KR100638706B1 - 밀배아 응집소와 프라에콕신 a의 결합체 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포 성장 억제와 전이 억제 활성을 갖는 단백질과 화합물의 결합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 흑색종 세포를 선택적으로 인식하는 기능을 갖는 렉틴과 암세포를 파괴하는 기능을 갖는 엘라지탄닌을 결합시켜 흑색종에 의한 전이를 억제하는 치료제로 사용될 수 있는 렉틴과 엘라지탄닌의 결합체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 렉틴과 엘라지탄닌 결합체는 흑색종을 특이적으로 인식하여 흑색종 세포의 성장과 전이를 억제할 수 있기 때문에 흑색종에 대한 항암제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

흑색종, 렉틴, 엘라지탄닌

Description

밀배아 응집소와 프라에콕신 A의 결합체 제조방법{Method for preparing wheat germ agglutinin-conjugated praecoxin A}

도 1은 밀배아 응집소(WGA)와 프라에콕신 A의 결합체가 생성되는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.

도 2는 WGA와 프라에콕신 A 결합체의 렉틴 활성도를 그래프로 나타낸 것이다.

▲: WGA 단독

■: WGA와 프라에콕신 A 혼합물

●: WGA와 프라에콕신 A 결합체

도 3은 흑색종이 유도된 마우스에 WGA 단독, 프라에콕신 A 단독, WGA와 프라에콕신 A 결합체 및 WGA와 프라에콕신 A 혼합물을 각각 5mg/kg의 농도로 투여한 후, 생명연장 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

** : p<0.01

* : p<0.05

도 4는 흑색종이 유도된 마우스에 WGA와 프라에콕신 A 결합체를 농도별로 투 여하고 48시간 후, 생명연장 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

** : p<0.01

* : p<0.05

도 5는 흑색종이 유도된 마우스에 WGA 단독, 프라에콕신 A 단독, WGA와 프라에콕신 A 결합체 및 WGA와 프라에콕신 A 혼합물을 각각 5mg/kg의 농도로 투여한 후, 암 전이 억제 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

** : p<0.01

* : p<0.05

도 6은 흑색종이 유도된 마우스에 WGA와 프라에콕신 A 결합체를 농도별로 투여하고 48시간 후, 암전이 억제 효과 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

** : p<0.01

* : p<0.05

본 발명은 암세포 성장 억제와 전이 억제 활성을 갖는 단백질과 화합물의 결합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 흑색종 세포를 선택적으로 인식하는 기능을 갖는 렉틴과 암세포를 파괴하는 기능을 갖는 엘라지탄닌을 결합시켜 흑색종 세포의 성장 억제와 흑색종의 전이를 억제하는 치료제로 사용될 수 있는 렉틴과 엘라 지탄닌의 결합체에 관한 것이다.

렉틴(lectin)은 세포막 복합 당질(당단백질 또는 당지질)의 당사슬과 결합하여 세포 응집, 세포 분열 유도 및 세포 기능의 활성화 등을 유발하는 물질로서, 세포가 종양화된 경우, 종양 세포막의 당단백질에 결합된 탄수화물의 구조 변화를 인식하여 종양세포에 결합하게 된다. 이러한 렉틴에는 T 세포의 분열을 유도하는 기능을 갖는 PHA(phytohemagglutinin), 콘카나발린 A(concanavalin A; Con A)와 T 세포 및 B 세포의 분열을 유도하는 기능을 갖는 밀배아 응집소(Wheat Germ Agglutinin; 이하 "WGA"라 함), PWM(pokeweed mitogen)등이 포함되어 있다. 특히, 렉틴은 림프구를 자극하여 분열시키고 암세포의 응집을 유도하며, 다른 백혈구를 자극함으로써 세포 파괴 물질을 방출하는 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 렉틴을 이용하여 암세포를 진단할 뿐만 아니라 적절한 약물을 결합시켜 암세포만을 선택적으로 공격하는 약물 표적화를 위한 연구가 보고되고 있다(Weis et al., Annu. Rev. Biochem., 65:441, 1996; Peuman et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio., 33:209, 1998; Mody et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 33:1, 1995).

