KR20240067065A - 재조합 글리칸 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 변형된 단백질 서열 즉, 재조합적으로 발현된 글리칸 결합 단백질을 제공한다. 상기 글리칸 결합 단백질은 스클레로티움 롤프시 렉틴의 변이체이며 분자 안정성 향상, N-말단 메티오닌 불순물 감소 및 기타 생물학적 및 화학적 약물(들)에 대한 단백질의 접합 지원과 같은 특성을 포함하도록 변형된다.

Description

재조합 글리칸 결합 단백질 및 이의 용도
본원은 생물공학 분야에 관한 것으로, 특히 암 검출 및 치료에 유용한 재조합 글리칸 결합 단백질에 관한 것이다. 본원은 또한 렉틴을 이용한 치료용 조성물의 발현, 정제 및 제조에 관한 것이다.
렉틴은 미생물, 식물 및 동물을 포함한 살아있는 다양한 유기체로부터 발견되고 유래되는 글리칸 결합 단백질이다. 렉틴은 높은 글리칸/탄수화물 특이성을 나타내며 특정 단당류 또는 올리고당에 가역적으로 결합하는 비촉매 도메인에 의해 적혈구를 응집시키는 것으로 알려져 있다. 이는 탄수화물의 특성 변형 없이 세포 표면의 탄수화물 모이어티(moiety)에 대해 결합 특이성을 가지는 것으로 알려져 있다. 이 기능은 바이오마커 검출, 당단백질, 당지질 정제 및 세포 선택 과정을 통해 진단 또는 분석 기술에서 많이 응용된다.
진단 외에도 렉틴은 암 치료제로서의 유용성을 탐구하기 위해 연구되어 왔다. 최근, 암 세포가 세포 표면의 탄수화물 구조에서 다양한 변화를 나타냄에 따라 암 항원에 선택적으로 결합하고, 세포사멸, 세포독성, 증식/항증식 활성, 전이, 세포 부착 억제 등과 같은 다양한 생리학적 효과를 발휘하는 능력에 대해 수많은 렉틴이 탐구되고 있다.
비록 다양한 자원으로부터의 렉틴은 높은 탄수화물 특이성을 나타내지만 분자 크기 및 당(sugar) 특이성과 같은 물리-화학적 특성이 상이하다. 겨우살이 렉틴 (Mistletoe lectins, MLs)과 같은 소수의 식물 렉틴은 다양한 종의 겨우살이 (Viscum album L.)로부터 수득되며, 다양한 암의 예방 및 치료에서 강력한 항암제로 사용된 광범위한 역사를 공유한다. 겨우살이 렉틴-Ⅰ (Mistletoe lectin-I, ML-Ⅰ)은 세포독성 및 면역조절 기능으로부터 발생하는 항-증식 활성에 대해 모든 MLs 중 가장 많이 연구되고 있다. 그러나 식물 자원으로부터의 렉틴을 사용하는 것은 선택성 부족, 일정하지 않은 품질, 및 산업 규모로 생산 확대의 어려움과 같은 고유의 문제점을 가진다.
미국 특허 번호 제9500650호는 렉틴-렉틴 샌드위치 방법으로 미분화 당쇄 마커를 검출하여 분화 세포 유무의 확인을 가능하게 하는 렉틴의 유용성을 개시하고 있다. 상기 특허에 개시된 렉틴은 재조합 DNA 기술을 사용하여 스클레로티움 롤프시 (Sclerotium rolfsii), 코프리놉시스 시네레아 (Coprinopsis cinerea), 아가리쿠스 비스포러스 (agaricus bisporus), 제로코무스 크리센테론 (Xerocomus chrysenteron), 알레우리아 아우란티아 (Aleuria aurantia) 등으로부터 유래된 렉틴으로 구성된다. 상기 특허는 렉틴의 치료 능력을 전혀 개시하지 않는다.
톰슨 프라이덴리히 (Thomsen Friedenreich, TF) 이당류 (Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr) 및 N-아세틸갈락토사민 (TN) 단당류 (GalNAc)와 같은 종양 관련 탄수화물 구조는 암 세포의 90%에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 스클레로티움 롤프시 렉틴 (Sclerotium rolfsii lectin, SRL)은 TF 및 TN 항원에 대한 특이성을 나타내며 식물병원성 진균의 경화체(sclerotic body)로부터 정제된다. 인도 특허 출원 번호 제1265/MUM/2004호는 유세포 분석을 사용하여 연구된 다양한 유형의 암을 대표하는 인간 세포주 패널에 대한 SRL의 결합 특이성을 개시하고 있다. 그러나 천연 자원의 SRL 렉틴은 수율에 영향을 미치고 정제 공정에 문제가 있어, 상기 렉틴의 대량 생산을 위한 공정비용이 매우 높아진다. 또한 천연 자원 유래 렉틴은 진단 및 치료에서 렉틴의 유용성을 추가로 저해시키는 용해도 및 안정성 문제와 직면한다.
나아가, 단백질 합성은 진핵 생물에서는 메티오닌 또는 원핵 생물에서는 포르밀메티오닌 (N 말단 메티오닌)에 의해 개시된다. 재조합 단백질이 발현되는 동안 N 말단 메티오닌은 내인성 메티오닌 아미노펩티다아제 (Methionine Aminopeptidase, MAP)에 의해 절단된다. 상기 절단 과정은 발현된 재조합 단백질의 양이 N 말단 메티오닌을 절단하기 위한 제한된 양의 MAP의 능력을 능가하기 때문에 효율적이지 않으며, 이로 인해 상당량의 발현된 단백질은 성숙 단백질의 일부가 아닌 첫번째 아미노산으로 메티오닌을 포함한다. 나아가, N 말단 메티오닌을 갖는 단백질은 생산 및 보관 동안 산화되기 쉬우며, 이러한 산화는 주의 깊게 관찰되어야 한다. 단백질에서 메티오닌 잔기가 산화될 때 메티오닌 설폭사이드 또는 메티오닌 설폰이 생성될 수 있으며, 이는 면역원성, 비활성, 및 응집 증가를 추가로 유발할 수 있고; 이로 인해 치료제의 임상적 효능, 안정성 및 규제 승인이 제한될 수 있다.
