... 15999,66 6,57 Solúvel 1,12 45 0005/004 ULLB- AWKIT…..... 16036,74 6,57 Solúvel 15,6 34,29 0005/005 ii. Mudanças feitas para prevenir a formação de dímeros e oxidação de proteínas Variante do Mudança na Bioensaio (PA-1) Teórico Mol. Peso (Dalton) PI teórico Expressão clone sequência (% citotoxicidade) ULLB- C76G 15997,64 6,47 Solúvel 30 0005/015 ULLB- M89V 16011,67 6,47 Solúvel 34 0005/016 (Ao controle) N/D N/D 6,47 Solúvel 31,6 - 58

[00133] A sequência da lectina nativa também foi modificada para alterar a atividade biológica conforme descrito abaixo. c) Ligação com carboidratos do local de modificação primário:

[00134] O local primário de ligação com carboidrato exibe especificidade para o antígeno TF (Galβ1 → 3GalNAc-α-Ser//Thr) expresso em células cancerosas.

Os aminoácidos nos sítios de ligação dos carboidratos primários foram alterados e as proteínas de lectinas modificadas foram investigadas em relação à solubilidade, especificidade e atividade biológica da proteína.

No que diz respeito ao efeito sobre a especificidade e atividade biológica, a citotoxicidade das proteínas de lectina modificados contra uma linha celular de câncer de ovário (PA-1) foi avaliada.

As modificações de aminoácidos feitas no local de ligação com carboidrato primário estão ilustradas na Tabela 3. As variantes ULLB-0005/008 (Y27G e A28W) e ULLB-0005/011 (R105F) da sequência de lectina nativa expressou lectina recombinante em forma solúvel; no entanto, a atividade biológica foi perdida.

Ao passo que a variante ULLB- 0005/010 (H70I, N71W e Y72G) foi expressa como parcialmente solúvel e a citotoxicidade desta variante era mais elevada do que o da lectina recombinante em variante ULLB-0005/009 (S47L e G48W) foi expressa como corpos de inclusão.

Portanto, alterar o local de ligação do carboidrato primário afeta a solubilidade e também a atividade biológica da lectina.

Os dados neste exemplo demonstram que os resíduos de aminoácidos nas posições 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 e 105 definem o local de ligação com carboidrato primário.

Foi concluído que o local de ligação com carboidrato primário está envolvido na ligação com o antigénio TF que está presente na superfície de células cancerosas.

Tabela 3. Resumo dos clones projetados para alterar os locais de ligação com carboidratos primários Variante do clone Mudança na Peso Ponto Expressão Bioensaio (PA-1) sequência de molecular isoelétrico (% citotoxicidade) aminoácidos teórico teórico ULLB-0005/0 08 Y27G, A28W 16052,74 6,47 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/0 09 S47L, G48W 16198,97 6,47 IB formado Sem atividade ULLB-0005/0 10 H70I, N71W, Parcialmente 15985,73 6,38 52 Y72G Solúvel ULLB-0005/0 1 1 R105F 16034,72 6,16 Solúvel Sem atividade Ao controle Não aplicável 16044,73 6,47 Solúvel 31,6 a 58 d) Modificação do sítio de ligação com carboidrato secundário:

[00135] O sítio de ligação com carboidrato secundário envolvido na ligação com GalNAc-α- (antígeno Tn) foi modificado. Os aminoácidos nos sítios de ligação com carboidratos secundários foram alterados e as proteínas de lectinas modificadas foram investigadas em relação à solubilidade, especificidade e atividade biológica da proteína. O efeito na especificidade e atividade biológica contra a linhagem de células de câncer de ovário (PA-1) foi avaliado. A modificação de aminoácidos realizada no local de ligação do carboidrato secundário está representada na Tabela 4 e afeta a solubilidade, especificidade e/ou atividade biológica da lectina recombinante.

