NO338767B1 - Minimal DNA-sekvens som virker som en kromatinisolator og dets anvendelse i proteinekspresjon - Google Patents
Minimal DNA-sekvens som virker som en kromatinisolator og dets anvendelse i proteinekspresjon Download PDFInfo
- Publication number
- NO338767B1 NO338767B1 NO20062315A NO20062315A NO338767B1 NO 338767 B1 NO338767 B1 NO 338767B1 NO 20062315 A NO20062315 A NO 20062315A NO 20062315 A NO20062315 A NO 20062315A NO 338767 B1 NO338767 B1 NO 338767B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- interest
- use according
- polypeptide
- vector
- expression
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 22
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims abstract description 73
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 30
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 24
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 17
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 102100035017 Interleukin-18-binding protein Human genes 0.000 claims description 11
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 7
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 claims description 4
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 claims description 4
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 claims description 4
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 claims description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 claims description 2
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- -1 IL- 6 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 claims description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 claims description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 claims description 2
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 claims 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 101710205006 Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 claims 1
- 101100153125 Thermococcus kodakarensis (strain ATCC BAA-918 / JCM 12380 / KOD1) thsB gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 claims 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims 1
- 101150102887 ths gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 101001019591 Homo sapiens Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108010014064 CCCTC-Binding Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 101001035782 Gallus gallus Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 102100027671 Transcriptional repressor CTCF Human genes 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 241000487918 Acacia argyrodendron Species 0.000 description 1
- 102000000325 Amino Acid Transport System L Human genes 0.000 description 1
- 108010055672 Amino Acid Transport System L Proteins 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000008143 Bone Morphogenetic Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000003737 Bright-Glo Luciferase Assay System Methods 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101900137526 Escherichia coli Galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002114 Reduced Folate Carrier Human genes 0.000 description 1
- 108050009454 Reduced Folate Carrier Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000011222 chang cao shi Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 108010085650 interferon gamma receptor Proteins 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen angår anvendelse av ekspresjonsvektorer som omfatter en DNA-sekvens på 146 bp som kan virke som kromatinisolator, vertsceller som inneholder slike vektorer, fremgangsmåte for å fremstille et ønsket polypeptid ved å anvende vektorer som inneholder nevnte sekvens og anvendelsen av nevnte DNA-sekvens.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Introduksjon av gener i pattedyrceller ved transfeksjon medfører stabil integrasjon i genomet til vertscellene. Vanligvis er denne integrasjonshendelsen sjelden (< 0,01 %) og skjer på en tilfeldig måte hva gjelder integrasjonslokuset. Ekspresjonen av det integrerte transgenet avhenger av det lokale miljøet. Dette betyr at nærliggende forsterkere (enhancere) eller dempere (silencers) kan påvirke ekspresjonen og gener kan inaktiveres ved å spre heterokromatin (kromatinposisjonseffekt, CPE, også kalt demping (silencing)).
I løpet av de siste år har studier som begynte i Drosophilia og som nå er utvidet til vertebrater identifisert DNA-sekvenselementer kalt isolatorer som synes å fungere som "barrierer" ved å forhindre CPE, og/eller som "forsterkerblokkade" med kapasiteten å kunne verne en promoter fra virkningen av en fjern enhancer uten å forhindre at enhanceren virker på en nærliggende promoter. Isolatorer er følgelig DNA-sekvenselementer som beskytter transkriberte regioner fra å fjerne ikke-relevante regulatorsekvenser.
De første DNA-sekvensene beskrevet med egenskapene til en isolator var ses (spesialisert kromosomstrukturer)-elementer i Drosophila. Chung og Felsenfeld beskrev et element, 5'HS4 (Dnase-I-hypersensitivt sete) som virket som en isolator tilstede i et 1,2 kb DNA-fragment utledet fra 5'-enden til kylling B-globinlokuset (Chung et al., 1993, US 5 610 053). Mye av aktiviteten til isolatoren ble vist å være tilstede i et 250 bp-fragment, "kjerne"-regionen som er inkludert i 5'HS4-sekvensen (Chung et al., 1997). DNA'en i kjerneregionen ble videre analysert i fem fottrykks-regioner (FI-FV) og det ble vist at disse var GC-rike med egenskapene til en "CpG-øy", men ikke syntes å ha funksjon som en promoter. Eksperimenter viste at kun én region, Fil, var nødvendig for enhancerblokkerende egenskap og rensingen av dets bindingsproteiner avslørte at bindingen av CTCF (CCCTC-bindingsfaktor) var ansvarlig for dets aktivitet (Bell et al., 1999).
I en annen studie har nytten av fullengde 1,2 kb betaglobinisolatorelementet i å beskytte rapportører fra CPE i in vivo-analyser, inkludert transgene mus (Ciana et al., 2001). I CHO-cellelinjer viste Izumi og Gilbert at nærværet av kromatinisolatorsekvenser moderat forbedret stabiliteten men at det ikke var tilstrekkelig for å fremstille homogene transformanter (Izumi og Gilbert, 1999).
I en nyere publikasjon (Recillas-Targa et al., 2002) ble den funksjonelle aktiviteten til et 1,2 kb isolatorelement fra kylling beta-globingenet avslørt. Ved siden å virke som effektiv barriere mot aktiviteten til nærliggende forsterkere eller dempere ble det vist at 250 bp-kjerneelementet var tilstrekkelig til å gi beskyttelse mot demping av gener forårsaket av CPE og å tilveiebringe langtids stabil ekspresjon. To kopier av mindre fragmenter av 250 bp-kjernesekvensen vesentlig fri for fottrykksregion II, på hver side av rapportgenet, var tilstrekkelig for å gi beskyttelse fra CPE, men ikke forsterkningsblokkering i pre-erytroide 6C2-kyllingceller.
Siden vektorstørrelser ikke burde overskride 10 kb er det et behov for å redusere størrelsen til de regulatoriske elementene som er tilstede i disse vektorene. F.eks. øker vektorstabilitet ettersom størrelsen på dets DNA reduseres. Mindre vektorer kan tilpasses større segmenter av innskudd. Videre forenkler små elementer modifiseringen av ekspresjonsvektorer og tillater konstruksjoner der den totale innskuddslengden må begrenses.
Det er derfor et formål ved den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et kort DNA-element som har isolatoraktivitet når det anvendes i vektorer.
Sammendrag av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse er basert på det funn at et kort DNA-element på 146 bp, med sekvensen i SEKV. ID nr. 1, er i stand til å virke som kromatinisolator. I det følgende kalles isolatoren "isolatoren ifølge oppfinnelsen" eller bare "isolatoren". Antallet transfekterte kloner som uttrykker genet av interesse ble vurdert når de anvendte konstruktene anvendte isolatoren ifølge oppfinnelsen. Produksjonen av polypeptidet av interesse ble vist å være høyere i uttrykkende kloner som inneholdt isolatoren ifølge oppfinnelsen og langtidsekspresjon ble vist å være stabil.
Det beskrives heri et DNA-element med sekvensen SEKV. ID nr. 1.
Et første aspekt ved oppfinnelsen angår anvendelsen av en vektor som omfatter én eller flere kromatinisolator bestående av SEKV. ID. nr. 1 for ekspresjon av et gen av interesse i en CHO-celle.