렉틴 중 시알산 유도체인 N-아세틸뉴라미닉산(N-acetylneuraminic acid)을 인식하는 것으로 보고된 WGA는 분자량 16,995Da의 서브유니트가 이량체를 형성하고 있으며, 4개의 도메인에 걸쳐 분포하는 16개의 디설파이드(disulfide)결합으로 이루어져 있다. WGA의 각 서브유니트에는 서로 독립적인 두 개의 결합부위가 있어 당결합에는 두 서브유니트가 동시에 관여한다고 보고되어 있다(Wright et al., Biochemistry 23:280, 1984).

이러한 WGA는 바이러스와 발암성 화학물질에 의하여 악성화된 세포에 강하게 응집하는 성질이 있다고 알려져 있다(Valdizan et al., J. Cell Physiol., 151:451, 1992). 또한, 암환자로부터 얻은 흑색종 세포주(melanoma cell line)인 IGR39 및 IGR37이 WGA와 강하게 결합한다는 보고가 있으며(Lorea et al., Melanoma Res., 7:353, 1997), HM7 흑색종 세포의 세포막으로부터 뮤린형 당단백(murin-type glycoprotein)을 분리, 정제하는 데에도 WGA가 결합된 컬럼이 이용되고 있다(Valdizan et al., J. Cell Physiol., 151:451, 1992). 이상과 같은 연구 보고들은 WGA가 흑색종 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 단백질임을 나타낸다.

한편, 탄닌(tannin)은 식물에 존재하는 성분으로서 엘라지탄닌(ellagitanin), 엘라지닉산(ellagic acid), 갈릭산(gallic acid)등이 알려져 있으며, 혈중 질소의 저하, ACE(angiotensin converting enzyme)의 활성 억제, 항바이러스 효과 및 항박테리아 효과 등과 같은 생물학적 활성을 갖는 것으로 보고되고어 있다(Uchida et al., Jpn. J. Pharmacol., 43:242, 1987).

최근에는, 엘라지탄닌의 일종인 오에노테인 B(oenothein B)라는 물질이 항암 활성이 있으며(Miyamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 84:99, 1993), 갈릭산과 같은 몇몇 유도체가 마우스의 피부암에 유효하다는(Gali et al., Carcinogenesis, 13:715, 1992) 보고들이 잇따르면서, 탄닌화합물의 항암제로서의 기능에 관한 관심이 높아지고 있다. 특히, 엘라지타니니의 일종인 프라에콕신 A(praecoxin A)라는 물질은 분자량 952.7Da을 갖는 화합물로서 최근에 항종양 작용에 대한 기작이 밝혀진 바 있다(Chang et al., Arch. Pharm. Res., 18:396, 1995).

본 발명자들은 흑색종 세포를 선택적으로 인식하는 기능을 갖는 밀배아 응집소(WGA)와 종양 억제 활성을 갖는 엘라지탄닌 유도체인 프라에콕신 A를 결합하여 흑색종과 같은 전이암을 선택적으로 인식하여 억제할 수 있는 렉틴과 엘라지탄닌의 결합체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 흑색종 세포 성장 억제와 전이 억제 활성을 갖는, 렉틴과 엘라지탄닌의 결합체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑색종 세포를 선택적으로 인식하는 작용을 하는 렉틴과 암세포를 파괴하는 기능을 갖는 엘라지탄닌의 결합체를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하다.

렉틴은 세포 표면에 존재하는 당의 구조적 차이를 인식하여 세포와 결합하는 단백질로서, 특히, WGA는 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 및 N-아세틸뉴라미닉산(N-acetylneuraminic acid)에 특이적으로 결합한다.