[00136] Os locais de ligação secundária foram selecionados de 77, 78, 80, 101, 112 ou 114 e foram modificados para substituir de D, I, T, R, Y e V para F, G, W, F, G e N, respectivamente para preparar várias novas variantes da sequência de lectina nativa. As variantes ULLB-0005/012 (D77F, I78G e T80W) e ULLB-0005/014 (Y112G e V114N), que foram projetadas para alterar o sítio de ligação com carboidrato secundário expressaram lectina recombinante na forma de corpos de inclusão e parcialmente solúvel, respectivamente. É possível que uma substituição desfavorável de aminoácidos feita na variante ULLB-0005/012 tenha contribuído para a expressão insolúvel dessa proteína. A variante ULLB-0005/013 mostrou perda de atividade antiproliferação contra a linha celular PA-1, enquanto a variante ULLB-0005/014 mostrou atividade antiproliferação semelhante em comparação com o clone de controle contra a linha celular PA-1. Os dados neste exemplo demonstram que os resíduos de aminoácidos nas posições 77, 78, 80, 101, 112 e 114 definem o local de ligação do carboidrato secundário. Concluiu-se que a modificação do sítio de ligação do carboidrato secundário afeta a solubilidade e também a atividade biológica da lectina. Tabela 4. Sumário dos clones projetados para alterar os locais de ligação com carboidratos secundários Peso molecular Ponto Mudança na Bioensaio (PA-1) Variante do clone teórico isoelétrico Expressão sequência (% citotoxicidade) teórico D77F, I78G, 16104,82 6,90 ULLB-0005/012 Formação IB Não realizada T80W

ULLB-0005/013 16034,72 6,16 R101F Solúvel Sem atividade ULLB-0005/014 15952,58 6,47 Parcialmente Y112G, V114N 42,3 solúvel Ao controle Não aplicável 16044,73 6,47 Solúvel 31,6 - 58 Exemplo 7: Nova mutagênese dirigida ao local

[00137] Similar ao Exemplo 1, a sequência de aminoácidos da variante de lectina de sequência SEQ ID NO. 2 foi modificada nas diferentes posições específicas conforme mencionado abaixo na Tabela 5 através de mutagênese dirigida ao local. Tabela 5: Lista de iniciadores utilizados para a construção de lectina diferentes variantes derivadas a partir da variante de lectina de sequência SEQ ID NO. 2 a. Variantes do clone para alterar o local de ligação do carboidrato primário Variante do clone Mudar Forward Primer Reverse Primer ULLB-0005/026 Y27W GTGTGGAAATGGGCGAATGGC GCCATTCGCCCATTTCCACAC ULLB-0005/027 Y27F GTGTGGAAATTTGCGAATGGC GCCATTCGCAAATTTCCACAC ULLB-0005/028 Y27E GTGTGGAAAGAAGCGAATGGC GCCATTCGCTTCTTTCCACAC ULLB-0005/029 Y27H GTGTGGAAACATGCGAATGGC GCCATTCGCATGTTTCCACAC ULLB-0005/030 A28S GGAAATATAGCAATGGCGGTACC GGTACCGCCATTGCTATATTTCC ULLB-0005/031 A28G GGAAATATGGCAATGGCGGTACC GGTACCGCCATTGCCATATTTCC ULLB-0005/032 A28D GGAAATATGATAATGGCGGTACC GGTACCGCCATTATCATATTTCC ULLB-0005/033 A28H GGAAATATCATAATGGCGGTACC GGTACCGCCATTATGATATTTCC ULLB-0005/0 18 R105Q GAAGAAGCGCAGGAACGCCAG CTGGCGTTCCTGCGCTTCTTC ULLB-0005/0 19 R105E GAAGAAGCGGAAGAACGCCAG CTGGCGTTCTTCCGCTTCTTC ULLB-0005/0 20 R105L GAAGAAGCGCTGGAACGCCAG CTGGCGTTCCAGCGCTTCTTC ULLB-0005/0 21 R105K GAAGAAGCGAAAGAACGCCAG CTGGCGTTCTTTCGCTTCTTC ULLB-0005/0 34 R105A GAAGAAGCGGCGGAACGCCAG CTGGCGTTCCGCCGCTTCTTC ULLB-0005/0 35 R105S GAAGAAGCGAGCGAACGCCAG CTGGCGTTCGCTCGCTTCTTC ULLB-0005/0 36 R105V GAAGAAGCGGTGGAACGCCAG CTGGCGTTCCACCGCTTCTTC ULLB-0005/0 37 R105I GAAGAAGCGATTGAACGCCAG CTGGCGTTCAATCGCTTCTTC ULLB-0005/0 38 R105P GAAGAAGCGCCGGAACGCCAG CTGGCGTTCCGGCGCTTCTTC ULLB-0005/0 39 R105M GAAGAAGCGATGGAACGCCAG CTGGCGTTCCATCGCTTCTTC ULLB-0005/0 40 R105G GAAGAAGCGGGCGAACGCCAG CTGGCGTTCGCCCGCTTCTTC ULLB-0005/0 41 R105T GAAGAAGCGACCGAACGCCAG CTGGCGTTCGGTCGCTTCTTC

