CN102863538A - 含蛋白转导域的融合多肽突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)融合多肽突变体的结构序列及构建方法。该融合蛋白突变体含73个氨基酸。将该蛋白进行融合表达和纯化，以纯化的TAT-SARA/SBD为受试药物进行动物单侧输尿管结扎梗阻模型实验，结果表明，受试药物具备逆转纤维化效果。该融合蛋白突变体可高效上清表达、易于纯化，便于生产，有望用于抑制肾纤维化的治疗中。

Description

含蛋白转导域的融合多肽突变体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及含有蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的融合多肽突变体，还涉及编码该融合多肽突变体的cDNA序列及其衍生物，包含此类cDNA序列的重组表达载体，用此类重组表达载体转化的宿主细胞，以及用于制备此类重组蛋白质和它们的衍生物的方法。本发明还涉及该融合蛋白突变体的构建方法及其应用。

背景技术

肾脏纤维化是不同病因(包括炎症、损伤、药物、糖尿病和遗传因素、衰老等)所导致慢性肾脏疾病的最终共同结局。各种进展性肾脏疾病，无论其原发病如何，最终都将导致肾脏纤维化，进展为终末期肾功能衰竭，并必须依靠透析或肾移植维持生命。因此，研究肾脏纤维化的发病机制、探索能够缓解肾脏纤维化进程或逆转肾脏纤维化的有效治疗手段、延缓终末期肾衰的发生是肾脏疾病研究领域亟待解决的重要临床问题。

近年来研究发现，在众多细胞因子、体液、代谢和血流动力学因素中，转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和骨形态发生蛋白(bone morphorgenic protein，BMP)及其下游的smad信号转导通路在肾脏纤维化发生发展中起着决定性作用。通过阻断TGF-β1信号转导通路和(或)增强BMP7信号来逆转或延缓肾脏纤维化成为当前研究的热点，并已在大量的体外及动物实验中得以证实。但目前已经建立的阻断TGF-β1信号转导通路的策略在抑制肾脏纤维化的同时也对机体对抗肾脏炎症的作用通路产生了抑制作用，因此难于在临床推广应用。BMP7在治疗急性和慢性肾脏疾病中虽显示出良好的效果，然而BMP7的活性形式为二聚体，含有6个分子内二硫键和一个分子间二硫键，使用基因工程技术制备时蛋白复性成本过高，不能被广大患者接受。

从2009年始，本课题组一直致力于探索TGF-β1通路抑制蛋白SARA阻断肾纤维化的作用研究，探索能够替代基因治疗及BMP7并能有效治疗、缓解肾脏纤维化的蛋白药物。合成的SARA融合蛋白虽具一定的功能活性，但蛋白表达不稳定，以包涵体形式存在，沉淀蛋白须经复性才可使用，但复性常使蛋白性质发生变化而失去功能，不利于今后的药物生产。

发明内容

本发明的目的在原有SARA融合蛋白的工作基础上，对SARA羧基末端的Smad结合作用域——SARA肽适体(SARA/SBD)进行改造，获得一种含蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的新的融合多肽突变体。

其中，所述蛋白转导域TAT为人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)的反式激活蛋白(transactivator of transcription，TAT)改造而来，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1(YARAAARQARA)。其中，Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)与人SARA/SBD同源，其突变体是通过将Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突变为T以及第54位由A突变为P而获得的；该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2(MSASSQSPNPNNPAEYCSTIPPLQQAQASGALSSPPPTVMVPVGVLKHPGTEVPQPR)。其中，所述连接肽包含至少1个、3个、5个、7个、9个、15个、25个氨基酸，如其氨基酸序列为SGGGS(SEQ ID No：3)。

本发明还涉及该融合蛋白突变体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：4所示(YARAAARQAR ASGGGSMSAS SQSPNPNNPA EYCSTIPPLQ QAQASGALSSPPPTVMVPVG VLKHPGTEVP QPR)；本发明还涉及编码该融合蛋白突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；以及该核酸分子的cDNA序列；该核酸分子或其cDNA与启动子构建的表达盒；包含该核酸分子、或其cDNA、或其表达盒的质粒或载体，其中该质粒或载体是表达载体；还涉及宿主细胞，其包含该核酸分子、cDNA序列、表达盒、或质粒或载体。

本发明还涉及制备该融合蛋白突变体的方法，其中所述方法包括：1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白突变体的核苷酸序列；2)在所述生物中表达所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体；和3)纯化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体。

本发明还涉及将该融合蛋白突变体用作制备药物；本发明还涉及药物组合物，其包含有效量的该融合蛋白突变体以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还涉及药物组合物，其包含上述表达盒、或上述质粒或载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还涉及上述融合蛋白突变体、核酸分子、cDNA、表达盒、质粒或载体、宿主细胞的用途，如制备治疗肾脏纤维化的药物。

本发明最大的目的就是在原有SARA融合蛋白的工作基础上，对SARA羧基末端的Smad结合作用域-SARA肽适体(SARA/SBD)进行改造，获得这种含蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的新的融合多肽突变体。再将该融合蛋白突变体的编码基因导入表达质粒中，转化细胞，诱导表达后分离纯化。具体为将该融合蛋白突变体克隆至S1载体，转化BL21大肠杆菌感受态细胞，进行表达纯化，得到大量上清表达、不需复性、稳定的目的蛋白。

检测该融合蛋白突变体的功能活性，发现该融合蛋白突变体具备体内生物学活性。建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以TAT-SARA/SBD为受试药物，SARA/SBD、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定该蛋白具备明显逆转肾纤维化的效果。因此，该融合蛋白突变体可用于制备治疗肾脏纤维化的药物。

附图说明

图1是实施例融合蛋白突变体的质粒结构图，其中，图1A为S1-TAT-SARA/SBD质粒结构图、图1B为M2-TAT-SARA/SBD质粒结构图。

图2是实施例S1-TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的诱导表达结果图，其中：M：蛋白marker；NC：未诱导的BL21/S1-TAT PTD-SARA/SBD；1：15℃过夜诱导BL21/S1-TAT PTD-SARA/SBD；2-3：37℃4h诱导的BL21/S1-TAT PTD-SARA/SBD。

图3是实施例S1-TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的纯化结果，其中M：marker；1：离心后的沉淀；2：离心后的上清；3：穿过峰；4-10：洗脱后的产物。

图4是实施例S1-TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的纯化产物鉴定结果，其中：M1：marker；M2：Easy westernmarker；1：纯化产物SDS-PAGE(图3的4～7)；2：纯化产物SDS-PAGE(图3的8～10)；3：Western blot鉴定(图3的4～7)；Lane 4：Western blot鉴定(图3的8～10)。

图5是实施例TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的抑制单侧输尿管结扎后肾纤维化的效果(图5A，图5B)。

具体实施方式

1、为了在S1质粒中表达本发明的TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体，在该融合蛋白突变体的前面加上His tag和SUMO tag。按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码TAT-SARA/SBD的核酸片断：

CATATGATGC  ATCACCACCA  CCATCACTAT  GCCCGTGCGG  CGGCGCGTCA

GGCCCGTGCT  TCTGGCGGCG  GTTCAATGTC  GGCGAGTAGT  CAGAGTCCGA

ACCCGAACAA  TCCGGCAGAA  TATTGCTCCA  CCATTCCGCC  GCTGCAGCAA

GCGCAGGCCA  GCGGCGCGCT  GAGCTCTCCG  CCGCCGACCG  TGATGGTTCC

GGTCGGCGTT  CTGAAACACC  CGGGCACCGA  AGTTCCGCAA  CCGCGTTAAT

GAAAGCTT(SEQ ID NO：5)(图1)。

2、S1、M2质粒由南京金斯瑞(GenScript)生物科技有限公司获得，它的克隆位点是Nde I和Hind III，将上述合成的片断亚克隆至质粒S1。(图1)

3、TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的诱导表达

将重组好的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，随机挑选单克隆接种于含氨苄青霉素的LB中，37℃、200rpm活化振摇培养，一旦细胞浓度达OD_650nm＝0.6-0.8，加入IPTG诱导培养。SDS-PAGE and Western blot监测表达表达结果。(图2)

4、TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的纯化

质粒S1用于扩增产物，3L培养液15℃过夜诱导，细胞经50mM Tris-HCl，300mMNaCl，20mM Imidazole，pH8.0高频声波裂解，离心后上清装填Ni-NTA层析纯化，SDS-PAGE凝胶电泳检测并经凝胶成像系统分析，纯度大于95％。(图3、4)

5、TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的体内抗纤维化作用

TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体对单侧输尿管梗阻所致肾脏纤维化模型的治疗作用：制备小鼠UUO模型，按5mg、10mg/kg体重尾静脉注射TAT-SARA/SBD，观察TAT-SARA/SBD对UUO模型肾脏纤维化的治疗作用。设立假手术组、单纯UUO模型组和SARA组作为对照。组织形态学指标观察：免疫组化染色定量肾组织E-cadherin、a-SMA等。

图5A和图5B是TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体体内逆转纤维化结果图。

Claims (10)

1.一种TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体，其是由蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的突变体通过连接肽连接获得，所述蛋白转导域TAT为人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)的反式激活蛋白(transactivator of transcription，TAT)改造而来，所述Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)与人SARA/SBD同源。

2.权利要求1的融合蛋白突变体，其中所述蛋白转导域TAT的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

3.权利要求1的融合蛋白突变体，其中通过将Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突变为T，第54位由A突变为P，从而获得所述Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)突变体，获得的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白突变体，其中所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

5.权利要求1-4中任一项的融合蛋白突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

6.核酸分子，其中所述核酸分子包含编码权利要求1-5的融合蛋白突变体的多核苷酸序列。

7.权利要求6的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

8.制备权利要求1-5中任一项的TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体的方法，其中所述方法包括：

1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白突变体的核苷酸序列；

2)在所述生物中表达所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体；和

3)纯化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体。

9.药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-5任一项的TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体以及药学上可接受的载体或赋形剂。

10.权利要求1-5任一项的TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体、或权利要求6或7的核酸分子在制备治疗肾脏纤维化的药物中的应用。

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