따라서, 본 발명에서는 흑색종 세포를 특이적으로 인식하는 렉틴, 바람직하게는 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)에서 유래된 WGA와 항암 활성을 나타내는 물질을 결합시킨 결합체를 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 WGA와 결합될 수 있는 항암 활성을 나타내는 물질로는 항암효과 가 있는 것이면 제한되지 않고 사용될 수 있으나, 탄닌 종류의 엘라지탄닌, 구체적으로 프라에콕신 A를 사용하는 것이 바람직하다. 프라에콕신 A는 오리나무(Alnus hirsute var. microphylla, Betulaceae)로부터 정제된 엘라지탄닌 유도체로서 항암 및 면역부활 작용이 알려져 있다. 또한, 프라에콕신 A는 분자내에 -COOH기를 포함하고 있어 WGA와의 결합 형태를 추정하기가 용이하므로 몇 몰의 프라에콕신 A가 WGA와 결합하였는지 쉽게 확인할 수 있기 때문에 본 발명에 따른 렉틴과 엘라지탄닌 결합체에 사용되는 것이 바람직하다.

한편, 프라에콕신 A는 하기 화학식 1에서와 같이 분자구조내에 -COOH기가 존재하며 구조내의 -OH기와 렉틴간에 공유 결합이 형성되기 위해서는 -OH기를 활성화시켜야 한다.

이때는 단백질의 활성에 영향을 미치지 않는 조건하에서 결합을 시켜야 하며, 렉틴의 일차 구조중에서 라이신(lys), 알지닌(arg), 아스파틱산(asn) 및 글루탐산(gln)과 N-말단의 아미노기가 주로 프라에콕신 A의 활성화된 -OH기와 결합하게 된다. -OH기를 활성화시키는 방법으로는 카르보닐디이미다졸법 (carbonyldiimidazol), 숙시닉 안하이드리드법(succinic anhydride), 아미노에틸카르복시메틸법 (aminoethylcarboxymethyl), 글루타일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르법 (glutayl-N-hydroxysuccinimide), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드법 (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드법 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDAC) 등이 있다(Kobayashi et al., J. Agric. Food Chem., 49:823, 2001; Drabick et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:583, 1998; Combeau et al., J. Biol. Chem. 267:14038, 1992).

본 발명의 일 실시예에서는 WGA의 -OH기를 활성화시키는 방법으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드법을 이용하여(도 1 참조), 프라에콕신 A와 결합하였다. 본 발명에 따른 WGA와 프라에콕신 A의 결합체 제조시, WGA와 프라에콕신 A의 혼합비율은 1:1 내지 1:10의 몰비율인 것이 바람직하며, 구체적으로 1:10인 것이 더욱 바람직하다. 몰비율을 1:10으로 하여 본 발명에 따른 결합체를 제조하는 경우 24시간 동안 70% 이상의 결합률을 유지하기 때문에 상기 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 결합체의 분자량을 당업계에 공지된 방법인 MALDI-TOF Mass spectrometer에 의하여 조사한 결과, WGA 한 분자당 프라에콕신 A가 18분자 결합하고 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 결합체가 WGA 원액과 비교하여 렉틴 고유의 성질을 그대로 유지하고 있음을 확인하였다. 렉틴의 성질을 갖고 있는가를 확인하기 위해서는 당업계에 공지된 다양한 방법이 이용될 수 있으나, 본 발명에서는 적혈구 응집 반응 및 ELLA(enzyme-linked lectin assay)법에 의한 활성도 측정으로 확인하였다.

상기 방법에 의한 측정 결과, 본 발명에 따른 결합체가 적혈구 응집을 억제하는 성질을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, WGA가 결합체를 형성한 후 에도 N-아세틸뉴라미닉산과 결합하는지의 여부를 보다 정량적으로 확인하기 위하여 N-아세틸뉴라미닉산이 말단에 결합된 당단백질인 페투인(fetuin)에 대한 결합력을 ELLA법에 의하여 확인하였다. 상기에서 페투인과 WGA의 결합도가 높으면, 결과적으로 페투인의 양이 줄어들기 때문에 흡광도가 낮게 나타난다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, WGA와 프라에콕신 A의 결합체가 가장 낮은 흡광도를 나타내어 페투인에 대한 결합력이 가장 높은 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 결합체가 암세포, 특히, 흑색종 세포의 성장과 전이를 억제하는가를 확인하기 위하여, 마우스를 대상으로 한 생체내(in vivo) 실험을 수행하였다.