Variante do clone Mudar Forward Primer Reverse Primer ULLB-0005/0 42 R105Y GAAGAAGCGTATGAACGCCAG CTGGCGTTCATACGCTTCTTC ULLB-0005/0 43 R105W GAAGAAGCGTGGGAACGCCAG CTGGCGTTCCCACGCTTCTTC ULLB-0005/0 44 R105N GAAGAAGCGAACGAACGCCAG CTGGCGTTCGTTCGCTTCTTC ULLB-0005/0 45 R105C GAAGAAGCGTGCGAACGCCAG CTGGCGTTCGCACGCTTCTTC ULLB-0005/0 46 R105D GAAGAAGCGGATGAACGCCAG CTGGCGTTCATCCGCTTCTTC ULLB-0005/0 47 R105H GAAGAAGCGCATGAACGCCAG CTGGCGTTCATGCGCTTCTTC b. Variantes do clone para alterar o local de ligação do carboidrato secundário Variante do clone Mudar Forward Primer Reverse Primer ULLB-0005/0 22 R101Q CAGAAAAACCAGGAAGAAGCGC GCGCTTCTTCCTGGTTTTTCTG ULLB-0005/0 23 R101M CAGAAAAACATGGAAGAAGCGC GCGCTTCTTCCATGTTTTTCTG ULLB-0005/0 24 R101E CAGAAAAACGAAGAAGAAGCGC GCGCTTCTTCTTCGTTTTTCTG ULLB-0005/0 25 R101K CAGAAAAACAAAGAAGAAGCGC GCGCTTCTTCTTTGTTTTTCTG Exemplo 8: Modificação de aminoácidos da sequência de lectina variante SEQ ID NO: 2.

[00138] A sequência de lectina nativa foi modificada para alterar as propriedades físico- químicas conforme descrito abaixo. a. Modificação do sítio de ligação com carboidrato primário:

[00139] O principal local de ligação com carboidrato exibe especificidade para o antígeno TF (Galβ1 → 3GalNAc-α-Ser//Thr) expresso em células cancerosas. Os aminoácidos nos sítios de ligação com carboidratos primários foram alterados e as proteínas de lectinas modificadas foram investigadas em relação à solubilidade, especificidade e atividade biológica da proteína. Com relação ao efeito sobre a especificidade e atividade biológica, a citotoxicidade das proteínas de lectina modificadas contra uma linha celular de câncer de ovário (PA-1) foi avaliada. As modificações de aminoácidos feitas no local de ligação com carboidrato primário são ilustradas na Tabela 6. As variantes da sequência de lectina nativa, ULLB-0005/028 (Y27E), ULLB-0005/032 (A28D), ULLB-0005/018 (R105Q), ULLB-0005/035 (R105S), ULLB- 0005/043 (R105W), e ULLB-0005/045 (R105C), que expressaram lectina recombinante na forma solúvel; no entanto, a atividade biológica foi perdida.

As variantes ULLB- 0005/021 (R105K) ULLB-0005/047 (R105H) foram expressas na forma solúvel e a citotoxicidade desta variante foi consideravelmente maior do que as outras variantes.

Isso pode ser devido à natureza básica do aminoácido substituído.

De forma semelhante, a substituição conservativa em A28 com Glargina não polar (A28G - ULLB- 0005/031) também foi expressa na forma solúvel e a citotoxicidade desta variante foi consideravelmente maior do que as outras variantes.

As variantes ULLB-0005/019 (R105E) e ULLB-0005/046 (R105 D) foram expressas como corpos de inclusão.

É possível que a substituição de R105 por aminoácidos ácidos tenha contribuído para a expressão insolúvel dessa proteína.

As variantes ULLB-0005/034 (R105A), ULLB-0005/037 (R105I), ULLB-0005/038 (R105P) e ULLB-0005/041 (R105T) foram expressas em uma forma solúvel e, portanto, não foram afetadas em comparação com o controle.

Portanto, alterar o local de ligação com carboidrato primário afeta a solubilidade e também a atividade biológica da lectina.

Os dados neste exemplo demonstram que os resíduos de aminoácidos nas posições 27, 28 e 105 definem o local de ligação com carboidrato primário.