Et andre aspekt ved oppfinnelsen angår en CHO-celle som omfatter er transfektert med en vektor som definert heri.
Et tredje aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende transfeksjon av en CHO-celle i følge oppfinnelsen.
En fjerde aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid av interesse omfattende å dyrke en CHO-celle i følge oppfinnelsen.
Ytterligere utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse fremgår av de vedlagte patentkrav.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 viser en sammenstilling av isolatoren ifølge oppfinnelsen (A) med den 250 bp kjerneisolatorregionen (B) fra kylling beta-globin 5'HS4-isolatorregionen beskrevet i den kjente teknikk. Fig. 2 viser to toveis reporterkonstrukter for IL18BP-ekspresjon. A: IL18BP-gen er vist som en uthevet linje og mCMV-IEl- og mCMV-IE2-promoterer er indikert som piler. Trekantene representerer intron A fra hCMV IE-regionen og de ovale delene representerer polyadenyleringssignalet. Isolatoren ifølge oppfinnelsen (fylt sirkel), kalt INS, tandemgjentagelsesflanke (tandem repeat flank) omgir hver ende av ekspresjons-kassetten. B: samme konstrukt uten isolatoren ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 viser ekspresjonsenheten til luciferase. A: luciferacegenet er vist som en uthevet linje og den humane CMV-promoteren (hCMVp) er angitt som en pil. Den ovale formen representerer polyadenyleringssignalet. Isolatoren ifølge oppfinnelsen (fylt sirkel), angitt INS, tandemgjentagelse flankerer hver ende av ekspresjons-kassetten. B: samme konstrukt uten isolatorsekvensen ifølge oppfinnelsen. Fig. 4 viser luciferaseekspresjon målt som RLU (relative lysenheter) i stabile prøver av transfekterte CHO-S-celler i SFM 3 måneder etter transfeksjon med isolatoren ifølge oppfinnelsen (I.hCMV Luc.L, fig. 3 A) eller ikke-isolator (hCMV Lue, fig. 3B)-konstrukter i nærværet eller fraværet av purpmucin (puro). 96 tilfeldige plukkede individuelle kloner for hver av de fire betingelsene ble rangert og angitt ved hjelp av økende nivåer luciferaseekspresjon (hver inkrement på X-aksen representerer én klon). Fig. 5 viser luciferaseekspresjon målt som RLU (relative lysenheter) i CHO-S-celler som forbigående er transfektert med plns(2)-SV-Luc, plns(2)revSV-Luc, pSV-Luc, pGL3-ctrl-konstrukter eller som var mock-transfektert.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse er basert på funnene om at et kort DNA-element på 146 bp, med sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 1, er i stand til effektivt å virke som kromatinisolator når denne er duplisert og satt inn oppstrøms og nedstrøms for en ekspresjonsenhet. Nærværet av isolatoren ifølge oppfinnelsen i transfeksjons-vektorer øker signifikant antallet kloner som uttrykker et markørgen. Videre hadde prøvene omfattende isolatorekspresjonskassetten en signifikant forhøyet produktivitet sammenlignet med kontrollprøven. I tillegg til dette var sjansen for å oppnå stabile langtidsuttrykkende kloner økt i nærvær av isolatoren ifølge oppfinnelsen.
Det beskrives heri et DNA-element med sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 1.
Det beskrives videre heri en vektor for anvendelse i følge oppfinnelsen som omfatter én eller flere kromatinisolator bestående av SEKV. ID. nr. 1 for ekspresjon av et gen av interesse i en CHO-celle.
Uttrykket "vektor" viser til enhver bærer av eksogent DNA eller RNA som er anvendelig for å overføre eksogent DNA til en vertscelle for replikasjon og/eller passende ekspresjon av det eksogene DNA av vertscellen, slik som f.eks. plasmider, ekspresjonsvektorer, virale vektorer osv.
Vektoren omfatter videre fortrinnsvis et DNA-element valgt fra:
a. en forsterker (enhancer), eller et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment derav; b. et promoterdomene eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav; c. en DNA-sekvens som koder for én eller flere polypeptider av interesse.
En "forsterkerregion" viser til en DNA-region som fungerer slik at transkripsjonen av ett eller flere gener forsterkes eller øker. Forsterkere kan vanligvis fungere i begge orienteringer og ved ulike avstander fra genet, eller til og med inne i genet. Fagmannen på området vil videre forstå at uttrykkene "promoter" (se nedenfor) og "forsterkere" ikke er eksakt definert og at promoteren kan omfatte forsterkerregioner, eller forsterkerregioner kan omfatte promoterregioner, avhengig av nomenklaturen og konteksten.
Uttrykket "promoter" som anvendt heri viser til en DNA-region som fungerer slik at den kontrollerer transkripsjonen av én eller flere DNA-sekvenser, og at dens struktur identifiseres gjennom nærværet av et bindingssete for DNA-avhengig RNA-polymerase og av andre DNA-sekvenser som reagerer slik at promoterfunk-sjonen reguleres. Som nevnt ovenfor kan en forsterkerregion omfatte hele eller en del av en promoter.
Et "funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment", som anvendt heri, av en promoter eller en enhancer er en forkortet eller trunkert promoter eller forsterkersekvens som bibeholder aktiviteten som en promoter eller forsterker. Promoter- eller forsterkeraktivitet kan måles ved bruk av en hvilken som helst kjent analysemetode, f.eks. i en rapportøranalyse ved anvendelse av luciferase som rapportørgen (de Wet et al., 1985; Wood et al., 1984) eller kommersielt tilgjengelig fra Promega .
I en foretrukket utførelsesform omfatter vektoren ytterligere elementer som regulerer eller påvirker transkripsjonen eller translasjonen. Slike elementer kan påvirke fremgangsmåten for transkripsjonen per se, bearbeidingen, stabiliteten eller translasjonseffektiviteten av RNA. Eksempler på egnede elementer er f.eks. valgt fra gruppen bestående av 5'UTR'er, introner, 3'UTR'er (Mazumder et al., 2003), mRNA 3'-ende bearbeidingssekvenser f.eks. polyadenyleringsseter, og IRES-sekvenser for polysistronekspresjon (Mountford og Smith, 2003).
Det er foretrukket å anvende et IRES-element for ekspresjon av polysistron-mRNA, der de kodende sekvensene er separert ved hjelp av IRES. Fordelen er at flere polypeptider av interesse kan uttrykkes fra det samme mRNA og følgelig fra den samme promoteren.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter vektoren ytterligere ekspresjonsfremmende sekvenser slik som grenseelementer (boundary elements), LCR (f.eks. beskrevet av Blackwood og Kadonaga, 1998) eller matriks/plattformforankrings-regioner (f.eks. beskrevet av Li et al., 1999) og elementer for rekombinasjon og kassettbytte.
I enda en ytterligere foretrukket utførelsesform kan promoteren inneholdt i vektoren ifølge oppfinnelsen være av en hvilken som helst cellulær eller viral/fag-opprinnelse slik som SV40, hCMV, mCMV-IEl, mCMV-IE2, RSV, T7, T3, eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav.
