CN101705244B

CN101705244B - 一种动物细胞双顺反子高效表达载体

Info

Publication number: CN101705244B
Application number: CN 200910199254
Authority: CN
Inventors: 周永春; 张玉晶; 厉颖; 李瑶
Original assignee: Shanghai Chemo Wanbang Biopharma Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd; SHANGHAI CHEMO WANBANG BIOPHARMA Co.,Ltd.
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2029-11-23
Also published as: CN101705244A

Abstract

本发明涉及一种适用于工业化生产的动物细胞双顺反子高效表达载体。本发明涉及的表达载体含有CMV增强子，SV40晚期启动子、内部核糖体进入位点、SV40晚期polyA信号，其中，SV40晚期polyA信号区插入了一段重复序列。本发明的表达载体与现有SV40晚期启动子的动物细胞表达载体相比，在动物细胞中的外源蛋白表达量得到大幅提升，表达水平提高了约10倍。

Description

一种动物细胞双顺反子高效表达载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于动物细胞的双顺反子表达载体。

技术背景

外源基因在宿主细胞中的高效表达是蛋白质的结构和功能分析、蛋白质或多肽类药物研究开发的先决条件。目前用于外源基因表达的宿主细胞主要有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。大肠杆菌是原核细胞，缺少内质网和高尔基体等可用于进行糖基化等翻译后修饰的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在。而酵母及昆虫等真核细胞虽能进行糖基化等翻译后修饰，但它们采取的糖基化等翻译后修饰方式与人类细胞的方式不完全一样，从而影响了蛋白质的构象、分泌效率、生物活性、体内稳定性以及免疫原性等生物学特性。用于表达重组蛋白的表达体系有微生物、植物、酵母、昆虫细胞和动物细胞等。与大肠杆菌、酵母及昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源基因产物与天然蛋白在结构、糖基化类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白，并可大规模、高密度培养。但动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高动物细胞外源蛋白表达效率，降低生产成本是当前工作中的重中之重。

适合于哺乳动物细胞表达的载体的结构均比较复杂。目前已发展出很多哺乳动物细胞的表达载体，并且许多已经商业化。哺乳动物细胞的表达载体主要可以分成两大类，病毒型载体和非病毒型载体。非病毒型载体基本上是一类质粒DNA。这些表达载体都提供能在哺乳动物细胞中表达的强启动子，如SV40早期基因的启动子和增强子、人巨细胞病毒瞬时早启动子、TK基因启动子等等。载体DNA包含有提供外源基因插入的多克隆位点，以及其他的相关元件如poly(A)加尾信号。有的载体还提供内含子序列以增强表达效果，以及原核和真核细胞的筛选标记基因、原核复制起始区域、哺乳动物细胞病毒复制的相关序列(如SV40复制起始区)，在表达SV40病毒大T基因的细胞中如COS系列的细胞，该区域的存在可以使得相应的质粒在细胞中复制和扩增等。这类表达载体的代表有Invitrogen公司的一系列哺乳动物表达载体如pCDNA3。选用什么表达载体需要从多方面考虑，同一个表达载体，同一个启动子在不同的细胞类型中效果差异较大，这和该细胞中转录调控因子的存在状况有关，除了借鉴他人的经验，还需要许多具体的实验工作来确定。

在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白依赖于许多因素，如转录和翻译控制因子、RNA加工(RNA Processing)、基因拷贝的数目、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性(genetic properties)等。为重组蛋白选择一个合适的表达系统，由许多因素决定，这些因素包括：细胞生长的特点、表达的水平、胞内或胞外表达、重组蛋白的转录后修饰和生物活性、以及蛋白生产过程中的调控技术和经济问题等。而表达载体的选择是建立一个哺乳动物细胞表达系统的关键要素之一。

一般，哺乳动物细胞表达载体主要由以下几个部分组成：

1)一个组成型或诱导型的启动子来启动转录活性；

2)优化的mRNA加工和翻译信号，包括Kozak序列，翻译终止密码子，mRNA断裂(cleavage)和多聚腺苷化信号，及mRNA剪接信号等；

3)转录终止子；

4)用于基因扩增和建立稳定细胞株的筛选标记；

5)用于在细菌中质粒载体扩增的原核来源的复制起始位点和选择标记；

6)其他有特殊功能的元件：如融合域(fusion moieties)、蛋白酶切割位点、基因或蛋白靶向序列和构成双顺反子的IRES元件，另外如SV40复制起始位点有利于外源基因在COS细胞中瞬时表达等。