N 말단 메티오닌 불순물을 갖는 생물학적 제제는 인체 내 단백질과 동일한 구조를 갖지 않을 수 있으며, 이러한 이유로 인간 개체에 투여될 때 개체에 예기치 못한 면역 반응을 유발하여 비효과적인 치료 기능을 유발할 수 있다. 그러므로, 제제화 전에 생물학적 제제로부터 메티오닌 불순물을 제거하거나 최소화하는 것이 중요하다.
인도 등록 특허 번호 제277986호 (출원번호 350/MUM/2009)는 천연 스클레로티움 롤프시 렉틴으로부터 유래된 재조합적으로 발현된 변형된 렉틴을 개시하고 있다. 상기 특허는 대장균 또는 효모와 같은 숙주 세포에서 발현된 재조합 렉틴의 제조 방법을 추가로 개시한다. 나아가, 상기 방법은 스클레로티움 롤프시 렉틴, 토양 매개 진균, 및 숙주 세포에서 이의 클로닝의 MALDI MS/MS로부터 유래된 아미노산 서열에 기반한 렉틴 유전자의 합성 단계를 포함한다. 상기 특허에서 언급된 렉틴은 일반적으로 N 말단 메티오닌을 갖거나 갖지 않는 렉틴 혼합물로 구성되며, 이는 규제 허가 과정에 장애물로 이어질 수 있다. 상기 렉틴 단백질은 또한 아미노산 서열에 시스테인 잔기의 가용성으로 인해 다합체, 특히 이합체를 형성하는 경향이 있을 수 있다.
특허 WO2020044296은 숙주세포에서 발현된 단백질의 증가된 용해도가 단백질의 항원 결합 특이성에 대한 친화도를 변형시키거나 감소시킬 수 있음을 개시하고 있다. 따라서, 재조합 단백질은 특정 항원에 대한 결합 친화도를 유지하는 동안 충분한 안정성을 나타내면서 용해도를 보이는 것이 중요하다.
특허 WO2020074977은 개시 메티오닌을 갖는 재조합 렉틴이 20% 미만인 재조합 렉틴 단백질을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특허는 업스트림 및 다운스트림 전략을 활용하여 N 말단 메티오닌 변이체/불순물을 갖는 렉틴의 발현을 감소시킨다.
또한 표적 약물 치료와 같은 새로운 치료 개념인 단백질 약물 접합체 (Protein Drug Conjugates, PDC)가 최근 개발되고 있으며, 이는 항체 또는 단백질이 선택적인 화학 링커를 통해 세포독성 활성을 갖는 강력한 약물 분자에 접합된 것이다.
이상적인 PDC는 정상 (건강한) 세포에 없는 항원에 대한 높은 특이성; 종양 세포에 내재화된 후 표적 세포 죽음을 유도하도록 설계된 강력한 세포독성제 (일반적으로 높은 전신 독성을 갖는 저분자 약물); 및 표적 세포에서 세포독성제를 방출하지만 순환에서 안정한 선택적인 화학 링커를 가진다. 그러나 화학 링커의 사용은 추가적인 화학 공정 및 다운스트림 정제의 사용을 필요하게 한다. 또한 대부분의 항체는 특정 유형의 암세포에서 특이적으로 발현된 항원에 결합하는 능력을 가진다. 현재까지 대부분의 암세포에 나타나는 보편적인 항원에 대해 특이성을 갖는 항체들은 보고되지 않았다. 따라서, 대부분의 암세포에 나타나는 보편적인 항원에 대해 높은 특이성을 갖는 단백질이 과학적 연구 하에 있다. 이러한 단백질이 강력한 약물 분자에 접합되면 수많은 유형의 암의 효과적인 치료를 위한 보편적인 치료법의 길을 열 수 있다.
과거에는 단백질 약물 접합체의 제조를 위해 다양한 접합 화학이 사용되었다. 보고된 접합 화학에는 리신 접합 화학, 말레이미드 단백질 접합 반응 화학 등이 포함된다. 항체 약물 접합체의 제조를 위해 리신-기반 접합 공정은 다양성 및 간단한 공정 요건으로 인해 가장 선호되는 공정 중 하나이며, 여러 세포독성제 (특히 항체)와 반응할 수 있다. 그러나 상기 공정은 리신 아미노산 잔기가 다양한 위치에 존재하는 단백질에서 이질적인 분자 발생을 야기할 수 있다. 그리고 이질적인 분자는 진부한 정제 및 특성화 공정이 요구되므로, 규제 허가에 장애물이 될 수 있다.
바이오 의약품 제조를 위해 향상된 균질성의 단백질 약물 접합체를 만들기 위해서는 접합 능력을 용이하게 하는 안정적이고 용해가능한 단백질이 필요하며, 접합된 약물을 표적 위치, 즉 암세포에 전달하는 능력을 갖는 것이 요구된다.
요약
본원은 재조합적으로 발현된 글리칸 결합 단백질을 제공한다. 상기 글리칸 결합 단백질은 스클레로티움 롤프시 렉틴 (Sclerotium Rolfsii Lectin, SRL)의 변이체로, 분자 안정성 향상, 메티오닌 불순물 감소, 및 기타 생물학적 및 화학적 분자/약물에 대한 접합 지원과 같은 특성을 포함하도록 변형되고, 시스테인-시스테인 이합체를 방지함으로써 단백질 안정성을 제공하며, N-말단 메티오닌의 효과적인 제거를 촉진한다. 일 실시양태에서, 상기 단백질은 야생형 SRL과 비교하여 카복시 말단에 추가의 시스테인을 포함하고; 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대해 결합 친화도를 갖는 것이다.
