NO302527B1 - Fremgangsmåte ved fremstilling av polypeptid med antikoagulerende aktivitet - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt polypeptid erholdt ved genetiske rekombinasjonsteknikker hvor polypeptidet har en aminosyresekvens som angitt i krav l's ingress, og med aktiviteter lik human trombomodulin, såsom antikoagulerende aktivitet og trombolytisk aktivitet. Oppfinnelsen angår også et deoksyribonukleinsyre (nedenfor referert til som "DNA")-fragment som koder for nevnte polypeptid.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Heparin, antitrombin III og lignende blir for tiden brukt som antikoagulerende midler. Med hensyn til trombolytiske midler, har urokinase isolert fra urin eller dyrkede nyreceller, streptokinaseisolat fra S-hemolytiske strep-tokinase og lignende blitt satt i praktisk bruk, såvel som en nylig utviklet vevsplasminogenaktivator.

Disse substanser har imidlertid bieffekter som bløder-tendens og viser kun én aktivitet, antikoagulerende aktivitet eller trombolytisk aktivitet.

På basalforskningsområdet har nylig en substans med en effekt til å inhibere blodkoagulering og en effekt til å fremme dannelse av aktivert protein C som øker fibrinolyse blitt funnet i et lungevevsekstrakt fra kanin av N. L. Esomn et al. og kalt trombomodulin (J. Biol. Chem., Vol. 257, side 859, 1982). Det er blitt rapportert av Maruyama et al. at trombomodulin er en trombinreseptor beliggende på blodkar endotelialceller og at trombin blir befridd for sin blodkoagulerende aktivitet når det er bundet til trombomodulin og trombin-trombomodulinkomplekset aktiverer protein C for å senke sin antikoagulerende effekt (J. Clin. Invest., Vol. 75, side 987, 1985). Med andre ord er det mulig at trombomodulin gir effekter for både inhibering av blodkoagulering og økning av fibrinolyse og følgelig kan

bli anvendt for kliniske formål.

Det følgende oppsummerer eksempler på isoleringen av human trombomodulin som er blitt rapportert opp til nå. I dette tilfelle er, med mindre annet er angitt, data angående molekylvekt angitt nedenfor for slike målt under ikke-reduserende betingelser ved hjelp av natrium-dodesylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE).

P. W. Majerus et al. har renset trombomodulin fra human placenta og rapportert dets molekylvekt til å være 75 K (J. Biol. Chem., Vol. 259, side. 12246, 1984), mens Aoki et al. har renset trombomodulin fra human placenta og angitt dets molekylvekt som 71 K (Thrombosis Res., Vol 37. side 353, 1985; og japansk patentsøknad Kokai nr. 60-199819). Maruyama et al. har renset trombomodulin fra humant lungevev og rapportert at dets egenskaper var de samme som dem av placental opprinnelse (J. Clin. Invest., Vol. 75, side 987, 1985). I tillegg har Suzuki et al. delvis renset trombomodulin fra humane blodplater og bestemt dets molekylvekt som 78 K og angitt at trombomodulinpreparatene erholdt fra blodplater, placenta og endotelialceller fra lungeblodkar hadde samme egenskaper i forbindelse med sin elektrofore-tiske oppførsel og affiniteter for trombin og protein C (J. Biochem., Vol. 104, side 628, 1988).

I tillegg til disse trombomodulinmolekyler renset fra humane organer (referert til nedenfor som "human trombomodulin") har de følgende substanser med lignende egenskaper (refereres til som "human trombomodulinlignende substans") blitt rapportert.

P. W. Majerus et al. har delvis renset to humane trombomodulinlignende substanser fra humant plasma med molekylvekter på henholdsvis 63 K og 54 K, og rapportert at lignende substanser også var tilstede i urin (J. Clin. Invest., Vol. 75, side 2178, 1985). I tillegg har Ishii et al. rapportert at lignende substanser med molekylvekter på 105 K, 63 K, 60 K, 33 K, 31 K, og 28 K (ingen beskrivelse angående reduserende eller ikke-reduserende målebetingel-ser) ble utskilt i urin (Abstracts of Papers, the 108th Meeting of Phrmaceutical Society of Japan, 6F05, 11-1, 1988). Andre eksempler på humane trombomodulinlignende substanser erholdt fra urin innbefatter en blanding av substanser med molekylvekt på 200 K, 48 K og 40 K (japansk patentsøknad Kokai nr. 63-30423) og slike med molekylvekt på 39 K og 31 K (japansk patentsøknad Kokai nr. 63-146898). C. T. Esmon et al. har fremstilt et kjemisk syntetisert peptid som tilsvarer en del av trombomodulinmolekylet (japansk patentsøknad Kokai nr. 2-19399).

På den annen side har Suzuki et al. klonet et gen for human trombomodulinprekursor inneholdende et signalpeptid fra et humant lunge cDNA-bibliotek som gjør bruk av genetiske manipuleringsteknikker, og har bestemt genets fullstendige struktur og funnet en aminosyresekvens på 557 aminosyreresiduer med et signalpeptid på 18 aminosyrer ved siden av sekvensen, med den konklusjon at den N terminale aminosyresekvens for humant trombomodulin var Ala-Pro-Ala-Glu-Pro (EMBO Journal, Vol. 6, side 1891, 1987). I tillegg har Suzuki et al. rapportert at aktivitet av humant trombomodulin fremstilt ved genetiske manupuleringsteknikker var den samme som den av naturlig humant trombomodulin renset fra biologisk vev (J. Biol. Chem., Vol 264. side 4872, 1989) og at den humane trombomodulinlignende aktivitet var begrenset til en del av aminosyresekvensen fra posisjon 345 til posisjon 462 av aminosyreresiduene nummerert fra sin amino-terminal, og at aktiviteten forsvant når hvilken som helst av aminosyrene i den aktive del ble fjernet (J. Biol. Chem. Vol. 264, side 10351, 1989; og Abstracts of Papers, the 12th~~Meeting of International Society of Thrombosis and Hemostasis, side 334, Title No. 1039, 1989). I tillegg har R. W. Jackman et al. bestemt den fullstendige struktur for et gen av human trombomodulinprekursor og vist en aminosyresekvens på 559 aminosyreresiduer med et signalpeptid på 16 aminosyrer tilstøtende sekvensen, med den konklusjon at den N terminale aminosyresekvens for humant trombomodulin var Phe-Pro-Ala-Pro-Ala-Glu-Pro (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 84, side 6425, 1987). I tillegg har D. Wen et al. klonet et trombomodulinprekursor-gen fra et human navle-strengåre cDNA-bibliotek, og bestemt fullstendig struktur av genet og påvist en aminosyresekvens på 554 aminosyreresiduer med et signalpeptid på 21 aminosyreresiduer ved siden av sekvensen, med den konklusjon at den N-terminale aminosyresekvens for human trombomodulin var Glu-Pro (Bio-chemistry, Vol 26, side 4350, 1987) .

Dessuten har Andersen et al. forsøkt å fremstille en human trombomodulinlignende substans som tilsvarer en del av det humane trombomodulinmolekyl<y>ed hjelp av genetiske manipuleringsteknikker (internasjonal patentsøknad WO 88/09811).

I tillegg har P. W. Majerus et al. utviklet en cDNA klon av human trombomodulin ved hjelp av genetiske manipuleringsteknikker og har lykkes i å uttrykke et proteinmolekyl med fullstendig aminosyresekvens til human trombomodulin (japansk patentsøknad Kokai nr. 63-301791) .

Beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnerene av foreliggende oppfinnelse har isolert et gen av human trombomodulinprekursor fra et humant cDNA bibliotek, fremstilt forskjellige DNA-fragmenter fra dets parti-elle struktur og innesluttet disse fragmenter i mikroorganismer og celler for å undersøke biologiske aktiviteter av polypeptider kodet for av DNA fragmentene. Som et resultat av andre serier av studier, har foreliggende oppfinnere isolert et trombomodulinlignende substans med en molekylvekt på 72 K fra human urin (europeisk patentpublikasjon EP 376251) og har vist at dets struktur og aktivitet er for skjellig fra dem allerede rapportert for humane trombomodulinmolekyler. Denne nye substans blir nedenfor referert til som "human urin trombomodulin". Foreliggende oppfinnere har fremstilt DNA fragmenter som koder for et polypeptid med samme aminosyresekvens til dette humane urin trombomodulin samt andre fragmenter som koder for derivater av polypeptidet, hvor enkelte aminosyrer av aminosyresekvensen var modifisert ved subtitusjon, delesjon, addisjon og lignende, inkorporert de således fremstilte DNA fragmenter i mikroorganismer og celler, gjenvunnet polypeptider uttrykt i vertsorganismen og undersøkt for deres biologiske aktivitet, og har som et resultat lykkes i å erholde nye polypeptider hvorav hver har en trombinbindende egenskap, antikoagulernende aktivitet og trombolytisk aktivitet. Disse nye polypeptider blir nedenfor referert til som "rekombinant human urin trombomodulin (ruTM)".

I det-følgende beskrives foreliggende oppfinnelse i detalj.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt polypeptid erholdt ved genetiske rekombinasjonsteknikker, med lignende aktiviteter som human trombomodulin, såsom antikoagulerende aktivitet og trombolytisk aktivitet, samt et DNA fragment som koder for nevnte polypeptid. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et polypeptid med trombindannende egenskap, antikoagulerende aktivitet og trombolytisk aktivitet som omfatter en aminosyresekvens representert ved den følgende formel. I foreliggende oppfinnelse blir hver aminosyresekvens beskrevet ved å bruke trebokstavskoden ved å starte fra N-terminalen. Aminosyrenummer brukt heri er basert på numrene til det humane trombomodulin rapportert av Suzuki et al. (EMBO Journal, Vol.6, side 1891, 1987) .

Et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens representert av den følgende formel:

I denne formel er Xxen sekvens representert ved den følgende formel:

eller en variasjon derav, hvor et vilkårlig antall eller enkle aminosyrer er fjernet utgående fra dens N-terminal og Y-l er en sekvens representert ved den følgende formel: eller variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle aminosyrer er fjernet, utgående fra dens C-terminal, hvori eventuelt minst én aminosyre av denne sekvens kan ha en sukkerkjede. Ifølge oppfinnelsen fremstilles fortrinnsvis et polypeptid som omfatter ovenfornevnte aminosyresekvens hvor X-l er en sekvens representert ved den følgende formel: og Y1er en sekvens representert av den følgende formel:

hvor z er Val eller Ala,

eller variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle aminosyrer er fjernet ved å starte fra dens N terminal.

Mer foretrukket fremstilles et polypeptid som omfatter ovehTbrnevnte aminosyresekvens hvor Xxer eh sekvens representert ved følgende formel:

og Yxer en sekvens representert av den følgende formel: eller et polypeptid som omfatter ovenfornevnte aminosyresekvens hvor X 1 er en sekvens representert av den følgende formel:

og alle aminosyrer av Yxer fjernet.