CHO(中国仓鼠卵巢)细胞是目前最常选用的工程细胞。二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)缺陷型CHO细胞株(CHO/DHFR-)的特点是缺失二氢叶酸还原酶。叶酸是细胞生存所必需的，必须由培养基供给，而叶酸又必须在二氢叶酸还原酶作用下还原为四氢叶酸，成为叶酸的活性形式才能被细胞利用。氨甲喋吟(MTX)的结构与叶酸相似，是叶酸的拮抗剂，它能抑制二氢叶酸的活性，使四氢叶酸的合成减少，从而抑制体内胸腺嘧啶核苷酸的合成，而干扰细胞的生长。二氢叶酸还原酶缺陷型不能合成四氢叶酸，如果引入外源DHFR基因，通过氨甲喋呤(methotraxate，MTX)扩增体系，可明显提高外源蛋白的表达量。提高CHO/DHFR-外源蛋白的表达水平，可以通过优化载体的方式来实现，因此构建一种适用于动物细胞，尤其是CHO细胞的高效表达载体在工业生产中意义重大。

发明内容

本发明目的是提供一种高效表达外源蛋白的表达载体及其应用，以降低小分子蛋白的生产成本。

首先，本发明提供了一种用于动物细胞的双顺反子表达载体，包括CMV增强子、SV40晚期启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、SV40晚期polyA信号等，所述SV40晚期polyA信号区插入了一段重复序列。

较佳的，所述CMV增强子拼接于SV40晚期启动子的5’端。本发明实施例列举的SV40晚期启动子的序列为SEQ ID NO：1。

所述CMV增强子可以为人CMV增强子。本发明实施例列举的人CMV增强子序列为SEQ IDNO：2。

所述插入SV40晚期polyA信号中的重复序列为SEQ ID NO：4。

优选的，所述SV40晚期polyA信号序列为SEQ ID NO：3。

本发明实施例所列举的表达载体，是由质粒pIRESneo3改造获得，其中，CMV增强子与SV40晚期启动子的拼接序列替换了原质粒中的hCMV主要立即早期启动子(Humancytomegalovirus major immediate early promoter)序列，改造的SV40晚期polyA信号序列替换了原质粒中的早期SV40多聚腺苷酸信号(SV40 early mRNA polyadenylationsignal)序列。

本发明的用于动物细胞的双顺反子表达载体还可进一步包括筛选标记，所述内部核糖体进入位点为部分失活的内部核糖体进入位点。

所述部分失活的内部核糖体进入位点，可以是可引导3’端蛋白翻译的元件如5’端先导序列等。

所述筛选标记可选自二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素抗性基因(neo)。

本发明还提供了上述动物细胞的双顺反子表达载体在小分子蛋白或多肽的高效细胞表达中的应用。

所述小分子蛋白或多肽可以是各种分子量为小于60kDa的蛋白或多肽，如各种药物蛋白：促红细胞生成素(EPO)，长效EPO以及各种具有促红细胞生成素活性的改构促红细胞生成素等。

本发明将几种含有相同外源蛋白的重组质粒进行瞬时转染，外源蛋白的表达量的测定结果表明，本发明的动物细胞的双顺反子表达载体特别适用于CHO细胞，与现有SV40晚期启动子的的动物细胞表达载体相比，在动物细胞中的外源蛋白表达量获得大幅提升，表达水平提高了约10倍，其应用有利于筛选到高表达单克隆细胞株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。

附图说明

图1显示表达载体的结构

图2显示表达载体构建过程

图3显示SV40晚期启动子的测序图谱

图4显示CMV增强子/SV40晚期启动子测序图谱

图5显示SV40晚期polyA信号的测序图谱

图6显示本发明SV40晚期polyA信号的测序图谱

图7pCSL-EPO酶切鉴定

其中，1：SpeI/NheI双酶切产物(约870bp；4850bp)

2：GeneRuler DNA ladder Mix #SM0331

3：NheI/BamHI双酶切产物(约590bp；5130bp)

4：XbaI/BST1107I双酶切产物(约280bp；5440bp)

5：pCSL-EPO质粒

图8pSVS-EPO酶切鉴定

其中，1：SpeI/NheI双酶切产物(约410bp；4800bp)

2：NheI/BamHI双酶切产物(约590bp；4620bp)

3：XbaI/BST1107I双酶切产物(约230bp；4980bp)

4：pSVS-EPO质粒

5：GeneRuler DNA ladder Mix #SM0331

图9pCSS-EPO酶切鉴定

其中，1：GeneRuler DNA ladder Mix #SM0331

2：SpeI/NheI双酶切产物(约870bp；4800bp)

3：NheI/BamHI双酶切产物(约590bp；5080bp)