Mange polypeptider av interesse kan uttrykkes ved å anvende en vektor ifølge oppfinnelsen. Polypeptidet av interesse kan være et hvilket som helst polypeptid som man ønsker å produsere. F.eks. kan polypeptidet av interesse være et naturlig utskilt protein, et normalt cytoplastmatisk protein, et normalt transmembrant protein eller et humant eller et humanisert antistoff. Når proteinet av interesse er et normalt cytoplasmatisk eller et normalt transmembrant protein er proteinet fortrinnsvis konstruert for å bli løselig. Polypeptidet av interesse kan ha en hvilken som helst opprinnelse. Foretrukne polypeptider av interesse er av human opprinnelse.
I foretrukne utførelsesformer velges polypeptidet fra gruppen bestående av chorion-gonadotropin (CG), follikkelstimulerende hormon (FSH), lutropinchoriogonado-tropisk hormon (LH), tyroidstimulerende hormon (TSH), veksthormon (GH), interferonreseptorer (f.eks. IFNAR1, interferongammareseptor), TNF-reseptorer p55 (TNF bindende protein I, TBP I) og p75 (TNF bindende protein II, TBP II), interleukiner (f.eks. IL-6), interleukinbindende proteiner (f.eks. IL-18BP), leukemi-inhibitorisk faktor (LIF), anti-CDl la-antistoffer, eller muteiner, fragmenter, løselige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.
"Interferon" eller interferoner er en underklasse av cytokiner som hemmer antiin-flammatorisk, antiviral og antiprolifererende aktivitet. Med grunnlag i de kjemiske og immunologiske egenskaper grupperes de naturlig forekommende humane interferonene i tre klasser: interferon alfa (leukocytt), interferon beta (fibroblast) og interferon gamma (immun). Alfa-interferon godkjennes i disse dager i USA og andre land for behandlingen av hårcelleleukemi, veneriske vorter, Kaposis sarkom
(en krefttype som vanligvis rammer pasienter som lider av ervervet immunsvikt-syndrom (AIDS)), og kronisk ikke-A-, ikke-B-hematitt.
Interferon gamma er et dimerprotein med underenheter på 146 aminosyrer. Det har antiviral og antaparasittaktivitet og hemmer også prolifereringen av et antall normale og transformerte celler.
Spesielt har humant fibroblastinterferon (IFN-P) antiviral aktivitet og kan også stimulere naturlige dreperceller mot neoplastiske celler. Det er et polypeptid på 166 aminosyrer og som er omtrent 20 kDa. Rebif<®>(rekombinant humant interferon-P) er den seneste utviklingen i interferonterapi for multippel sklerose (MS) og representerer et signifikant fremskritt i behandling. Rebif<®>er interferon (IFN)-beta la, fremstilt fra pattedyrcellelinjer og som er så å si identisk med det naturlig forekommende humane molekylet.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform inkluderer polypeptider av interesse f. eks. erytropoietin (EPO), granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), hypofysepeptidhormoner, over-gangsaldergonadotropin, insulinlignende vekstfaktorer (f. eks. somatomedin-C), keratinocyttvekstfaktor, glialcellelinjeutledet nevrotrofisk faktor, trombomodulin, basisk fibroblastvekstfaktor, insulin, en koagulasjonsfaktor (f.eks. faktor VIII), somatoprin, benmorfogenetisk protein-2, platelettutledet vekstfaktor, hirudin, epoietin, et integrin (f.eks. LFA), rekombinant LFA-3/IgGl-fusjonsprotein, gluko-cerebrosidase, en kjede av et humanisert eller humant antistoff, et cytokin, etanercept, tPA og muteiner, fragmenter, løselige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.
Ytterligere eksempler som er egnet i henhold til den foreliggende oppfinnelse angår markørproteiner, slik som negative eller positive seleksjonsmarkører, eller amplifiserbare gener. Eksempler inkluderer proteiner valgt fra adenosindeaminase (ADA), aminoglykosidfosfotransferase (neo), dihydrofolatreduktase (DHFR), hygromycin-B-fosfotransferase (HPH), tymidinkinase (tk), xantinguaninfosforibosyltransferase (gpt), multippel medikamentresistensgen (MDR), ornitindekarboksylase (ODC) og N-(fosfonacetyl)-L-aspartatresistens (CAD), eller puromycinacetyltransferase (PAC). Ytterligere eksempler inkluderer gener anvendt for seleksjon ved anvendelse av partikulær metabolsk vei så som galaktokinase (Schumperli et al., 1982), folatreseptor (Zhu et al., 2001) eller redusert folatbærer (Assaraf et al., 1992). I enda en ytterligere foretrukket utførelse er polypeptidet av interesse et reporter gen. Eksempler er valgt fra luciferase, grønt fluoresensprotein, alkalinsk fosfatase, P-galaktosidase eller pepperrotperoksidase eller intramuskulære kombinasjoner derav eller med andre proteiner, slik som f.eks. det grønne fluorescens protein (GFP) eller forsterket GFP (EGFP) med puromycinacetyltransferase (Abbate et al., 2001).
Fortrinnsvis er insolatoren posisjonert oppstrøms (dvs. i flankeringsregion 5') og/eller nedstrøms (dvs. i flankeringsregion 3') av en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av interesse.
I en foretrukket utførelsesform er i det minste to isolatorer posisjonert oppstrøms og nedstrøms for en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av interesse.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform er i det minste to kodende sekvenser posisjonert mellom isolatorene ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen.
I enda en ytterligere foretrukket utførelsesform koder de to kodende sekvensene for underenheter av et multimerprotein.
Samtidig ekspresjon av to underenheter av det samme proteinet er spesielt fordelaktig siden ekspresjonen fra begge promotere kan resultere i produksjonen av ulike mengder underenheter, eller av på forhånd bestemte mengder av begge polypeptider avhengig av styrken på promoterne som anvendes. Underenhetene kan deretter settes sammen i den samme cellen og danne et modent protein.
Foretrukne eksempler på dimerproteiner som er egnet uttrykt ved anvendelse av en vektor ifølge oppfinnelsen er alfakjeden og betakjeden til et peptidhormon slik som humant FSH, humant LH, humant TSH og humant CG. Fagmannen på området vil forstå at hormoner fra andre arter kan likeledes anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse, slik som heste-, svine-, kuhormoner avhengig av den tilsiktede anvendelsen av det rekombinante polypeptidet.
I en annen utførelsesform av oppfinnelsen anvendes en vektor der den første underenheten er den tunge kjeden, og den andre underenheten er den lette kjeden til et immunglobulin, eller vice versa. Et foretrukket eksempel på et egnet immunglobulin er et IgG. Slike immunglobuliner kan feks. være humaniserte eller humane antistoffer for terapeutisk anvendelse. Et svært foretrukket eksempel på et slikt humanisert antistoff er et humanisert anti-CDl 1 -antistoff med varemerke Raptiva<®>.
I en annen utførelsesform av oppfinnelsen uttrykkes genet av interesse samtidig med en markør eller et seleksjonsgen (feks. genet for IL-18BP og genet for PAC eller luciferase).
I enda et aspekt angår oppfinnelsen en CHO celle, hvori cellen er transfektert med en vektor som definert heri.
Fagmannen på området vil forstå at vertscellen kan tilsvarende transfekteres samtidig med to eller flere vektorer ifølge den foreliggende oppfinnelse. Vertscellen og isolatoren kan være utledet fra ulike arter. Isolatoren er utledet fra kylling-DNA, men det er vist å være funksjonelt i celler utledet fra andre arter slik som eggstokkceller fra kinesiske hamstre (CHO).