마우스에 흑색종 세포를 주사하여 종양을 유도한 후, 각각 WGA 단독, 프라에콕신 A 단독, WGA와 프라에콕신 A의 혼합물 및 WGA과 프라에콕신 A의 결합체를 주사하고 마우스의 생명연장 효과를 측정하였다. 그 결과, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, WGA 단독, 프라에콕신 A 단독을 투여하였을 때 보다 WGA와 프라에콕신 A의 결합체에 의한 생명연장 효과가 높음을 확인할 수 있었다.

또한, 마우스에 흑색종 세포를 주사하여 종양을 유도한 후, 각각 WGA 단독, 프라에콕신 A 단독, WGA와 프라에콕신 A의 혼합물 및 WGA와 프라에콕신 A의 결합체를 주사하고 마우스의 폐를 적출하여 상기 물질들에 의한 암전이 억제 효과를 비교하였다. 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, WGA 단독, 프라에콕신 A 단독을 투여하였을 때 보다 WGA와 프라에콕신 A의 결합체에 의한 암전이 억제 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

세포배양

본 발명에서 사용된 종양 세포주인 마우스 흑색종 세포주(mouse melanoma cell line) B16-F10은 전남대학고 약학대학 면역학 교실에서 분양받아 사용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린(100U/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎕/㎖)이 포함된 RPMI 1640 배지상에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 조작된 배양기로 배양하였으며, 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.

<실시예 2>

WGA와 프라에콕신 A 결합체의 제조 및 분자량 확인

0.1M KCl, 0.2mM CaCl₂, 5mM 하이드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide), 22mM Tris-HCl(pH 7.5)이 함유된 용매로 프라에콕신 A 분말(중앙대학교 약학대학 생약학 교실)을 용해하고 5mM의 농도가 되도록 EDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminipropyl)carbodiimide)를 첨가하고 20℃에서 15분 동안 방치한 후, 2-머캅토에탄올을 20mM 농도가 되도록 첨가하였다. 상기 용액과 0.4M KCl, 20mM Tris-HCl(pH 7.5)이 함유된 용매로 조제한 WGA(Sigma) 용액을 몰비 1:1, 1:10으로 혼합한 후, 실온 및 37℃에서 반응시켜 WGA와 프라에콕신 A의 결합체를 제조하였다(도 1 참조). 반응 0, 1, 2, 4, 24 시간마다 100㎕씩 취해 원심분리기(Amicon)를 사용하여 2,000g로 20분 동안 원심분리하였고, 10kDa이하의 하액을 취하여 신크로펙(SynChropak) 컬럼을 이용한 HPLC로 분석 및 확인하였다. 결합률(binding ratio)은 같은 농도의 약물 원액의 피크 면적에 대한 미결합 약물의 피크 면적비로 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 대조군으로 실온 및 37℃에서 WGA와 프라에콕신 A를 1:1, 1:10으로 단순히 혼합한 용액을 사용하였다.

그 결과, WGA와 프라에콕신 A의 단순 혼합물을 1:10의 몰비로 혼합한 경우 4시간부터 결합률이 저하되어 24시간 후 13.4%로 저하되었으며, WGA와 프라에콕신 A의 몰비를 실온에서 1:10으로하여 결합시킨 경우, 70% 정도의 결합률이 24시간 동안 유지됨을 확인할 수 있었다. 이는 비특이적으로 비공유 결합한 물리적 혼합물보다 공유 결합한 결합체가 더 안정함을 나타낸다.

또한, WGA와 프라에콕신 A의 결합비를 확인하기 위하여 몰비 1:10으로 결합한 경우를 당업계에 공지된 방법인 MALDI-TOF Mass spectrometet를 사용한 방법을 이용하여 분자량(m/z)을 측정하였다.

그 결과, 분자량이 17061.5, 34112.5, 51493.8, 68930.9의 값을 나타냈으며, WGA의 분자량이 16,995 Da, 이량체의 분자량이 33,990 Da임을 감안하면, WGA 한분자 당 프라에콕신 A가 각각 18분자씩 결합함을 의미한다.