I tillegg, i henhold til polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan minst én aminosyre av ovenfornevnte aminosyresekvens ha en sukkerkjede. Uttrykket "sukkerkjede" som brukt heri refererer til et enkelt sukker eller en rett eller forgrenet kjede av et antall sukker som kan være i form av såkalt N-glykosidisk bindingstype eller O-glykosidisk bindingstype. Det er kjent at aktiviteten av trombomodulin endrer seg avhengig av bindingstypen for sukkerkjedene. F.eks. i tilfelle med O-glykosidisk bindingstype av sukkerkjeden har Parkinson, J. F. et al. nylig rapportert at human trombomodulin fremstilt ved hjelp av genetiske manipuleringsteknikker hadde en kondroitinsulfat-lignende sukkerkjede (J. Biol. Chem., Vol. 265, side 12602,1990). Fremstiling av et slikt sukkerkjedeinneholdende polypeptid er også innbefattet i omfanget av foreliggende oppfinnelse.

På grunn av de høye tekniske nivå som er nådd i de senere år, kan en del av den kjemiske struktur til et polypeptid lett bli endret uten å endre dets aktivitet. Følgelig er ethvert polypeptid med en aminosyresekvens som er blitterholdt ved delvis å modifisere ovenfornevnte aminosyresekvens ved substitusjon, delesjon, addisjon eller lignende

også innbefattet i omfanget av foreliggende oppfinnelse.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et DNA-fragment som koder for ovenfornevnte polypeptid. DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter også ethvert fragment med en basesekvens som koder for ovenfornevnte modifiserte polypeptid av polypeptidet ifølge oppfinnelsen avledet ved hjelp av substitusjon, delesjon, addisjon eller lignende.

DNA-fragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ethvert fragment forutsatt at det inneholder en basesekvens som koder for det oppfinneriske polypeptid, men kan fortrinnsvis inneholde en basesekvens representert av den følgende formel. I dette tilfelle er basesekvensen til DNA-fragmentet vist ved å starte fra dets 5' ende. Også i dette tilfelle angir A, G, C og T_henholdsvis deoksyadenylsyre, deoksyguanylsyre, deoksycytidylsyre og tymidylsyre.

I denne formel gjelder at S er G eller C; X2er sekvensene representert ved den følgende formel:

forutsatt at W er T eller A,

eller variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle nukleotider er utelatt i tripletter ved å.starte fra dens 5'ende; og Y2er en sekvens representert ved den føl-gende formel:

forutsatt at Y er T eller C,

eller variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle nukleotider er utelatt.i tripletter ved å starte fra dens.3' ende.

I tillegg til den ovenfornevnte nukleotidsekvens kan DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse ha en passende promoter og en SD-sekvens (eller et passende ribosombindende sete) bundet til sin 5' ende og om nødvendig en basesekvens inneholdende et translasjons-initieringskodon bundet til den 5' ende og en basesekvens inneholdende et avslutningskodon bundet til sin 3' ende.

Mer foretrukket, i basesekvensen av DNA-fragmentet er X2en sekvens representetert ved den følgende formel:

hvor W er T eller A

og Y2er en sekvens representerert den følgende formel:

hvor Y er T eller C,

eller X2er en sekvens representert ved den følgende formel:

hvor W er T eller A,

og enkle baser av Y2er fjernet.

Som det er vel kjent, kan minst ett nukleotid i et gen erstattes med et annet nukleotid i samsvar med det degenerasjonen av kodonet, uten å endre aminosyresekvensen for polypeptidet kodet for av genet. Følgelig kan DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse ha en nukleotid-sekvens avledet fra ovenfornevnte oppfinneriske nukleotidsekvens hvor minst et nukleotid er blitt erstattet med et annet nukleotid i samsvar.med det degenerasjonen av kodonet, spesielt en nukleotidsekvens hvor minst ett nukleotid er blitt erstattet med et annet nukleotid på en slik måte at det resulterende kodon viser høy utnyttel-sesfrekvens i en spesiell vertscelle når polypeptidet fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved å gjøre bruk av genetiske manipuleringsteknikker.

DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles fra en naturlig kilde eller syntetiseres kjemisk. Det følgende beskriver eksempler på slike fremgangsmåter.

Hvis det brukes en naturlig kilde, kan DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse erholdes ved fremstilling av et DNA-fragment som koder for den oppfinneriske nukleotidsekvens ved å bruke naturlige materialer såsom et cDNA-bibliotek fremstilt fra celler eller vev inneholdende trombomodulin mRNA, et kommersielt tilgjengelig cDNA-biblTotek eller et kromosomalt gen, og derpå konvertere det således fremstilte fragment til fragmentet ifølge oppfinnelsen.

I den hensikt å fremstille et cDNA-bibliotek ekstraheres mRNA fra humant vev eller humane celler inneholdende humant trombomodulin mRNA i samsvar med kjente metoder (f.eks. Molecular Cloning, a laboratory manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Deretter fremstilles et enkeltkjedet cDNA ved å bruke det erholdte mRNA som et templat, fulgt av syntese av dobbeltkjedete cDNA fra det enkeltkjedete cDNA (konferer Molecular Cloning, a laboratory manual, angitt ovenfor; Land's metode beskrevet i Nucleic Acid Research, Vol. 9, side 2251-2266, 1981; Okayama-Berg's metode i mol. Cell. Biol., Vol. 2, side 161-170, 1982; og Gubler-Hoffmans metode i Gene, Vol. 25, side 263, 1983). De således erholdte dobbeltkjedete cDNA-fragmenter ligeres i en plasmidvektor såsom pBR322, pUC18 eller lignende eller en fag vektor såsom7gtlO,7gtll.eller lignende og transformeres derpå i E. coli eller lignende for å erholde et DNA-bibliotek.

Når et kromosomalt gen blir brukt som en kilde for DNA, ekstraheres kromosomalt DNA fra humant vev eller humane celler, og det ekstraherte DNA fordøyes med passende restriksjonsenzymer eller ved fysiske metoder og de for-døyde fragmenter ligeres i en plasmid eller fag-vektor og derpå transformeres den resulterende vektor i E. coli eller lignende for å erholde et DNA-bibliotek.

Et DNA-fragment som koder for DNA-sekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse blir så påvist og isolert fra det således erholdte DNA bibliotek. Det vil si, et kodende plasmid eller fag-DNA ifølge foreliggende oppfinnelse påvises på vanlig måte, såsom ved en hybridiseringsmetode (Wallace et al., Nucleic Acid Res., Vol. 9, side 879, 1981) og deretter isoreres nevnte DNA fra de således påvirkede plasmider eller fhager. Et DNA- eller RNA-fragment som er blitt syntetisert på en slik måte at det koder for alt eller en del av aminosyresekvensen av polypeptidet, som beskrevet heri, kan underkastes radioaktiv merking for å erholde en passende probe. Den radioaktive markør kan festes generelt ved å merke DNA-fragmentet eller RNA-fragmentet med<32>P, ved å benytte kinering, kutt-translasjon, tilfeldig priming eller lignende metoder.

Det således isolerte DNA-fragment fra et DNA-bibliotek ved tidligere nevnte prosess kan konverteres til DNA-fragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse på følgende måte. F.eks. blir, som et foretrukket eksempel, det således isolerte DNA fra et DNA-bibliotek fordøyet med restriksjonsenzymer for å erholde ønskede DNA-fragmenter. Adskilt fra dette blir en basesekvens som koder for den N-terminale eller C-terminale region av polypeptidet, såvel som et termineringskodon, et restriksjonsenzym gjenkjennelsessete, et translasjons-initieringskodon og lignende., syntetisert kjemisk ved en metode som vil bli beskrevet nedenfor. Etter å ligere en passende syntetisk linker til de således syntetiserte sekvenser og kodoner, blir de bundet til DNA-fragmentene erholdt ovenfor og derpå satt inn i et plasmid eller en fag-vektor som et DNA-fragment av interesse. Når oligonukleotider syntetiseres kjemisk er det mulig å lage en passende erstatning for nukleotidet.

Polymerasekjedereaksjon (heretter referert til som "PCR") kan også bli brukt som en annen foretrukket metode. Det vil si oligonukleotider med nukleotidsekvenser som koder for N-terminalregion, C-terminalregion og mellomliggende region av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, eller om nødvendig, disse oligonukleotider inneholdende et termineringskodon, passende restriksjonsseter et translasjons-initierings kodon og lignende syntetiseres kjemisk. Ved å bruke de således syntetiserte oligonukleotider som primere, blir"et DNA fragment, isolert fra et bibliotek ved ovenfornevnte metode, underkastet PCR- og DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse erholdt. En passende nukleotid- erstatning kan også bli innført i primerene. Alternativt kan ovenfornevnte DNA-bibliotek underkastes direkte PCR ved å ta i bruk disse primere for å forøke å isolere DNA-fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse, som så blir ligert i et passende plasmid eller fag-vektor. PCR-metoden kan utføres i lys av referanser eller en bok (PCR Protocols, A Guide to methods and applications, Michael A. I. et al., Academic Press, 1990).

I tillegg til de ovenfornevnte metoder kan andre vanlige metoder være tilgjengelige såsom metoden til Kramer W. et al. (Nucleic Acid Res., Vol. 12, side 9441-9465, 1984) og seterettet mutagenese (Methods in Enzymology, Vol. 154, side 350 - 367, 1988).

På den annen side, når det oppfinneriske fragment fremstilles ved kjemisk syntese,. blir en DNA-sekvens av interesse laget, og om nødvendig delt opp i fragmenter med passende lengde og derpå blir tilsvarende oligomer syntetisert kjemisk ved å bruke en fullautomatisert DNA-syntetisator (f.eks. modell 381A fremstilt av Applied Biosystems, Inc). Om nødvendig kan den således erholdte DNA-oligomer bli underkastet fosforylering ved sin DNA 5' ende ved å bruke T4 polynukleotidkinase fulgt av sammenkobling. I tillegg er det, om nødvendig, mulig å ligere det resulterende DNA-fragment i en passende vektor ved å bruke T4 DNA ligase.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter å utføre minst et trinn valgt fra de følgende trinn: a) å fremstille et DNA-fragment inneholdende en '~~nukleotidsekvnes som koder for nevnte "polypeptid, b) å sette nevnte DNA-fragment inn i en ekspresjonsvektor for å erholde et rekombinant DNA-fragment som inneholder nevnte DNA-fragment og som er i stand til å undergå replikasjon,

c) å transformere en vertscelle med nevnte rekombinante DNA-fragment for å isolere en transformant

organisme som kan uttrykke nevnte polypeptid, og

d) dyrke nevnte transformant organisme slik at denne danner nevnte polypeptid, og gjenvinne nevnte polypeptid fra den resulterende dyrkningsblanding.