정의
본원에서 사용된 용어 “아미노산”은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 갖는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전 암호에 의해 코딩되는 아미노산이며 단백질생성 아미노산(proteinogenic amino acid)을 포함한다. 또한 자연 발생 아미노산은 세포에서 번역 후 변형된 것을 포함한다. 합성 아미노산은 셀레노시스테인 및 피롤리신과 같은 비표준(non-canonical) 아미노산을 포함한다. 일반적으로 합성 아미노산은 단백질생성 아미노산이 아니다.
본원에서 사용된 용어 “단백질”은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.
용어 “재조합”은 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로 (즉, 비자연적으로) 변형된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 변형은 자연 환경 또는 상태 내, 또는 이로부터 제거된 재료에 대해 수행될 수 있다. 예를 들면, “재조합 핵산”은, 예를 들어 클로닝, DNA 셔플링 또는 기타 잘 알려진 분자 생물학적 방법으로 핵산을 재조합함으로써 만들어진 것이다. “재조합 DNA 분자”는 이러한 분자 생물학적 기술 수단에 의해 함께 결합된 DNA 단편으로 구성된다.
본원에서 사용된 용어 “재조합 단백질” 또는 “재조합 폴리펩티드”는 재조합 DNA 기술을 사용하여 발현된 단백질 분자를 지칭한다. 재조합 단백질은 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 발현될 수 있다. 부위 특이적 돌연변이유발 (Site-directed mutagenesis, SDM)은 이중 가닥 플라스미드 DNA에 특정 표적 변화를 발생시키는 방법이다. 이러한 특정 변형, 삽입, 삭제 또는 치환은 단백질 구조 또는 활성을 변화시키거나 변형시키기 위해 사용된다. 부위 특이적 돌연변이유발 방법은 이러한 개념의 초기 서술(Smith, M., Annv. Rev. Genet. 19, 423-462 (1985))로부터 빠르게 발달해왔다. 사용 가능한 방법들의 공통적인 특징은 돌연변이유발 부위에서 뉴클레오티드 서열의 원하는 변화를 전달하는 합성 올리고뉴클레오티드의 사용이다. 이러한 “돌연변이” 올리고뉴클레오티드는 정상 서열을 설계된 올리고뉴클레오티드로 대체함으로써 관심 서열에 통합된다. 이는 시험관 내 효소 DNA 합성에 의해 수행된다. 변형된 DNA는 코딩된 단백질(들)의 발현을 위해 적절한 숙주 시스템으로 형질전환된다.
본원에서 사용된 용어 “렉틴” 또는 “렉틴 단백질”은 달리 명시되지 않는 한, NCBI AN (National Center for Biotechnology Information Accession Number) 2OFC_A를 갖는 스클레로티움 롤프시 (인도 기원의 토양 매개 병원성 진균)의 글리칸/탄수화물 결합 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 “변이체”는 단일 유전자 또는 유전자 패밀리로부터 유래하고 유전적 차이의 결과로 매우 유사한 단백질 세트를 갖는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 이들은 보통 유사한 구조 및 기능성을 가진다. 변이체는 보통 천연 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “치환”은 아미노산 서열의 특정 위치에서 아미노산을 임의의 다른 적절한 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다.
용어 “세포독성제(Cytotoxic agent)”는 세포를 억제하거나 세포의 기능을 억제하고/하거나 세포 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 화학요법제, 저분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소와 같은 독소, 이들의 합성 유사체 및 유도체를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 “접합체(Conjugate)”는 본원의 생성물을 지칭한다. 본원의 목적에 따라, 상기 접합체는 링커의 도움으로/도움없이 단백질에 부착된 약물을 포함할 수 있거나, 단백질에 직접적으로 부착된 약물을 포함할 수 있다.
용어 “암” 및 “암성”은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장의 특징이 있는 포유류의 생리학적 상태 또는 장애를 지칭하거나 서술한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 “치료하다” 또는 “치료”는 재발을 방지하기 위한 치료 및 예방 수단을 지칭하며, 여기서 목적은 암의 발달 또는 확산과 같이 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애를 억제하거나 늦추는(완화하는) 것이다. 본원의 목적에 따라, 유익하거나 원하는 임상적 결과는 검출 가능여부에 상관없이, 증상의 경감, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화 상태 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 관해 (일부 또는 전체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 “치료”는 치료를 받지 않는다면 기대할 수 없는 생존과 비교했을 때 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 대상은 이미 상태 또는 장애가 있는 대상뿐만 아니라 상태 또는 장애를 가질 수 있는 대상을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “부형제”는 활성 성분의 치료 작용에 영향을 주지 않지만 활성 성분에 대한 비히클 또는 매질 역할을 하는 제제에 첨가되는 비활성 또는 보통 불활성인 물질을 지칭한다. 원하는 농도 (consistency)를 제공하고, 안정성을 개선하고/하거나 조성물의 삼투압몰농도를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 본원의 목적에 따라 사용된 부형제는 단백질 안정화제, 완충액, 중합체, 용해제, 동결보호제, 희석제 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 “의약(medicament)”은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 활성 화합물을 포함하는 약학적 제제를 의미한다. 의약의 물리적 상태에는 액체, 고체, 반고체, 현탁액, 분말, 페이스트, 겔 및 이들의 조합 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 “서열 동일성”은 정렬된 서열 내 동일한 위치에서 정확하게 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 발생을 지칭한다.
용어 ‘제제’, ‘약학적 제제’ 및 ‘약학적 조성물’은 상호교환적으로 사용되며 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 하는 형태로 존재하므로, 예방 또는 치료적 용도를 위해 개체에 투여될 수 있는 제제를 지칭하며, 달리 명시되지 않는 한 상기 개체는 바람직하게는 인간이다.
용어 “표적 전달”은 표적하는 신체 영역 (특정 조직의 장기, 세포, 및 준세포 수준)에 이의 활성을 나타내는 약물을 직접적으로 특정하는 시스템을 지칭한다. 이는 비특이적이고 원하지 않는 약물의 효과를 극복하기 위해 의도하는 효능에 요구되는 약물의 양을 감소시킴으로써 수행된다.