4：XbaI/BST1107I双酶切产物(约230bp；5440bp)

5：pCSS-EPO质粒

图10显示本发明质粒与相关质粒促红细胞生成素表达量的比较

其中，横坐标：促红细胞生成素重组质粒

纵坐标：促红细胞生成素表达量

具体实施方式

下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制

实施例1SV40晚期启动子的构建

(1)SV40晚期启动子的扩增

①以SV40基因组(NCBI登录号：NC_001669)中的SV40晚期启动子序列为参考设计引物F01/R01，pSVL质粒(Amersham)为模版进行PCR扩增，PCR反应条件如表1。

F01 ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC (SEQ ID NO：5)

R01 GGTGGCTAGCGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTG (SEQ ID NO：6)

表1PCR反应条件

②以SV40基因组中的SV40晚期启动子序列为参考设计引物F012/R01，pSVL质粒(Amersham)为模版进行PCR扩增，PCR反应条件如表1。

F012 ATTGACTAGTAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAA(SEQ ID NO：7)

所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57(购自Fermentas公司)连接，并进行测序鉴定。

(2)CMV增强子的扩增

以质粒pIRESneo3(购自Clontech公司)为模版，人CMV增强子序列为参考，设计引物F02/R02，进行聚合酶链式反应，扩增出CMV增强子序列，反应条件如表1。

F02：ATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(SEQ ID NO：8)

R02：AGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATG(SEQ ID NO：9)

(3)CMV增强子与SV40晚期启动子的拼接

将上述实施例1(1)①的SV40晚期启动子和实施例1(2)的CMV增强子PCR产物等比例混合，按照表1条件进行PCR扩增获得目的序列(CMV增强子/SV40晚期启动子)。将PCR产物与经过SmaI处理的pUC57连接，并进行测序鉴定。

实施例2 SV40晚期polyA信号序列合成

(1)SV40晚期polyA信号的扩增

以pSVL为模版，pSVL序列中SV40晚期polyA信号序列为参考设计引物F03/R03，PCR反应条件如表1。

F03：TATATCTAGACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCAC(SEQ ID NO：10)

R03：GTCGACGGTATACTACCACATTTGTAGAGG(SEQ ID NO：11)

所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57连接，并进行测序鉴定。

(2)本发明SV40晚期polyA信号的合成

以SV40基因组中SV40晚期polyA信号序列为参考，人为添加了一段重复序列，该段重复序列为SV40晚期polyA信号区上的一段重复序列。设计引物如下：

1 ACAAATCTAGACAGACATGATAAGATACATTGAT(SEQ ID NO：12)

2 AGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTCT(SEQ ID NO：13)

3 GAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCACTCGACGCGTT(SEQ ID NO：14)

4 TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTCGAGTGCATTC(SEQ ID NO：15)

5 AAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGA(SEQ ID NO：16)

6 CACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT(SEQ ID NO：17)

7 AAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCAT(SEQ ID NO：18)

8 TTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCAT(SEQ ID NO：19)

9 TATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCA(SEQ ID NO：20)

10 ACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTG(SEQ ID NO：21)

11 GGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAA(SEQ ID NO：22)

12 aatcaGTATACTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCC(SEQ ID NO：23)

将上述引物混合，进行聚合酶链式反应，获得本发明SV40晚期polyA信号全序列。PCR反应条件如表1。将该PCR产物与经过SmaI处理的pUC57连接，并进行测序鉴定。测序结果表明序列为SEQ ID NO：3。

实施例3表达载体的构建

将实施例1(3)中的产物CMV增强子/SV40晚期启动子与pIRESneo3质粒进行SpeI/NheI双酶切连接，获得质粒pCSe。

将实施例2(1)的SV40晚期polyA信号与pCSe质粒进行XbaI/BST1107I双酶切连接，所得质粒命名为pCSS。

将pCSS与实施例1(1)②的SV40晚期启动子进行SpeI/NheI双酶切连接，所得质粒命名为pSVS。

将实施例2(2)的本发明SV40晚期polyA信号与pCSe进行XbaI/BST1107I双酶切连接，所获得的质粒本发明的表达载体，命名为pCSL。

实施例4转染COS7细胞作外源蛋白的瞬时表达研究

将经过密码子优化的人促红细胞生成素基因(GeneBank登录号：AB463610)经NheI/BamHI双酶切处理后，连接至NheI/BamHI双酶切后的本发明构建的质粒pCSL、pSVS、pCSS和商业化质粒pSVL(Amersham)中，获得重组质粒pCSL-EPO、pSVS-EPO、pCSS-EPO和pSVL-EPO。并采用脂质体法(lip2000，invitrogen)将该四种重组质粒pCSL-EPO、pSVS-EPO、pCSS-EPO和pSVL-EPO分别转染COS7细胞，检测其促红细胞生成素的表达水平。