몰비 (WGA:프라에콕신 A)	결합방법	온도	반응 시간(시간)
			0	1	2	4	24
1:1	혼합물	실온	74.1	72.5	72.5	72.5	61.4
		37℃	75.7	72.5	74.6	67.2	76.2
	결합체	실온	83.5	78.0	75.6	75.9	79.3
		37℃	82.1	78.0	75.6	79.2	79.3
1:10	혼합물	실온	85.9	91.2	86.7	82.6	51.3
		37℃	88.7	88.4	80.0	57.9	13.4
	결합체	실온	66.1	73.4	64.8	59.0	65.3
		37℃	70.3	96.9	66.4	67.6	64.0

혼합물 : WGA와 프라에콕신 A를 단순히 혼합한 것

결합체 : WGA와 프라에콕신 A를 EDAC를 사용하여 공유결합시킨 것

<실시예 3>

WGA와 프라에콕신 A의 결합체의 렉틴 활성 유지 측정

3-1) 적혈구 응집 반응

WGA와 프라에콕신 A 결합체가 렉틴으로서의 활성을 유지하는지 여부를 확인하기 위하여 적혈구 응집 반응을 수행하였다.

미세플레이트의 웰에 상기 실시예 2)에서 제조한 결합체 시료 원액 50㎕씩을 넣고 0.15M NaCl로 2배씩 희석시키고 현탁시킨 적혈구를 각각 50㎕씩 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 적혈구 응집 반응을 육안으로 관찰하여 응집 반응이 일어나는 최대 희석 배수를 관찰하였다.

그 결과, 하기 표 2에서와 같이, WGA의 원액은 적혈구를 32배 희석한 경우까지 응집을 저해하였고, 본 발명의 결합체의 경우 이보다 약간 낮은 8배까지 저해하 는 활성을 나타내었다. 즉, 결합체의 경우 결합전의 WGA에 비해서는 저해 농도가 약간 저하하였으나 적혈구 응집을 억제하는 성질은 거의 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

시료	헤마글루타닌 활성(hemagglutination activity)(HA titer)
	1	2	3	8	16	32	64
WGA	+	+	+	+	+	+	-
결합체	+	+	+	+	-	-	-

+ : 응집 안됨 - : 응집됨

3-2) ELLA(enzyme-linked lectin assay)법에 의한 측정

WGA와 프라에콕신 A 결합체가 렉틴으로서의 활성을 유지하는지 여부를 보다 정량적으로 확인하기 위하여 ELLA(enzyme-linked lectin assay)를 수행하였다(Tsujimura et al., Clin. Diagn. Lab Immunol. 8:454, 2001).

N-아세틸뉴라미닉산(N-acetylneuraminic acid)을 포함하고 있는 당단백질인 페투인(fetuin) 1mg/㎖을 100, 1,000, 10,000배 희석한 용액 100㎕를 미세플레이트의 웰에 각각 코팅한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 코팅 용액을 제거한 후, PBS 완충용액 100㎕로 세척하는 과정을 3회 반복하였다. BSA 1%를 포함한 PBS 용액 100㎕를 블로킹 용액으로 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 여기에 각각 WGA 단독, WGA와 프라에콕신 A의 혼합물, WGA와 프라에콕신 A의 결합체를 각 웰에 100㎕씩 넣어 37℃ 에서 1시간 동안 반응시키고 PBST 완충용액으로 세척하였다. 이러한 과정을 3회 반복한 후, 여기에 퍼옥시다제(peroxidase)로 표지된 WGA 용액(25㎍/㎖)을 각각 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 제거하고 각 웰에 PBST 완충용액을 첨가하여 5회 세척하였다. PBS에 녹인 0.55% 2,2'-ABTS(Azino-bis[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 5㎖에 과산화수소 5㎕를 넣은 용액 100㎕를 각 웰에 넣고 즉시 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, WGA 단독보다 결합체의 흡광도 값이 낮아 페투인에 대한 결합력이 가장 높은 것으로 나타났다.

<실시예 4>

WGA와 프라에콕신 A 결합체에 의한 생명연장 효과

본 발명의 WGA와 프라에콕신 A 결합체가 흑색종 세포를 효과적으로 억제하여 항암제로 사용될 수 있는지의 여부를 판단하기 위하여 5주령된 C57BL/6 마우스(대한동물)을 대상으로 한 생명연장 효과를 측정하였다.

