JPS63502719A

JPS63502719A - プロモ−タ−系

Info

Publication number: JPS63502719A
Application number: JP50044387A
Authority: JP
Inventors: デ・ヴィリアーズ，ジーン
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1985-12-18
Filing date: 1986-12-12
Publication date: 1988-10-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（９）請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。

（１０）請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。

（１１）請求の範囲第４項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。

（１２）請求の範囲第５項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。

（１３）請求の範囲第６項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。

（１４）請求の範囲第７項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。

（１５）請求の範囲第８項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（１６）請求の範囲第９項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（１７）請求の範囲第１０項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（１８）請求の範囲第１１項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺転子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（１９）請求の範囲第１２項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（２０）請求の範囲第１３項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

（２１）請求の範囲第１４項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。

明　細　書プロモーター系遺伝子工学の、特にここｌＯ学年間わたる進歩はいくっがの場合に異種タンパク質のｉｎ　ｖｔｔｒｏ合成を可能にした。一般に、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、転写プロモーター、転写および翻訳の開始信号、ならびに転写および翻訳の終止信号を含む発現調節配列に上記のヌクレオチド配列が作動可能な状態で連結されたベクターを介して、培養宿主細胞中に導入される。その後、遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、プロモーターの転写制御下に異種タンパク質を発現しうる適当な条件のもとで培養される。

遺伝子発現において転写速度の変化および転写の特異性は重要な現象である。組換えＤＮＡ技術の急速な進歩は、多数の細胞遺伝子およびウィルス遺伝子の徹底分析を容易にした。これらの研究は、真核細胞のポリペプチド産物をコードする遺伝子の場合には転写プロモーター配列が一般にＲＮＡ転写物の開始部位、すなわちキャップ部位、の上流に位置することを明らかにした。“ＴＡＴＡ”ボックスおよび“ＣＡＡＴ”ボックスはそれぞれキャップ部位の約３０ヌクレオチド上流および約８０ヌクレオチド上流に存在する〔コードン（Ｃｏｒｄｅｎ、　Ｊ、）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　：　１４０Ｂ　〜１４１４　（１９８０）およびブレスナーク（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ、　Ｒ，）およびチャンポン（Ｃｈａｍｂｏｎ、　Ｐ、）、　ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　５０　：　３４９〜３８３　（１９８１）を参照されたい〕。真核細胞遺伝子の１１０ｂｐ以上上流に位置する転写モジュレータ−因子は最近になって開示された。サルおよびネズミＤＮＡ腫瘍ウィルス、サルウィルス４０（ＳＶ４０）およびポリオーマウィルス（Ｐｙ）の初期遺伝子の発現にとって必要不可欠なこの種の上流配列はそれぞれ現在一般に“エンハンサ−”と呼ばれる１つのクラスの遺伝子調節因子の原型である。転写エンハンサ−は、単離して種々の遺伝子に連結したとき、鋳型のコピー数を上昇させずに転写を劇的に増大し且つ他の発現調節成分よりも一層離れた距離にわたって通常どの方向にも機能するシス作用性ＤＮＡ配列である〔バナージ（Ｂａｎｅｒｊｌ、　Ｊ）ら、　Ｃｅ１ｌ　２７　：　２９９〜３０ｇ　（１９８１）　、ならびにデビリアーズ（ｄｅＶｉｌｌｌｅｒｓ、　Ｊ、）およびシャフナ−（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｗ、）。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　：　６２５１〜６２６４　（１９８１）を参照されたい〕。それ以来エンハンサ−はヒトおよびネズミのサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ：ボスハート（Ｂｏｓｈａｒｔ、　Ｍ、）ら、Ｃｅ１１４１　：　５２１〜５３０　（１９８５）　：　ｍＣＭＶ　：ドルシューハスラー（Ｄｕｒｓｃｈ　−Ｈａｓｌｅｒ、　Ｋ、）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８２　：８３２５〜８３２９　（１９８５）を参照〕を含めた多くのウィルスゲノムならびに細胞遺伝子において固定された。