용어 “티올-말레이미드 반응”은 티올 및 말레이미드 사이에 티오숙신이미드 생성물을 생성시키는 간단하고 빠른 반응이며 생물접합 기술에서 시스테인 잔기의 부위 선택적 변형에 사용된다. 상기 티올-말레이미드 반응은 형광 염료, PEG, 방사성표지, 및 저분자와 같은 티올 접합을 통해 생체 분자에 화학적 표지를 추가하는데 사용된다.
상세한 설명
본원의 일 측면에서, 재조합 글리칸 결합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 설계되고 발현된 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (Sclerotium rolfsii Lectin, SRL)의 변이체이다.
본원의 일 실시양태에서, 상기 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 변이체의 서열 동일성은 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)과 비교하여 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
본원의 일 실시양태에서, 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체이다. 일 실시양태에서, 상기 변이체는 서열번호 1로 표시되는 야생형 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)과 비교하여 결합 친화도를 유지한다. 상기 결합 친화도는 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태, 예를 들어 분지화 및 푸코실화된 N- 및 O-글리칸의 변형된 발현(인간 암의 90% 이상에서 발현되는 루이스 항원 (SLex 및 SLea)의 변화를 포함)으로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대한 것으로 예상된다. 코어 글리칸의 변형 외에도, 이러한 각각의 탄수화물은 추가로 변형되어 종양 형질전환(neoplastic transformation) 후 특정 변화를 겪을 수도 있는 독특한 말단 글리칸 모티프를 생성할 수 있다. 예를 들어, 루이스 항원 [루이스a/b (Lea/b) 및 루이스x/y (Lex/y)]과 같이 고도로 푸코실화된 글리칸은 종양 형질전환 후 세포 표면에 많아질 수 있다. 유사하게, 흔한 말단 글리칸 변형인 시알릴화 또한 종양 진행 동안 유의미한 변화를 겪을 수 있다.
본원의 일 실시양태에서, TF 항원 (또는 T 항원)의 변이체 또는 변형된 형태는 [3OSO3]Galβ1-3GalNAcα; Neu5Acα2-3Galβ1-3 [6OSO3] GalNAcα; Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα; GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα; Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6) GalNAcα; Galβ1-3(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAβ1-6)GalNAc; Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAcα; Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα; Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα; Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3) GalNAcα; Galβ1-3GalNAcα (TF 항원); Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα; Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAc; Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc; GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3) GalNAcα; Galβ1-3 (Neu5Acβ2-6)GalNAcα; Fucα1-2Galβ1-3GalNAcα; Neu5Acβ2-6 (Galβ1-3)GalNAcα; GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα를 포함한다.
본원의 일 실시양태에서, 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체로, 서열번호 1의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의한 단백질의 변형을 포함하고 상기 변형은 단백질의 구조적 또는 기능적 활성을 변형시키지 않으며, 예를 들어 상기 단백질/변이체는 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대해 결합 친화도를 갖는다.
본원의 일 실시양태에서, 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체로, 야생형 SRL과 비교하여 서열번호 1의 1번 내지 141번 아미노산 위치에서 아미노산 시스테인 (C)이 결여된 것이다. 상기 변이체는 서열번호 1에서 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 제조된 것으로, 상기 변형은 단백질의 구조적 및 기능적 활성을 변형시키지 않으며, 예를 들어 단백질/변이체는 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대해 결합 친화도를 갖는다.
본원의 일 실시양태에서, 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체로, 야생형 SRL과 비교하여 카복시 말단에 추가의 시스테인을 포함한다. 카복시 말단에서 시스테인의 추가는 단백질의 구조적 및 기능적 활성을 변형시키지 않는 방식으로 수행되며, 예를 들어 단백질/변이체는 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대해 결합 친화도를 갖는다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 숙주세포에서 설계되고 발현되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체이다. 상기 서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 인도 특허 출원 350/MUM/2009에 개시되어 있다. 상기 서열번호 2의 단백질은 GalNAc 및 GlcNAc 글리칸에 대해 친화도를 갖는 두 개의 탄수화물 결합 부위 (1차 & 2차)를 가지며; 일 실시양태에서 상기 서열번호 2의 단백질은 인간 암의 90% 이상에서 발현되는 종양태아성(oncofetal) 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원 및 이의 유도체에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다. 종양태아성 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원 및 이의 유도체는 O-GalNAc 코어1 (T 항원); 및 코어2, α2,3/6-시알릴 코어1 (시알릴-T 항원), α2,6/6-시알릴 코어2, 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태를 포함하는 확장된 코어 구조를 포함한다.