Concluiu-se que o principal sítio de ligação com carboidrato está envolvido na ligação com o antígeno TF que está presente na superfície das células cancerosas.

Tabela 6. Sumário dos clones projetados para alterar os locais de ligação com carboidratos primários Variante do clone Mudança na Peso Ponto Expressão Bioensaio (PA-1) sequência de molecular isoelétrico (% aminoácidos teórico teórico citotoxicidade)

ULLB-0005/0 26 Y27W 16066,77 6,47 Solúvel 40 ULLB-0005/0 27 Y27F 16027,73 6,47 Solúvel 50 ULLB-0005/0 28 Y27E 16009,67 6,17 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/0 29 Y27H 16017,69 6,55 Solúvel 26 ULLB-0005/0 30 A28S 16059,73 6,47 Solúvel 43 ULLB-0005/0 31 A28G 16029,70 6,47 Solúvel 57 ULLB-0005/0 32 A28D 16087,74 6,17 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/03 3 A28H 16109,79 6,55 Solúvel 49 ULLB-0005/0 18 R105Q 16015,67 6,16 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/0 19 R105E 16016,66 5,91 Insolúvel Sem atividade

ULLB-0005/0 20 R105L 16000,70 6,16 Solúvel 25,38 ULLB-0005/0 21 R105K 16015,72 6,47 Solúvel 53,99 ULLB-0005/0 34 R105A 15958,62 6,16 Solúvel 39,29 ULLB-0005/0 35 R105S 15974,62 6,16 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/03 6 R105V 15986,67 6,16 Solúvel 31,2 ULLB-0005/03 7 R105I 16000,70 6,16 Solúvel 37,89 ULLB-0005/03 8 R105P 15984,66 6,16 Solúvel 42,28 ULLB-0005/03 9 R105M 16018,73 6,16 Solúvel 54,48 ULLB-0005/0 40 R105G 15944,59 6,16 Solúvel WL ULLB-0005/0 41 R105T 15988,65 6,16 Solúvel 37,08 ULLB-0005/0 42 R105Y 16050,72 6,16 Solúvel 52,5 ULLB-0005/0 43 R105W 16073,75 6,16 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/0 44 R105N Não 16001,64 6,16 Solúvel determinado ULLB-0005/0 45 R105C 15990,68 6,16 Solúvel Sem atividade ULLB-0005/0 46 R105D 16002,63 5,90 Insolúvel Sem atividade ULLB-0005/047 R105H 16024,68 6,26 Solúvel 52 Ao controle Não aplicável 16044,73 6,47 Solúvel 31,6 a 58 b. Modificação do sítio de ligação com carboidrato secundário:

[00140] O sítio de ligação com carboidrato secundário envolvido na ligação com GalNAc-α- (antígeno Tn) foi modificado. Os aminoácidos nos sítios de ligação com carboidratos secundários foram alterados e as proteínas de lectinas modificadas foram investigadas em relação à solubilidade, especificidade e atividade biológica da proteína. O efeito na especificidade e atividade biológica contra a linhagem de células de câncer de ovário (PA-1) foi avaliado. A modificação de aminoácidos realizada no local de ligação do carboidrato secundário está representada na Tabela 7 e afeta a solubilidade, especificidade e/ou atividade biológica da lectina recombinante. O local de ligação secundária 101 foi modificado para substituir R por Q, M, E e K para preparar várias novas variantes da sequência de lectina nativa. A substituição favorável e neutra na posição 101 leva à expressão solúvel das variantes ULLB-0005/022 (R101 Q), ULLB- 0005/023 (R101M), ULLB-0005/024 (R101E) e ULLB-0005/025 (R101K) e mostrou atividade antiproliferação semelhante em comparação com o clone de controle contra a linha celular PA-1. Os dados neste exemplo demonstram que os resíduos de aminoácidos na posição 101 definem o local de ligação com carboidrato secundário. Concluiu-se que a modificação do sítio de ligação com carboidrato secundário leva à expressão solúvel da lectina recombinante e exibe atividade biológica comparável ao controle. Tabela 7. Sumário dos clones projetados para alterar os locais de ligação com carboidratos secundários Peso Ponto Bioensaio (PA-1) Mudança na Variante do clone molecular isoelétrico Expressão (% sequência teórico teórico citotoxicidade) ULLB-0005/02 2 R101Q 16015,67 6,16 Solúvel 44,26 ULLB-0005/023 R101M 16018,73 6,16 Solúvel 32,18 ULLB-0005/02 4 R101E 16016,66 5,91 Solúvel 44,21 ULLB-0005/02 5 R101K 16015,72 6,47 Solúvel 38,35 Ao controle Não aplicável 16044,73 6,47 Solúvel 31,6 - 58 Sumário das Sequências SEQ ID NO. 1:

TYKITVRVYQTNPNAFFHPVEKTVWKYANGGTWTITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFT ATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQLSNYEVHNAKGRLITENDEG

NFEIV SEQ ID NO. 2:

TYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYANGGTWTITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFT ATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNREEARERQLSNYQVKNAHANKGRIVNF

QNDEGQND SEQ ID NO. 3:

VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYANGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFT ATFGVHNYKRWCDIVTNLAADETGMVINQQYYSQKNARERQLSNYQVKNAKGRANNEGQNEG

QIV SEQ ID NO. 4:

VYKITVRVYQTNPDAFFHPVEKTVWKYADGGTWSITDDQHVLTMGGSGTSGTLRFHADNGESFT ATFGVHDYKRWCDIVTDLAADETGMVINQEYYSEKDREEARERQNSNYEVHDAKGRLINFEIV

[00141] Nesta descrição, foi feita referência a múltiplas abordagens para o processo, equipamento e sistemas que constituem esta invenção única e integrada e entende-se que muitas mudanças e modificações na modalidade descrita podem ser realizadas sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. Os exemplos anexos mostram, a título de ilustração, abordagens exemplares específicas da invenção. Estas abordagens são descritas em detalhes suficientes para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção, e deve ser entendido que modificações nas várias abordagens descritas podem ser feitas por um especialista na técnica.

[00142] Onde os métodos e etapas descritos acima indicam determinados eventos que ocorrem em certa ordem, os versados na técnica irão reconhecer que a ordem de certas etapas pode ser modificada e que tais modificações estão em conformidade com os princípios da invenção. Além disso, certas etapas podem ser realizadas simultaneamente em um processo paralelo quando possível, bem como realizadas sequencialmente.

Claims

REIVINDICAÇÕES:

1. Proteína de lectina modificada, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer um de: i) SEQ ID NO. 1; ou ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com i), em que a sequência de aminoácidos de i) ou ii) compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de um ou mais dos seguintes (a) a (d): a) pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii); ou b) pelo menos uma modificação de aminoácido em um N-terminal de i) ou ii), c) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 76; ou d) pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 44 ou 89, em que a proteína de lectina modificada não consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 2 a 4.

2. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de lectina modificada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com SEQ ID NO. 1.

3. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de lectina modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em um local de ligação com carboidrato de i) ou ii).

4. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 3, em que o local de ligação com carboidrato é um local de ligação com carboidrato primário e/ou secundário.

5. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 4, em que o sítio de ligação com carboidrato primário compreende uma posição selecionada de um ou mais de: 27, 28, 47, 48, 70, 71, 72 e 105 em SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

6. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 5, em que a posição da modificação de aminoácido é selecionada a partir de um ou mais de:

i) 27 e/ou 28; ii) 47 e/ou 48; iii) 70, 71 e/ou 72; e/ou iv) 105.

7. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 4, em que o local de ligação com carboidrato secundário compreende uma posição selecionada de um ou mais de: 77, 78, 80, 101, 112 e 114 na SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente em uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

8. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 7, em que a posição da modificação de aminoácido é selecionada de um ou mais de: i) 77, 78 e/ou 80; ii) 101; iii) 112 e/ou 114.

9. Proteína de lectina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido de modo que um aminoácido substituto substitui um aminoácido original.

10. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 6, em que a substituição de aminoácido no sítio de ligação com carboidrato primário é selecionada a partir de um ou mais de: i) na posição 27: um aminoácido conservativo, favorável ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar ou ácido; favorável é polar ou básico e o aminoácido desfavorável é não polar; ii) na posição 28: um aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é não polar; favorável é polar, neutro é ácido ou básico e o aminoácido desfavorável é polar; iii) na posição 47: um aminoácido desfavorável, que é básico ou não polar; iv) na posição 48: um aminoácido desfavorável, que é não polar; v) na posição 70: um aminoácido desfavorável, que é não polar; vi) na posição 71: um aminoácido desfavorável, que é não polar;

vii) na posição 72: um aminoácido desfavorável, que é não polar; e/ou viii) na posição 105: um aminoácido conservativo, favorável, neutro ou desfavorável, em que o aminoácido conservativo é básico ou não polar; favorável é polar, neutro é ácido, básico ou polar e/ou aminoácido desfavorável é polar, não polar ou ácido.

11. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 8, em que a substituição de aminoácido no sítio de ligação com carboidrato secundário é selecionada a partir de um ou mais de: i) na posição 77: um aminoácido desfavorável que é não polar; ii) na posição 78: um aminoácido desfavorável que é não polar; iii) na posição 80: um aminoácido desfavorável que é não polar; iv) na posição 101: um aminoácido favorável, um desfavorável ou um neutro, em que o aminoácido favorável é polar ou básico, o aminoácido desfavorável é não polar e o aminoácido neutro é não polar ou ácido; v) na posição 112: um aminoácido desfavorável que é não polar; vi) na posição 114: um aminoácido desfavorável que é polar.

12. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de lectina modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no N-terminal de i) ou ii), em que o N-terminal compreende uma posição selecionada de: 1 e/ou 2 em SEQ ID NO. 1 ou uma posição correspondente na sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com esta.

13. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 12, em que a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido na posição 1 e em que um aminoácido substituto não é treonina ou valina.

14. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 13, em que o substituto de aminoácido é selecionado a partir de: alanina, glicina, prolina ou serina.

15. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 12, em que a modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido na posição 2 e em que um aminoácido substituto é triptofano.

16. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 12, em que a clivagem de um iniciador metionina é aumentada ou diminuída em comparação com um controle.

17. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 1, em que o a modificação de aminoácido na posição 76 é uma substituição de aminoácido com um aminoácido não-polar.

18. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 17, em que o aminoácido não polar é selecionado de: glicina, valina ou leucina.

19. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 1, em que a modificação do aminoácido na posição 44 ou 89 é uma substituição de aminoácido com um aminoácido não-polar.

20. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 19, em que o aminoácido não polar é selecionado de: leucina, isoleucina ou valina.

21. Proteína de lectina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a proteína de lectina modificada é solúvel, parcialmente solúvel ou insolúvel e/ou tem citotoxicidade.

22. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína de lectina modificada tem uma citotoxicidade de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de um controle.

23. Proteína de lectina modificada de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína de lectina modificada tem uma percentagem de citotoxicidade que é inferior a 10% de um controle, ou está ausente de citotoxicidade.

24. Proteína de lectina modificada, de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína de lectina modificada tem uma porcentagem de citotoxicidade que é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de aumento em comparação com um controle.

25. Proteína de lectina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que a proteína de lectina modificada é igual ou inferior a 500, 400, 300, 250, 200 ou 150 aminoácidos de comprimento.

26. Composição farmacêutica que compreende uma proteína de lectina modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25 e um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente outro ingrediente terapêutico.

27. Método de tratamento de câncer em um paciente, que compreende a administração da proteína de lectina modificada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, ou a composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26, a um paciente.

28. Proteína de lectina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 para uso em medicina.

29. Proteína de lectina modificada ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28 para uso no tratamento de câncer.

30. Proteína de lectina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, como e quando usada na detecção de uma célula cancerosa, diagnóstico de câncer e/ou terapia de câncer.

31. Molécula de ácido nucleico, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de lectina modificada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

32. Vetor recombinante, que compreende uma inserção de uma molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 31.

33. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 32 que compreende operativamente ligado em uma direção 5' para 3': um promotor que funciona em uma célula hospedeira; sequência de nucleotídeos conforme definida na reivindicação 31, que codifica uma proteína de lectina modificada; e um sinal de terminação.

34. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, em que o vetor recombinante é capaz de ser replicado, transcrito, traduzido e/ou expresso em um organismo unicelular.

35. Célula hospedeira transformada, que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 31 ou o vetor recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 34.

36. Célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 35, em que a célula hospedeira é uma bactéria Escherichia coli ou uma célula de levedura.

37. Método para a produção de um recombinante Sclerotium rolfsii lectina proteína que compreende: i) cultivar uma célula hospedeira contendo o vetor recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 34 que codifica para uma proteína de lectina recombinante; ii) expressar a proteína de lectina recombinante; iii) isolar uma proteína de lectina recombinante bruta da cultura.