En CHO-celle, og nærmere foretrukket en CHO-S-celle anvendelig som vertscelle i følge oppfinnelsen er beskrevet feks. av Shotwell et al. (Shotwell et al., 1982).
Oppfinnelsen angår i følge enda et aspekt en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid av interesse, omfattende trinnet å transfektere en vertscelle med i det minste én vektor som definert heri. Avhengig av naturen til polypeptidet av interesse medfører prosessen ifølge oppfinnelsen til et utskilt protein som kan høstes fra cellekultursupernatanten, eller til et cellemembranprotein eller et intracellulært protein som kan isoleres fra cellene. Avhengig av den tilsiktede virkning kan cellene i seg selv med det integrerte polypeptidet være produktet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid av interesse omfattende trinnet å dyrke en CHO-celle ifølge den foreliggende oppfinnelse.
I enda en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet å isolere proteinet av interesse fra vertscellene. Dette trinnet er spesielt fordelaktig og lett å utføre for utskilte proteiner som kan isoleres enkelt fra cellekultursupernatanten. Dette trinnet gjelder tilsvarende for isolering av polypeptider fra cellemembraner eller intracellulære avdelinger.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes i forbigående, stabile, episomale eller virale ekspresjonssystemer. Som beskrevet i eksemplene nedenfor resulterte anvendelsen av vektoren ifølge oppfinnelsen i spesifikk sterk ekspresjon av det ønskede proteinet dersom det ble anvendt i et stabilt ekspresjonssystem. I en foretrukket utførelsesform er følgelig transfeksjonen stabil transfeksjon.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform anvendes en vektor ifølge oppfinnelsen for ekspresjon av et gen av interesse.
Anvendelsen av vektoren for den samtidige ekspresjonen av to eller flere gener eller cDNA av interesse er også foretrukket.
Eksempler
Eksempel 1: konstruksjon av isolatorer og vektorer
Isolator
Isolatoren ifølge oppfinnelsen er 146 bp og har SEKV. ID nr. 1. Den omfatter 146 bp av den 250 bp kjernesekvensen (SEKV. ID nr. 2) fra den 1,2 kb isolatorregionen i kylling b-globulin 5'HS4-lokuset, som vist i fig. 1 og mangler ytterligere ett basepar (rundt posisjon 107 i sammenstillingen). Det ble satt sammen ved hjelp av oligonukleotidkloning. Det resulterende fragmentet har kunstige ender for konvensjonell subkloning.
Vektorer
Det 146 bp fragmentet ble først duplisert og deretter klonet i to tandemanalyser separert av et multippelt kloningssete, inn i den kommersielle kloningsvektoren pBluescript II SK + fra Stratagene (kat. nr. 212205-01).
IL - 18BP
En første ekspresjonskassett for et markørgen (IL18BP) uttrykt i to kopier fra en toveispromoter (mCMV-IEl og mCMV-IE2), ble satt inn mellom de to isolatortandemrepeterende enhetene som vist i fig. 2A. Parallelt ble en ellers identisk kontrollvektor unngått brukt som isolator konstruert som vist i fig. 2B.
Luciferase
I en annen tilnærming ble en transgen kassett med ildflueluciferasegenet uttrykt fra en human CMV-promoter satt inn mellom isolatortandemrepeterende områder (fig. 3 A). Igjen ble en kontrollvektor uten isolatorelementene konstruert ved å sette ekspresjonskassetten inn i den opprinnelige ryggradsvektoren (pBluescript II SK +, Stratagene, kat. nr. 212205-01) som vist i fig. 3B.
Eksempel 2: isolatoraktivitet i stabilt transfekterte CHO- cellepopulasioner ( IL-18BP)
CHO-S-celler ble transfektert med toveis rapportørkonstrukter for IL18BP ekspresjon ifølge fig. 2A og B.
Materialer og metoder
Celler: CHO-S-celler fra Invitrogen (kat. nr. 11619).
Transfeksjonsmiddel: DMRIE-C, Invitrogen, kat. nr. 10459-014.
Vektorer.
- isolert og ikke-isolert IL18BP-ekspresjonsvektor beskrevet i eksempel 1.
- vektor som gir puromycinresistens (puro)
- plasmid som koder for seleksjonsmarkøren DHFR.
Vektormengdene som er anvendt er vist i den følgende tabellen:
Transfeksjonsprotokoll
CHO-S-celler (Invitrogen, kat. nr. 11619) ble stabilt transfektert ved å anvende DMRIE-C (Invitrogen, kat. nr. 10459-014). Kort fortalt ble 40 Mio-celler eksponert i fire timer for en transfeksjonsblanding inneholdende den respektive ekspresjons-vektor for IL18BP og en vektor som gir puromycinresistens så vel som et plasmid som koder for DHFR.
Transefeksjonsblandingen inneholdt ILI 8BP-ekspresjonsvektoren isolert og vektoren som har resistens mot puromycin, så vel som det som koder for DHFR i et molart forhold på 10:1:1. De tilsvarende mengdene er 33,6 ug, 3 \ ig og 3 \ ig (se tabell 1).
I tilfellet av ikke-isolerte IL 18BP-ekspresjons vektor er, ble lignende molare forhold anvendt, som svarer til en mengde på 30 ug, 3 \ ig og 3 \ ig (se tabell 1). Alle vektorer som ble anvendt var på forhånd linearisert med et restriksjonsenzym, Pvul for begge IL18BP-ekspresjonsvektorer og Sspl for både puro- og DHFR-seleksjons-plasmider. Etter pelletering ble supernatanten fjernet og cellene ble fortynnet i serumfritt dyrkningsmedium ProCHO-5 (Cambrex) og inkubert ved 37°C i 48 timer. Puromycin ble deretter tilsatt ved en konsentrasjon på 10 ug/ml for å velge ut stabile transfekterte celler. Kontrollprøver ble tilsatt i mediet som inneholdt 10 % føtalt bovint serum for å vurdere det totale antallet transfektanter i samlingen ved å telle kolonier som vokser på plastikkoverflaten. Prøver av begge konstrukter representerte tilnærmet 200000 uavhengig stabile transfektanter.
Selektivt trykk ble opprettholdt i 41 dager for å eliminere alle transfektanter med ustabile integrasjonsseter. Det selektive presset var fjernet og prøver av IL18BP-målinger ble tatt etter å ha oppbevart cellene 14 dager unten puromycin.
IL-18BP-ekspresjonsmål
IL18BP-ekspresjon ble målt ved å eksponere tilnærmet 1 mioceller til ferskt medium i 24 timer. Mediet ble deretter filtrert for å fjerne cellene og IL18BP ble kvantifisert ved hjelp av en standard ELISA-analyse i triplikat. De resulterende IL18BP-titere ble anvendt for å beregne spesifikk produktivitet pr. celle (pikogram pr. celle og dag, pcd).
Resultater
Samlingene transfektert med isolatorekspresjonskassetten hadde en produktivitet som var forhøyet mer enn tre ganger (3,7 pcd) sammenlignet med kontrollprøven (1,1Pcd).