按照lip2000操作说明书，将4μg pCSL-EPO、pSVS-EPO、pCSS-EPO和pSVL-EPO分别转染培养于5ml DMEM/F12(10％胎牛血清)的25cm²方瓶中的COS7细胞(约5×10⁷个细胞)中。转染细胞在5％CO₂，37℃的二氧化碳培养箱中培养3天后，收集培养液上清，利用ELISA法测定其促红细胞生成素表达量。pCSS-EPO、pSVS-EPO、pCSL-EPO和pSVL-EPO的促红细胞生成素表达量分别是88.6、18.3、176.3和17.8ng/ml。结果显示，本发明构建的重组质粒pCSL-EPO促红细胞生成素表达量最高，约是pSVL-EPO和pSVS-EPO的10倍。

序列表

<110>上海凯茂生物医药有限公司

<120>一种动物细胞双顺反子高效表达载体

<130>PCNKM091555

<160>23

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>407

<212>DNA

<213>Simian virus 40

<400>1

aagctttttg caaaagccta ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct ggaatagctc 60

agaggcagag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg 120

agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat 180

ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga 240

ctttccacac ctggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg 300

ggagcctggg gactttccac accctaactg acacacattc cacagctggt tctttccgcc 360

tcagaaggta cctaaccaag ttcctctttc agaggttatt tcaggcc 407

<210>2

<211>406

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300

accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgtttt 406

<210>3

<211>275

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>改造的SV40晚期polyA信号序列

<400>3

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cactcgacgc 60

gttaagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 120

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 180

agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 240

tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggta 275

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>改造的SV40晚期polyA信号序列中的重复序列

<400>4

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gca 43

<210>5

<211>47

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>5

acgtcaatgg gagtttgttt taagcttttt gcaaaagcct aggcctc 47

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>6

ggtggctagc ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt g 41

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>7

attgactagt aagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 40

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>8

attgactagt tattaatagt aatcaattac g 31

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>9

aggcctaggc ttttgcaaaa agcttaaaac aaactcccat tgacgtcaat g 51

<210>10

<211>50

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>10

tatatctaga cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 50

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>11

gtcgacggta tactaccaca tttgtagagg 30

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>12

acaaatctag acagacatga taagatacat tgat 34

<210>13

<211>47

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>13

agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtct 47

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>14

gagtttggac aaaccacaac tagaatgcac tcgacgcgtt 40

<210>15

<211>43

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>15

ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gtcgagtgca ttc 43

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>16

aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtga 46

<210>17

<211>49

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>17

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggt 49

<210>18

<211>53

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>18

aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cat 53

<210>19

<211>52

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>19

ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc at 52

<210>20

<211>54

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>20

tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttca 54

<210>21

<211>44

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>21

acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttg 44

<210>22

<211>42

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>22

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aa 42

<210>23

<211>53

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>23

aatcagtata ctaccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct ccc 53

Claims

1.一种用于动物细胞的双顺反子表达载体，包括CMV增强子、SV40晚期启动子、内部核糖体进入位点、SV40晚期polyA信号，所述SV40晚期polyA信号区序列为SEQ ID NO：3，所述双顺反子表达载体是由质粒pIRESneo3改造获得，其中，CMV增强子与SV40晚期启动子的拼接序列替换了原质粒中的hCMV主要立即早期启动子序列，所述SV40晚期polyA信号序列替换了原质粒中的早期SV40多聚腺苷酸信号序列。

2.如权利要求1所述用于动物细胞的双顺反子表达载体，其特征在于，所述SV40晚期启动子的序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1所述用于动物细胞的双顺反子表达载体，其特征在于，所述CMV增强子为人CMV增强子。

4.如权利要求3所述用于动物细胞的双顺反子表达载体，其特征在于，所述人CMV增强子序列为SEQ ID NO：2。

5.如权利要求1所述用于动物细胞的双顺反子表达载体，其特征在于，所述用于动物细胞的双顺反子表达载体还进一步包括筛选标记，所述内部核糖体进入位点为部分失活的内部核糖体进入位点。

6.如权利要求5所述用于动物细胞的双顺反子表达载体，其特征在于，所述筛选标记选自二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因。

7.如权利要求1-6任一所述用于动物细胞的双顺反子表达载体在多肽的高效细胞表达中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多肽为小分子蛋白。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多肽为促红细胞生成素。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述促红细胞生成素为长效EPO。