5주령된 C57BL/6 마우스를 각 실험군 당 5마리씩 준비하고 상기 실시예 1)에서 준비한 B16-F10 마우스 흑색종 세포를 마우스 당 1×10⁴세포씩 주사하였다. 암세포 이식 10시간 후, 음성 대조군으로는 D-PBS완충용액을 0.05㎖, 양성 대조군으로는 강력한 항암제인 시스플라틴(cisplatin) 10mg/kg를 투여하였다. 실험군으로 는 렉틴, 프라에콕신 A, 렉틴과 프라에콕신 A의 혼합물, 렉틴과 프라에콕신 A의 결합체를 각각 5mg/kg를 투여하였으며, 48시간 간격으로 3주간 투여하였다. 대조군과 실험군의 생존기간과 고형 종양의 크기, 무게를 비교하여 각 약물의 고형종양에 대한 생명연장 효과를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 렉틴이나 프라에콕신 A 단독을 투여하였을때 보다 렉틴과 프라에콕신 A의 결합체의 생명연장 효과가 높음을 확인할 수 있었으며, 도 4에 도시된 바와 같이, 농도가 증가할수록 그 효과도 증가함을 알 수 있었다.

<실시예 5>

WGA와 프라에콕신 A 결합체에 의한 암전이 억제 효과

본 발명의 WGA와 프라에콕신 A 결합체가 흑색종 세포를 효과적으로 억제하여 항암제로 사용될 수 있는지의 여부를 판단하기 위하여 5주령된 C57BL/6 마우스(대한동물)을 대상으로 한 암전이 억제 효과를 측정하였다.

5주령된 C57BL/6 마우스를 각 실험군 당 5마리씩 준비하고 상기 실시예 1)에서 준비한 B16-F10 마우스 흑색종 세포를 마우스 당 5×10⁵세포씩 앞발바닥에 주사하였다. 암세포 이식 10시간 후, 발바닥에 종양의 크기가 7~8mm기 되었을때, 발목을 절단하고 70% 에탄올로 지혈시켰다.

이후, 약물은 복강으로 주하하였으며, 음성 대조군으로는 D-PBS완충용액을 0.05㎖, 양성 대조군으로는 강력한 항암제인 시스플라틴(cisplatin) 10mg/kg를 투여하였다. 실험군으로는 렉틴, 프라에콕신 A, 렉틴과 프라에콕신 A의 혼합물, 렉틴과 프라에콕신 A의 결합체를 각각 5mg/kg씩 투여하였으며, 48시간 간격으로 3 주간 투여하였다. 마지막 약물 투여 3일 후, 마우스의 무게를 측정하고 흉부를 절개하여 폐를 적출하였고, 폐에 전이되어 나타나는 종양 콜로니의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 렉틴이나 프라에콕신 A 단독을 투여하였을때 보다 렉틴과 프라에콕신 A의 결합체의 암전이 억제 효과가 높음을 확인할 수 있었으며, 도 6에 도시된 바와 같이, 농도가 증가할수록 그 효과도 증가함을 알 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 흑색종 세포를 특이적으로 인식하는 기능을 갖는 렉틴의 일종인 밀배아 응집소(WGA)와 암세포를 파괴하는 기능을 갖는 물질인 엘라지타닌의 일종인 프라에콕신 A를 결합하여 새로운 렉틴과 엘라지탄닌 결합체를 제조하였다.

본 발명에 따른 렉틴과 엘라지탄닌 결합체는 흑색종을 특이적으로 인식하여 흑색종 세포의 성장과 전이를 억제할 수 있기 때문에 흑색종에 대한 항암제로서 효과적으로 사용될 수 있다

Claims (5)

1. a) 하이드록시숙신이미드가 함유된 용매에 프라에콕신 A를 용해시키는 단계;

   b) 상기 a)단계의 용액에 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)를 첨가하는 단계 및

   c) 밀배아 응집소 대 프라에콕신 A의 몰 비율이 1:1 내지 1:10이 되도록 상기 b)단계의 용액에 밀배아 응집소를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 밀배아 응집소와 프라에콕신 A의 결합체 제조방법.
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