서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 대장균과 같은 적절한 숙주에서 발현될 때, 발현된 단백질은 N 말단 메티오닌 불순물을 ~10-30% 포함한다. N 말단 메티오닌을 갖는 상기 단백질은 생산 및 보관 동안 산화되기 쉽다. 메티오닌 산화는 의약품의 임상적 효능, 안정성 및 규제 승인을 제한할 수 있다. 본원의 일 실시양태에서, 전술한 문제를 극복하기 위해 1번 위치의 아미노산을 적절한 아미노산으로 치환할 수 있으며, 이는 숙주세포의 내인성 시스템을 사용하여 N 말단 메티오닌의 효율적인 제거에 도움이 된다. 치환이 상기 단백질의 구조 및 기능에 영향을 주지 않는 방식으로 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 매우 잘 알려져 있다. 구체적인 일 실시양태에서, 서열번호 2의 1번 위치에 있는 트레오닌 (T)은 적절한 아미노산으로 치환될 수 있으며, 이는 숙주 세포 공정 기전을 사용하여 N 말단 메티오닌의 효율적인 제거를 돕는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 서열번호 2의 첫번째 위치에 있는 트레오닌 (T)은 아미노산 세린 (S)으로 치환될 수 있으며, 이는 제로 위치에서 N 말단 메티오닌의 효율적인 제거를 돕는다. 상기 치환은 기능적 안정성 및 TF 및 TN 항원에 대한 단백질의 결합 친화도에 영향을 주지 않는 방식으로 수행된다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체는 전술한 실시양태에 따라 제조되며 약물에 추가로 접합되는 것으로 예상된다. 상기 약물은 치료제, 세포독성제, 방사선제, 항암제, 진단제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
접합체의 제조를 위해, 상기 약물은 당업계에 공지된 적절한 임의의 접합 화학을 사용하여 단백질과 반응할 수 있다. 접합 화학의 무작위한 사용은 이질적인 접합 분자의 생성을 초래할 수 있다. 상기 이질성은 환자에서 특성화, 효능 및 안전성 문제를 추가로 초래할 수 있다. 유사한 문제를 방지하기 위해, 단백질에 대한 약물의 부위 특이적 접합은 선호/설계될 수 있다. 일 실시양태에서, 서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 약물의 부위 특이적 접합 현상을 활용하도록 재설계(re-engineered)될 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 사용된 부위 특이적 접합 화학은 티올-말레이미드 반응 화학, 즉 시스테인-기반 부위 특이적 접합이다. 시스테인-기반 부위 특이적 접합의 이점을 활용하기 위해, 서열번호 2는 서열번호 2의 카복시 말단, 즉 142번째 위치에서 시스테인 (C)을 포함하도록 재설계될 수 있으나, 142번째 위치의 시스테인 (C)은 76번째 위치의 시스테인 (C)과 함께 이황화 결합을 형성하여 스크램블링(scrambling)으로 인해 단백질 구조 변화를 초래하며, 나아가 정제/다운스트림 공정 개발의 어려움을 초래한다. 또한, 단백질 구조 변화는 구조적 및 기능적 생물활성에 변화를 유발할 수 있다. 상기 문제점은 시스테인 (C) 아미노산 (서열번호 2의 76번째 위치에서 사용가능)이 임의의 다른 적절한 아미노산으로 치환되는 것에 의해 해결될 수 있다. 상기 치환은 기능적 안정성과 톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태에 대한 단백질의 결합 친화도에 영향을 주지 않는 방식으로 수행될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 서열번호 2의 76번째 위치에서 사용가능한 시스테인 (C) 아미노산은 글리신 (G)으로 치환될 수 있다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 1번째, 76번째 및 142번째 위치에서 변형을 가지도록 재설계되었다. 상기 변형은 1번째 위치에서 세린이 트레오닌으로 치환; 76번째 위치에서 글리신이 시스테인으로 치환; 및 서열번호 2의 카복시 말단에서 시스테인의 추가를 포함한다. 본원의 다른 실시양태에서, 재설계된 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 3의 단백질이다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 2의 재조합 글리칸 결합 단백질은 1번째, 76번째 및 142-143번째 위치에서 변형을 가지도록 재설계된다. 상기 변형은 1번째 위치에서 세린이 트레오닌으로 치환; 76번째 위치에서 글리신이 시스테인으로 치환; 및 142번째 위치에서 세린; 및 143번째 위치, 즉 서열번호 2의 카복시 말단에서 시스테인의 추가를 포함한다. 본원의 다른 실시양태에서, 재설계된 재조합 글리칸 결합 단백질은 서열번호 4의 단백질이다. 142번째 위치에서 세린의 추가는 c-말단 시스테인 및 단백질 사이에 공간 및 유연성을 제공하고, 추가로 접합된 약물에 대한 유연성을 제공하며 단백질 접합체의 용해도 문제를 방지하는데 도움이 될 수 있다.
본원의 다른 실시양태에서, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 단백질은 단백질 접합체의 제조를 위해 추가로 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로 티올-말레이미드 반응의 사용은 접합체의 균질한 혼합물을 제공한다. 제어된 약물-항체 비율 (Drug-Antibody Ratio, DAR)을 갖는 상기 균질한 접합체는 향상된 치료 지수를 갖는 접합체를 추가로 발생시킨다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 핵산 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 재조합 글리칸 결합 단백질의 발현에 사용될 수 있다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체 및 상기 변이체를 사용하여 제조된 접합체는 암 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체 및 상기 변이체를 사용하여 제조된 접합체는 암 진단 또는 치료에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본원의 일 실시양태에서, 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (SRL)의 변이체 또는 상기 변이체를 사용하여 제조된 접합체를 포함하는 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제(들)의 존재 하에 제조된다. 상기 약학적으로 허용가능한 부형제(들)은 안정성, 생체이용률, 또는 환자 용인성을 지지하거나 증진시키기 위해 선택될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 액체 (예컨대, 수용액 또는 현탁액, 또는 유성 기반 용액 또는 현탁액), 고체 (예컨대, 캡슐 또는 정제), 동결건조 분말, 스프레이, 크림, 로션 또는 겔, 빌로솜, 리포솜, 니오솜, 트랜스페로솜, 에토솜, 스핑고솜, 파마코솜(pharmacosomes), 다층 소포체, 마이크로스피어 등과 같은 소포형(vesicular) 약물 전달 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 약학적으로 허용가능한 형태로 제공될 수 있다.
본원의 여러 양태는 하기에 나열된 실시예를 통해 추가로 설명된다. 실시예들은 예시적인 것이며, 당업자는 이러한 실시예들의 명백한 변형에 대해 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 실시예들은 본원의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
도 1: 서열번호 3의 발현된 단백질의 용해도 분석
도 2: 서열번호 4의 발현된 단백질의 용해도 분석
도 3: 발효 단계 동안 서열번호 3의 발현된 단백질의 용해도 분석
도 4: 발효 단계 동안 서열번호 4의 발현된 단백질의 용해도 분석
도 5: 서열번호 2의 공동국소화 연구
실시예 1: 재조합 단백질의 제조 과정
서열번호 3 및 서열번호 4의 재조합 글리칸 결합 단백질의 발현
서열번호 3의 재조합 글리칸 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 5)을 NdeI 및 BamHI를 사용하여 pET27b 벡터에 클로닝하여 pET27b 구조체를 생성하였다. 추가로 pET27b 구조체를 증식 숙주 E.coli Top 10 수용성 세포(competent cells)로 형질전환하였다. 플라스미드를 형질전환 세포로부터 분리하고, 제한 분해 분석(restriction digestion analysis)에 의해 삽입 무결성을 확인하였으며, 유전자 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 선별된 pET27b 플라스미드는 E. coli BL21 DE3 (GOLD) 발현 숙주에 추가로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 발현을 위해 형질전환된 클론을 시험하고, 높은 발현을 보이는 클론은 DNA 시퀀싱에 의해 선별하였으며, 세포 은행 제조에 추가로 사용하였다. 특성화된 세포 은행은 발효 공정에 사용되었다.