Eksempel 3: Isolatoraktivitet i stabilt transfekterte CHO- kloner ( luciferase) Materialer og metoder
CHO-S-celler (Invitrogen, kat. nr. 11619) var stabilt transfektert med de tidligere nevnte luciferaserapportkonstruktene (se eksempel 1) ved å anvende DMRIE-C som transfeksjonsmiddel. Et plasmid som uttrykker puromycinresistensgenet ble samtidig transfektert ved å anvende den samme protokollen som beskrevet i eksempel 2. To grupper ble etablert ved å anvende 10 ug/ml puromycin. Stabile grupper ble oppbevart under selektivt press i 40 dager for å eliminere celler med ustabile integrasjonsceller (fase I). Gruppene ble målt for luciferaseaktivitet (data ikke vist) før utsåing i 348 brønners plater ved å anvende begrenset fortynning. For hver gruppe ble utsåing utført både i fravær av og nærvær av puromycin i mediet. Individuelle kloner ble deretter tilfeldig plukket og igjen sådd ut i 96 brønners plater for å oppnå 2 plater for hvert konstrukt. Disse klonene ble deretter dyrket med og uten puromycin i ytterligere to måneder opptil totalt tre måneder etter begrenset fortynning med det mål å analysere 96 kloner for hver konstrukt og betingelse (fase II).
Luciferasemåling
Luciferaseekspresjonen ble målt som RLU i stabile grupper transfektert med isolator (I.hCMV Luc.I) eller ikke-isolator (hCMV Lue)-konstrukter i nærværet eller fraværet av puromycin (puro). Bright-Glo™-luciferaseanalysesystemer fra Promega, kat. nr. E2610, ble anvendt ifølge forhandlerens retningslinjer. Kort fortalt ble 50 ul cellesuspensjon lysert med 50 ul Bright-Glo-reagens og inkubert i 5 min. ved romtemperatur. Luciferaseaktivitet ble deretter målt på et luminometer i løpet av 5 sekunder/brønn.
Resultater
For hver av de testede betingelsene I.hCMV Luc.I med puro, I.hCMV Luc.I uten puro, hCMV Lue med puro, hCMV Lue uten puro, ble 96 individuelle kloner rangert og satt inn avhengig av økende nivåer luciferaseekspresjon (se fig. 4).
Vurderingen av uttrykkende kloner er sammenfattet i tabell 2 for de fire betingelsene som ble testet. Antallet uttrykkende kloner (antall uttrykkere) ble talt og gjennomsnittelig ekspresjon over de utvalgte ekspresjonskloner så vel som den høyeste ekspresjonsklonen ble angitt.
Gjennomsnittlig luciferaseekspresjon målt som RLU-nivå i kloner med isolator ifølge oppfinnelsen (I.hCMV Luc.I) er gjennomsnittlig 5 ganger høyere enn klonene uten isolatoren. Den høyest uttrykkende klonen I.hCMV Luc.I med puromycin uttrykker 14 ganger mer luciferase enn den beste klonen fra hCMV Lue med puromycin.
Ved å anvende isolatoren ifølge oppfinnelsen i konstruktet øker antallet uttrykkende kloner, det gjennomsnittlige ekspresjonsnivået og ekspresjonsnivået til den høyest uttrykkende av de respektive serier. I fraværet av seleksjon gjennom fase II øker isolatoren ifølge oppfinnelsen sannsynligheten for å identifisere uttrykkende kloner med stabil og forhøyet ekspresjon over lang tid.
Eksempel 4: Vurdering av en putativ forsterkerfunksjon
En forsterker bør være i stand til å øke ekspresjonen av en heterolog promoter uavhengig av orienteringen og posisjonen til promoteren. Denne definisjonen ble fulgt for å vurdere en putativ forsterkningsfunksjon av isolatoren ifølge oppfinnelsen.
Vektorkonstrukt
pSV - Luc
Denne vektoren som inneholder kun SV40-promoteren og luciferase ble utledet fra pGL3-Ctrl (Promega, E 1741), som inneholder SV40-promoteren som driver luciferasegenet og SV40-forsterkeren lokalisert i 3'-enden til genet, og pGL3-Basic (Promega, E1751), som mangler både promoter og forsterker. Kort fortalt ble pGL3-ctrl kuttet ved hjelp av Notl/Xbal, for å isolere et fragment som inneholder SV40-promoteren etterfulgt av luciferasegenet.
På en lignende måte ble pGL3-basic kuttet ut av Notl/Xbal og vektorens ryggrad inneholdt poly A-regionen, økte uten 3'-forsterkeren. pSV-Luc ble oppnådd ved å kombinere begge fragmenter.
pBS ( 2Ins ) 2 . 2
Kort fortalt ble polynukleotidene designet slik at de var basert på isolatoren ifølge oppfinnelsen og det resulterende fragmentet ble fordøyd med Xbal/Spel og klonet inn i pBluescript II SK +, Stratagene (kat. nr. 212205-01), også fordøyd av Xbal/Spel (trinn 1). Et tandemrepeterende fragment av isolatoren ifølge oppfinnelsen ble klonet ved å åpne vektoren oppnådd i trinn I med Xbal, og sette inn et fragment av den andre isolatoren ifølge oppfinnelsen som var fordøyd med Xbal/Spel (trinn 2). Sekvensen og orienteringen ble undersøkt før duplisering av isolatortandemreprisen. Det andre repeterende tandemelementet ble klonet i Acc651 -setet, fordøyd for oppnåelse av jevne ender av Klenow-enzymet fra vektoren oppnådd i trinn 2. Isolatoren ifølge oppfinnelsen ble deretter oppnådd ved å fordøye vektoren fra trinn 2 med Xbal/Spel, fått jevne ender med Klenow-enzymet. Vektoren som ble oppnådd ble kalt pBS(2Ins)2,2.
plns ( 2 ) SV - Luc os dets motsatte orienterinssversjon , plns ( 2 ) revSV - Luc En enhet av isolatorsekvensen som omfatter en tandemrepeterende enhet (2 x isolator ifølge oppfinnelsen) ble isolert, gjennom fordøying med pBS(2Ins)2,2 ved hjelp av Spel/Xbal. Mottakervektoren var pSV-Luc åpnet med Nhel. Ettersom setene anvendt for fordøying var kompatible ga kloningsreaksjonen vektorer med begge orienteringer.
Transient transfeksjon
Materialer og metoder
CHO-S, Invitrogen (kat. nr. 11619).
Plasmid DNA angitt nedenfor (se ovenfor nevnte avsnitt om vektorkonstruksjon) ble isolert fra standardkulturer som var dyrket over natt med nukleobånd PC 500-kit (Macherey-Nagel kat.nr. 740 574) ifølge protokollen som er tilveiebrakt av forhandleren: - DNA som skal vurderes: plns(2)-SV-Luc og dets motsatte orienterte versjon, plns(2)revSV-Luc
- DNA- kontroll
°pSV-Luc: ekspresjon fra SV40-promoteren i fravær av en for sterker s ekvens.
°pGL-3-ctrl: ekspresjon fra SV40-promoteren så vel som SV40-forsterkeren lokalisert 3' for genet.
Transfeksjon
Lipofectamin (Invitrogen, kat. nr. 18324-012)
Format: 24 brønners plater.