Et DNA-fragment inneholdende en nukleotidsekvens som koder for det aktuelle polypeptidet kan erholdes på ovenfornevnte måte.

Ethvert vektorsystem kan bli.brukt som ekspresjonsvektor ved denne prosess, forutsatt at det er istand til å undergå replikasjon i den benyttede vertsorganisme, men fortrinnsvis en vektor som inneholder en promoter som er nødvendig for ekspresjonen av polypeptidet i en vert, og om nød-vendig, kan en SD-sekvens (eller en passende ribosombindende region) og/eller en DNA-sekvens som koder for et signalpeptid bli brukt. Alle promoterer, SD sekvenser (eller egnede ribosombindende regioner) og DNA-sekvenser som koder for signalpeptider, og som virker i vertsorganismen, kan bli brukt og kan bli erholdt ved kjemisk syntese eller være avledet fra vertsorganismer som skal benyttes, virus, plasmider, fager og lignende.

Med hensyn til vertscellene som skal brukes for innføringen av det således erholdte rekombinante DNA-fragment, kan passende celler for ekspresjon av polypeptidet bli valgt fra enten eukaryote celler såsom COS-celler, CHO-celler, gjær~~og lignende, eller prokaryote celler såsom E. coli, Bacillus subtilis og lignende, hvorav COS-celler og CHO-celler er spesielt foretrukket. Det er effektivt å bruke en vertsorganisme og en ekspresjonsvektor i en slik kombinasjon at de kan oppvise effektiv ekspresjon av DNA-fragmentet som koder for det aktuelle polypeptid. Foretruk-kede eksempler på kombinasjoner vertsceller med ekspre-sjonsvektorer innbefatter: C0S-7-celler eller CHO-celler med en ekspresjonsvektor inneholdende den tidlige promoter for simian virus 40 (SV40) , med pH /3 APr-neo inneholdende den humane S-actin promoter, eller med en pattedyr ekspresjonsvektor avledet fra pCDL-SR a 296 inneholdende SR a promoteren; og E. coli HB101 med en ekspresjonsvektor inneholdende et DNA-fragment som koder for en tryptofan-promoter og en tryptofan SD-sekvens.

En vert således transformert med en ekspresjonsvektor kan dyrkes på generelt brukte måter for dyrkning av mikroorganismer eller animalske celler, i samsvar med fremgangsmåten beskrevet f.eks. i Seibutsu Kagaku Kogaku (eller Biochemical Engineering; S. Aiba et al., 1976, Tokyo University Press) eller i Soshiki Baiyo (eller Tissue Culture; J. Nakai et al., 1976, Asakura Shoten). Det således fremstilte polypeptid av de transformerte vertsceller gjenvinnes ved å isolere og rense det fra dyrknings-blandingen. Opprensning av polypeptidet kan utføres i lys av forskjellige generelt brukte måter som er blitt beskrevet i mange artikler og bøker, såsom Seikagaku Jikken Koza

(eller Biochemical Experiments; vol. I, Protein Chemistry, 1976, utgitt av The Japanese Biochemical Society, TokyoKagaku Dojin), f.eks. ved å bruke en passende kombinasjon av opprensningsmåter valgt fra dialyse, utsalting, gelfilterering, syreutfelling, ionebyttekromatografi, affinitetskromatografi, høyeffektskromatografi, elektroforese og lignende. Fortrinnsvis kan polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli gjenvunnet fra dyrknings-blandingen og gjøre bruk av minst én metode valgt fra ionéByttekromatografi, affinitetskromatografi hvor trombin blir brukt som ligand og gelkromatografi.

F.eks. blir en dyrkningsblanding inneholdende polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse først underkastet avsalting og konsentrering, f.eks. ved å gjøre bruk av en ultrafiltereringsmembran med en cutoff molekylvekt på 30 000. Derpå justeres den således konsentrerte dyrknngs-blanding til pH 5 til 10, fortrinnsvis pH 7,3 ± 0,2, og behandles ved 50 til 70°C i 5 til 45 minutter fortrinnsvis ved 60 + 5°C i 15 + 5 minutter, for å inaktivere proteaser, og settes deretter på en kolonne pakket med anionbytteresin som er blitt ekvilibrert til pH 5,5 til 7,5, fortrinnsvis pH 6,5 + 0,2. Det således absorberte polypeptid elueres med en bufferoppløsning med en pH verdi på 2 til 4,5, fortrinnsvis pH 4,0 + 0,05. Det resulterende eluat underkastes avsalting og konsentrering ved å bruke en ultrafiltreringsmembran med en cutoff molekylvekt på 3 0 00 0. Etter justering av pH til 7,5 underkastes det således konsentrerte eluat affinitetskolonnekromatografi hvor trombin blir.brukt som ligand, og den resulterende kolonne vaskes med en bufferoppløsing inneholdende 0,05 til 0,3 M NaCl, fortrinnsvis 0,1 ± 0,05 M NaCl, og derpå elueres polypeptidet med et elueringsmiddel inneholdende 0,9 til 0,2 M NaCl, fortrinnsvis 1,0 ± 0,05 M NaCl. Etter avsalting og konsentrering blir det således konsentrerte eluat igjen underkastet affinitets-kolonnekromatografi hvor trombin blir. brukt som ligand, den resulterende kolonne vaskes med bufferoppløsning inneholdende 0,3 til 0, 8 M NaCl, fortrinnsvis 0,7 + 0,1 M NaCl, og derpå blir polypeptidet eluert med et elueringsmiddel inneholdende 0,9 til 2,02 M NaCl, fortrinnsvis 1,0 ± 0,05 M NaCl. Deretter underkastes den således eluerte aktive fraksjon avsalting og konsentrering og derpå gelfiltererings kolonnekromatografi for å erholde en aktiv fraksjon tilsvarende polypeptidet hvorfra det oppfinneriske polypeptid kan erholdes i ren form. Alternativt kan polypeptidet erholdes i ren form ved å underfaste den eluerte fraksjon fra ovenfornevnte affinitetskolonne avsalting og konsentrasjon og derpå påføre den konsentrerte fraksjon SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Det således erholdte polypeptid kan formes til en farmakologisk akseptabel form ved å inaktivere virus via varmebehandling ved 60 + 2°C i 10 timer.

Eksempler på anionbytteresinet som er egnet for bruk i ovenfornevnte opprensningsprosess innbefatter DEAE cellulose, DEAE sefarose, DEAE cellulofin og lignende, mens ovenfornevnte affinitetskolonne, hvor trombin blir brukt som en ligand, kan bli fremstilt ved å binde trombin til et bæremiddel såsom cellulose, agarose, dextran eller lignende ved å bruke cyanogenbromid og derpå behandle det resulterende resin med diisoprpyl-fluorofosfat (DIP), fenylmetan-sulfonyl-fluorid eller lignende. Som et resin for bruk i gelfilterering kan Sephacryl<®>S-200, Sephacryl<®>S-300, Sephadex<®>G-150 eller lignende være effektive.

Ved å anvende fremgangsmåten.beskrevet ovenfor kan polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli erholdt i ren form. Ved bruk av samme fremgangsmåte kan en forskjellig substans med lignende egenskaper også bli erholdt.

Det følgende beskriver virkninger og egenskaper til polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

(Eksperimentelt eksempel 1) Affinitet for trombin (anti-trombinvirkning)

a) Når behandlet kromatografisk ved å bruke DIP-trombinagarose, blir et pKCR-TM-Val-bestående

rekombinant humant urin trombomodulin (heretter angitt som "ruTM-Val") fremstilt i eksempel 3 og et annet rekombinant humant urin trombomodulin (nedenfor referert til som "ruTM-Ala") fremstilt i eksempel 6-2

'"absorberes av trombin med nesten 100 %" nøyaktighet.

b) En 100 fil del av bovin trombinoppløsning (1 U/ml, fremstilt av Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) blandes med 10 0 fil av en oppløsning inneholdende ruTM-Val eller ruTM-Ala, den således blandede oppløsning inkuberes ved 37°C i 3 0 minutter og den resulterende oppløsning blandes med 100 p. 1 av human fibrinogen oppløsning (2 mg/ml, fremstilt av Sigma Chemical Co.) for å måle koaguleringstiden ved å bruke et koagulo-meter (fremstilt av Amelung Co. Ltd.).

Som det fremgår fra disse resultater, har ruTM-Val og ruTM-Ala funksjoner til å binde til trombin og sterkt inhibere den koagulerende aktivitet.

Tabell 2 viser data hentet fra japansk patentsøknad Kokai nr. 62-169728 angående koaguleringstiden målt ved å bruke en trombomodulinlignende substans renset fra human placenta.

I tillegg, ifølge den ovenfor anførte publikasjon, er det en beskrivelse at denne humane placenta trombomodulinlignende substans har to ganger eller enda høyere aktivitet enn det eksisterende humane trombomodulin, noe som fører til den konklusjon at fra sammenligningen av resultatene vist i tabell 1 og 2, har ruTM-Val og ruTM-Ala sterkere trombinaktivitet enn det eksisterende humane trombomodulin.

Eksperimentelt eksempel 2

Protein C-aktiverende egenskap

Protein C-aktiverende egenskap måles ved nærvær av trombin ved å bruke et syntetisk substrat Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (fremstilt av Peptide Research Institute, Protein Research Foundation). Det vil si 60/il av 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 7,5) blandes med 20/il av en10U/ml oppløsning bovin trombin (fremstilt av Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), 10/il av. en oppløsning inneholdende ruTM-Ala erholdt i eksempel 6-2 og en mutasjonstype rekombinant human urin trombomodulin (nedenfor referert til som "DEL 10") hvor 10 aminosyreresiduer er fjernet fra C-terminalen av human urin trombomodulin (0,1 til 10 fig/ ml totalt) og10 fil av 500 fig/ ml oppløsning av human protein C (American Diagnostica, Inc.), i denne rekkefølge. Etter inkubering ved 37°C i 30 minutter blandes den resulterende reaksjonsblanding med 150 fil av en blanding inneholdende samme volum av 1 U/ml human antitrombin (fremstilt av The Green Cross Corporation) og 10 U/ml heparin (fremstilt av Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), fulgt av ytterligere inkubering ved 37°C i 15 minutter. Derpå blandes den resulterende reaksjonsblanding med 250 fil av 0,1 mM oppløsning av ovenf ornevnte syntetiske substrat og inkuberes ved 37°C i 10 minutter for å av-slutte reaksjonen, som så blir stoppet ved tilsetning av 500 fil av 20% eddiksyreoppløsning. Deretter blir reaksjons-blahcTingen utsatt for måling av fluorescens"styrken ved å bruke et fluorofotometer (Hitachi, Ltd.) ved en eksita-sjonsbølgelengde på 3 80 nm og en emisjonbølgelengde på 4 60 nm. I dette tilfelle ble human placenta trombomodulin renset fra human placenta i samsvar med fremgangsmåten vist i referanseeksempelet brukt som en positiv kontroll. Som vist i tabell 3, er protein C-aktiverende egenskaper av ruTM-Ala og DEL 10 utregnet fra fluorescensstyrken markert høyere i nærvær av trombin sammenlignet med den for human placenta trombomodulin.