발효를 위해 효모 추출물 (10 g/L), 인산이수소칼륨 (3 g/L), 인산수소이칼륨 (12.54 g/L), 황산 암모늄 (5 g/L), 염화나트륨 (0.5 g/L), 덱스트로스 (12 g/L), 황산 마그네슘 7수화물 (1 g/L), 황산 카나마이신 (20 mg/L) 및 미량 금속 용액 (1 ml/L)을 함유한 배지에 글리세롤 스톡(glycerol stock)의 배양물을 접종하여 종자 배양물을 제조하였다. 발효를 30℃에서 개시한 후에 온도를 18℃로 점진적으로 감소시켰다. DO 수준은 60%로 유지되었으며, pH는 탄소 공급원 전환 동안을 제외하고 알칼리 용액으로 6.80±0.05로 유지되었다. 유가식(Fed batch) 발효 공정에서 글리세롤 (50%) 및 효모 추출물 (40%)을 각각 탄소 및 질소 공급원으로 사용하였다. 유도는 약 60의 OD600 nm에서 IPTG 0.15 mM로 수행되었다. 총 배치 실행 시간은 48 내지 72 시간이었으며 52 로그 시간 후 달성된 최대 OD600은 107의 범위였다. 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질의 발현은 약 6.3 g/L이었다. 발효기로부터 발효액을 채취하였다. 그 다음, 10℃에서 10-15분 동안 9000 rpm으로 원심분리하여 밀집한 세포 펠렛을 수득하였다. 그 다음, 수득된 펠렛을 25 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA, pH 8.5를 함유하는 용해 완충액에 1:10 비율 (w/v)로 현탁하고, 현탁액을 10±4℃의 온도를 유지하는 기계식 교반기를 사용하여 1-2시간 동안 교반하였다. 용해는 1100±200 bar에서 고압 균질기를 사용하여 1-2번 통과시켜 수행하였다. 90-95% 이상의 세포 용해 효율을 수득하였으며(OD600에 의해 측정됨) 용해물을 저온에서 수집하였다.
상기 세포 용해물을 0.1 μ TFF를 사용하여 정화하고 투과액을 수집하였다. 최대량의 단백질을 회수하기 위해, 투석유물(retentate)을 280 nm에서 단백질 흡광도가 4-6 미만으로 떨어질 때까지 25 mM 트리스-HCl 완충액, 1 mM EDTA, pH 8.0으로 단계적으로 세척하였다. 상기 용액을 2-10 psi의 막차압(Trans Membrane Pressure)으로 0.1 μ 중공 섬유 필터를 사용하여 정화하였다. 단백질을 함유한 세척액을 주요 투과액과 풀링하였다. 전체 정화 공정 동안 온도는 25℃ 아래로 유지되었다.
서열번호 3의 단백질을 세 단계의 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 첫번째 단계에서 세포 용해물을 1 mM EDTA를 함유하는 25 mM 트리스 완충액, pH 8.0±0.5로 사전 평형화한 Cellufine Max Qresin에 로딩하고, pH 8.0에서 25 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl로 세척하였다. 단백질을 pH 8.0에서 25 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl로 용출하였다. 전체 피크를 단일 분획으로 수집하였다. 두번째 단계에서는 첫 번째 단계에서 용출된 서열번호 3의 단백질을 20 mg/ml의 결합 용량에서 평형 완충액으로 사전 평형화된 CM Sepharose 컬럼에 결합시켰다. 로딩 완료 후, 컬럼을 평형 완충액 25 mM 아세트산나트륨, 5 mM β- 머캅토에탄올, pH 5.1로 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거하였다. 15 컬럼 부피에 대해 0-50% 25 mM 아세트산나트륨, 1.0 M NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, pH 5.1의 선형 구배로 용출을 수행한 다음, 100% 완충액 25 mM 아세트산 나트륨, 1.0 M NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, pH 5.1로 세척하였다. CM Sepharose 컬럼으로부터 수득한 용출액을 트리스 완충액으로 pH 적정을 8.0까지 수행하였으며, 완충액을 5KDa 막을 사용하여 25 mM 트리스, 5 mM 베타 머캅토에탄올, pH 8.0과 교환하여 2.0 mS/cm 미만의 전도도로 맞추었다. 서열번호 3의 단백질을 평형 완충액 (25 mM 트리스, 5 mM 베타 머캅토에탄올, pH 8.0)으로 사전 평형화한 세번째 컬럼 Source 30Q에 로딩하였다. 그 다음, 서열번호 3의 단백질을 25 mM 트리스, 5 mM 베타 머캅토에탄올, 500 mM NaCl, pH 8.0의 용출 완충액을 사용하여 용출하였다. 순도 95% 이상을 갖는 서열번호 3의 재조합 단백질을 수득하였다.
유사하게, 서열번호 4의 단백질을 95% 이상의 순도로 제조하였다.
서열번호 3 및 서열번호 4의 정제된 단백질의 분자량 및 pI는 하기에 나타낸 바와 같다.
실시예 2: 발현된 단백질의 세포독성(MTS-PMS) 분석
서열번호 3 및 서열번호 4의 단백질의 생물활성을 MTS-PMS 생물검정을 사용하여 분석하였다. 난소암 세포주 PA-1, 혈액암 세포주 MOLT-3, 혈액암 세포주 Jurkat E6, 및 유방암 세포주 MDA-MB 231에 대한 상기 단백질의 효과를 연구하였다.