Celler: CHO-S i eksponentiell vekstfase for å sikre at cellene er i god form, dyrkes 24 timer før transfeksjon. For å unngå en stasjonærfase med lav celletetthet ble cellene fortynnet 0,75 x IO6 celler/ml. Den totale mengden celler som skulle trans f ekter es var 1,5 x IO<5>, resuspendert i 100 ul ProCho5, (Cambrex, kat. nr. B-12766Q) pr. brønn i 24 brønners plate.
Transfeksjonsblandinger var som følger: (for 1 brønn er det å bemerke at en masterbladning lages ved å ta 3,3x volumer som angitt nedenfor slik at triplikatanalyser kan utføres)
A) Lipofectamin: 2 ul
ProCho5-medium: 48 ul
Totalvolum er 50 ul.
B) DNA: 1 jig,
ProCho5-medium: komplement til 50 ul.
Løsning A og B ble blandet og inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Denne blandingen ble tilsatt til 100 ul ProCho5-medium inneholdende 1,5 x 10<5>celler.
Cellene ble plassert tilbake i en inkubator og inkubert ved 37°C, 5 % CO2i 3 timer. Deretter ble 400 ul ProCho5-medium tilsatt for å fortynne lipofectamin. Cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer forut for prøving for analyse. Alle transfeksjoner ble utført i triplikat.
Mock - transfeksjon : Det svarer til ikke-transfekterte celler og gir bakgrunnsnivåindikasj on.
Luciferasemålins
Bright-Glo-luciferaseanalysesystemer fra Promega (kat. nr. E2610) ble anvendt i henhold til forhandlerens retningslinjer. Kort fortalt ble cellesuspensjonen homogenisert ved å pipettere opp og ned flere ganger og en prøve på 50 ul ble tatt ut og overført til en hvit 96 brønners plate (Nunc, kat. nr. 236108). 50 ul av rekonstituert Bright-Glo-reagens ble direkte tilsatt og blandingen ble inkubert i 5 min. ved romtemperatur. Lysemisjon ble målt på et Centro LB 960-luminometer (Berthold Technologies) i løpet av 5 sekunder av utprøvingstiden. Normalisering ved hjelp av en internkontroll eller totalproteinnivå var ikke gjort men variasjoner innenfor triplikatene tilveiebringer en tilstrekkelig indikasjon for sammenlignbar transfeksj ons effektivitet.
Resultater
Resultatene av luciferaseekspresjonen kjørt av de ulike plasmid-DNA er rapportert i fig. 5.
Dataene indikerer klart at det ikke er noen forsterkerfunksjon i isolatoren ifølge oppfinnelsen. Ingen signifikant økning i ekspresjonsnivå ble observert når isolatoren ble tilsatt til pSV-Luc, i sens- eller anti-sensorientering.
Konklusjoner
Fra de ovenfor angitte eksemplene kan følgende konklusjoner trekkes:
- Isolatoren ifølge oppfinnelsen viser sterk isolatoraktivitet i CHO-celler; - Antallet uttrykkende kloner er høyt (5 gangers økning/sannsynlighet for å identifisere uttrykkende kloner); - Ekspresjonsnivå for å uttrykke kloner in high; - Nærværet av isolatoren ifølge oppfinnelsen øker sjansene for å oppnå stabil langtidsekspresjon. - Isolatoren ifølge oppfinnelsen inneholder ingen forsterkeraktivitet.
Referanseliste
Abbate.J., Lacayo,J.C, Prichard.M., Pari,G., and McVoy,MA (2001). Bifuncfional protein conferring enhanced green fluorescence and puromycin resistance. Biotechniques 31,336-340.
Assaraf.Y.G., Feder.J.N., Sharnia.R.C, Wright,J.E., RosowskyA, Shane,B., and Schimke,R.T. (1992). CharacterizaSon of the coexisting multiple mechantsms of metriotrexate resistance in mouse 3T6 R50 fibroblasts. J Biol Chem 267,5776-5784.
BellAC, WestAG., and Felsenfeld.G. (1999). Hie protein CTCF is required for the enhancer blockmg acSvity of vertebrate insulators. Geil 98,387*396.
Blackwood,E.M. and Kadonaga,J.T. (1998). Going the distance: a current view of enhancer action. Science 281,61-63.
Chung,J.H., BellAC, and Felsenfeld.G. (1997). Characterization of the chicken beta-gtobin insulator. Proe Nati Acad Sa* U S A 94, 575-580.
Chung,J.H.tWhiteley.M., and Felsenfeld.G. (1993). A 5" element of the chicken beta-gtobin domain sen/es as an insulator in human eryttiroid cells and proieefs against position effect in Drosophlla. Ceil 74,505-514.
Ciana.P., Di Luccio.G., Beicredito.S., Potlio.G., Vegeto.E., Tatangeto.L, Trveron,C., and MaggiA (2001). Engineering of a mouse for the in vi vo profiling of estrogen receptor acfivity. Mol Endocrinol. 15,1104-1113.
de WeU-R-, Wood,K.V., Hefinski.D.R., and DeLuca,M. (1985). Ctaning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coii. Proe Nati Acad Sa* U S A 62,7870-7873.
lzumi,M. and Gilbert,D.M. (1999). Homogeneous tetracycline-regulatable gene expression in mammalian fibroblasts. J Ceil Biochem 76,280-289.
U.Q., Harju.S., and Peterson,K.R (1999). Locus control regions: coming of age at a decade plus. Trends Genet 15,403-408.
Mazumder.B., Seshadri,V., and Fox,P.L. (2003). TranslaHonal control by the 7-UTR: the ends specify the me ans. Trends Biochem Sei 28,91-98.
Mountford.P.S. and Smith AG- (2003). Translational control by the 3'-UTR: the ends specify the means JntemaJ ribosome enfry stes and drcisfronic RNAs in mammalian transgenesis . Trends Genet 28,91-98.
Reci*las-Targa,F., Pikaart,MJ., Burgess-Beusse,B., BellAC., LittM.D., WestAG., Gaszner.M., and Felsenfeld.G. (2002). Position-effect protection and enhancer btocking by the chicken beta-gtobin insulator ane separable activities. Proe Natt Acad Sei U S A 99,6883-6888.
Schumperii.D., Howard.B.H., and Rosenberg,M. (1982). Efficient expression of Escherichia coli galactokinase gene in mammalian cells. Proe Nati Acad Sei U S A 79,257-261. ShotwelLMA, Mattes,P.M., Jayme,D.WM and Oxender.D.L (1982). Regulator) of amino acid transport system L in Chinese hamster ovary cells. J Bol Chem 257,2974-2980.
Wood,K.V., de Wet,J.R-, DeuftN., and DeLuca,M. (1984). Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lantems . Biochem Biophys. Res. Commun. 124,592-596.
Zhu,W.Y., AIBegro,MA, and Meiera.P.W. (2001). The rate of folate receptor alpha (FR alpha) synthesis in folate depleted CHL cells is regulated by a translational mechanism sensitive to media folate tevets, white stable overexpression of its mRNA is mediated by gene amplificatJon and an increase in franscript half -life. J Cetl Biochem 81,205-219.
Claims (24)
1. Anvendelse av en vektor omfattende en eller flere kromatinisolator bestående av SEKV. ID. nr. 1 for ekspresjon av et gen av interesse i en CHO-celle.