(Eksperimentelt eksempel 3)

Antikoagulernde aktivitet

En 100 fil del av eddiksyre tilsatt blodplatefattig plasma-prøve erholdt fra en frisk person blandes med10 fil av en oppløsning inneholdende ruTM-Val eller ruTM-Ala (10-100 /zg/ml) , og den således fremstilte blanding inkuberes ved 3 7°C i to minutter og derpå blandes reaksjonsoppløsningen med 100 fil av human trombin (fremstilt av the Green Cross Corporation, 2 U/ml) for å måle koaguleringstiden og å finne sterk virkning av ruTM-Val og ruTM-Ala til å forlenge blodkoaguleringstiden.

(Eksperimentelt eksempel 4)

Akutt toksisitet i mus

Når ruTM-Val eller ruTM-Ala tilføres ved intravenøs injeksjon til 5 individer av ddY hannmus og observert i 7 dager, ble-ingen tilfeller av signifikant toksisitet eller død funnet innen den effektive dose.

(Eksperimentelt eksempel 5)

Oppløselighet

Ved romtemperatur, oppløses ruTM-Val og ruTM-Ala i destillert vann til en konsentrasjon på minst 3 0 mg/ml.

I tillegg, når det tilføres intravenøst in vivo, viser den vannoppløslige ruTM utmerket DIC forbedrede funksjon sammenlignet med det dårlig oppløselige placenta trombomodulin som har fosfolipidbindende egenskap.

Således, siden polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har sterk trombomodulinbindende egenskap, antikoagulerende aktivitet og trombolytisk aktivitet og har lav toksisitet, som det fremgår av foregående beskrivelse og forsøk, kan polypeptidet bli brukt effektivt for forebygging og behandling av hyper-koaguabilitets-relaterte sykdommer såsom DIC, forskjeJLlige typer trombose, perifere åreknuter, myokardial infarkt, cerebralt infarkt, transient cerebralt ischemisk angrep, gestasjonell toksikose, hepa-tisk insuffisiens, renal insufficiens og lignende.

Polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dannet til farmasøytiske preparater, fortrinnsvis injeksjoner som er egnet for bruk som effektiv tilførsel til pasienter, ved å blande det med passende bæremiddel eller medium, såsom sterilt vann, fysiologisk saltvann, en planteolje, et ikke toksisk organisk oppløsningsmiddel elle<r>" lignende som generelt brukes som medikamenter, og om nødvendig ytterligere med et fyllmateriale, et fargemiddel, et emulgeringsmiddel, et suspensjonsmiddel, en stabili-sator, et konserveringsmiddel eller lignende. Når polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse blir brukt som injeksjon kan det tilføres til hver pasient på én gang, eller kontinuerlig ved å oppdele den daglige dose i 1 til 6 gangar. Daglig dose av polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i området fra 0,05 til 500 mg potensitet, fortrinnsvis fra 0,1 til 10 mg potensitet som en utregnet verdi i forhold til potensiteten i kaninlunge trombomodulin, selv om dosen kan bli passende endret, avhengig av hver pasients alder, vekt, symptomer og lignende.

I tillegg kan polypeptidet fresmtilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli brukt ved å finne eller absorbere det til overflaten av medisinske innretninger såsom kunstige blodkar, kunstige organer, kateter og lignende ved å gjøre bruk av et fornettningsmiddel eller lignende. Ved en slik behandling kan blodkoagulering på overflaten av medisinske innretninger forhindres.

Beste form for utføring av oppfinnelsen

Eksempler på foreliggende oppfinnelse angitt nedenfor som illustrasjon og ikke som begrensning. Forkortelser brukt heri er basert på idiomatiske uttrykk som brukes i dette fagområdet.

Forsøk relatert til genetiske DNA'er i

kombinasjonsteknikker blir utført med mindre annet er angitt i lys av bøker innbefattende "Maniatis T. et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982" og "S. Kobayashi, Hanbook for Gene Manipulation Experiments, JATEC Publishers, 1985" og instruksjoner medfølgende inn-kjøpte reagenser og anordninger. I tillegg, med mindre annet er angitt, ble restriksjonsenzymer brukt i de følgende forsøk kjøpt fra Takara Shuzo Co., Ltd. eller fra New England Biolabs, Inc.

En høy ruTM-Ala uttrykkende stamme, TMM-B1C, brukt i de følgende eksempler, er blitt deponert den 25. juni 1991, hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, og er blitt gitt betegnelsen FERM BP-3463.

EKSEMPEL 1

Kloning av trombomodulin cDNA og konstruksjon av ekspresjonsplasmid

1) Kloning av trombomodulin cDNA

Oligonukleotidproben vist i figur 1. ble fremstilt ved å bruke en DNA-syntetisator (allerede nevnt) basert på en aminosyresekvens,

Glu-His-Asp-Cys-Phe-Ala,

som er en del av den N-terminale aminosyresekvens av human urin trombomodulin isolert og renset fra human urin. Det således syntetiserte oligonukleotid ble renset ved å bruke OPC kolonne (Applied Biosystems, Inc.) og dets 5' ende ble merket ved å bruke T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) og (7-<32>p) ATP (Amersham) . Derpå ble den resulterende reaksjonsoppløsning satt på Sephadex G-25 kolonne (Pharmacia) for å adskille den merkede oligo-nukleotidprobe fra (7-<32>P) ATP for bruk i den følgende prosedyre som en probe.

Total RNA ble fremstilt fra en omkring 20 g del av human placenta ved hjelp av guanidin-isotiacyanat-ekstraksjon. 10 mg av det således ekstraherte totale RNA ble underkastet 2 ganger oligo (dT)- cellulosekromatografi (type 7, Pharmacia) for å erholde omkring 90/xg renset poly A<+>RNA, fulgt av cDNA-konstruksjon ved å bruke det således erholdte poly A<+>RNA. Det vil si dobbeltkjedet cDNA fremstilt (ved å bruke et cDNA syntetiseringssystem, Amersham) fra 2 0 ixg av poly~A<+>RNA ved å bruke oligo dT som en primer ved metoden til Gubler og Hoffman (Gubler, U. og Hoffman, G.J., Gene, Vol. 25, side 263, 1983). Det således fremstilte cDNA ble underkastet metylering ved å bruke EcoRI metylase og derpå ble EcoRI-linkere tilsluttet. Etter fordøying med EcoRI, ble fri linker og DNA fragmenter mindre enn 500 bp fjernet ved gelfilterering (BioGel A50m, Bio-Rad Laboratories). Det resuTterende DNA-fragment ble ligert i en fag vektor X gtll (Amersham) for å fremstille et cDNA bibliotek med en effek-tivitet på omkring 90% og inneholdende omkring 2 x IO<6>uavhengige kloner. Fag-partikler i det således fremstilte X gtll bibliotek ble utsådd på E. coli stammer Y1090 som vertscelle på vanlig måte med en slik inoculum størrelse at plakker ble dannet på omkring5x IO<3>med en diameter på 9 cm. De således dannede plakker ble overført på nylonfiltere (Hybond-N, Amersham), og de resulterende filtere ble plassert på filtererpapir gjennomtrukket med 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH oppløsning i 5 minutter og derpå med 1,5 M NaCl/0,5 M Tirs-HCl buffer (pH 8,0) i 5 minutter for å denaturere DNA. Derpå ble de således behandlede nylonfiltere vasket med 0,3 6 M NaCl/2 0 mM natriumfosfat (pH 7,4)/2 mM EDTA (pH 7,4) oppløsning og derpå lufttørket. Etter fiksering av DNA på filterne med ultrafiolett bestrålning ble de resulterende filtere vasket med en 0,1% SDS/x 0,1 SSC oppløsning (SSC: x1konsentrasjon; 150 mM NaCl/15 mM natriumsulfat pH 7,0) ved 65°C i 1 time. De således DNA fikserte filtere ble underkastet prehybridisering, ved 65°C i 6 til 24 timer i en oppløsning på 6 x SSC/50 mM natriumsulf atbuf f er (pH 6, 8)/ x.1Denhardt oppløsning/100/x g/ml denaturert laksesæd DNA fulgt av hybridisering over natten ved 37°C i samme opp-løsning supplementert med omkring 10<6>cpm/ml av det tidligere nevnte 5' endemerkete oligonukleotid. Filtrene ble vasket med 6 x SSC i 5 til 30 minutter ved 4°C, 37°C og 42°C i denne rekkefølge, lufttørket og derpå underkastet autoradiografi.

Ved å undersøke omkring 3 x IO<6>plakker via ovenfornevnte prosedyre ble et totale på 23 kloner som viste positiv reaksjon med proben isolert. Etter å underkaste hver av de således isolerte fag-kloner plakkdannelse, ble ovenfornevnte hybridiseringsprosedyre gjentatt for å erholde 9 kloner som igjen viste det positive signal og hvorfra fag DNA prøver ble samlet opp. Når fordøyet med et restriksjonsenzym, EcoRI, ble omkring 0,7 til 2,5 kb innsatt DNA funnet i X gtll. Et restriksjonskart av det største 2,5 kb innsatt DNA er vist i figur 2. To fragmenter erholdt ved spaltning ved EcoRI og Pstl av det 2,5 kb innsatte DNA ble isolert og subklonet i en M13 fag, mpl8 eller mpl9, mellom EcoRI og Pstl kloningssetene på vanlig måte for å fremstille enkeltkjedet fag-DNA og ble sekvensert med en DNA-sekvensator (370A, Applied Biosystems, Inc.). Ut fra dette ble en sekvens tilsvarende den N-terminale sekvens av human trombomodulin funnet i en aminosyresekvens avledet fra nukleotidsekvensen av et EcoRI/Pstl DNA fragment, på omkring 0,4 kb, noe som bekreftet at det klonede cDNA er av human urin trombomodulin. Figur 3a til 3m viser resultater av nukleotidsekvensen av 2,5 kb DNA fragmentet. (2) Konstruksjon av rekombinant human urin trombomodulinekspresjonsvektor

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid for bruk i pattedyrceller (fig. 4(a) - fig. 4(b))

Det- 2,5 kb trombomodulin cDNA ble fordøyet med EcoRI og underkasteet agarosegelelektroforese og DNA-fragmenter isolert fra gelen ble subklonet i plasmid pUC118.

Plasmid DNA således fremstilt ble fordøyet med EcoRI og derpå ble de 3' innliggende terminaler fylt ved å bruke T4 DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.). BamHI-linkerne (Takara Schuzo Co., Ltd.) ble koblet til de buttendede terminaler ved å bruke et ligeringskit (Takara Shuzo Co., Ltd.), og det resulterende DNA-fragment ble dobbeltfordøyet med BamHI og Kpnl fulgt av elektroforese for å isolere et DNA-fragment på omkring 1,5 kb fra gelen.

To syntetiske oligonukleotidlinkere (hver linker ble fremstilt fra et sett på en 49 mer og en 53 mer komple-mentært oligonukleotid) som vist i fig. 5(a) ble erholdt ved å bruke den tidligere nevnte DNA-syntetisator, idet hver linker startet fra Kpnl-setet av det"humane urin trombomodulin cDNA som koder for en C-terminal aminosyresekvens (Leu-Ala-Arg) av human urin trombomodulin og slutter like etter terminalsekvensen med et terminalkodon og BamHI-sete. I dette tilfellet ble opprenskning av hvert enkeltkjedet oligonukleotid utført ved å bruke revers fase HPLC (C8 kolonne, AQUAPORE RP-30, Applied Biosystems, Inc.). 49 mer oligonukleotidet ble underkastet 5'-endefosforylering ved å bruke T4-polynukleotidkinase (nevnt ovenfor) og derpå koblet til 53 mer oligonukleotidet.

Deretter ble linkeren ligert med et på forhånd fremstilt BamHI/Kpnl-fragment på omkring 1,5 kb trombomodulin cDNA (nevnt ovenfor) og fordøyet med BamHI og deretter ble de fordøyede DNA-fragmenter underkastet agarosegelelektroforese for å isolere et 1,6 Kb DNA-fragment. På den annen side ble en ekspresjonsvektor i pattedyrceller, pKCR (0'Hara, K. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 78, s. 1527, 1981) fordøyet med BamHI og derpå behandlet med en fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for å erholde et lineært DNA-fragment som derpå blir underkastet ligering (beskrevet ovenfor) med 1,6 kb DNA-fragmentet for å fremstille human urin trombomodulinekspresjonsplasmider, pKCR-TM-Ala og pKCR-TM-Val, i pattedyrceller.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid i E. coli (fig. 6(a) - fig. 6(b))

Hvert av de ovenfornevnte plasmider, pKCR-TM-Ala og pKCR-TM-Val, ble dobbeltfordøyet med BamHI og Smal, og det resulterende 1,3 kb DNA-fragment ble isolert ved agarosegelelektroforese. Derpå ble en oligonukleo-tidlinker bestående av 6 9 mer og 67 mer syntetiske oligonukleotider som vist i fig. 5(b) fremstilt på samme måte som beskrevet ovenfor. 67 mer oligonukleotidet ble underkastet fosforylering ved å bruke en nukleotidkinase og'"derpå koblet sammen med 69 mer oligonukleotidet, og den resulterende linker ble ligert med det tidligere nevnte 1,3 kb DNA-fragment, og ble dobbeltfordøyet med

Smal og BamHI. På den annen side ble plasmid pM450

(Kanamori, T. et al., Gene, Vol. 66, s.295 - 300, 1988)

dobbeltfordøyet med BamHI og Ndel, og ble underkastet agarosegelelektroforese for å isolere et DNA-fragment på omkring 3,2 kb. Det således fremstilte 3,2 kb DNA-fragment ble ligert med hver av de to linker-forbundne trombomodulin cDNA-fragmenter erholdt ovenfor for å fremstille plasmidene pM450-TM-Ala og pM450-TM-Val for ekspresjon av rekombinant human urin trombomodulin i E. coli.

Eksempel 2

Kloning av trombomodulin cDNA og konstruksjon av ekspre-sj onsplasmid

(1) Kloning av trombomodulin cDNA

Et .enkeltkjedet cDNA ble fremstilt fra 10/xg av poly A<+>RNA avledet fra human placenta erholdt i eksempel 1- (1) ved å bruke en oligo dT primer og en revers transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) som vanlig.

Adskilt fra dette ble et totale på 6 oligonukleotider (fig. 7) fremstilt ved å bruke en DNA-syntetisator (nevnt ovenfor), hvorav hver som tilsvarte nukleotidsekvensen kodet for en del av det humane urin trombomodulin cDNA-fragment erholdt i eksempel 1- (1), med sin 5'-ende med et"gjenkjennelsessete for et restriksjonsenzym valgt fra Sal-I, BamHI, EcoRI, Hindlll eller Pstl. I dette tilfelle tilsvarer hver av Sl, S2 og Se oligonukleotidene til en del av "+"-kjeden av det humane urin trombomodulin, mens hver av Al-, A2- og A3-oligonukleotidene tilsvarer en del av "-"-kjeden. Også i dette tilfellet ble Xhol-setet innført i S3-oligonukleotiden ved hjelp av stum mutasjon. Og~s"å A3-oligonukleotiden inneholder en DNA-sekvens som tilsvarer et termineringskodon. De således syntetiserte trombomodulin-spesifikke oligonukleotidprimere ble renset

ved å bruke OPC-kolonne (nevnt ovenfor).

Derpå ble PCR utført ved å bruke det enkeltkjedede cDNA som et templat og de kjemisk syntetiserte oligonukleotider som primere for å erholde human urin trombomodulin cDNA ved å dele det opp i tre deler. Dvs. 100/il av en reaksjonsoppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 8,3)/50 mM KCl/1,5 mM MgCl2/0,01% gelatinoppløsning inneholdende omkring 50 ng av det enkeltkjedede cDNA, 0,8/tg av hver primer (Sl og Al) og 2,5 enheter av en termo-stabil DNA-polymerase (Perkin-Elmer Cetus) ble påført en termisk cyklisator (Perkin-Elmer Cetus) og PCR ble utført under betingelser av: sammenkobling 55°C i 2 min.; syntese av komplementærkjede 72°C i 3 min., termisk dena-turering 94°C i 1 min.; og syklusantall 30. Etter opprensning ved fenolkloroformekstraksjon og etanolut-felling ble amplifisert DNA-fragment I med en størrelse på omkring 450 bp erholdt. PCR-prosedyren ble gjentatt på samme måte, bortsett fra at S2 og A2 eller S3 og A3 ble brukt som primere for å erholde DNA-fragment II på omkring 650 bp og DNA-fragment III på omkring 3 50 bp. De således fremstilte fragmenter I, II og III ble fordøyet med hhv. SalI/BamHI, Hindlll/Scal og PstI/BamHI og subklonet i pUC118 på vanlig måte for å erholde pUC118-FI, pUC118-FII og pUC118-FIII.

De tre DNA-fragmenter av det humane urin trombomodulin cDNA således erholdt ved PCR ble satt sammen med hver-andre på følgende måte for å konstruere et cDNA-fragment som koder for et signalpeptid og hele det ferdigutviklede protein supplementert med avslutningskodon ved dets 3'-ende.

Først ble pUC118-FI fordøyet med HindiII og BamHI, og de fordøyede produkter ble underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere et DNA-fragment med en størrelse på omkring 450 bp. Det således isolerte DNA- fragment ble videre fordøyet med Ddel og det fordøyede materialet ble underkastet opprenskning for å isolere et DNA-fragment, Fl, med klebrige ender av HindiII og Ddel ved sin 5'- og 3'-ende. På samme måte ble et annet DNA-fragment, Fil, som har en størrelse på omrking 650 bp med klebrige ender av Ddel og Sali ved sin 5'-ende og 3'-ende, erholdt ved å underkaste pUC118-FII fordøying med Hindlll og Sali, separasjon av det resulterende fordøyede materialet, fordøying med Ddel og opprensning av fragmentet av interesse. Såvel som enda et annet DNA-fragment, FIII, som har en størrelse på omkring 3 50 bp med klebrig ende av Xhol og EcoRI ved sin 5'-ende og 3'-ende, ble også erholdt ved å underkaste pUC118-FIII fordøying med Xhol og EcoRI, separasjon av det resulterende for-døyede materialet og opprenskning av fragmentet av interesse. Dernest ble fragmentene Fl, Fil og FIII ligert i Hindlll/EcoRI kloningssete av pUC118 for å erholde et plasmid pUC-TM. (Konstruksjonsprosessen er vist i fig. 8). cDNA-et av interesse ble subklonet på vanlig måte i M13 fag, mpl8 eller mpl9, enkeltkjedet DNA-fragment ble fremstilt for å bestemme oligonukleotidsekvensen av en DNA-sekvensator (nevnt ovenfor), det ble bekreftet at dette cDNA kodet for det humane urin trombomodulin. Resultatene av nukleotidsekvensbestemmelsen er vist i fig. 9(a) - fig. 9(b). (2) Konstruksjon av rekombinant human urin-trombo-modulinekspresj onsvektor

Plasmidet pUC-TM inneholdende human urin trombomodulin cDNA fremstilt i eksempel 2- (1) ble fordøyet med Sali og BamHI, og et DNA-fragment på omkring 1,4 Kb ble isolert og renset på vanlig måte ved å bruke agarosegelelektroforese. Det således fremstilte fragment ble satt inn i et SaTi-BamHI kloningssete av en ekspresjonsvektor for pattedyrceller pH £ APr-l-neo (P. Gunning et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 84, s. 4831, 1987), for å konstruere en vektor LK444-TM for ekspresjon av rekombinant trombomodulin. Dernest ble et plasmid pAdD2 6SV (A)

(R. J. Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 13 04, 1982) som inneholder et gen som koder for dihydrofolat reduktase (heretter referert til som "DHFR") fordøyet med Bgll, og de tilbaketrukne terminaler ble fylt ved å bruke T4 DNA polymerase (nevnt ovenfor), og fragmentet ble fordøyet med EcoRI og derpå underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere og rense et DNA-fragment på omkring 3 Kb inneholdende DHFR-genet. Dernest ble ekspresjonsvektoren LK444-TM erholdt ovenfor fordøyet med Aatll og de tilbaketrukne terminaler ble fylt ved å bruke T4 DNA-polymerase (nevnt ovenfor), og fragmentet ble fordøyet med EcoRI og derpå underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere og rense et DNA-fragment på omkring 9 kb. Deretter ble det således fremstilte DNA-fragment ligert med det på forhånd fremstilte DHFR gen-inneholdende DNA-fragment på vanlig måte for å konstruere LK444-TM-DHFR. (fig. 10a) -fig. 10(b)) .

Dernest ble pUC-TM fordøyet med Sali og EcoRI, og underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere og rense et DNA-fragment med en lengde på omrking 1,4 kb. Sammen med en Pstl-Sall-linker (5'-TCGATGCA-3') som har blitt fremstilt med en DNA-syntetisator (nevnt ovenfor) og renset på en OPC-kolonne (nevnt ovenfor), ble det således erholdte DNA-fragment ligert i et Pstl/EcoRI-kloningssete av en ekspresjonsvektor for pattedyrceller, pCDL- SR a 296 (Y. Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, s.466, 1988), for å konstruere en human urin trombomodulinekspresjonsvektor, pCDSR a-TM. Dernest ble den således konstruerte vektor fordøyet med Sali og Clal, de tilbaketrukne ender ble fylt ved å bruke T4 DNA-polymerase" (nevnt ovenfor) og derpå underkastet agarosegel-elektrof orese på vanlig måte for å isolere og rense et DNA-fragment inneholdende det humane urin trombomodulin cDNA. På den annen side ble den tidligere nevnte LK444 - TM - DHFR fordøyet med EcoRI og Ndel, de tilbaketrukne ender ble fylt ved å bruke T4 DNA-polymerase (nevnt ovenfor) og derpå underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere et renset DNA-fragment inneholdende DHFR-genet. Deretter ble det således fremstilte DNA-fragment ligert med det på forhånd fremstilte DNA-fragment inneholdende det humane urin trombomodulin cDNA på vanlig måte for å konstruere pCDSR a-TM-DHFR. (fig. 11(a) - fig. 11(b)).

Eksempel 3

Ekspresjon av trombomodulin

Hver av plasmidene pKCR-TM-Ala og pKCR-TM-Val fremstilt i eksempel 1 ble overført til C0S-7-celler 8ATCC nr. CRL1651) ved hjelp av DEAE-.dekstranmetoden for å uttrykke rekombinant trombomodulin. Dvs. semikonfluente C0S-7-celler fremstilt på forhånd ble transfektert med plasmid DNA i et forhold på omkring 1/ig DNA pr. omkring 2 x 10s celler i samsvar med metoden til Lauren et al. (Lauren, M., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 78, s. 7575, 1981). De således behandlede celler ble dyrket i 3 dager ved å bruke Dulbecco's modifisert Eagles medium (heretter referert til som "D-ME medium") som har blitt supplementert med 0,01% albumin, fulgt av gjenvinning av kul-tursupern.atanten for å erholde en grov rekombinant human urin trombomodulinoppløsning. Transfeksjon ble utført på samme måte og en 10 liter del av det resulterende kultur-filtratet ble underkastet avsalting og konsentrasjon ved å ta i bruk en ultrafiltreringsmembran med 30.000 molekylærvektscutoff.

Etter justering til pH 7,3 ble det konsentrerte kultur-fi'Itrat behandlet ved 60°C i 15 min. Den resulterende prøve ble satt på en kolonne pakket med 3 00 ml DEAE-cellulose (Whatman) som hadde blitt ekvilibrert med fosfatbuffer på forhånd, kolonnen ble vasket med 750 ml av samme buffer brukt for ekvilibreringen, og den således adsorberte aktive fraksjon ble eluert med acetatbuffer (pH 4,0).

Eluatet ble konsentrert ved å bruke en ultrafiltreringsmembran med cutoffmolekylærvekt på 30.000, justert til pH 7,5 med 2 M NaOH og derpå påført en 2,5 ml DIP-trombin-agarosekolonne som hadde blitt ekvilibrert med 0,02 M Tris-HCl buffer (pH 7,5) inneholdende 0,1 M NaCl, 1 mM benzamidinhydroklorid og 0,5 mM CaCl2for derved å adsorbere den aktive fraksjon. Dernest ble kolonnen vasket med 25 ml av samme buffer brukt for ekvilibreringen og den aktive fraksjon ble så eluert med 0,02 M Tris-HCl buffer (pH 7,5) inneholdende 1 M NaCl, 1 mM benzamidinhydroklorid og 0,5 mM EDTA. Eluatet ble dialysert mot samme buffer som brukt ved ekvilibreringen og derpå underkastet opprenskning ved hjelp av DlP-trombin-agarosekolonnekromatografi på samme måte som beskrevet ovenfor.

Det resulterende eluat ble konsentrert ved å bruke en ultrafiltreringsmembran med cutoff molekylvekt på 30.000 og derpå underkastet gelfiltrering ved å bruke en kolonne pakket med 500 ml Sephacryl<®>S-3 00 (Pharmacia Fine Chemicals) som har blitt ekvilibrert på forhånd med 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,14 M NaCl, for derved å gjenvinne den aktive fraksjon av interesse.

Ved å utføre den ovenfor beskrevne fremstillingsprosess ble omkring 0,5 mg renset rekombinant human urintrombomodulin erholdt fra hver av kulturfiltratene som stammet fra pKCR-TM-Ala og pKCR-TM-Val. Hver av de således ren-sede rekombinante human urintrombomoduliner viste et enkelt bånd på ikke-redusert SDS-PAGE. Når de ble under-søkt viste begge høye aktiviteter.

Etter å underkaste 3 00 /zg av hver av polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse reduktiv karboksy-metylering i samsvar med metoden til C. H. Hirs et al.

(Methods in Enzymol., vol. 11, s. 199, 1967) og derpå avsalting, ble N-terminale aminosyresekvenser av de således behandlede prøver bestemt ved å bruke gassfase-proteinsekvensator (Applied Biosystems, Inc., modell 4 70A), og deres C-terminale aminosyresekvenser ble analysert ved hjelp av karboksypeptidasemetoden (Biochem. Biophys. Acta, vol. 397, s. 443, 1975). Som resultater av dette stemte de N-terminale og C-terminale aminosyresekvenser av disse to polypeptider med de til 72 K human urintrombomodulin. Med andre ord var aminosyresekvensen til polypeptidet erholdt fra det pKCR-TM-ala-stammende kulturfiltrat

og aminosyresekvensen av polypeptidet erholdt fra det pKCR-TM-Val-stammende kulturfiltrat var som følger

Eksempel 4

Ekspresjon av human urintrombomodulin

Plasmidet pCDSR a-TM-DHFR konstruert i eksempel 2 ble transfektert i CHO-celler ved hjelp av elektroporering (metoden angitt av D. Zerbib et al., i Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 129, s. 611, 1985, ble lett modifisert) på følgende måte for å uttrykke rekombinant human urintrombomodulin.

Dvs. CHO DXB11 celler (Urlaub, G. og Chasin, L. A., Proe.

Nati. Acad. Sei., vol. 77, s. 4216, 1980) ble dyrket ved 37°C i 2 dager i 5% C02-95% luft ved å bruke Ham's F12 (Flow Laboratories, Inc.) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Nippon Bio-Supply Center Co., Ltd.) (heretter referert til som "medium-1 ") dispergert ved trypsin-EDTA-behandling og derpå suspendert i 50 ml ferskt medium-1. Den således fremstilte cellesuspensjon ble sentrifugert ved 1.000 r.p.m. i 5 min. ved å bruke en avkjølt sentrifuge (Kokusan Enshiki Co., Ltd.). Etter å ha kastet supernatanten ble de resulterende celler suspendert i 50 ml av en sukrose-inneholdende fosfatbuffer (540 mM sukrose/7,0 mM natriumdihydrogenfosfat 12 H20/4,2 mM magnesiumklorid, pH 7,4) og sentrifugert ved 1,000 r.p.m. i 5 min. Etter å ha gjentatt de ovenfornevnte suspensjonstrinn i den sukroseinneholdende fosfatbuffer og påfølgende sentrifugeringstrinn, ble de resulterende celler suspendert i den sukrose-inneholdende fosfatbuffer til. jen tetthet på 1 x IO<7>celler/ml, og 0,4 ml av den således fremstilte cellesuspensjon ble overført i en kuvette for en elektroporeringsapparatur, Gene Pulser TM (BIO-RAD). Til kuvetten ble det ytterligere tilsatt 0,4 ml av plasmid pCDSR a-TM-DHFR som har blitt fremstilt ved en konsentrasjon på 50/xg/ml av den sukrose-inneholdende fosfatbuffer. Den resulterende blanding i kuvetten ble tillatt å stå i 15 min. i et isbad og derpå underkastet elektroporering ved å bruke Gene Pulser. Deretter ble de således behandlede celler i kuvetten tillatt å stå i 10 min~i et isbad og ble derpå dannet til en cellesuspensjon på1x 10<4>celler/ml ved å bruke medium-1. 10 ml av den således fremstilte cellesuspensjon ble overført i en dyrkningsskål på 10 cm i diameter og dyrket ved 37°C i 5% C02-95% luft. To dager etter dyrkningen ble medium i dyrkningsskålen fjernet og kulturen ble fortsatt ved å tilføre skålen med 10 ml MEM a (-) (inneholder ingen ribonukleosider eller deoksyribonukleosider, fremstilt av GIBCO) inneholdende 10% av varmeinaktivert og dialysert føtalt bovint serum (nevnt ovenfor) (heretter angitt som "medium-2"). Kulturen ble videreført ved å erstatte medium-2 med et ferskt hver 2. til 4. dag og enkle kolonier bestående av 100 til 200 celler ble isolert etter 16-19 dager av dyrkningen ved hjelp av penicillin-koppmetoden. De oppsamlede celler ble overført til en 96 brønners multiskål (A/S Nunc) og dyrket ved å bruke meidum-2. Hver av de således erholdte kloner, når de vokste til et passende nivå, ble igjen dyrket ved å bytte dyrkningsskålen. I løpet av dyrkningsprosessen ble en del av cellene dyrket i et serumfritt medium og mengden av rekombinant trombomodulin i den resulterende dyrkningssupernatant ble målt på følgende måte for å vurdere rekombinant trombomodulinproduktivitet hos hver klon. Dvs. 3 ml cellesuspensjon justert til 4,2 x 10<4>celler/ml ved å bruke medium-2 ble plassert i en dyrkningsskål på 35 mm i diameter og dyrket ved 37°C i 3 dager i 5% C02- 95% luft.

Dernest, etter fjerning av dyrkningsmediet ble de dyrkede celler vasket med PCS-Tween og dyrket på nytt ved å bruke 3 ml MEM a (-) inneholdende 5 KIU/ml av aprotinin (Repul-son, Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) ved 37°C i 2 dager i 5% C02-95% luft for å måle biologisk aktivitet i den resulterende dyrkningssupernatant. På denne måte, ble en klon som viste en høy aktivitet valgt ut som en høy-ekspresjonsstamme av rekombinant trombomodulin. I tillegg ble den således utvalgte rekombinante trombomodulin høy-ekspresjonsstamme justert til 1 x IO<4>celler pr. ml ved å bruke medium 2 som hadde blitt supplementert med 2 0 nM metotreksat (Lederle Japan) (heretter referert til som "MTX") og10 ml av den således fremstilte cellesuspensjon ble plassert i en dyrkningsskål på 10 cm i diameter og dyrket ved 37°C i 5% C02-95% luft. Således erholdte resi-stente celler ovenfor 20 nM MTX ble underkastet kloning ve.d-å gjøre bruk av penicillin kopp metoden, og rekombinant trombomodulinproduktivitet til hver klon ble vurdert for å velge ut en rekombinant trombomodulin høy-ekspre-sjonsstamme. Ekspresjonskonsentrasjonen av den således utvalgte høy-ekspresjonsstamme, TMM-B1C, var en 1,3 \ l g/ml. Det rekombinante trombomodulin i dyrkningssuper-natanten ble gjenvunnet og renset i henhold til fremgangsmåten fra eksempel 3, og dets N- terminale og C-terminale aminosyresekvenser ble bestemt også i samsvar med fremgangsmåten i eksempel 3. Som resultater ble disse sekvenser som følger bestemt.