시험을 위해 5000 세포/웰이 사용되었다.
독소루비신 약물을 시스템 적합성(system suitability, SST) 참조로서 사용하였다.
세포독성 분석 결과는 다음과 같다:
[표 1]MTS-PMS 생물검정
결론:
- 서열번호 2, 3, 및 4의 단백질은 MDA-MB-231 세포에서 독소루비신 약물과 비교하여 더 나은 세포독성 결과를 나타내었다.
- 서열번호 2, 3, 및 4의 단백질은 다른 세포주, 즉 PA-1, MOLT-3, 및 Jurkat E6 세포주에서 독소루비신 약물과 비교하여 더 나은 세포독성 결과를 나타내었다.
- 상기 단백질은 유사한 생물활성을 나타내었기 때문에 유사한 기능을 갖는다고 추론할 수 있다.
실시예 3: 글리칸 결합 연구 및 공동국소화(co-localization) 연구
a. 암 세포에 발현된 글리칸에 대한 서열번호 2를 갖는 렉틴의 결합 친화도 및 특이성을 이해하기 위해 글리칸 결합 연구를 수행하였다.
서열번호 2의 렉틴은 특이적 결합 모티프를 식별하기 위해 다음의 글리칸 어레이로 분석되었다:
- 94 글리칸을 함유하는 O-글리칸 어레이; 및
- 100 글리칸을 함유하는 N-글리칸 어레이
관찰:
- 서열번호 2를 갖는 렉틴은 비-환원 말단에서 GlcNac를 포함하는 N-글리칸에 특이적인 결합을 나타내었으며; 말단 N-글리칸 GlcNac 모티프로 측정한 Kd는 0.238 내지 0.460 Kd (ug/ml) 였다.
- 서열번호 2를 갖는 렉틴은 O-글리칸, 구체적으로 T-항원 및 이의 확장된 코어 구조에 대한 강하고 넓은 결합 프로파일을 나타내었다. 주요 결합 모티프는 O-GalNAc 코어1 (T 항원); 확장된 코어1 구조; Core2; α2,3/6-시알릴 코어1; 및 α2,6/6-시알릴 코어2로 확인되었다. T 항원에 대해 측정된 Kd는 0.319, 시알릴 T 항원은 0.670 내지 1.756, 및 코어 2는 0.212 Kd (ug/ml)이다.
b. 서열번호 2의 공동국소화 연구
공초점 현미경을 사용하여 세포 소기관 내 서열번호 2 (시험 항목)의 위치를 분석하기 위한 연구를 수행하였다.
수용액으로 제공된 시험 항목을 단백질 농도 1 mg/ml의 FITC 라벨로 태그하였다.
시험항목의 원액을 단일 농도- 100 μg/mL로 무혈청 배지 (Serum Free Medium, SFM)에 희석하였다.
세포를 웰 당 0.1x106 세포 밀도로 유리 커버슬립에 두었다. 커버슬립에 세포의 부착이 완료된 후, 세포를 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 FITC-재조합 렉틴 100 μg/mL으로 37℃에서 2 시간 동안 처리하였다.
배양 후 세포를 PBS로 세척하고(3번 세척) 4% 파라포름알데히드를 사용하여 실온(RT)에서 10분 동안 고정하였다. 고정 후, 세포를 0.5% IGEPAL을 사용하여 실온에서 10분 동안 투과화하였다 (투과화는 판-카드헤린(Pan-Cadherin)으로 염색된 세포에 대해서는 수행되지 않음). 투과화 후, 세포를 5% 정상 염소 혈청을 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 차단 후, 세포를 세포소기관 특이적 마커로 실온에서 1.5시간 동안 처리한 다음, 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 처리하였다.
다음의 항체를 여러 세포소기관에 사용하였다:
표 3: 세포소기관에 사용된 항체
배양 후, 세포를 PBST (3번 세척) 및 PBS (3번 세척)을 사용하여 세척하고 DAPI (핵 염색)로 실온에서 3분 동안 염색하였다.
세포를 세척하고(3번 세척) Prolong 유리 변색방지 마운트제를 사용하여 유리 슬라이드에 고정하였다. 공초점 형광 현미경 (제조: Olympus FV1000)을 사용하여 이미징을 수행하였다. 이미지를 FluoView 소프트웨어를 사용하여 캡쳐하였다.
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 재조합 렉틴 (재조합 단백질)의 공동국소화를 측정하기 위해, 방광암 세포 (T24)를 FITC 태그로 표지된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 재조합 렉틴으로 2시간 동안 배양하였다. 다음으로 세포소기관 특이적 마커인 MTCO2 (미토콘드리아), 칼넥신 (소포체), GM130 (골지체), 판 카드헤린 (원형질막) 및 라민 A/C (핵막)로 염색하였다. 세포를 공초점 현미경을 사용하여 이미징하였다.
결과는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 재조합 렉틴 (재조합 단백질) 이 미토콘드리아, 소포체, 골지체 및 원형질막 (적색 형광)에 공존한다는 것을 증명하였다. [도 5 참조]
실시예 4: N 말단 메티오닌에 대한 발현된 단백질의 비교
서열번호 2, 3 및 4의 단백질의 N 말단 메티오닌 함량을 역상-고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다.
결론: 서열번호 3 및 4의 단백질은 2% 미만의 N 말단 메티오닌 불순물을 나타낸 반면, 서열번호 2의 단백질은 13% 이상의 N 말단 메티오닌 불순물을 나타냈다.
실시예 5: 안정성에 대한 발현된 단백질의 비교
발현된 단백질, 즉 서열번호 3의 안정성을 pH 7.8의 10 mM TBS 완충액을 사용하여 2 내지 8 ℃에서 2주 동안 측정하였다.
결론: 발현된 단백질, 즉 서열번호 3은 2 내지 8 ℃, pH 7.8의 10 mM TBS 완충액에서 안정한 것으로 확인되었다.
실시예 6: 용해도에 대한 발현된 단백질의 비교
생산 배지에서 서열번호 3 및 4의 발현된 단백질 (0.25 mM IPTG 로 18℃에서 유도됨)의 용해도를 SDS PAGE 분석을 사용하여 측정하였다.
결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1: 서열번호 3의 발현된 단백질의 용해도
도 2: 서열번호 4의 발현된 단백질의 용해도
결론: 서열번호 3 및 4의 발현된 단백질의 용해도를 생산 배지에서 확인하였다.
실시예 7: 발효 단계 동안 다른 시점에서의 가용성 단백질, 즉 서열번호 3 및 4의 발현 분석
세포를 제어된 조건 하에 발효 배지에서 성장시키고 적절한 유도제로 유도하였다. 수확은 다양한 시점에서 수행되었으며 SDS-PAGE를 사용하여 가용성 단백질의 발현을 분석하였다.
결론: 생산 배지에서 서열번호 3 및 4의 발현된 단백질의 용해도를 발효 단계 동안 여러 시점에서 확인하였다 (도 3 및 4 참조).
실시예 8: 단백질 약물 접합체의 제조
서열번호 3의 단백질을 하기 과정을 사용하여 세포독성 약물 MMAE에 접합하였다:
1X PBS 중 서열번호 3의 단백질 30 mg (7.0 mg/ml)을 10 mM EDTA, DMA 및 DMA 중 3.0 당량의 10 mM MC-Val-Cit-PAB-MMAE가 포함된 1X PBS로 최종 농도 2.5 mg/ml로 희석하여 최종 DMA 농도가 20% (V/V)가 되도록 하였다. 2시간 후 반응이 완료되지 않았고 3.0 당량의 MC-Val-Cit-PAB-MMAE를 추가로 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다.
상기 단백질 약물 접합체의 DAR 값을 LCMS 분석을 수행하여 측정하였다. 형성된 생성물을 50 mM 트리스, 150 mM NaCl의 완충액 교환을 포함하는 GE10-300 Superdex 75 컬럼을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)를 수행하였으며, TBS를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하였다.
SEC 정제 후 단백질 약물 접합체의 DAR값은 1.0으로 측정되었다.
결론: 서열번호 3의 단백질을 사용하여 제조한 상기 단백질 약물 접합체는 DAR 값이 1로 측정되었으며, 이는 형성된 접합체의 균질성을 추가로 제안하는 것이다.
실시예 9: 생물검정 - 접합체의 세포독성 효과
생물검정 - 난소암 세포주 (PA-1) 및 인간 방광암 세포주 (T-24)에 대한 실시예 8의 접합체의 세포독성 효과를 분석하였다.
5,000 세포/웰을 넣고 37℃에서 밤새 배양하였다.
접합체/비히클 대조군 희석액을 각각의 배지에서 만들어 세포에 첨가하였다. 각 웰에 50 μL 부피를 첨가하였다. 실시예 8의 접합체, 및 대조군 서열번호 3 단독 및 10% 비히클 대조군 (20% DMA를 포함하는 1X PBS)에 대한 시작 처리 농도는 1 μM이었으며, 그 다음 총 11회 처리 희석을 위해 10 배로 희석하였다. 각 농도를 3배수로 분석하였다. 배지-단독 웰을 대조군으로 사용하여 생존율을 계산하였다. 세포 역가 글로우 시약 (부피: 50 μL)을 각 웰에 첨가하였으며, 플레이트를 5 분 동안 흔들고 발광을 기록하였다. 약물 처리 시간: 72 시간. 각각의 처리된 웰에서 수득한 발광 신호를 미처리 웰 (배지-단독 대조군)으로 나누고 100을 곱하여 생존율을 계산하였다.
다음으로 데이터를 X= 로그 (x)를 사용하여 변환한 후 비선형 회귀 (곡선 맞춤), 용량 반응 억제 - 로그 (억제제) 대 반응 (3가지 파라미터)으로 분석하고 PRISM 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 측정하였다.
얻은 결과는 다음과 같다:
결론: 접합된 분자는 세포주 PA-1 및 T-24에 대해 서열번호 3과 비교하여 매우 높은 효능을 나타내었다. IC50 값은 서열번호 3의 경우 15-25 μM의 범위인 반면, 실시예 8의 접합체는 나노몰 단위의 IC50 값을 가진다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 스클레로티움 롤프시 렉틴 (Sclerotium rolfsii Lectin, SRL)의 변이체를 포함하는 재조합 글리칸 결합 단백질로서, 상기 변이체는 야생형 SRL과 비교하여 카복시 말단에 추가의 시스테인을 포함하고;
    톰슨-프라이덴리히 (Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr, TF 또는 T) 항원, O-GalNAc 코어1 (T 항원), 코어2, 'α2,3/6-시알릴 코어1' (시알릴-T 항원), 'α2,6/6-시알릴 코어2', 및 TF 및 T 항원의 변형된 형태로부터 선택된 하나 이상의 항원에 대해 결합 친화도를 갖는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1에 대해 70% 내지 99.99%의 서열 동일성을 갖는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 서열번호 1의 1번 내지 141번 아미노산 위치에서 시스테인 (C)이 결여된 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 1번 위치에서 트레오닌 (T)이 세린 (S)으로 치환되는 것을 포함하는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 76번 위치에서 시스테인 (C)이 글리신 (G)으로 치환되는 것을 포함하는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 142번 위치에서 시스테인 (C)의 추가를 포함하는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 142번 및 143번 위치에서 각각 추가의 세린 및 시스테인 (C)을 포함하는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 약물에 접합되는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약물은 치료제, 세포독성제, 방사선제, 항암제, 진단제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단백질 약물 접합체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 단백질은 약물의 표적 전달을 위해 사용되는 것인, 단백질 약물 접합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 암 치료용 의약의 제조에 사용되는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 암 진단 또는 치료에 사용되는 것인, 재조합 글리칸 결합 단백질.
  14. 제1항의 재조합 글리칸 결합 단백질; 및
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제(들)을 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제1항의 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 세포.
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