2. Anvendelse i følge krav 1, hvori nevnte vektor ytterligere omfatter i det minste et DNA-element valgt fra: a. en forsterker eller et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment derav; b. et promoterdomene eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav; og c. en DNA-sekvens som koder for én eller flere polypeptider av interesse.
3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvori nevnte vektor ytterligere omfatter én eller flere DNA-sekvenser som koder for regulatoriske elementer valgt fra 5'UTR, introner, 3'UTR, mRNA 3'-endebearbeidingssekvenser, polyadenyleringsseter og interne ribisominngangssekvenser (IRES).
4. Anvendelse ifølge krav 2 eller 3, hvori DNA-sekvensen koder for mer enn ett polypeptid av interesse gjennom et polysistron-mRNA.
5. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-4, hvori vektoren ytterligere omfatter én eller flere DNA-elementer valgt fra grenseelementene, lokuskontrollregioner (LCR), matriksforankringsregioner (MAR), og elementer for rekombinasjon og kassettutbytte.
6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvori promoteren er valgt fra cellulære eller virale/fagpromotere slik som mCMV-IEl, mCMV-IE2, hCMV, SV40, RSV, T7, T3, eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav.
7. Vektor ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, hvori polypeptidet av interesse er valgt fra FSH, LH, CG, THS, veksthormon, interferon, TNF-bindende protein I, TNF-bindende protein II, IL-18BP, IL-6, IFNAR1, LIF eller muteiner, fragmenter, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.
8. Anvendelse i følge hvilke som helst av kravene 1-6, hvori polypeptidet av interesse er valgt fra EPO, G-CSF, GM-CSF, en kjede av et humanisert antistoff, et cytokin, en koaguleringsfaktor, etanercept, tPA, et integrin eller muteiner, fragmenter, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.
9. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, hvori polypeptidet av interesse er valgt fra adenosindeaminase (ADA), aminoglykosidfosfotransferase (neo), dihydrofolatreduktase (DHFR), hygromycin-B-fosfotransferase (HPH), tymidinkinase (tk), xantinguaninfosforibosyltransferase (gpt), multippel medikamentresistensgen (MDR), ornitindekarboksylase (ODC) og N-(fosfonacetyl)-L-aspartatresistens (CAD), puromycinacetyltransferase (PAC), galaktokinase, human folatreseptor, eller reduserte folatbærere.
10. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-6, hvori polypeptidet av interesse er valgt fra luciferase, grønt fluorescensprotein, alkalisk fosfatase og pepperrotperoksidase eller kombinasjoner derav.
11. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-10, hvori en isolator er posisjonert oppstrøms og en isolator er posisjonert nedstrøms for en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av interesse.
12. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-10, hvor i det minste to av isolatorene er posisjonert oppstrøms og nedstrøms for en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av interesse.
13. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11 eller 12, hvor i det minste to kodende sekvenser er posisjonert mellom isolatorene.
14. Anvendelse ifølge krav 13, hvori de i det minste to kodende sekvensene koder for underenheter av et multimerprotein.
15. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den første underenheten er alfa-kjeden og den andre underenheten er beta-kjeden til et hormon valgt fra FSH, humant LH, humant TSH og humant CG.
16. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den første underenheten er beta-kjeden og den andre underenheten er alfa-kjeden til et hormon valgt fra humant FSH, humant LH, humant TSH og humant CG.
17. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den første underenheten er den tunge kjeden og den andre underenheten er den lette kjeden til et immunglobulin.
18. Anvendelse ifølge krav 14, hvori den første underenheten er den lette kjeden og den andre underenheten er den tunge kjeden til et immunglobulin.
19. Anvendelse av en vektor ifølge hvilket som helst av kravene 1-18 for samtidig ekspresjon av to eller flere gener eller DNA av interesse.
20. CHO celle, hvori cellen er transfektert med en vektor som definert i følge hvilket som helst av kravene 1-19.
21. Fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid av interesse,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnet å transfektere en CHO vertscelle med i det minste én vektor som definert ifølge hvilket som helst av kravene 1-19.
22. Fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid av interesse,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnet å dyrke en celle ifølge krav 20.
23. Fremgangsmåte ifølge krav 21 eller 22,
karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet å isolere polypeptidet av interesse fra CHO-cellene.
24. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 21-23,karakterisert vedat transfeksjonen er stabil transfeksjon.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03103890 | 2003-10-21 | ||
| PCT/EP2004/052591 WO2005040384A1 (en) | 2003-10-21 | 2004-10-20 | Minimal dna sequence acting as a chromatin insulator and its use in protein expression |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20062315L NO20062315L (no) | 2006-07-18 |
| NO338767B1 true NO338767B1 (no) | 2016-10-17 |
Family
ID=34486337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20062315A NO338767B1 (no) | 2003-10-21 | 2006-05-22 | Minimal DNA-sekvens som virker som en kromatinisolator og dets anvendelse i proteinekspresjon |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8133699B2 (no) |
| EP (1) | EP1675956B1 (no) |
| JP (1) | JP4745972B2 (no) |
| AT (1) | ATE484591T1 (no) |
| AU (1) | AU2004284243B2 (no) |
| CA (1) | CA2541523A1 (no) |
| CY (1) | CY1110868T1 (no) |
| DE (1) | DE602004029598D1 (no) |
| DK (1) | DK1675956T3 (no) |
| ES (1) | ES2354160T3 (no) |
| HR (1) | HRP20100560T1 (no) |
| IL (1) | IL175021A (no) |
| NO (1) | NO338767B1 (no) |
| PL (1) | PL1675956T3 (no) |
| PT (1) | PT1675956E (no) |
| SI (1) | SI1675956T1 (no) |
| WO (1) | WO2005040384A1 (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4307079B2 (ja) | 2001-01-26 | 2009-08-05 | セレキス エスアー | マトリックス付着領域およびその使用方法 |
| DK1601776T3 (da) | 2003-03-11 | 2008-10-13 | Serono Lab | Ekspressionsvektorer omfattende mCmV-IE2-promotoren |
| ATE549353T1 (de) * | 2003-05-13 | 2012-03-15 | Merck Serono Sa | Aktive varianten des il-18 bindenden proteins und dessen medizinische verwendungen |
| RU2375450C2 (ru) | 2003-10-24 | 2009-12-10 | Селексис С.А. | Днк, повышающая продуцирование белка, и ее применение |
| ATE360647T1 (de) * | 2003-11-05 | 2007-05-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| SI1720979T1 (sl) | 2004-03-01 | 2007-12-31 | Ares Trading Sa | Uporaba medija za celiäśno kulturo brez seruma zaizdelavo il-18bp pri celicah sesalcev |