数種の真核細胞プロモーター（特に真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ■により確認されたもの）は異種ＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現のために使用され、そしてそれぞれの場合に異なる程度の成功をおさめた。それらにはサルウィルス４ｏおよびポリオーマウィルスの初期遺伝子プロモーター、レトロウィルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）および細胞遺伝子プロモーター（例えばマウスのメタロチオネイン遺伝子プロモーター）のようなプロモーターが含まれる。

ヘルペスウィルス科に属するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）は多くの異なる動物種から単離され、そして科学文献中に記載されている。ＣＭＶのいくつかの菌株はアメリカンψタイプ・カルチャーφコレクション（米国メリーランド州ロックビル）に例えばＡＴＣＣ番号ＶＲ７０６、ＶＲ５３ｇ　、　ＶＲ８０７、ＶＲ５３６およびＶＲ１９４として寄託されている。２つのグループはマウス・サイトメガロウィルス（ｍＣＭＶ；マウス唾液腺ウィルス（スミス株）としても知られる〕ゲノムの分子特性決定ならびにクローニングを報告した〔例えばエベリング（Ｅｂｅｌｉｎｇ。

い〕。

本発明は、ｍＣＭＶ前初期遺伝子の調節配列から誘導されるＤＮＡフラグメントの転写制御下に、異種タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞内に挿入することにより、異種タンパク質の有意に増強されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現レベルを達成する。これらのフラグメントにはウィルスゲノムから単離した約２２７０ｂｐの制限エンドヌクレアーゼフラグメント、このフラグメントの末端切断型、およびこのフラグメントから誘導される転写プロモーター配列と他の転写単位から誘導される調節配列とを組み合わせることによりｉｎ　ＶｌｔｒＯで作製したハイブリッドプロモーターが含まれる。さらに、驚くべきことに、２２７０塩基対フラグメントの末端切断は異種構築物中のプロモーターとしてのそのＤＮＡフラグメントの効力を有意に改良することが見出された。

その上、マウスＣＭＶ前初期プロモーター成分と他の転写単位から単離されたエンハンサ−因子とを組み合わせることによりｔｎ　ｖｉｔｒｏで作製した新規なハイブリッドプロモーターは、天然“野生型”プロモーターフラグメントよりもさらに一層効果的でありうることが判明した。

より詳細には、本発明はマウス・サイトメガロウィルス前初期プロモーターを含むｍＣＭＶゲノムの約２．２７キロ塩基対のＰｓｔＩ制限フラグメントまたはその有効な発現促進フラグメントに作動可能な状態で連結された異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列から成る組換えＤＮＡ分子を提供する。。そのフラグメントは大きいＰｓｔＴフラグメントの１３８７塩基対（ｂｐ）ＨｐａＩ／ＰｓｔＩフラグメントまたは１９６　ｂｐＸ　ｈｏ　Ｉ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｉフラグメントであり得、また表Ｉに示したヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列から成る他の有効な発現促進フラグメントでありうる。

本発明はさらに異種転写調節配列、例えば以下でより詳しく述べるＳＶ４０またはポリオーマウィルスの転写エンハンサ−のような異種エンハンサ−に機能的に連結された上記の組換えＤＮＡ分子から成るハイブリッド転写単位を提供する。

本明細書においてタンパク質またはＤＮＡ配列に対して用いる“異種”なる新語は、自然界に存在するｍＣＭＶのゲノム中に存在しないタンパク質またはＤＮＡ配列を意味する。

本発明はさらに上記の組換えＤＮＡ分子またはハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞、ならびにこの種の宿主細胞を細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法を提供する。

モーターまたはその誘導体を保有する新規ＤＮＡフラグメントを使用すると、ｉｎ　ｖｌｔｒｏ細胞培養系において慣例的なパラメーターが利用可能である。

特に、本発明者はｍＣＭＶゲノムの約２２７０の塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ制限フラグメントおよびその末端切断誘導体ならびにハイブリッド誘導体を使用する。２２７０ｂｐフラグメントはｍ　ＣＭ　Ｖ（スミス株ＡＴＣＣＮ１１ＬＶＲ１９４）ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、続いて慣用技法により消化産物を調製用アガロースゲル電気泳動で分離することにより得られる。そのより短い１３８７ｂｐ誘導体は、ＰＳｔＩフラグメントの唯一のＨｐａＩ部位で切断し、斯く形成された平滑ＤＮＡ末端をベクターＤＮＡの平滑末端に連結することにより発現ベクター内に挿入される（以下の実施例２で詳細に説明する）。そのより短い１９６ｂｐ誘導体は大きいフラグメントのいずれか一方の唯一のＸｈｏＩ部位で切断し、次に斯く形成されたＤＮＡ末端をベクターＤＮＡに連結することにより発現ベクター内に挿入される（以下の実施例２で詳細に説明する）。

ｍＣＭＶプロモーターのハイブリッド誘導体は、欠失されたｍＣＭＶの配列の代わりにＳＶ４０、ポリオーマウィルスまたは他の転写単位から単離された転写調節ＤＮＡフラグメントを挿入することにより作られる（以下の実施例２で詳細に説明する）。

細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の発現を誘発するこの種のプロモーターフラグメントの能力は実施例３に記載の如く定量化され、そして斯く得られた発現レベルは他の強力な真核細胞プロモーターの場合に得られる発現レベルと比較された。２２７０ｂｐのｍ　ＣＭ　ＶＤＮＡフラグメントは、トランスフェクションされだ哺乳動物細胞の溶菌液においてＣＡＴ遺伝子産物の上位レベルの酵素活性により立証される如く、非常に強力なプロモーターを保有することが見出された。驚くべきことに、末端切断されたＬ３８７ｂｐフラグメントは、ある種の細胞株での異種遺伝子発現を促進するという点で、長いフラグメントよりもさらに一層効果的であるとわかった。プロモーター活性のこの予期しない増強は、少なくとも若干の細胞において異種遺伝子（ここではＣＡＴ遺伝子）の転写にネガティブな影響を与え且つ１３８７ｂｐフラグメントでは効果的に欠失される１つまたはそれ以上の因子が２２７０ｂｐフラグメント中に存在することを示している。また、ｍＣＭＶプロモーターの最も短い末端切断誘導体（１９６ｂｐフラグメント）でさえも残余の転写プロモーター活性を保持し、その活性がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）のようないくつかの細胞株ではポリオーマウィルスの初期プロモーターよりもさらに一層効果的であるという発見は驚くべきことである。このことは、このフラグメントに含まれる転写開始部位の約１５０ｂｐ内の配列が大きいｍＣＭＶプロモーターフラグメントの全効率に有意に寄与しうろことを示している。２２７０ｂｐフラグメント内に存在するネガティブ因子の一部または全部を欠くフラグメン）　（１３８７ｂｐフラグメントのヌクレオチド配列を含む）はどれも適当な状況のもとて有効な発現調節因子として有用であるだろう。このような中程度の長さのフラグメントは慣用技法により２２７０ｂｐフラグメントをＢａ、９３１エキソヌクレアーゼで消化するか、あるいは末端切断することにより容易にえることができる。

これらの中程度の長さフラグメントは表工に示したヌクレオチド配列とハイブリダイスすることができるだろう。中程度の長さのフラグメントのプロモーター活性は、以下の実施例３に記載の方法を含めた慣用方法により容易に定量化され、１９６ｂｐフラグメント、１３８７ｂｐフラグメント、１３８７ｂｐフラグメントおよび他のプロモーターの活性と比較しうる。１３８７ｂｐフラグメントは目下のところ本発明に従って使用するのに好適であるが、２２７゜ｂｐフラグメントのより長いまたはより短いサブフラグメントもそれぞれの場合において有用であるだろう。

ハイブリッドＳＶ４０エンハンサ−−ｍＣＭＶフラグメントは意外にも、とりわけヒトＨｅＬａ細胞株およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株において、非常に強力な転写プロモーターであることが見出された。同様に、ハイブリッドポリオーマウィルスエンハンサ−−ｍＣＭＶフラグメントは、とりわけマウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣＨＯ細胞株において、非常に強力な転写プロモーターであることが判明した。

これらの新規ハイブリッド転写プロモーター配列は明らかに、異種転写調節成分と組み合わせることにより、自然界に存在する対応物よりも優れた利用性をもつ遺伝子発現ベクターを構築する潜在的能力を有している。

２２７０ｂｐ、　１３８７ｂｐおよび１９８ｂｐのｍＣＭＶＤＮＡプロモーターフラグメント、ならびにＳＶ４０エンハンサ−−ｍＣＭＶプロモーター（ＳＶ− ＣＭＶ）およびポリオーマウィルスエンハンサー−ｍＣＭＶプロモーター（ＰＹ　−ＣＭＶ）　ハイブリッドフラグメントの他の異種真核細胞遺伝子の発現を誘発する能力が試験された。ＣＡＴ遺伝子だけでなく他の異種遺伝子も、上皮および間葉山来のヒト、ラット、マウス、チャイニーズハムスター、サルおよびミンク細胞を含むいろいろな種類の細胞において効果的に発現されることが見出された。

本発明の組換えＤＮＡ分子（例えばクローニングベクターまたは発現ベクター、もしくはウィルス−またはプラスミド−誘導分子）はこうして、ｍＣＭＶ前初期プロモーターの発現促進フラグメントに作動可能な状態で（すなわちその発現制御下に）連結された異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。従って、ｍＣＭＶ−誘導プロモーターは上記の約２２７０ｂｐＰｓｔ　Ｉフラグメント、または１３８７ｂｐＨｐａ　Ｉ　／　Ｐ　ｓｔＩフラグメント（その塩基配列は表Ｉに示す）もしくはそれにハイブリダイズすることができるフラグメントのような有効なその発現促進フラグメントでありうる。ｍＣＭＶ −誘導プロモーターはまたｍＣＭＶプロモーターまたはその末端切断誘導体に機能的に連結された、他の転写単位から単離された転写調節配列から成るハイブリッド、例えば実施例２で説明しかつ第１図に示すようなＳＶ−ＣＭＶまたはｐｙ −ｃＭｖプロモーターフラグメントでありうる。この種の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞は、異種タンパク質を生産し、その後回収・精製する方法のような慣用技法を用いて培養される。

本発明によるｍＣＭＶプロモーターの使用は意図する異種タンパク質によって制限されず、それ故にこの点において広い利用可能性をもつ。これらのプロモーターはまた非常に広い宿主域を有し、試験したいろいろな細胞株において効果的に機能した。これらのプロモーターは例えば当分野で知られるような増幅可能なベクター、および哺乳動物細胞によるタンパク質の発現を介してタンパク質コードＤＮＡを同定・単離するために考案されたベクターを含む多種多様のベクターにおいて有用であるだろう〔例えばウオン（Ｗｏｎｇ、　Ｇ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：８１０〜８１５　（１９８５）を参照〕。異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、上記のようにして得られたｍＣＭＶプロモーターまたはその誘導体に作動可能な状態で連結されたクローニングベクターまたは発現ベクター中に容易に挿入することができる。

ベクターの構築は公知の技法を用いて行われ、そしてそのベクターＤＮＡは所望の宿主細胞を形質転換するために使用される。これらの形質転換細胞はその後慣用方法を用いて培養され、そしてタンパク質またはＲＮＡ産物は当分野で知られる如く分離・精製される。

表ＩｍＣＭＶ前初期プロモーターを含むＨｐａ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　ＩｏａｃｖｒｒａａａａａａＴＴＩＩｎＡＣｏｒｎｃｏａｍａｃｏａａａａｐｎｃａｅｙｅ＾Ｔ？ａｆＯＣ：ＣＣｅ丁ｏａａＡａｌｌＴｏ００ｆｔＡｌｌｌＡＪ１ｉ５ＴＴｅＯＣ：丁Ｔ丁ｃａｏａａｏａｒｒ＾ＴＬＩＴＱａ３ＴａＴ！ＩＩ　１！＠　２３＠　１４６　ｊ七２６・よ７・ｘａｏ２９０コｌ１１ｍコ１・　コ【ロ　ココ・　エ４ｅ　コ３Φ１＆＠　コア・　ニー窃　コ軸　４・１ｗｇａｃａ＾ｅａａｖｉｅａｔａｔａａｅ丁ｏａａｙｔａｙｅ：ａ、ｙｃａａａａｒｙａｃｃｃａｅｉａｏｔａ＊ＨｐａＩ／ＰｓｔＩフラグメントは本明細書において１４００ｂｐ”フラグメントまたはセグメントとも呼ばれる。

実施例　１ｍＣＭＶ（マウス唾液腺ウィルス、スミス株）は米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー令コレクション（ＡＴＣＣ番号Ｖ　Ｒ−１９４）から入手可能である。ウィルスはＢａ１ｂ／Ｃマウス胚線維芽細胞内で増殖させ、そしてウィルスＤＮＡは従来の手法に従って調製した〔エバーリング前初期プロモーターを保有する約２２７０ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ウィルスＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化することによりｍＣＭＶゲノムから切除し、このようにして得られたフラグメントは標準手法を使用するアガロースゲル電気泳動により単離した〔マニアチス（Ｍａｎｉａｔｌｓ）ら、′モレキュラークローニング、実験室マニュアル”、コールド・スプリング・ハーバ−、ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）を参照されたい〕。アガロースゲルの適当な領域から抽出したＤＮＡは適当なりローニングベクターににサブクローニングし、正しいＰｓｔＩフラグメント挿入物の存在は標準組換えＤＮＡ法、例えば表■に示す配列の一部または全部に対応する標識ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーション、あるいは制限酵素分析により証明した。

上記の２２７０ｂｐフラグメントの１３８７ｂｐ末端切断誘導体は、そのフレアーゼＨｐａｌでさらに切断することにより作った。この部位は大きいフラグメント中で唯一のものであり、そして平滑末端をもつＤＮＡを生成するので、そのＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて他の平滑末端ＤＮＡに連結することができた（マニアチスの上記文献参照）。

大きいｍ　ＣＭ　Ｖ前初期遺伝子プロモーターフラグメント（２２７０ｂｐフラグメントまたは１３８７ｂｌ）フラグメントのいずれか一方）の１９６ｂｐ末端切断誘導体は、表Ｉのヌクレオチド番号１１９０と１１９７の間に位置する唯一のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断することにより作った。このようにして生成したＤＮＡ末端はＤＮＡリガーゼを用いて適合性のＤＮＡ末端に連結することができた（マニアチスの上記文献参照）。

上記の前初期プロモーターを保有するＤＮＡフラグメントは表Ｉに示したＤＮＡ配列内の部位を認識する多数の制限エンドヌクレアーゼ（ＡｃｃＩ、　ＮｄｅＩ、　ＡａｔＩＩおよびＸｂｏＩを含む）で消化することにより性状決定された。

表１に示した１３８７ｂｐ末端切断プロモーターフラグメントのＤＮＡ配列は、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により決定された〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４　：５４６３〜５４６７　（１９７７）を参照されたい〕。

すべてのプラスミドＤＮＡ構築物は組換えＤＮＡの使用を管理するＮＩＨガイドラインに従って、マニアチスらの上記文献（１９８−２）に記載されるような標準技法を用いて作製した。本発明者は上記のｍＣＭＶ前初期プロモーター誘導ＤＮＡフラグメント類の１つを保有する多数の異なる真核細胞発現ベクター誘導体を構築した。これらのフラグメントのほとんどすべての適当なりローニングベクターまたは発現ベクターへのサブクローニングは慣用手法により行うことができる。大きい（２２７０ｂｌ））フラグメントはＰｓｔＩ切断産物としてｍＣＭＶウィルスＤＮＡから生成され、それは発現すべき異種遺伝子またはクローニング部位がそのプロモーターの“下流”になるように方向づけられねばならない。そのＤＮＡフラグメントの方向づけはそのフラグメントの“下流”末端から１９７ｂｐのところに非対称的なＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在するために容易である。より短い（１３８７ｂｐ）フラグメントは大きい（２２７０ｂｐ）ＰｓｔＩフラグメントのＨｐａＩ切断により生成し、このフラグメントの方向づけはこのフラグメントの“上流”末端が平滑であるので容易に達成される。同様に、より短い１９６ｂｐフラグメントは大きいフラグメントのいずれか一方のＸｈｏＩ切断により生成し、このフラグメントの方向づけは“上流”および “下流”末端が同じでない唯一の適合性ＤＮＡ末端に連結され得るので容易に達成される。

これらのプロモーターフラグメントの強さを完全化して他のプロモーター配列と比較するために、第１図に示した試験用のプラスミドＤＮＡを標準技法により作製した。

これらのプラスミドはｐＳＶ２ＣＡＴ　（ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ、　２　：　１０４４〜１０５１　（１９８２）を参照〕がら誘導されるｐＰｙＣＡＴ〔ベルドマン（Ｖａｌｄｍａｎ）ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：６４９〜６５８（１９８５）を参照〕の誘導体である。

本発明者が作製したＣＡＴプラスミド誘導体は、ｐＰｙＣＡＴ中のポリオーマウィルス（Ａ２株）の初期プロモーターが第１図に示すような上記のｍ　ＣＭ　Ｖプロモーター誘導フラグメントで置き換えられている。それぞれのｍＣＭＶプロモーター誘導フラグメントは細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が転写キャップ部位に隣接し且つその転写プロモーターの“下流“になるように方向づけられる。これは初めにｐＰｙＣＡＴプラスミドからポリオーマウィルス初期プロモーターを保有するＨｉｎｄ　ｍ／　ＥｃｏＲｌＤＮＡフラグメントを除き、その後合成オリゴヌクレオチドアダプターフラグメントを使用して慣用方法により２２７０ｂｐのｍ　ＣＭ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントで置き換えることにより達成された。以下で述べる他のＣＡＴプラスミド誘導体がその後ｐｍＣＭＶＣＡＴと命名されたこの構築物から誘導された。これらはｐｍｃＭＶ１３８７ｃＡＴ　；　ｐｍｃＭＶ１９６　ＣＡＴ　；ｐＳＶｍＣＭＶＣＡＴ　；　ｐＰｙｍＣＭＶＣＡＴである（第１図参照）。このようにして作製されたＤＮＡプラスミドはコンピテント大腸菌ＨＢ　１０１細胞をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用した。これはマニアチスらの上記文献（１９８２）に記載される標準技法を用いた目的プラスミドのクローニング、同定、単離および分子特性決定を可能にした。

実施例　３培養哺乳動物細胞による異種遺伝子発現の定量分析ＳＶ４０初期プロモーターまたはポリオーマウィルス初期プロモーター、上記の２２７０ｂｐｍ　ＣＭ　Ｖ前初期プロモーターフラグメント、その末端切断１３８７ｂｐおよび１９６ｂｐ誘導体、ならびにＳＶ４０−ｍＣＭＶおよびポリオーマウィルス−ｍＣＭＶハイブリッド誘導体によって誘発される、削孔動物細胞による細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の発現を定量化するために、次のプラスミドのそれぞれのＤＮＡを精製した：ｐＳＶ２ＣＡＴ；　（ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、。

２　：　１０４４〜１０５１　（１９１１１２）を参照〕ＣＡＴ遺伝子の発現を誘発するＳＶ４０初期プロモーターをもっ；ＡＴＣＣ番号３７１５５゜ｐＰｙＣＡＴ　；　〔ベルドマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　５　：　６４９〜８５８　（１９８５）を参照〕ポリオーマウィルス初期プロモーターにより誘発されるＣＡＴ発現をもつ。

ｐｍＣＭＶＣＡＴ；ポリオーマウィルス初期プロモーターの代わりに大きい（２２７０ｂｐ）　ｍ　ＣＭ　Ｖ　Ｐ　ｓｔ　Ｉプロモーターフラグメントをもつ上記ｐＰ　ｙＣＡＴの誘導体（第１Ａ図参照）。

ｐ　ｍ　ＣＭＶ１３８７ＣＡ　Ｔ　；ポリオーマウィルスプロモーターの代わりに末端切断された１３８７ｂｐｍ　ＣＭ　ＶＨｐａＩ／ＰｓｔＩフラグメントをもつ類似プラスミド（第１Ｂ図参照）。

ｐｍｃＭＶ１９６　ＣＡＴ；ポリオーマウィルスプロモーターの代わりに末端切断された１９６ｂｐ　ｍ　ＣＭ　ＶＸｈｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントをもつ類似プラスミド（第１Ｃ図参照）。

ｐＳＶｍＣＭＶＣＡＴ；１９６ｂｐ　５Ｖ４０ＸｈｏＩ転写エンハンサ−保有フラグメント〔ヌクレオチド１００〜２９６、デビリアーズ（ｄｅＶｉｌｌｉｅｒｓ、　Ｊ、）ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０　：　７９６５〜７９７Ｂ（１９８２）を参照〕に機能的に連結されたｍＣＭＶの１９Ｅｉｂｐ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｉプロモーターフラグメントから成るハイブリッドプロモーターをもつ、ｐｍｃＭＶ１９６　ＣＡＴから誘導されたプラスミド構築物（第１Ｄ図参照）。

ｐＰｙｍＣＭＶＣＡＴ；ポリオーマ株Ａ２　（ＡＴＣＣ４５０１７）由来の約６３３ｂｐポリオーマウイルスＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ転写エンハンサ−保有フラグメント〔ヌクレオチド４６３２〜５２６５、チンダル（Ｔｙｎｄａｌｌ、　Ｃ，）ら、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　９　：　６２３１〜６２５０　（１９８１）を参照〕に機能的に連結されたｍＣＭＶの１９６ｂｐＸｈｏＩ／ＰｓｔＩプロモーターフラグメントから成るハイブリッドプロモーターを含む類似プラスミド（第１Ｅ図参照）。

プラスミドＤＮＡは慣用手法により細菌培養物から単離し、そして２段階のＣｓＣρ密度勾配遠心により精製した。その後これらの精製ＤＮＡは上皮および間葉山来の種々の培養哺乳動物細胞（ヒト、ラット、マウス、チャイニーズハムスター、サルおよびミンクの細胞を含む）へ別々に導入した。これはリン酸カルシウム共沈降法またはＤＥＡＥ−デキストラン法〔デビリアーズ（ｄｅＶｉｌｌｉｅｒｓ）およびシャフナ−（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ）。

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、　Ｂ５．フラベル（Ｒ，Ａ、　Ｐｌａｖｅｌｌ）編集、エルスピア−・サイエンティフィック・パブリッシャーズ、アイルランド（１９８３）を参照〕のいずれかにより行われた。トランスフェクションされた哺乳動物細胞はトランスフェクションの４８時間後に溶菌し、モして溶菌液中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性について検定した〔ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ。

２　：　１０４４〜１０５１　（１９８２）を参照されたい〕。細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘発する上記プロモーターフラグメントの能力は、標準技法により得られたオートラジオダラムのデンシトメーター走査により定量化された。２２７０ｂｐｍ　ＣＭ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントは非常に強力なプロモーターを保有することがわかった。驚くべきことに、その１３８７ｂｐ末端切断フラグメントはある種の細胞株においてさらに一層効果的であることが判明し、そして最も短い末端切断誘導体のＬ９６ｂｐフラグメントでさえも残余の転写プロモーター活性をかなり保持していた。ＳＶ４０エンハンサ−−ｍＣＭＶプロモーターハイブリッドおよびポリオーマウィルスエンハンサー−ｍＣＭＶプロモーターハイブリッドがある種の細胞株において “野生型°のプロモーターフラグメントよりもさらに一層効果的であるという発見は非常に意義のあるものだった。また、上記の転写プロモーターは、ＣＡＴ遺伝子が異なる動物種および種族から誘導されたいろいろな種類の細胞において効果的に発現されることが見出されたので、広い範囲の利用可能性をもつことが明らかになった。

図面の簡単な説明第１Ａ図は２２７０ｂｐｍ　ＣＭ　Ｖ　Ｐ　ｓｔ　Ｉプロモーターフラグメント第１Ｂ図は１３８７ｂｐｍ　ＣＭ　Ｖ　Ｈｐａ　Ｉ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｉフラグメントを含むプラスミドｐｍｃＭＶ１３８７ｃＡＴを示し；第１Ｃ図は１９６ｂｐ　ｍＣＭＶＸｈｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントを含むプラスミドｐｍｃＭＶ１９６　ＣＡＴを示し；第１Ｄ図はＳＶ４０エンハンサ−−ｍＣＭＶプロモーターハイブリッドを含むプラスミドｐＳＶｍＣＭＶＣＡＴを示し；第１Ｅ図はポリオーマウィルスエンハンサー−ｍＣＭＶプロモーターハイブリッドを含むプラスミドｐＰｙｍＣＭＶＣＡＴを示す。

Ｆｉｇ、ＩＢＦｉｇ、ＩＤＦｉｇｕｒｅ　ＩＥ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マウス・サイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）の前初期プロモーターを含むｍＣＭＶゲノムの約２．２７キロ塩基対のＰｓｔＩ制限フラグメントまたはその有効な発現促進フラグメントに作動可能な状態で連結された異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列から成る組換えＤＮＡ分子。
（２）有効な発現促進フラグメントは２．２７キロ塩基対のＰｓｔＩフラグメントの１３８７ｂｐＨｐａＩ／ＰｓｔＩ末端切断誘導体から成り、該１３８７ｂｐフラグメントは表Ｉに示すヌクレオチド配列によってさらに特徴づけられる、請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
（３）有効な発現促進フラグメントは２．２７キロ塩基対のＰｓｔＩフラグメントの１９６ｂｐＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ末端切断誘導体から成る、請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
（４）有効な発現促進フラグメントは表Ｉに示すヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列から成る、請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
（５）異種転写調節配列に機能的に連結された請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子から成るハイブリッド転写単位。
（６）異種転写調節配列は異種エンハンサーである、請求の範囲第５項記載のハイブリッド転写単位。
（７）異種エンハンサーはＳＶ４０またはポリオーマウィルスの転写エンハンサーから成る、請求の範囲第６項記載のハイブリッド転写単位。
（８）請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。
（９）請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。
（１０）請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。
（１１）請求の範囲第４項記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。
（１２）請求の範囲第５項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。
（１３）請求の範囲第６項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。
（１４）請求の範囲第７項記載のハイブリッド転写単位を含む真核宿主細胞。
（１５）請求の範囲第８項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（１６）請求の範囲第９項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（１７）請求の範囲第１０項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（１８）請求の範囲第１１項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（１９）請求の範囲第１２項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（２０）請求の範囲第１３項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。
（２１）請求の範囲第１４項記載の宿主細胞を、細胞増殖および遺伝子発現を可能にする適当な条件下で培養することから成る異種タンパク質の生産方法。