Eksempel 5

Ekspresjon i E. coli

E. coli stamme HB101 transformert med plasmidet pM450-TM-Ala eller pM450-TM-Val fremstilt i eksempel 1 ble dyrket over natten i 5 ml L medium inneholdende 100 \ i /ml ampi-cillin (heretter referert til som "Ap"). Det resulterende dyrkningsmedium ble inokulert i 50 volumdeler M9CA medium inneholdende 100 \ l g/ml og 50 /i g/ml tryptofan, og dyrket ved 37°C i ca. 3 timer inntil celleveksten hadde nådd sin sene logaritmiske fase, fulgt av tilsetning av 3 £ idol-akrylsyre (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) til en endelig konsentrasjon på 10/zg/ml og påfølgende dyrkning i3til 5 timer. De således dyrkede celler ble gjenvunnet ved å bruke en sentrifuge (MR-15, Tomy Seiko Co., Ltd.) og vasket med fysiologisk saltvann, og det resulterende presipitat ble suspendert i en 2% natriumdodecylsulfat/l mM EDTA/10 mM Tris-HCl (pH 7,4) oppløsning i en mengde ekvivalent til 1/10 volumdel av dyrkningsmediet for å dispergere cellene, og derpå lysert ved varmebehandling ved 90°C i 5 min. Deretter, ble uløselige materialer i lysatet fjernet med en sentrifuge (nevnt ovenfor) ved 15 000 r.p.m. i 10 min, og den resulterende supernatant ble dialysert mot PBS for å erholde en lysatprøve.

To lysatprøver erholdt på denne måte ble undersøkt for sin reaktivitet med antihuman urin trombomodulinanti-stoff. Det vil si hver brønn av en flatbundet 96 brønners mikrotiterplate (Immulom-600, Greiner, Inc.) ble tilsatt 100/x 1 av antihuman urin trombomodulin antistoff (erholdt ved å sensitivisere en kanin med 72 KDa human urin trombomodulin fremstilt fra urin og ved å rense det resulterende serum med ammoniumsulfatutfelling og DEAE-sefarosekolonne) som hadde blitt justert til en konsentrasjon på 10/x g/ml ved å bruke 0,1 M natriumkarbonat-buffer, pH 9,6. Etter å ha latt dette stå ved 4°C i 16 timer ble de således behandlede brønner vasket 3 ganger med 10 mM fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,05% Tween-20 (BioRad Laboratories, Inc.) (heretter referert til som "PBS-Tween"). Hver av de således behandlede brønner ble tilsatt 3 00/xl av Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) oppløsning som hadde blitt fortynnet fire ganger med vann, inkubert ved 37°C i 1 time for å blokkere ikke-absorbert materiale og derpå vasket 3 ganger med PBS-Tween. Etter tilsetning av 10 0/xl av lysatet og inkubering ved 3 7°C i 1% time, ble hver brønn vasket 3 ganger med PBS-Tween, tilsatt 100/xl av 10/xg/ml biotinbehandlet antihuman urin trombomodulin-anti-stoffoppløsning og derpå inkubert ved 37°C i en time. Etter vask 3 ganger med PBS-Tween ble 100/x 1 av en pepperrot-peroksidase-merket streptoavidin (Zymed Laboratories, Inc.) oppløsning tilsatt og derpå inkubert ved 37°C i 1 time. Etter vask 3 ganger med PBS-Tween ble hver brønn vasket 1 gang med sitratfosfatbuffer, pH 4,0, og derpå tilsatt 200/x 1 av et fargeutviklende middel (ABTS-.

(2,2'-asinobis(3-etylbensyltiazolin-sulfonsyre-diammoni-umsalt) som hadde blitt oppløst til en konsentrasjon på 1 mg/ml i sitratfosfatbuffer, pH 4,0, inneholdende 0,003% hydrogenperoksid. Den fargedannende reaksjon ble fortsatt inntil tilstrekkelig absorbanse ble erholdt og derpå

stoppet ved å tilsette 50/xl av 21 mg/ml hydrogenfluorid-oppløsning til hver brønn. Deretter ble absorbanse ved en bølgelengde på 405 nm målt ved å bruke en mikrotiterplate

avleser.

Som resultater ble fargeutvikling observert i lysatet hos stammen inneholdende pM450-TM-Ala eller pM450, mens ingen fargeutvikling ble observert i et lysat av E. coli stamme HB101 inneholdende plasmid pM450, som er blitt erholdt i

samme dyrknings- og fremstillingsprosedyre.

Eksempel 6

Konstruksjon og ekspresjon av delesjonsmutant (1) konstruksjon av delesjonsmutant ekspresjonsvektor

En vektor for bruk i ekspresjonen av DEL 10 ble konstruert på følgende måte. Oligonukleotider (D5-16U og D5-24L) omfattende 10 mer og 24 mer som vist i figur 12a ble fremstilt ved å bruke en DNA syntetisator (nevnt ovenfor) renset med OPC kolonne (neynt ovenfor), og derpå tilkoblet på vanlig måte for å erholde et DNA fragment med klebrige ender til Kpnl og EcoRI. Dette fragment ble ligert på vanlig måte med et DNA fragment på omkring 4,5 kb fremstilt fra en Kpnl/EcoRI fordøying av pUC-TM erholdt i eksempel 2-(1), for å konstruere plasmid pUC-DEL 10 som koder for humant trombomodulin signalpeptid og DEL 10 supplementert med et terminalkodon ved sin 3' ende. Det således konstruerte plasmid ble fordøyet med EcoRI/Mlul fordøyingene ble underkastet agarosegelelektroforese på vanlig måte for å isolere et DNA fragment på omkring 650 bp og det således isolerte fragment ble ligert på vanlig måte med et DNA fragment på omkring 4,5 kb fremstilt av en EcoRI/MluI fordøying av pCDSR a-TM erholdt i eksempel 2- (2) for å konstruere plasmid pCDSR a-DEL 10 (figur 13a til figur 13b).

På den annen side ble en vektor for bruk ved ekspresjonen av"et mutert rekombinant urin trombomodulin hvor de C terminale 4 9 aminosyrer er fjernet fra det humane trombomodulin (heretter referert til som "DEL 49")

konstruert på følgende måte.

Oligonukleotider (D10-14U og D10-14L) hver omfattende 14 mer som vist i figur 12b ble fremstilt ved å bruke DNA syntetisator (nevnt ovenfor) renset ved å bruke OPC kolonne (nevnt ovenfor), og derpå tilkoblet på vanlig måte for å erholde et DNA-fragment med klebrige ender til en Nhel og EcoRI. Dette fragment ble ligert på vanlig måte med et DNA fragment på 5 kb fremstilt fra en EcoRI/Nhel fordøying av pCDSR a-TM erholdt i eksempel 1-(2) for å konstruere plasmid pCDSR a-DEl49 som inneholder DNA av interesse, (figur 13a til figur 13b)

Ekspresjon i animalske celler

pCDSR a-TM fremstilt i eksempel 2-(2) og pCDSR a-DEL 10 og pCDSR a-DEL 49 fremstilt i eksempel 6-(1) ble satt inn i COS I celler for å uttrykke henholdsvis ruTM-Ala, DEL

10 og DEL 49. Det vil si, 0,5 il g av pCDSR a-TM, pCDSR a-DEL 10 eller pCDSR a-DEL 49 ble oppløst i 5 ti 1 av TE, og den resulterende oppløsning ble blandet med 700/x 1 av D-ME medium inneholdende 0,2 mg/ml av DEAE-dekstran og 50

mM Tris-HCl (pH 7,4) for å fremstille en oppløsning av DNA-DEAE-dekstranblanding. Den således fremstilte DNA-DEAE-dekstranblandingsoppløsning ble tilsatt dråpevis til COS I celler som hadde blitt dyrket til en semikonfluent tilstand til en dyrkningsskål på 35 mm i diameter, og de således behandlede celler ble dyrket ved ved 37°C i 4 timer i nærvær av 5% C02-95% luft. Etter fjerning av DNA-DEAE-dekstranblaningsoppløsningen ble D-ME medium inneholdende 1% fetaltbovinserum (allerede nevnt ovenfor) tilsatt til dyrkningsskålen. Etter dyrkning 37°C i 48 til 96 timer i nærvær av C02-95% luft, ble den resulterende dyrkningssupernatant gjenvunnet og protein C aktiverende egenskap til supernatanten ble målt i henhold til fremgangsmåten i eksperimentelt eksempel 2. Som resultater, ble den biologiske aktivitet funnet i RuTM-Ala og DEL 10, men ikke i tilstrekkelig grad i DEL 49. Resultatene er

vist i tabell 4.

Det følgende beskriver eksempler på farmasøytiske preparater inneholdende polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 7

ruTM-Ala 2 0,0 mg Renset gelatin 50,0 mg Natriumfosfat 34,8 mg Natriumklorid 81,8 mg Mannitol 25,0 mg

Etter oppløsning av de ovenfornevnte komponenter i 10 ml destillert vann for injeksjonsbruk, ble den resulterende oppløsning sterilisert ved filtrering, plassert i 10 ml porsjoner i sterile ampuller og derpå frysetørket for å fremstille injeksjoner.

Eksempel 8

ruTM-Ala 4 0.0 mg Albumin 20.0 mg

Natriumsulfat 34,0 mg Natriumklorid 81,8 mg Mannitol 25,0 mg Etter innveiing av hver av de ovenfornevnte komponenter ble et frysetørket farmasøytisk preparat fremstilt på samme måte som i eksempel 7.

Eksempel 9

DEL 10 20,0 mg Renset gelatin 50,0 mg Natriumfosfat 34,8 mg Natriumklorid 81,8 mg Nannitol 25,0 mg

Etter innveiing av hver av de ovenfornevnte komponenter ble et frysetørket farmasøytisk preparat fremstilt på samme måte som i eksempel 7.

Referanseeksempel

Eksempel på fremstilling av. human placenta trombomodulin

Trombomodulin ble renset fra human placenta i henhold til fremgangsmåten beskrevet i japansk patentsøknad Kokai nr. 60-199819. Det vil si, 12 kg av humane placentalprøver (30 placenta) ble vasket med 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,5, inneholdende 0,25 M sukrose og 1 mM benzamidin, og derpå homogenisert ved å bruke en kjøttkvern. Etter å underkaste den således homogeniserte suspensjon sentri-fugering ved 3.000 rpm i 40 minutter, ble det resulterende presipitat suspendert i den tidligere nevnte bufferoppløsning, omrørt i 10 minutter og derpå sentrifugert for å erholde et presipetat. De ovennevnte trinn ble gjentatt 3 ganger ved å bruke 2 0 liter av buffer-oppløsningen pr. enkel syklus og det endelig erholdte presipitat ble ekstrahert med 60 liter 0,02 m Tris-HCl buffer, pH 7,5, inneholdende 0,25 M sukrose, 1 mM benzamidin-hydroklorid og 0,5% (v/v) Triton X-100 (Sigma CheTnical Co.) . Mengden av totalt protein i den således ekstraherte oppløsning ble funnet å være 46,7 g (bestemt ved Lowry's metode, det samme skal gjelde heretter). 60 liter grovekstraktet ble satt på en DIP-trombinagarose-kolonne (4 diameter x 16 cm) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 0,02 TRis-HCL buffer, pH 7,5, inneholdende 0,1 M NaCl, 0,5 mM CaC12, 0,1 mM benzamidinhydroklorid og 0,5% (v/v) Triton x-10 0, og derpå ble den således prote-inabsorberte kolonne vasket med 2 liter av samme buffer-oppløsning brukt for ekvilibreringen. Derpå ble eluering utført ved å bruke 0,02 m Tris HCL buffer pH 7,5, inneholdende 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM benzamidin-hydroklorid og 0,5% (v/v) Triton x-100. På denne måte, ble 650 ml av eluat inneholdende 1,7 protein erholdt. Eluatet ble underkastet avsalting og oppkonsentrering ved å bruke et ultrafiltreringsapparatur (Millipore Corp., nominell cutoff molekylvekt på 3 0 000) og så absorbert til DIP-trombinagarosekolonnen som hadde blitt ekvilibrert på samme måte som beskrevet ovenfor. Deretter, etter vask med 150 ml av 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,5, inneholdende 0,4 M NaCl, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mM benzamidin-hydroklorid, 0,5% (v/v) Triton x-100, ble eluering utført ved hjelp av tetthets gradient ved å bruke 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,5, inneholdende 0,1 mM EDTA, 1 mM benzamidin-hydroklorid, 0,5% (v/v) Triton x-100 og NaCl (0,4-1 M). Når eluatet ble samlet opp i 30 ml fraksjoner, ble et totale på 1 290 ml fraksjoner av interesse inneholdende 68 mg av protein erholdt. Eluatet ble underkastet avsalting og oppkonsentrering ved å bruke en ultrafiltreringsapparatur (Millopore Corp., nominell cutoff molekylvekt på 30 000) og derpå gelfiltrering for å samle opp en fraksjon av interesse ved å bruke S-300 (Pharmacia) kolonne (2,6 diameter x 90 cm) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 0,01 M Tris-HCl buffer, pH 7,0, inneholdende 0,05% Triton x-100 og 0,14 M NaCl. Det således erholdte humane placenta trombomodulinpreparat inneholdt 3,1 mg protein.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en kurve som viser oligonukleotidsekvensen til en probe som skal brukes ved foreliggende oppfinnelse.

Figur 2 er et restriksjonskart av et 2,4 kb cDNA-fragment inneholdende et DNA-fragment som koder for polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 3a til figur 3m innbefatter en kurve som viser oligonukleotidsekvensen til et 2,5 kb cDNA-fragment inneholdende et DNA fragment som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, samt avledet aminosyresekvens til polypeptidet. Figur 4a og 4b innbefatter en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av ekspresjonsplasmider pKCR-TM-Ala og pKCR-TM-Val ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk i pattedyrceller. Figur 5a og 5b er kurver som viser oligonukleotider brukt for konstruksjonen av plasmidene ifølge foreliggende oppfinnelse . Figur 6a og 6b innbefatter en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av ekspresjonsplasmider pM450-TM-Ala og pM450-TM-Val ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk i E. coli. Figur 7 er en kurve som viser et oligonukleotid brukt for konstruksjonen av plasmidet ifølge foreliggende oppfinnelse . Figur 8 er en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av plasmid pUC-TM inneholdende et DNA-fragment som koder for polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 9a og 9b innbefatter en kurve som viser oligonukleotidsekvensen til et DNA fragment som koder for

polypeptidet ruTM-Ala.

Figur 10a og 10b innbefatter en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av ekspresjonsplasmid LK-444-TM-DHFR ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk i pattedyrceller. Figur lia og 11b innbefatter en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pCDSR a-TM-DEFR i følge foreliggende oppfinnelse for bruk i pattedyrceller. Figur 12 er en kurve som viser oligonukleotider brukt for konstruksjonen av delesjonsmutant ekspresjonsplasmider pCDSR a-DEL 10 og pCDSR a-DEL 49 ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 13a og figur 13b innbefatter en kurve som viser en fremgangsmåte for konstruksjonen av ekspresjonsplasmider pCDSR a-DEL 10 og pCDSR a-DEL 4 9 ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk i pattedyrceller.

Industriell anvendbarhet

Polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse gir en effekt for inhibering både av blodkoagulering og blod- plateaggregering på grunn av sin funksjon og binde til trombin og innaktivere aktiviteten derav samt oppvise på samme tid antikoagulerende og trombolytiske aktiviteter ved aktivering av protein C. På grunn av slike effekter er det mulig å bruke polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i et bredt området av hyper-koagulabilitets-relaterte lidelser basert på dets trombusdannende inhiberende aktivitet, trombolytisk aktivitet, anti-DIC aktivitet og lignende. Spesielt kan reduksjon av bieffekter bli ventet på grunn av dets utmerkede funksjon til å aktivere protein C.

I tillegg har polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse blitt fremstilt for første gang ved hjelp av genetiske manipuleringsteknikker. Følgelig, når det anvendes i en farmasøytisk medisin som et middel for behandling eller forebygging av hyper-koagulablilitets-relaterte lidelser såsom trombose, DIC og lignende, kan sterkere effekt enn tilsvarende materiale ifølge tidligere teknikk, eller lignende effekt med mindre dose bli ventet, og gjør således økonomisk bruk av legemiddelet mulig med mindre fare for å danne bieffekter. I tillegg er det mulig å finne en fullstendig ny effekt, såsom behandling av en sykdom som er vanskelig å helbrede i foreliggende situasjon.

I tillegg kan polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli brukt mer sikkert som et farmasøytisk medikament, fordi det ikke .er nødvendig å bruke et over-flateaktivt middel, som er nødvendig for oppløse-ligheten av human trombomodulin ifølge tidligere teknikk ekstrahert fra placentavev, lunger og lignende.

I tillegg til dets anvendelse ved farmasøytiske medikamenter som beskrevet ovenfor kan polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse også bli brukt for det formål å forhindre blodkoagulering ved å binde og absorbere det til overflaten av et kunstig blodkar, et kunstig organ, et kateter eller lignende ved å ta i bruk et fornetningsmiddel eller lignende.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ved hjelp av genetiske rekombinasjonsteknikker, hvilket polypeptid omfatter en aminosyresekvens representert ved følgende formel:

hvor X-l er en sekvens representert av følgende formel:

eller en variasjon derav hvor et vilkårlig antall eller enkle aminosyrer er utelatt ved å starte fra dets N-terminal, og er en sekvens representert ved den følgende formel:

hvori Z er Val eller Ala eller variasjon derav hvor et vilkårlig antall eller enkle aminosyrer er utelatt ved å starte fra dets C-terminal, hvori eventuelt minst en aminosyre av denne sekvens kan ha en sukkerkjede, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinn valgt blant: a) å fremstille et DNA-fragment inneholdende en nukleotid-sekvéns som koder for dette polypeptid, b) å inkorporere dette DNA-fragment i en ekspresjonsvektor for å erholde et rekombinant DNA-fragment som inneholder dette DNA-fragment og er i stand til å undergå replikasjon, c) å transformere en verts-celle med dette rekombinante DNA-fragment for å isolere en transformant organisme som kan uttrykke nevnte polypeptid, og d) å dyrke denne transformante organisme slik at denne danner nevnte polypeptid og gjenvinne polypeptidet fra den resulterende dyrkningsblanding.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge krav 1 hvor eventuelt minst en aminosyre i nevnte amin-syresekvens kan ha en sukkerkjede, Xxer en aminosyresekvens representert ved formelen:

og Y;ler en aminosyresekvens representert ved formelen:

hvor Z er Val eller Ala, karakterisert vedat det benyttes tilsvarende kodende DNA-sekvenser, vektorer og vertsorganismer.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge krav 1 hvor eventuelt minst én aminosyre i nevnte aminosyresekvens kan ha en sukkerkjede, er en aminosyresekvens representert ved den følgende formel:

og enkle aminosyrer fra Y^er utelatt,karakterisert vedat det benyttes tilsvarende kodende DNA-sekvenser, vektorer og vertsorganismer.

4. Fremgangsmåte ved fremstiling av et polypeptid ifølge kravene 1 til 3 hvor minst én aminosyre av nevnte aminosyresekvens har en sukkerkjede, karakterisert vedat det benyttes tilsvarende kodende DNA-sekvenser, vektorer og vertsorganismer.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge kravene 1 til 3 hvor ingen av aminosyrene i nevnte sekvens har en sukkerkjede, karakterisert vedat det benyttes tilsvarende kodende DNA-sekvenser, vektorer og vertsorganismer.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge kravene 1 til 5, karakterisert vedat vertsorganismen er en eukaryot celle.

7.Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge kravene l til 5, karakterisert vedat vertsorganismen er en prokaryot celle.

8. DNA-fragment, karakterisert vedat det koder for et polypeptid som angitt i kravnene 1 til 5.

9. DNA-fragment ifølge krav 8,karakterisert vedat fragmentet omfatter en nukleotid-sekvens representert ved følgende formel:

hvor S er G eller C; X2er en sekvens representert ved følgende formel:

forutsatt at W er T eller A eller variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle nukleotider er utelatt i tripletter ved å starte fra dens 5'-ende; og Y2er en sekvens representert ved den følgende formel:

forutsatt at Y er T eller C elleT variasjoner derav hvor et vilkårlig antall eller enkle nukleotider er utelatt i tripletter ved å starte fra dens 3<1->ende.

10. DNA-fragment ifølge krav 9,karakterisert vedat X2er en nukleotid-sekvens representert ved den følgende formel:

hvor W er T eller A og Y2er en nukleotidsekvens representert ved den følgende formel:

i hvilket tilfelle Y er T eller C.

11. DNA-fragment ifølge krav 9,karakterisert vedat X2er en nukleotidsekvens representert ved den xølgende formel:

hvor W er T eller A samt hvor alle nukleotider av Y2er utelatt.