| DE602005009827D1 (de) * | 2004-06-29 | 2008-10-30 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| PL2267024T3 (pl) * | 2005-06-03 | 2012-10-31 | Ares Trading Sa | Wytwarzanie rekombinowanego białka wiążącego IL-18 |
| RS52273B (en) | 2005-06-10 | 2012-10-31 | Ares Trading S.A. | PROCESS FOR PURIFICATION OF IL-18 BINDING PROTEIN |
| EP1760092A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-07 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | System for screening cells for high expression of a protein of interest |
| FR2919616A1 (fr) * | 2007-08-02 | 2009-02-06 | Ecole Norm Superieure Lyon | Polynucleotides insulateurs derives de l'element d4z4 et leurs utilisations en transgenese |
| KR101993938B1 (ko) | 2011-04-13 | 2019-06-27 | 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 | IFNα2로부터의 SAR 인자를 갖는 발현 시스템 |
| US20140342432A1 (en) * | 2011-12-21 | 2014-11-20 | Danisco Us Inc. | Fungal Gene Expression Using Insulator DNA Sequences |
| JP6297559B2 (ja) * | 2012-07-31 | 2018-03-20 | バジル・エム・ハンタッシュＢａｓｉｌ Ｍ． ＨＡＮＴＡＳＨ | Ｈｌａｇ改変された細胞および方法 |
| KR101591823B1 (ko) | 2013-12-27 | 2016-02-04 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터 |
| WO2017075395A1 (en) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Tumor-specific adenovirus vectors and therapeutic uses |
| CA3002524A1 (en) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof |
| CN106754817B (zh) * | 2016-11-03 | 2021-02-05 | 山西省生物研究院有限公司 | 一种重组自分泌运动因子的表达方法 |
| US10947295B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-03-16 | Sanabio, Llc | Heterodimers of soluble interferon receptors and uses thereof |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5859205A (en) * | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| US6113898A (en) * | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
| US6432700B1 (en) * | 1997-03-03 | 2002-08-13 | Cell Genesys, Inc. | Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same |
| US6194152B1 (en) * | 1997-08-20 | 2001-02-27 | Dendreon Corporation | Prostate tumor polynucleotide compositions and methods of detection thereof |
| AU1128400A (en) * | 1998-10-22 | 2000-05-08 | Medical College Of Georgia Institute, Inc. | Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors |
| CA2377929A1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Adam C. Bell | Dna binding protein and sequence as insulators having specific enhancer blocking activity for regulation of gene expression |
| DK1601776T3 (da) | 2003-03-11 | 2008-10-13 | Serono Lab | Ekspressionsvektorer omfattende mCmV-IE2-promotoren |
| ATE549353T1 (de) | 2003-05-13 | 2012-03-15 | Merck Serono Sa | Aktive varianten des il-18 bindenden proteins und dessen medizinische verwendungen |
| ATE360647T1 (de) | 2003-11-05 | 2007-05-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| SI1720979T1 (sl) | 2004-03-01 | 2007-12-31 | Ares Trading Sa | Uporaba medija za celiäśno kulturo brez seruma zaizdelavo il-18bp pri celicah sesalcev |
| DE602005009827D1 (de) | 2004-06-29 | 2008-10-30 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| PL2267024T3 (pl) | 2005-06-03 | 2012-10-31 | Ares Trading Sa | Wytwarzanie rekombinowanego białka wiążącego IL-18 |
| RS52273B (en) | 2005-06-10 | 2012-10-31 | Ares Trading S.A. | PROCESS FOR PURIFICATION OF IL-18 BINDING PROTEIN |
-
2004
- 2004-10-20 EP EP04791263A patent/EP1675956B1/en active Active
- 2004-10-20 ES ES04791263T patent/ES2354160T3/es active Active
- 2004-10-20 SI SI200431541T patent/SI1675956T1/sl unknown
- 2004-10-20 DK DK04791263.9T patent/DK1675956T3/da active
- 2004-10-20 JP JP2006536087A patent/JP4745972B2/ja active Active
- 2004-10-20 CA CA002541523A patent/CA2541523A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-20 AT AT04791263T patent/ATE484591T1/de active
- 2004-10-20 PL PL04791263T patent/PL1675956T3/pl unknown
- 2004-10-20 PT PT04791263T patent/PT1675956E/pt unknown
- 2004-10-20 AU AU2004284243A patent/AU2004284243B2/en active Active
- 2004-10-20 DE DE602004029598T patent/DE602004029598D1/de active Active
- 2004-10-20 US US10/576,509 patent/US8133699B2/en active Active
- 2004-10-20 WO PCT/EP2004/052591 patent/WO2005040384A1/en active Application Filing
-
2006
- 2006-04-20 IL IL175021A patent/IL175021A/en active IP Right Grant
- 2006-05-22 NO NO20062315A patent/NO338767B1/no unknown
-
2010
- 2010-10-14 HR HR20100560T patent/HRP20100560T1/hr unknown
- 2010-10-29 CY CY20101100982T patent/CY1110868T1/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RECILLAS-TARGA F.et al., Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken beta-globin insulator are seperable activities, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, 2002, Vol. 99 (10), s. 6883-6888, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2004284243B2 (en) | 2010-11-04 |
| DK1675956T3 (da) | 2010-11-22 |
| ES2354160T3 (es) | 2011-03-10 |
| CA2541523A1 (en) | 2005-05-06 |
| WO2005040384A1 (en) | 2005-05-06 |
| ATE484591T1 (de) | 2010-10-15 |
| IL175021A0 (en) | 2006-08-20 |
| US8133699B2 (en) | 2012-03-13 |
| JP2007508833A (ja) | 2007-04-12 |
| EP1675956A1 (en) | 2006-07-05 |
| SI1675956T1 (sl) | 2010-12-31 |
| US20070134761A1 (en) | 2007-06-14 |
| NO20062315L (no) | 2006-07-18 |
| DE602004029598D1 (de) | 2010-11-25 |
| PT1675956E (pt) | 2010-11-04 |
| CY1110868T1 (el) | 2015-06-10 |
| PL1675956T3 (pl) | 2011-06-30 |
| IL175021A (en) | 2011-07-31 |
| JP4745972B2 (ja) | 2011-08-10 |
| HRP20100560T1 (hr) | 2010-11-30 |
| AU2004284243A1 (en) | 2005-05-06 |
| EP1675956B1 (en) | 2010-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO338767B1 (no) | Minimal DNA-sekvens som virker som en kromatinisolator og dets anvendelse i proteinekspresjon | |
| JP5171033B2 (ja) | ｍＣＭＶＩＥ２プロモーターを含んで成る発現ベクター | |
| JP4307079B2 (ja) | マトリックス付着領域およびその使用方法 | |
| EP2439269B1 (en) | Expression vector for establishing hyper-producing cells, and hyper-producing cells | |
| JP4817514B2 (ja) | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 | |
| EP1531666B1 (en) | Inducible eukaryotic expression system | |
| JP2012070744A (ja) | 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系 | |
| EP2484761A1 (en) | Dna construct, and process for production of recombinant cho cell using same | |
| JP5073653B2 (ja) | 高レベルのタンパク質を産生する発現ベクター及び方法 | |
| CN104278032A (zh) | 一种新型双启动子结构单元 | |
| EP2085475A1 (en) | Method for production of cell strain capable of tetracycline-induced gene expression or cell strain having conditional gene knockout, and use of the cell strains | |
| CN115698301A (zh) | 活性dna转座子系统及其使用方法 | |
| D'Aiuto et al. | Human IL-12 p40 as a reporter gene for high-throughput screening of engineered mouse embryonic stem cells | |
| JP2011019509A (ja) | クローニングに最適化された発現ベクター | |
| CN112813099A (zh) | 一种在活化的t细胞中具有高活性的启动子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS |